Rhan 2:Calpastatin yn Atal Angiotensin Anaf Podocyte wedi'i gyfryngu drwy Gynnal A chadw Autophagy

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls cliciwch yma i Rhan 1

Pls cliciwch yma i Rhan 3

Mae Angel + HSD yn actifadu gweithgaredd calpain mewn podocytes sy'n cyfrannu at rwystr awtophagy

Gan fod gweithgaredd calpain wedi'i ganfod(i)i'w actifadu gan Angel mewn sawl math o gell a(ii)i glyfar sawl protein sy'n gysylltiedig ag awtoffagy, roeddem yn meddwl tybed a ellid priodoli blocâd awtoffagy wedi'i gyfryngu gan HSD i fwy o weithgarwch calpain a ysgogwyd gan Angl. Canfuom yn gyntaf fod podocytau sylfaenol yn mynegi'r 3 math hollbresennol o galpainau (Ffigur 3a). Yna, dangoswyd bod AngII wedi ysgogi gweithgarwch calpain mewn podocytau cynradd. Rhwystrwyd y cynnydd hwn mewn gweithgarwch calpain gan ataliwr calpain detholus (Ffigur 3b). Defnyddiwyd llygoden sy'n deillio o'r llygoden gyda mynegiant trawsgenedlaeth calpastatin ychwanegol (gan arwain at lai o weithgarwch calpainau)i asesu rôl calpains yn AngII + HSD-gyfryngolarenAnafa blocâd awtophagy. Dangosodd podocytau sylfaenol o CST'g llygod ostyngiad mewn gweithgarwch calpain mewn ymateb i AngII o'i gymharu â phoocytau o reoli llygod (Ffigur 3c). Felly, gostyngodd gorbwysleisio calpastatin mewn podocytau actifadu calpain wedi'i gyfryngu gan AngII.

Cistanchetubulosaâ llawer oeffeithiau, cliciwch yma i wybod mwy

Fe wnaethom asesu lefelau awtophagy nesaf mewn podocytau o CSTTg llygod. Gwnaethom gynhyrchu CST llygod gyda'r trawsgene GFP-LC3. Roedd gohebydd LC3-GFP yn caniatáu cyfrif awtoffagosomes fel dotiau GFP+/P62+. Bydd P62 yn cronni mewn agregau mewn celloedd pan fydd yr hylif awtoffagig wedi'i rwystro. Yn y cyflwr basgol, cyfrifwyd llai o ddotiau GFP+ P62+ (Ffigur 4a, b, ac e)a llai o gronni P62 (Figure4c,d, ac f)mewn podocytau o CST1g GFP-LC3 llygod nag mewn podocytau o normal

Ffigur 4| Gwerthusiad o lyngyr awtophagig mewn podocytau o drawsgenig calpastatin (CST9) llygod. (a,b) Delweddau imiwnedd cynrychioliadol o fynegiant o brotein fflworoleuol gwyrdd (GFP)(gwyrdd) a P62 (coch) mewn menmeruli o GFP-LC3 12 wythnos oed a CST'GFP-LC3 llygod. Mae'r saethau'n dangos GFP+ P62+ awtophagosomes. (c,d) Delweddau imiwnedd cynrychioliadol o fynegiant P62 (gwyrdd) a Podocalyxin (PODXL; coch) mewn menmeruli o GFP-LC3 12 wythnos oed a CST'9 GFP-LC3 llygod. Mae is-adrannau ffigurau gyda'r prif gyflenwad yn dangos dwysáu uwch. Roedd Nuclei wedi'i staenio â Hoechst (glas). Bariau = 50 μm. (e) Meintioli nifer y dotiau LC3+ P62+ fesul podocyte. Prawf Mann-Whitney:**P=0.0065. (dd) Meintioli ardal P62+ fesul adran sgleiniog. Prawf Mann-Whitney:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 GFP-LC3 llygod a n =8 CST'9 GFP-LC3 llygod. Cyflwynir gwerthoedd fel lleiniau unigol ac yn golygu± SEM. Er mwyn optimeiddio gwylio'r ddelwedd hon, gweler y fersiwn ar-lein o'r erthygl hon yn GFP-LC3 llygod, gan awgrymu mwy o lyngyr awtophagig mewn podocytau o llygod gyda digonedd o galpastatin uchel.

Gellir monitro llyngyr Awtophagig drwy fesur trosi'r ffurf cytoplasmig o LC3, LC3-I, i'r ffurf awtophagosomal a'r ffurf sy'n gysylltiedig â ffosffatidylethanolamine o LC3, LC3-II, ar y blot Gorllewinol. Dangosodd Podocytes o CST llygod gynnydd mewn LC3-I i dröedigaeth LC3-II a gostyngodd fynegiant P62, ym mhresenoldeb ac yn absenoldeb bafilomycin A,(Ffigur 5a a b), sy'n dangos mwy o lyngyr awtophagig mewn podocytau gyda gorbwysleisio calpastatin. Yn olaf, roedd cronni dotiau GFP+P62+ mewn podocytau ar ôl gweinyddu cloroquine yn bwysicach yn CST'g GFP-LC3 llygod nag yn GFP-LC3 llygod, gan gadarnhau felly fod calpastatin yn gorbwysleisio hylif awtophagig mewn podocytau yn vivo (Ffigur 5c-e). At ei gilydd, mae ein data'n awgrymu bod AngII yn ysgogi gweithgarwch calpain mewn podocytau, bod awtoffagy yn cael ei atal gan galpain mewn podocytau, a bod atal y gweithgaredd calpain gwaddol gan orbwysleisio calpastatin yn ddigon i ysgogi hylif awtophagig mewn podocytau.

Mae CSTT9 llygod yn cael eu diogelu rhag anaf podocyte Angel + HSD

CSTT: ni ddangosodd llygod unrhywarennewid tan o leiaf 12 mis oed (Ffigur Atodol S5). Gwnaethom ddadansoddi anaf podocyte yn CST'号 llygod yn ystod triniaeth AngII + HSD. Er bod WT llygod wedi datblygu menmerulosclerosis ysgafn ac anaf podocyte ar ôl 4 wythnos o orbwysedd, fel y dangosir gan fynegiant annormal o podocalycsin a nephrin, cyflwynodd CSTTg llygod lai o anafiadau sglerotig sglerotig (Ffigur 6a

Ffigur 5| Cadarnhaodd rhwystro diraddio awtophagosomal fod mwy o lyngyr awtoffagig podocyte mewn trawsgenig calpastatin (CSTT)llygod. (a) Dadansoddiad blot y Gorllewin o fynegiant LC3. Sequestosome 1(SOSTM1)/P62, ac ATG5 mewn podocytau cynradd o fath gwyllt (W neu CST'9mice. Mae mynegiant tubulin yn normaleiddio. Roedd podocytau yn cael eu trin neu heb eu trin â bafilomycin A1(BafA1; 100 nM) am 4 awr cyn arestio diwylliant. (b) Meintioli'r cymarebau LC3-ll/'tubulin a P62/tubulin.n = 10 WT llygod a n =8 CST'9 llygod. Cyflwynir gwerthoedd fel lleiniau unigol ac mae'n golygu ± SEM. Dadansoddiad dwy ffordd o amrywiant wedi'i baru ar gyfer triniaeth: ar gyfer LC3-ll/tiwtor: genoteip, P= 0.0008;triniaeth, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">aren-international.org.

Ffigur 6| Mae gordyniad Calpastatin yn atal angioten Il (Angel)+ deiet halen uchel (HSD) anaf podocyte wedi'i gyfryngu. (a,b)

Cistancheyn gallu lliniaruclefyd yr arennau

Delweddau cynrychioliadol o rannau trichrome Masson o glomeruli o'r math gwyllt (WT a thrawsgenig calpastatin (CST'9) llygod ar ôl 6 wythnos o Angll+ HSD. Bariau=50 um. (c,d,f,g) Delweddau imiwnedd cynrychioliadol o fynegiant (c,d) Podocalyxin (PODXL) ac (f,g)nephrin (NPHS1)yn WT a CST'9mice ar ôl 6 wythnos o Angel +HSD ac (e,h) meintioliadau cysylltiedig. Bariau =50 um. (ii)

cistancheyn gallu trinmethiant arennol acíwt

Delweddau imiwnedd cynrychioliadol o fynegiant o Tumor Wilm 1 (WT1; gwyrdd) a PODXL (coch) mewn menmeruli o WT a CST'llygod ar ôl 6 wythnos o Angel +HSD a (k) meintioli cysylltiedig o nifer y celloedd WT1+ fesul adran sgleiniog. Roedd Nuclei wedi'i staenio â Hoechst(glas). Bariau =50 um. Yn (e,h,k), cyflwynir gwerthoedd fel lleiniau unigol ac maent yn golygu ± SEM,n =9 WT llygod, a n=7 CSTTg llygod. Prawf t di-dâl gyda DC cyfartal:**P=0.0095 yn (e),*P=0.0249 yn (h), P=0.7891 yn (k).

a b)a mynegiant podocalyxin a nephrin wedi'i gadw (Ffigur 6c-h). Gwelwyd gwahaniaethau o'r fath mewn ffenoteip podocyte ar adeg lle nad oedd dwysedd niwclei podocyte yn wahanol rhwng WT a gorbwysedd CST'g llygod (Ffigur 6i-k).

Yn yr un modd, ar ôl 6 wythnos o orbwysedd, cyflwynodd GFP-LC3 a CST'1 GFP-LC3 llygod anaf podocyte ond roedd anafiadau'n fwy amlwg yn GFP-LC3 llygod (Ffigur 7). Roedd y gymhareb albwmin-i-creatinine wrinol yn uwch yn GFP-LC3 llygod ar ôl 4 wythnos o AnglI + HSD (Ffigur 7a). Nid oedd rhif Podocyte yn wahanol rhwng y 2 genoteip, ond roedd mynegiant neffrin yn llawer mwy yn GFP-LC3 (rheoli) llygod (Ffigur 7b-e). I gyd-fynd â diogelwch sy'n cael ei gyfryngu gan calpastatin, dangosodd y dadansoddiad uwchadeileddol fod y broses droed ysgafn a chanolbwynt yn y broses o gael ei thrin yn GFP-LC3 llygod a gafodd ei thrin ag Angl+ HSD gyda gwell cadwraeth o'r broses droed yn CST'g llygod, er nad oedd meintioli byd-eang nifer y prosesau traed fesul islawr sgleiniog (GBM) yn ystadegol wahanol, yn fwyaf tebygol oherwydd bod anaf podocyte yn ganolbwynt ac yn segmentaidd yn ein model (Ffigur 7f-h). O'r nodyn, macrophages ac ymdreiddiad T-lymffocyte ynArennauoedd yn wahanol rhwng y grwpiau (Ffigur Atodol S6). Gyda'i gilydd, dangosodd y canlyniadau hyn fod calpastatin yn atal anaf podocyte a ysgogwyd gan AngII+ HSD.

Mae gorbwysleisio Calpastatin yn adfer hylif awtophagig mewn podocytau o llygod ar ôl triniaeth Angel + HSD

Yn olaf, roeddem yn meddwl tybed a oedd diogelwch sgleiniog wedi'i gyfryngu gan calpastatin yn y model AngII+ HSD yn awgrymu cynnal a chadw awtoffagy mewn podocytau. Yn ddiddorol, ataliwyd croniad P62 a ysgogwyd gan AnglI +HSD mewn podocytau yn CSTTg a GFP-LC3 CST'g llygod (Ffigur 8a-d), sy'n dangos bod calpastatin wedi atal blocâd o awtoffagy podocyte. O'r nodyn, roedd nifer y dotiau GFP+ P62+ sy'n labelu awto-phagosomes yn debyg mewn podocytau o orbwysedd GFP-LC3 a GFP-LC3 CST llygod, gan awgrymu felly bod AnglI + HSD wedi achosi arafu hylif awtoffagig podocyte yn hytrach nag arestio llwyr (Ffigur 8e-g).

Mewn rhagfynegiad silico o'r safle clyfar calpain mewn proteinau podocyte

Defnyddiwyd sawl un mewn offer silico i ragweld targedau calpain posibl mewn podocytau (Tablau Atodol S1 ac S2). Cymharwyd tair cronfa ddata ar-lein: GPS-CCD,4CaMPDB,5, a DeepCalpain.° Mewn dadansoddiad silico, nodwyd sawl protein podocyte, nephrin a phodocin yn eu plith, y gellid eu glanhau gan galpains. Felly, gellid cysylltu gwarchodaeth sgleiniog wedi'i chyfryngu â calpastatin â lleihau gweithgarwch enszymatig calpain, gan arwain at lai o ddirywiad mewn rhai proteinau podocyte.

At hynny, mae o leiaf 3 phrotein sy'n gysylltiedig ag awtoffagy yn dargedau uniongyrchol o galpainau. Mae ATG5 yn cael ei glyfar gan galpains, gan arwain at aflonyddwch yn y ffurfio cymhleth ATG12-ATG5.57 Mae gweinyddu swildod calpain yn vivo hefyd yn atal cleavage o'r protein awtophagy Beclin-1. 5"Mewn dadansoddiad silico o'r safle clyfar tybiedig ar brotestiadau sy'n gysylltiedig ag awtophagy, mae'n cefnogi'r rhagdybiaeth y gallai calpain reoleiddio awtoffagy drwy glyfar enszymatig proteinau awtophagy.

mRNA mynegiant o reticwm endoplasmig (ER) a marcwyr straen ocsideiddio mewn menmeruli o llygod a drinnir gydag Angll+ HSD

Gwerthuswyd straen reticwm endoplasmig (ER) a straen ocsideiddio gan PCR meintiol mewn menmeruli yn ystod triniaeth AngII +HSD (Tabl 1). Ar y llinell sylfaen, ni welsom unrhyw newid yn mynegiant mRNA o genynnau wedi'u dadansoddi mewn menmeruli5loxlox llygod (Atodol o WT a Nphs2.cre Atg5 Ffigur S7). Ar ôl 6 wythnos o orbwysedd, menmeruli o Nphs2. dangosodd cre Atg5loxlox llygod broffiliau mRNA gwahanol o genynnau o straen ER a llwybrau straen ocsideiddiol gyda mwy o fynegiant o Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl, a Hsp90b1 o'i gymharu â menmeruli WT, gan awgrymu felly bod disbyddu awtoffagy mewn podocytau yn ffafrio AngII + straen ER a ysgogwyd gan HSD a straen ocsideiddio. I'r gwrthwyneb, cyflwynodd menmeruli o CST llygod israddio nifer o genynnau o'r straen ER a llwybrau straen ocsideiddiol yn ogystal â llai o fynegiant o rai genynnau pro-apoptotig (Ffigur 9).

Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gallai gorbwysleisio calpastatin atal anaf sgleiniog drwy leihau AngII + ER a straen ocsideiddio a ysgogwyd gan HSD.

TRAFODAETH

Yn yr astudiaeth bresennol, dangoswyd bod awtoffagy podocyte wedi'i israddio'n sylweddol mewn gorbwysedd a ysgogwyd gan AngII+HSD. At hynny, roedd llygod gyda dileu atg5 sy'n benodol i podocyte yn fwy tebygol o fod yn angI+ sgleiniog a ysgogwyd gan HSD a cholled podocyte, gan ddangos felly fod awtoffagy mewn podocytau yn atal datblygiad neffropathi gorbwysedd, gan dynnu sylw at rôl hanfodol awtoffagy mewn anaf podocyte a ysgogwyd gan Angl + HSD. Ychydig sy'n hysbys am yr ysgogiadau alloffer sy'n rheoleiddio awtoffagy cellog, ac mae'r canlyniadau hyn yn taflu goleuni ar reoleiddio pathoffisiolegol awtoffagy podocyte gan AngII.

Yn y rhan fwyaf o sgleiniog dynol, mae'r broses traed podocyte yn arwydd o anaf sgleiniog sy'n arwain at proteinuria. Mae Autophagy yn debygol o chwarae rhan hanfodol yn y gwaith o gynnal swyddogaeth podocyte oherwydd bod y celloedd gwahaniaethol hyn yn dangos cyfraddau uchel o awtoffagy hyd yn oed yn absenoldeb straen. Dangosodd astudiaeth flaenorol fod awtoffagy Angi pro-motes drwy gynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol mewn llinell gell podocyte murlun sydd wedi'i hanfarwoli'n amodol.5 Mae cynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol yn wir yn ysgogydd cyffredinol o awtoffagy mewn llawer o fathau o gell ac mae'r rhesymau dros anghysondeb o'r fath gyda'n canfyddiadau yn aneglur. Yn wahanol i'r astudiaeth olaf hon, defnyddiwyd podocytau sylfaenol murlun yn cadw mynegiant podocin a nephrin ac mewn dulliau vivo ac nid llinellau celloedd murlun. Rydym yn cadarnhau adroddiadau blaenorol bod podocytau postmitotig yn dangos lefel anarferol o uchel o awtoffagy cyfansoddol. Mae angen mesur y swm cynyddol o LC3-II ar ôl ysgogi AngII ym mhresenoldeb neu absenoldeb swildod lysosomal er mwyn penderfynu

a yw hylif awtophagig yn cael ei gynyddu neu ei rwystro. Mae astudiaethau blaenorol wedi esgeuluso'r ffenomenon hon.

Yma, defnyddiwyd model gorbwysedd yn seiliedig ar berfedd AnglI a HSD. Mae Podocytes yn arddangos derbynyddion ATI ac yn agored i peptidau wedi'u hidlo am ddim fel AngII1,6,26,61-6 Tybir y gallai'r effeithiau a arsylwyd ar atal RAAS fod—yn rhannol o leiaf—oherwydd blocâd o'r RAAS hwn sy'n benodol i podocyte. Yn yr un modd, mewn astudiaethau vivo

Cistancheyn gallu lliniaruclefyd yr arennau