Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls cliciwch yma i Rhan 1

Pls cliciwch yma i Ran 3

Gall cistanche wella cof

O ystyried y canfyddiadau hyn, gwnaethom archwilio nesaf a oedd mynegiant miR hippocampal wedi'i uwchraddio mewn llygod ar ddysgu gofodol acofroedd ffurfio hefyd yn effeithio ar forffoleg niwronaidd in vivo. Yn arwyddocaol, canfuom fod dwysedd asgwrn cefn cyfartalog niwronau hippocampal llygod GLN yn uwch na llygod PLN, fel y datgelwyd gan Golgi trwytho'r pyramidaidd

Ffigur 3. Effeithiau newid lefelau mynegiant yr hippocampal miR-466f-3p ar berfformiad llygoden MWM

(A) Llinell amser arbrofol y dasg MWM, dadansoddiad mynegiant, neu fesur electroffisioleg ymennydd y llygoden ar ôl pigiad lentivirus.

(B) Paneli chwith: mynegiant dsRed yn hippocampus llygoden. Cynrychioladol delweddau chwyddo isel ac uchel OS o hippocampus o lygod wedi'u heintio â lentiviruses ailgyfunol yn mynegi dsRed-yn-unig fel rheolydd (colofn chwith delweddau) neu miR-466f-3p plws dsRed (dde colofn o ddelweddau). Mae ardaloedd bocsio'r ddwy ddelwedd uchaf wedi'u chwyddo a'u dangos isod. Bariau graddfa, 100 mm. Mae'r llinellau doredig yn dynodi ffiniau DG. Cafodd niwclei eu staenio â DAPI. GCL, haen cell granule; ML, haen moleciwlaidd. Histogram ar y dde, lefelau mynegiant cymharol miR-466f-3p yn hippocampus llygoden sydd wedi'i heintio â lentivirus sy'n mynegi rheolaeth neu miR-466f-3p, fel y'i profwyd gan RT-qPCR ( n=16 fesul grŵp).

(C) Perfformiadau MWM o lygod sydd wedi'u heintio â gwahanol lentifeirws ailgyfunol, wedi'u pecynnu gyda defnydd o bum plasmid gwahanol yn mynegi dsRed-yn-unig, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p, a sbyngau miR/SCR, yn y drefn honno, i'w hippocampus (n=13, 26, 16, 19, ac 11 y grŵp, yn y drefn honno). Panel chwith: dianc rhag hwyrni yn ystod yr hyfforddiant. Panel ar y dde: cuddni dianc unigol ar y 6ed sesiwn.

Cyflwynir data a ddangosir yn (B) fel cymedr ± SD, a chyflwynir data a ddangosir yn (C) fel cymedr ± SEM. Aseswyd arwyddocād ystadegol gan brawf t heb ei baru (B), ANOVA dwy ffordd gyda chymhariaeth post hoc Bonfer- roni (C, panel chwith), neu ANOVA un-ANOVA gyda phrawf post hoc Tukey (C, panel dde). Gwahaniaethau ystadegol: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" a="" ****p="">< 0.0001;="" *mir-466f-3p="" yn="" erbyn="" eraill;="" #mir-sbwng="" yn="" erbyn="">

niwronau yn hippocampus llygoden GLN a PLN (Ffigur S3). Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos bod uwchreoleiddio miR-466f-3p hippocampal yn hyrwyddo alldyfiant niwrit a ffurfiant asgwrn cefn dendritig, sy'n debyg i'r anwythiad o ddwysedd asgwrn cefn a welwyd yn hippocampus llygod GLN o'i gymharu â llygod PLN.

miR{0}}f-3p yn modiwleiddio dysgu gofodol llygoden yn gadarnhaol acofperfformiad, yn ogystal â phlastigrwydd synaptig

Ymchwilio a yw miR{0}}f-3p yn rheoleiddio dysgu gofodol llygoden yn gadarnhaol acofWrth ffurfio, gwnaethom ddefnyddio dull haint lentivirus ailgyfunol i orfynegi'r miRNA yn hippocampus y llygoden. Dadansoddwyd y llygod 7 diwrnod ar ôl pigiad lentivirus i'r DG (Ffigur 3A). Yn wir, dyrchafwyd delweddau cynrychioliadol o lefelau mynegiant clun miR-466f{-3p yn y grŵp gorfynegiant miR-466f-3p o gymharu â'r grŵp rheoli (histogram ar y dde yn Ffigur 3B). Gwelsom fod llygod â gorfynegiant hippocampal o miR-466f- 3p ac a oedd yn destun tasg MWM yn arddangos cuddfannau dianc o 88 ± 5 s yn y sesiwn 1af a 19 ± 1 s yn y 6ed sesiwn (coch llinell dot, Ffigur 3C), a oedd yn well nag ar gyfer llygod rheoli fector (llinell ddu) neu lygod rheoli mutant (llinell cylch coch) ac yn debyg i hwyrni dianc llygod GLN a ddisgrifir yn Ffigur 1A. Ochr yn ochr, archwiliwyd effaith colli swyddogaeth miR-466f-3p ar ddysgu gofodol acofdrwy atal miR-466f-3p gan ddefnyddio miR-sponge. Yn nodedig, roedd perfformiad MWM llygod lle'r oedd hippocampal miR-466f-3p wedi'i ddal gan y miR-sbwng yn debyg i berfformiad llygod PLN, hy, ni ddysgon nhw ddod o hyd i'r platfform hyd yn oed gan y sesiwn olaf (llinell sgwâr werdd solet,

Ffigur 3C). At hynny, nid oedd yn ymddangos bod llygod a gafodd eu chwistrellu â lentivirus wedi amharu ar blastigrwydd homeostatig, gan fod rhai llygod ym mhob grŵp wedi dysgu neu o leiaf yn y broses o ddysgu yn ystod y sesiwn ddiwethaf (Ffigur 3C, histogram ar y dde).

O ystyried bod gorfynegiant miR-466f-3p yn hippocampus llygoden wedi gwella eu dysgu acofgallu, dadansoddwyd electroffisioleg gymharol niwronau hippocampal diwylliedig sy'n mynegi lefelau gwahanol o miR{0}}f-3p. Roedd y cerrynt postsynaptig cynhyrfus bach (mEPSC) o niwronau hippocampal DIV14 yn gorfynegi miR-466f-3p neu mut-miR-466f-3p-3p), miR-sbwng, neu reolaeth oedd wedi'i recordio gan ddefnyddio clampiau clwt cell gyfan. Er nad oedd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol yn osgled mEPSC, codiad Tau, neu ddadfeiliad Tau ymhlith y pedair set o samplau, roedd amledd niwronau mEPSC yn gorfynegi miR-466f{-3p yn sylweddol uwch o gymharu â grwpiau eraill (Ffigur 4A), sy'n dangos bod derbynyddion glutaminergig postsynaptig yn cael eu hysgogi'n gryfach ar orfynegiant miR-466f{{- 3p{- 3p).

Yna fe wnaethom fesur potentiation hirdymor (LTP) i bennu rôl miR-466f-3p yn uniongyrchol mewn plastigrwydd synaptig in vivo. Weinjectedthehippocampusofmicewithcombinantivirus asdiscribedFfigure3andtheninducedLTPinhippocampalslices trwy ysgogiad tetanig (tri thrên o symbyliad amledd uchel [3xHFS]) o lwybr cyfochrog Schaffer. Canfuom fod ein protocol wedi ysgogi LTP ym mhob grŵp, fel y dangoswyd gan y cynnydd parhaus mewn potensial postynaptig cynhyrfus (fEPSPs) yn rhanbarth cornu amonis 1 (CA1) (Ffigur 4B, panel chwith). Roedd y CTLl yn gryfach mewn miR-466f-3p-sleisys gorfynegi (188 y cant ± 2 y cant o'r llinell sylfaen ar 40-50 munud ar ôl ysgogiad, cymedr ± SEM) o'i gymharu â mutant (169 y cant ± 1 y cant). o'r llinell sylfaen), sbwng AAD (173 y cant ± 3 y cant o'r llinell sylfaen), a thafelli wedi'u heintio â firws rheoli (159 y cant ± 2 y cant o'r llinell sylfaen), fel ataliad miR-466f{-3p gan Gostyngodd miR-sbwng y CTLl (128 y cant ± 1 y cant o'r llinell sylfaen) o'i gymharu â rheolaethau (Ffigur 4B, panel dde). Fe wnaethom hefyd fesur CTLl y grwpiau GLN a PLN ar ôl hyfforddiant. Datgelodd y data priodol hefyd wahaniaethau sylweddol mewn llethr fEPSP yn rhanbarth CA1 rhwng y grwpiau GLN a PLN (Ffigur 4C). Felly, mae lefel uwch o miR{33}}f{-3p yn gwella CTLl a phlastigrwydd synaptig sydd, yn ei dro, yn gallu hyrwyddo dysgu acofgallu llygod. Gyda'i gilydd, mae'r data a gyflwynir yn Ffigurau 2, 3, a 4 yn dangos bod miR-466f-3p yn chwarae rhan gadarnhaol hanfodol mewn dysgu gofodol acofffurfio, yn debygol trwy wella ffurfiant asgwrn cefn, LTP, a chryfder plastigrwydd synaptig.

Mae Mef2a mRNA yn darged rheoleiddiol o miR-466f-3p

Cynhaliom ddadansoddiad biowybodeg i nodi mRNAs targed posibl a reoleiddir trwy rwymo miR-466f{-3p i'w 30 UTR. Ymhlith yr ymgeiswyr a nodwyd gennym oedd amgodio mRNA Mef2a MEF2A. Yn ddiddorol, canfuwyd yn flaenorol bod mynegiant MEF2A wedi’i isreoleiddio ar ôl hyfforddiant MWM, a chafodd gorfynegiant y ffactor hwn effaith negyddol ar berfformiad llygod (Cole et al., 2012). Felly, defnyddiwyd assay gohebydd luciferase i archwilio a yw miR-466f-3p yn rheoleiddio cyfieithiad Mef2a mRNA trwy rwymo i'w 30 UTR. Fe wnaethom fewnosod dilyniannau math gwyllt neu mutant Mef2a 30 UTR i lawr yr afon o SV40-luciferase cDNA (Luc) a yrrir gan hyrwyddwr, gan arwain at y gohebydd yn plasmid psiCHECK2-MEF2A 30 UTR neu psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Ffigur 5A). Fel y dangosir yn histogram chwith Ffigur 5B, roedd cydfynegiant miR-466f{-3p wedi gwanhau mynegiant luciferase a gyfarwyddwyd gan Mef2a 30 UTR. Roedd yr effaith hon i'w gweld yn dibynnu ar y rhyngweithio rhwng miR-466f-3p a Mef2a 30 UTR ers treiglo naill ai safle rhwymo rhagweledig miR-466f-3p on y Mef2a 30 UTR (50-UGU- GUAU-30) neu'r rhanbarth hadau miR-466f-3p ({50-AUACACA-30)) gan gydnabod Mef2a diddymodd 30 UTR effaith ataliol miR-466f{{{{{{{{{{{{{-3}{{{-3}){{{{{-3}){{{{-3}){{{{-3}){{-3}{{-3)g48}}gweithgaredd) gweithgaredd luciferase (Ffigur 5B, histogram canol). At hynny, roedd cydfynegiant y miR-sbwng, ond nid y sbwng CR, hefyd yn dileu effaith ormesol miR-466f{{-3p{-3}p{-3}p) ar weithgarwch luciferase (Ffigur 5B, histogram ar y dde). Yn nodedig, ni chafodd gorfynegiant miR-466f-3p na miR-sbwng unrhyw effaith ar lefelau Mef2a mRNA mewn niwronau hippocampal cynradd (Ffigur 5C), ond fe wnaethant leihau neu gynyddu, yn y drefn honno, y lefel protein MEF2A (Ffigur 5D). Canfuom hefyd fod gorfynegiant miR-466f{-3p{{-3p{-3p neu miR-sponge), yn y drefn honno, yn isreoleiddio neu’n uwchreoleiddio lefel mRNA y protein sy’n gysylltiedig â sytosgerbydol a reoleiddir gan weithgaredd (Arc) mewn niwronau hippocampal cynradd (Ffigur 5C) , a oedd yn darged hysbys i lawr yr afon a reoleiddir yn gadarnhaol gan MEF2A (Flavell et al., 2006)

Fe wnaethom hefyd berfformio hybrideiddio fflworoleuedd yn y fan a'r lle (FISH) i ganfod miR-466f-3p a'i gyfuno â labelu IF o MEF2A mewn niwronau hippocampal cynradd DIV14 heb neu gyda thriniaeth forskolin. Mae'n hysbys bod Forskolin yn ysgogi LTP cemegol ac yn actifadu adenylyl cyclase, gan godi lefelau cAMP mewngellol. Gwelsom MEF2A yn cydleoli niwclear â miR-466f- 3p, fel y dangosir gan y delweddau cynrychioliadol yn Ffigur 5E. Fodd bynnag, ar ôl ysgogiad fforsgolin, cynyddodd y signal miR-466f-3p mewn soma a dendrites, tra bod y signal MEF2A yn y

lleihau cnewyllyn, fel y dangosir gan y newidiadau cilyddol yn nwysedd signalau MEF2A a Fast Red, yn y drefn honno, y celloedd niwronaidd unigol (Ffigur 5E). I grynhoi, mae'r data yn Ffigurau 5A–5E yn dangos bod miR{4}}f-3p yn rheoleiddio mynegiant protein MEF2A yn negyddol trwy rwymo i 30 UTR Mef2a mRNA ac o ganlyniad atal ei gyfieithiad.

Yn gyson â'r canlyniadau a ddisgrifir uchod, canfuom fod lefelau hippocampal o brotein MEF2A wedi'u hisreoleiddio mewn llygod GLN ar ôl hyfforddiant MWM, ond nid mewn llygod PLN (Ffigur 5F). At hynny, roedd cydberthynas gwrthdro rhwng lefelau cymharol MEF2A mewn llygod GLN unigol (smotiau) a llygod PLN (sgwariau) â lefelau miR-466f-3p (R=0.60, Ffigur 5G). Felly, patrymau heterogenaidd o ddysgu gofodol acofmae gallu yn cael ei fodiwleiddio gan gynnydd stocastig mewn miR- 466f-3p-3p mewn llygod unigol a gostyngiadau canlyniadol o MEF2A wrth ysgogi gweithgarwch niwronaidd.

Ysgogi stochastig o CREB hippocampal ac uwchreoleiddio trawsgrifiadol dilynol o'r clwstwr miR- 466-669 yn ystod hyfforddiant MWM

Fe wnaethom ymchwilio i'r mecanweithiau trwy ba rai y gallai tasg MWM gael eu huwchreoleiddio'n stochastig i miR{0}}f-3p yn hippocampus llygoden. Mae tri rhagflaenydd miRNA yn amgodio miR-466f-3p, ac mae pob un ohonynt yn perthyn i'r clwstwr miR-466-669 sy'n benodol i gnofilod sydd wedi'i leoli yn intron 10 o'i genyn gwesteiwr, mSfmbt2 (Inoue et al ., 2017) (Ffigur 6A). Yn ddiddorol, yn wahanol i miR-466f-3p, nid oedd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol yn lefelau mynegiant mSfmbt2 rhwngtheGLNandPLNgroups(Ffigwr6B), sy'n awgrymu y gallai'r clwstwr miR-466-669 amgodio trawsgrifiad ar wahân yn lle bod yn rhan o drawsgrifiad cynradd mSfmbt2. Yn unol â hynny, fe wnaethom ddylunio sawl set o baent preimio i nodi'r trawsgrifiad cynradd tybiedig o glwstwr miR-466-669 yn ôl RT-qPCR. Fel y dangosir yn ffigur 6A, darn PCR hir (ynghyd â 282 i 2,381), ynghyd â chyfres o fandiau qPCR sy'n gorgyffwrdd, sef A (plws 282 i 115), B (131 i 406), C (388 i 686), D ( 662 i 1,028), E ( 1,004 i 1,299), F ( 1,242 i 1,629), G ( 1,605 i 2,029), a H ( 2,005 i 2,381), yn hippocampus llygoden, ond nid yn rhan I ( 2 , 706 i 2 , 706) ) (data heb ei ddangos). Mae'r data hyn yn cefnogi bod y clwstwr miR{51}} wedi amgodio trawsgrifiad hir yn agos at tua 2,388 bp i fyny'r afon o'r rhagflaenydd miRNA cyntaf (hy, cyn-mir-466m, wedi'i ddynodi plws 1inFigure6A). Yn rhyfeddol, yn debyg i'r hyn a welsom ar gyfer miR-466f{{-3p), roedd lefel gyfartalog y trawsgrifiad hwn yn hippocampus llygod GLN yn uwch nag ar gyfer llygod PLN (Ffigur 6C). Felly, gwell dysgu acofmae gallu llygod GLN i'w briodoli i actifadu trawsgrifiadol y clwstwr miR-466-669.

Mae ysgogi CREB niwclear trwy ffosfforyleiddiad yn ystod tasgau MWM neu mewn mathau eraill o ddysgu yn gam hanfodol ar gyfer trosi tymor byr yn dymor hir.cof(Lisman et al., 2018; Roger- son et al., 2014). Felly, buom yn ymchwilio i weld a allai’r lefelau amrywiol o miR-466f{-3p ymhlith llygod unigol a oedd yn rhan o’r dasg MWM fod yn gydnaws â statws actifadu CREB. I archwilio'r syniad hwn, yn gyntaf archwiliwyd lefelau ffosfforyleiddiad CREB hippocampal mewn llygod unigol. Fel y dangosir yn Ffigur 6D, gwellwyd actifadu CREB (trwy ffosfforyleiddiad ar weddillion S-133) mewn llygod GLN o gymharu â llygod PLN a HC. Cadarnhawyd gennym hefyd fod miR{7}}f-3p yn wir wedi'i gyd-fynegi â pCREB mewn niwronau trwy berfformio miRNA ISH wedi'i gyfuno â staenio IF o pCREB a MAP2 mewn niwronau hippocampal cynradd (Ffigur S2A). Ymhellach, roedd cydberthynas gadarnhaol rhwng lefelau trawsgrifio cynradd clwstwr miR- 466-669 a pCREB mewn llygod GLN (R=0.52), tra roedd cydberthynas negyddol rhyngddo a pCREB mewn llygod PLN (R=0 .71) (Ffigur 6E). Fe wnaethom wirio am gydberthynas rhwng lefelau ffactor gweithredol arall, kinase a reoleiddir gan signal ffosffo-allgellog (pERK), a lefelau trawsgrifio cynradd y clwstwr miR-466-669. Canfuom fod y ddau fath o lygod a hyfforddwyd gan MWM yn cyflwyno cydberthynas gadarnhaol rhwng signal clwstwr miR-466-669 a pERK (R=0.59 a 0.48, yn y drefn honno; Ffigur S4A), ac nid oedd unrhyw wahaniaeth mewn pERK/ mynegiant tERK rhwng y ddau grŵp hynny (Ffigur S4B). Er mwyn egluro ymhellach effaith actifadu CREB ar drawsgrifio-rheoleiddio o'r clwstwr, o ganlyniad,

anwytho miR{0}}f-3p,weusedaspecficCREBinhibitor,666- 15 (Xie et al., 2015), ar y cyd â thriniaeth forskolin o niwronau hippocampal cynradd DIV14. Mae'n hysbys bod Forskolin yn actifadu ffosfforyleiddiad CREB (Malhotra et al., 2015). Canfuom fod cyn-driniaeth niwronau hippocampal cynradd gyda 666-15 wedi rhwystro actifadu CREB wedi'i achosi gan forskolin (Ffigur 6F) ac wedi lleihau lefelau clwstwr miR{9}}f{10}}p a miR{-466-669 trawsgrifiad (Ffigurau 6G a 6H). Ar yr un pryd, gostyngwyd lefelau mRNA o'r genynnau targed pCREB hysbys nurr1 a homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) hefyd ar 666-15 driniaeth (Ffigur 6H). Gyda'i gilydd, mae Ffigur 6 yn dangos bod actifadu stochastig CREB yn yr hipocampws o is-boblogaeth o lygod mewnfrid sy'n ymgymryd â thasg MWM yn achosi trawsgrifio o'r clwstwr miR-466-669 ac, o ganlyniad, sefydlu miR-466f{23 }}p, a thrwy hynny wella eu dysgu gofodol acofgallu i berfformio'n well yn y dasg.

TRAFODAETH

Rydym wedi archwilio rôl bosibl miRNAs wrth fodiwleiddio gallu amrywiol dysgu gofodol acofymhlith llygod mewnfrid C57BL/6J. Rydym yn awgrymu bod actifadu stochastig CREB ac uwch-reoleiddio o ganlyniad i gyfrifon hippocampal miR-466f-3p-3p yn cyfrif am fwy o ddysgu gofodol acofgallu is-grŵp o'n llygod prawf, mae'n debyg oherwydd miR-466f-3p cyfryngu ataliad trosiadol o Mef2a mRNA sy'n amgodio'rcofrheolydd negyddol MEF2A. Mae ein canfyddiadau yn darparu senario sy'n dangos rôl swyddogaethol ac esblygiadol miRNA penodol wrth reoleiddio gwybyddiaeth trwy anwythiad stocastig o echel CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A gan ysgogiadau amgylcheddol.

Defnyddiwyd tasg MWM yn eang i archwilio gallu amrywiol dysgu gofodol acofar gyfer cnofilod. O dan amodau arferol, mae cnofilod yn defnyddio ciwiau distal i gyfeirio eu hunain, gan ganiatáu iddynt ddysgu a chofio lleoliad y platfform cudd yn y dasg. Roedd y rhan fwyaf o'n llygod C57BL/6J mewnfrid prawf (62 y cant) yn arddangos patrwm arferol o hwyrni dianc, gan ddod o hyd i'r platfform o fewn 30 s erbyn sesiynau'r 3ydd-6fed (Ffigur 1A, GLN). Mewn cyferbyniad, ni ddysgodd grŵp o lygod (38 y cant) y dasg hyd yn oed erbyn y 6ed sesiwn (PLN). Yn nodedig, rydym hefyd wedi rhoi dau brawf adnabod arall ar y llygod. Y cyntaf oedd y prawf adnabod gwrthrych newydd (NOR), sef treial unigol yn seiliedig ar archwilio cynhenid ​​​​heb atgyfnerthiad na straen i ysgogi ymddygiad (Leger et al., 2013). Mae'r cydberthynas rhwng y tasgau NOR ac MWM o ran perfformiadau llygoden yn wael (R {{1{{20}}}}.13), sy'n debyg i'r cydberthynas rhwng perfformiadau NOR a lefelau mynegiant hippocampal o miR-466f-3p (R=0.01; data heb ei ddangos). Ni ddatgelodd y prawf NOR hefyd unrhyw wahaniaethau yn y mynegai gwahaniaethu rhwng y grwpiau MWM GLN a PLN (0.36 ± 0.25 yn erbyn 0.29 ± 0.18; Ffigur S1B). Mae'r dysgu gofodol arall acof-y dasg ddibynnol rydym wedi'i chymhwyso yw drysfa Barnes (BM), sy'n debyg i'r MWM. Mae'n seiliedig ar y rhagdybiaeth y dylai cnofilod sy'n cael eu gosod mewn amgylchedd anffafriol ddysgu a chofio lleoliad blwch dianc sydd wedi'i leoli o dan wyneb y platfform. Fel y dangosir yn Ffigur S1C, rydym wedi canfod bod perfformiadau llygoden yn y treialon stiliwr BM hefyd yn cydberthyn yn gadarnhaol â lefelau mynegiant hippocampal miR-466f-3p. Felly, sefydlu echel CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A yn yr hippocampus yn ystod dysgu acofffurfiant yn ofodol-ddibynnol.