Rhan 2 Mae Treigladau ERCC1 yn Rhwystro Atgyweirio Niwed DNA Ac yn Achosi Camweithrediad yr Afu a'r Arennau mewn Cleifion

Cyswllt:ali.ma@wecistanche.com

Cliciwch yma i ran 1

Rhan 2

Cliciwch i Cistanche NZ am glefyd yr arennau

Trafodaeth

Achos newydd o ddeu-aleligERCC1treigladau Dim ond dau unigolyn â deu-aleligERCC1mae treigladau wedi cael eu hadrodd hyd yma, gyda'r ddau ohonynt yn arddangos nodweddion tebyg i CS. Roedd gan yr unigolyn yr effeithiwyd arno fwyaf difrifol (165TOR) amrywiad nonsens (Q158X) ac amrywiad missense F231L yn y motiff (HhH)2 o ERCC1 (Ffig. S5 F), yn dangos arafiad twf, methiant datblygiadol, a chyfangiadau, a bu farw ar ôl y blwyddyn gyntaf bywyd oherwydd niwmonia (Jaspers et al., 2007). Roedd gan yr ail unigolyn yr effeithiwyd arno (CS20LO) gyfangiadau, microseffali, a hypertonia ac roedd yn homosygaidd ar gyfer yr amrywiad missens F231L a bu farw yn ail flwyddyn ei fywyd (Kashiyama et al., 2013).

Rydym yn adrodd am ddau frawd neu chwaer â deu-aleligERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) ac alel nwl oherwydd dilead mewngenig a etifeddwyd gan y fam. Mae'r holl brotein ERCC1 sy'n weddill a fynegir mewn celloedd o'r cleifion hyn yn cario'r amnewidiad asid amino R156W, sy'n tarfu ar bont halen rhwng y gweddillion R156 â gwefr bositif a'r gweddillion D129 â gwefr negatif gwrthwynebol sydd wedi'u lleoli ychydig yn is na'r boced rhwymo XPA yn y parth canolog oERCC1. Mae effaith yr amnewidiad hwn yn ddeublyg: (1) mae'n lleihau'n fawr sefydlogrwydd cyffredinol ERCC1 a'i bartner rhwymol XPF, a (2) mae'n effeithio'n benodol ar y rhyng-weithredu ag XPA (Ffig. 9).

Llai o lefelau protein niwclear o ERCC1 oherwydd cam-blygu rhannol

Datgelodd dadansoddiadau blot gorllewinol a immunofluorescence bod y cyffredinolERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) yn yr endogenaiddERCC1locws celloedd RPE1-hTERT. Yn ddiddorol, arweiniodd colli ERCC1 yn llwyr mewn llygod at farwolaeth o fewn 4 wythnos, tra bod cynyddu lefelau protein i tua 15 y cant o'r lefelau mewn llygod WT wedi cynyddu'r rhychwant oes bum gwaith (Weeda et al., 1997), sy'n awgrymu bod hyd yn oed lefelau isel o ERCC1 cynyddu'r potensial ar gyfer hyfywedd yn sylweddol. Yn gyson â'n canfyddiadau, mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod treigladau missens yn y parth canolog oERCC1achosi ansefydlogi yn gyffredinol (Sijbers et al., 1996b), sy'n dangos bod y rhanbarth hwn yn bwysig ar gyfer sefydlogrwydd protein.

Strwythur microsgopeg electron cryogenig a adroddwyd yn ddiweddar o'r hyd llawnERCC1-XPF heterodimer (Jones et al., 2020) yn datgelu bod yERCC1R156gweddillion wedi'i leoli ar ymyl iawn y heterodimer. Rydym yn dyfalu bod y cynnydd mewn swmp a strwythur electronig newidiol amnewid arginin â tryptoffan nid yn unig yn tarfu ar boced rhwymo XPA ond hefyd ar y rhyngwyneb pylu rhwng parth canolog ERCC1 a pharth niwcleas XPF, gan achosi ansefydlogi cyffredinol (Ffig. S5 F). O ddiddordeb, mae'r amrywiad missense XPFR799W wedi'i leoli ar yr un rhyngwyneb ar ochr XPF (Ffig. S5 F) ac mae hefyd yn arwain at ansefydlogi a lleihau lefelau protein XPF yn ddifrifol (Mori et al., 2018). Mewn un unigolyn yr effeithiwyd arno (CALIF1010) a gyflwynodd nodweddion progeroid tebyg i CS a segmentol, etifeddwyd yr amrywiad XPFR799W ynghyd â dileu rhynggenig yn yr alel XPF arall, gan arwain at ddiffyg NER cryf ynghyd â nam atgyweirio ICL ysgafn (Mori et al., 2018), yn debyg i'r brodyr a chwiorydd a adroddwyd yn yr astudiaeth hon.

Mynegiant ectopig o fersiwn anwythol oERCC1R156WFe wnaeth for24 h ein galluogi i gyrraedd lefelau WT o'r protein mutant hwn, a arweiniodd at gamleoli yn y cytoplasm, llai o ryngweithio ag XPF, a mwy o ryngweithio â hebryngwr sy'n plygu protein, fel y canfuwyd gan MS. Mae'r canfyddiadau hyn i gyd yn cefnogi'r syniad bodERCC1R156Wyn cael ei gamblygu a'i ddiraddio'n rhannol mewn celloedd cleifion, gan arwain at ostyngiad o -80 y cant yn lefelau protein niwclear ERCC1. Mae KI o ERCC1R156W mewn celloedd RPE1-hTERT yn cefnogi'r casgliad hwn.

Wrth gymharu yERCC1a lefelau protein XPF mewn celloedd PV46LD a PV50LD gyda'r rhai mewn celloedd o unigolion yr effeithiwyd arnynt yn fwy difrifol (165TOR a CS20LO), nodasom fod y lefelau hyn yn debyg, neu efallai hyd yn oed yn is, mewn celloedd o'r brodyr a chwiorydd a ddisgrifir yn yr astudiaeth hon (Ffig. 3). C a Ffigur S3, E ac F; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Sylwch fod CS20LO yn homosygaidd ar gyfer ERCC1F231L, tra bod 165TOR yn heterosygaidd ac yn cario stop cynamserol ychwanegol ar y llallERCC1alel (Q158X). Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu, yn ogystal â gostyngiad mewn lefelau protein, bod angen ystyried ymarferoldeb y protein mutant sy'n dal i gael ei fynegi a'r cyfuniad o'r ddau alel treigledig fel modulator posibl o ddifrifoldeb ffenotypig a mynegiant.

ERCC1R156W: Effaith wahaniaethol ar 1-lwybrau atgyweirio DNA dibynnol ERCC

Roedd mynegiant o ERCC1R156W-GFP mewn celloedd ERCC1-KO ar lefelau tebyg i ERCC1WT yn ein galluogi i ddatgysylltu effaith amnewid asid amino ar sefydlogrwydd protein oddi wrth yr effaith ar ymarferoldeb protein. Er bod y protein mutant ERCC1R156W wedi'i amharu'n ddifrifol yn ei ryngweithiad a achosir gan UV ag XPA a physgod ac wedi methu â lleoleiddio'n effeithlon i safleoedd o friwiau DNA a achosir gan UV, roeddem yn dal i ganfod gweithgarwch atgyweirio sylweddol (∼40 y cant) mewn profion UDS, goroesiad clonogenig, a phrofion NER in vitro. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gall protein ERCC1 mutant sydd ond yn rhyngweithio'n wan iawn â'r cymhleth NER barhau i gefnogi lefelau sylweddol o weithgaredd NER (∼40 y cant) y tu mewn i gelloedd. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod lefel mynegiant isel ERCC1 (∼20 y cant) ynghyd â gweithgaredd GGR gweddilliol y proteinau mutant sy'n dal i gael eu mynegi yn darparu amddiffyniad digonol i atal PV46LD a PV50LD rhag datblygu XP llawn-chwythu. Yn wir, roedd gweithgaredd GGR gweddilliol yn dal i gael ei ganfod o dan amodau mwy sensitif mewn profion UDS o'i gymharu â ffibroblastau gan glaf XP-A a effeithiwyd yn ddifrifol ac sy'n dueddol o ganser. Serch hynny, gallai'r ddau glaf ddal i fod mewn perygl o ddatblygu canser y croen, ac felly cynghorir amddiffyniad rhag golau'r haul. Roedd y gweithgaredd gweddilliol mewn celloedd PV46LD a PV50LD naill ai'n debyg neu'n is na'r gweithgaredd atgyweirio a ganfuwyd gennym mewn celloedd 165TOR neu CS20LO (Ffig. 6 J; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Nid yw'r difrifoldeb clinigol, felly, yn cyd-fynd â gweithgaredd NER ond mae'n debygol oherwydd rôl ERCC1 y tu allan i NER sy'n bwysig yn ystod datblygiad.

Er gwaethaf ein canfyddiadau bod ERCC1R156W yn dangos llai o ryngweithio â SLX4 a hefyd wedi'i recriwtio'n llai effeithlon i safleoedd sefydlu ICL lleol, datgelodd dadansoddiad pellach mai ychydig yn unig yr effeithiwyd ar brotein mutant ERCC1R156W wrth gefnogi atgyweirio ICL o'i fynegi'n ectopig yn ERCC1- celloedd KO. Fodd bynnag, roedd yr effaith ar atgyweirio ICL yn llawer ysgafnach nag effaith amnewidiad R156W ar NER, sydd, ynghyd â chanfyddiadau cynharach bod angen llawer llai o brotein ERCC1 ar atgyweirio ICLs nag atgyweirio briwiau DNA penodol i NER (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b), yn esbonio'n dda iawn yr effaith ysgafn ar atgyweirio ICL. Mewn ffibroblastau cleifion, sydd wedi gostwng lefelau ERCC1 yn sylweddol, fe wnaethom ganfod sensitifrwydd cymedrol, yn ogystal â mwy o doriad cromosom wrth ddod i gysylltiad â'r MMC cyfansawdd sy'n achosi ICL, er ei fod yn llawer mwynach na chelloedd claf FA a gynhwyswyd ochr yn ochr. Yn bwysig, nid yw PV46LD na PV50LD wedi dangos unrhyw arwyddion amlwg o nodweddion clinigol tebyg i FA, sy'n awgrymu bod y protein mutant ERCC1R156W yn darparu amddiffyniad digonol yn erbyn y llwyth ICL mewndarddol isel yn y cleifion hyn.

Mae diffyg ERCC1 yn achosi nam ar yr afu a'r arennau

Llygod sy'n KO ar gyfer naill ai ERCC1 neu XPF i ddangos rhedeg difrifol (hy, yn llai ac yn wannach na llygod WT) ac yn marw cyn 4 wythnos gyntaf bywyd oherwydd methiant difrifol yr afu (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997). Roedd mynegiant penodol i'r afu o ERCC1 yn y llygod hyn yn cywiro'n rhannol y maint llai a'r rhychwant oes estynedig hyd at 12 wythnos ond hefyd yn ddifrifol heb ei guddio.camweithrediad yr arennaua methiant arennol fel achos eilaidd o farwolaeth (Selfridge et al., 2001). Nid yw llygod KO sy'n benodol ar gyfer XP neu FA yn arddangos clefyd yr afu, sy'n awgrymu nad yw'r ffenoteip hwn yn cael ei achosi gan ddiffyg atgyweirio NER neu ICL. Mae'n bosibl y gallai diswyddiad rhannol rhwng y ddau lwybr hyn, a gollir mewn llygod ERCC sy'n ddiffygiol yn y ddau lwybr, esbonio'r ffenoteip hwn. Yn unol â'r syniad hwn, mae hepatocyte acelloedd tiwbyn arennau-procsimoldaeth yn polyploid mewn llygod ERCC1-KO a chronnodd lefelau uchel o p53 (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997), gan awgrymu bod difrod DNA mewndarddol yn cronni yn yr organau hyn gall ddigwydd. Fodd bynnag, mae union natur y briw DNA mewndarddol hwn yn parhau i fod yn aneglur.

Yn ddiddorol, nid yw llygod sy'n anactifadu atgyweiriad NER ac ICL ar y cyd yn dangos camweithrediad yr afu, sy'n awgrymu nad diswyddiad rhwng y llwybrau atgyweirio DNA hyn yw'r unig esboniad a bod swyddogaeth ychwanegol ERCC1-XPF y tu allan i'r llwybrau atgyweirio DNA hyn yn cyfrannu i nam ar yr afu (Mulderrig a Garaycoechea, 2020). Mae'n bosibl bod ERCC1-XPF yn ymwneud â llwybrau atgyweirio DNA ychwanegol sy'n ymdrin â difrod DNA mewndarddol. Er enghraifft, dangoswyd yn ddiweddar bod ERCC{3}}XPF yn gweithredu ar strwythurau DNA amgen, megis Z-DNA, pan fydd yn cydweithredu â phroteinau atgyweirio diffyg cyfatebiaeth yn hytrach na ffactorau atgyweirio NER neu ICL (McKinney et al., 2020). Yn ogystal, dangoswyd bod ERCC1-XPF yn rhan o is-lwybr atgyweirio toriad sylfaen ynghyd â hofrennydd RECQ1 (Woodrick et al., 2017).

Dangosodd y ddau frawd neu chwaer (PV46LD a PV50LD) yn yr astudiaeth hon fethiant i ffynnu, statws byr, a diffyg braster isgroenol, sy'n atgoffa rhywun o'r maint bach a welwyd yn llygod ERCC1-KO (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997). Ar ben hynny, datblygodd y brodyr a chwiorydd namau ar yr afu gyda llun yn bennaf golestatig a arweiniodd at drawsblannu afu orthotopig cyn 9 oed. Roedd yr ymyriad hwn yn amlwg yn atal marwolaeth gynnar ond ni wnaeth wella'r methiant i ffynnu, fel sy'n amlwg o dwf pwysau, taldra a chylchedd pen ôl-drawsblaniad ymhell islaw'r drydedd canradd.

O ddiddordeb, adroddwyd bod clefyd colestatig yr afu yn nodwedd gyffredin mewn cleifion CS yr Aifft, gan awgrymu y dylid monitro hyn yn agosach mewn cleifion CS o gefndiroedd ethnig eraill i weld a yw hon yn nodwedd fwy cyffredin nag a gydnabuwyd yn flaenorol (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Er nad oes unrhyw annormaleddau afu wedi'u disgrifio mewn cleifion XP, mae rhai achosion o sytolysis hepatig (chwalu yn y celloedd neu'n byrstio) mewn cleifion FA (Masserot-Lureau et al., 2012), a allai fod yn wahanol i'r annormaleddau afu a welwyd yn yr ERCC 1- brodyr a chwiorydd diffygiol. Datgelodd archwiliad histolegol o fiopsi iau gan y brawd neu chwaer hŷn (PV50LD) newidiadau mewn morffoleg hepatocyte gyda helaethiad niwclear ac amrywioldeb, fel y nodwyd yn llygod diffygiol yr ERCC (Ffig. S1 D; N’uñez et al., 2000). ).

Roedd ail achos marwolaeth mewn llygod ERCC1-KO gyda mynegiant penodol i'r afu o ERCC1 yn ddifrifolmethiant yr arennau(Selfridge et al., 2001). Mae'r ddau frawd neu chwaer hefyd yn dangos camweithrediad arennol, gyda nodweddion sy'n awgrymu camweithrediad tiwbaidd procsimol sy'n arwain at ddatblygiad cynyddolarennam. Fodd bynnag, swyddogaeth tiwbaidd sefydlogi yn dilyn y trawsblaniad afu, ondarenswyddogaethangen monitro parhaus. Mae ffenoteip arennol llygod ERCC1- KO - gyda thiwbiau ymledol yn cynnwys deunydd proteinaidd wedi'i ollwng sy'n gyson â thiwbwlopathi (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997) - yn debyg i gleifion a ddisgrifiwyd yn ein hastudiaeth. Ar ben hynny, mae nam arennol ac, mewn rhai achosion, methiant wedi'u nodi yn XP/CS cyfun (Ben Chehida et al., 2017; Kondo et al., 2016; Kralund et al., 2013) yn ogystal â CS (Funaki et al. ., 2006; Reiss et al., 1996; Sato et al., 1988), tra bod cysylltiad rhwng FA ac anomaleddau strwythurol yarenhas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) a fu farw yn 37 oed (Gregg et al., 2011; Imoto, K., et al. 2007. Mae cleifion â diffygion yn y proteinau atgyweirio toriad niwcleotid rhyngweithiol ERCC1 neu XPF yn dangos xeroderma pigmentosum gyda dirywiad niwrolegol difrifol sy'n dechrau'n hwyr). [Crynodeb] J. Invest.Dermatol. 127:S92). Er na adroddwyd am unrhyw nam ar yr afu, datblygodd y claf hwn atroffi ymennydd difrifol yn 15 oed, a ddatblygodd yn niwroddirywiad cynyddol gyda dementia. Mae atroffi ymennydd ysgafn hefyd wedi'i nodi yn y ddau frawd neu chwaer yn 13 ac 11 oed, sy'n nodi y dylid monitro datblygiad niwrolegol y ddau frawd neu chwaer yn ofalus.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers et al., 2007; Cyflwynodd Niedernhofer et al., 2006) ffenoteip gyda rhywfaint o orgyffwrdd â’r brodyr a chwiorydd a adroddir yma, gan gynnwys ffotosensitifrwydd heb ganser y croen, statws byr, diffyg braster isgroenol, oedi datblygiadol, ac annigonolrwydd arennol (Niedernhofer et al., 2006). Yn wahanol i'r brodyr a chwiorydd a adroddir yma, dangosodd y bachgen hwn nodweddion progeroid segmentol amlwg, ond llun iau llawer mwynach heb golestasis. Mae'r brodyr a chwiorydd a adroddir yma yn dangos y gall mwtaniadau ERCC1 deu-alelig achosi sbectrwm o ffenoteipiau, o'r hyn a welir yn nodweddiadol yn CS i ffenoteip sy'n cynnwys statws byr ysgafnach, ffotosensitifrwydd, ac afu difrifol aarennam, o bosibl oherwydd effaith gref gyfunol ar NER ac effaith ar yr un pryd ar atgyweirio ICL, a allai effeithio'n arbennig ar yr organau hyn.

Defnyddiau a dulliau

Mae'r holl driniaethau a gyflawnir yn yr astudiaeth hon yn unol â'r safonau moesegol ac fe'u cymeradwywyd gan Bwyllgor Moeseg Ddynol Ysbyty Brenhinol y Plant, Melbourne, Victoria, Awstralia (HREC36291C) a Phwyllgor Gwasanaeth Moeseg Ymchwil Cenedlaethol y DU Gogledd-ddwyrain-Newcastle a Gogledd Tyneside. 2. Recriwtiwyd cleifion i Raglenni Clefydau Heb Ddiagnosis ar gyfer cleifion pediatrig ag anhwylderau Mendelaidd "amddifad" tybiedig. Casglwyd samplau poer neu waed oddi wrth y cleifion ac aelodau eu teulu ar gyfer echdynnu DNA genomig ar ôl rhoi caniatâd gwybodus ysgrifenedig. Mae'r rhieni wedi rhoi caniatâd i ddangos ffotograffau heb eu golygu o'r brodyr a chwiorydd yr effeithiwyd arnynt yn Ffig. 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>Nodwyd T yn y ddau unigolyn yr effeithiwyd arnynt yn exon 4 o 8 o'r genyn ERCC1. Wrth archwilio’r data exome yn y ddau unigolyn yr effeithiwyd arnynt i ddechrau, roedd yn ymddangos bod yr amrywiad hwn mewn cyflwr homosygaidd ond roedd yn bresennol mewn cyflwr heterosygaidd yn y tad ac yn absennol yn y fam, sy’n awgrymu y gellid dileu alel y fam. Mae'r amrywiad missense yn bresennol yng nghronfa ddata gnomAD ar amlder o 0.01 y cant (22 heterosygot, dim homosygotau) ac nid yw wedi'i adrodd yn flaenorol mewn unigolion yr effeithiwyd arnynt. Mae'r amrywiad missense wedi'i adneuo yng nghronfa ddata LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 a http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) a chronfa ddata ClinVar ( amrywiad ID: 978472).

Canfod y dilead gan qPCR

Er mwyn canfod y dilead, echdynnwyd DNA genomig o lymffocytau/celloedd epithelial, a mwyhawyd rhanbarth perthnasol y genyn ERCC1 mewn qPCR. Perfformiwyd qPCR gan ddefnyddio stilwyr a phremwyr penodol (a restrir yn Nhabl S1) a ddyluniwyd gan ddefnyddio'r Universal ProbeLibrary Assay Design Centre (Roche) a'i syntheseiddio gan Sigma-Aldrich. Dyluniwyd y paent preimio i gynnwys y rhanbarth a ddilëwyd yn exon 4 a rhanbarth o fewn y genyn nad yw'n cael ei ddileu fel rheolydd (exon 5). Perfformiwyd qPCR amlblecs gan ddefnyddio cymysgedd adwaith LightCycler R 480 Probes Master (Roche) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr i ymhelaethu a meintioli rhanbarth genynnau ERCC1, gan ddefnyddio'r genyn CFTR (exon 27) fel safon fewnol (Tabl S1). Perfformiwyd y qPCR ar offeryn LightCycler R 480 (Roche), a pherfformiwyd dadansoddiad data gan ddefnyddio fersiwn meddalwedd LightCycler R 480 1.5.0 (Roche). Dilynwyd canllawiau Coleg Geneteg Feddygol America ar gyfer dehongli amrywiad dilyniant.

Canfod yr amrywiad missense trwy ddilyniannu Sanger

Cafodd DNA genomig ei ynysu trwy ail-alw pelenni cell mewn byffer lysate cell gyfan (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0,25 mM MgCl2, {{12} }.1 mg/ml gelatin, 0.45 y cant Tween-20, a 0.45 y cant NP-40) yn cynnwys 0.1 mg/ml Proteinase K (EO0491; ThermoFisher Scientific) ac yn deor ar gyfer 1 h ar 56 gradd ac yna 10-munud anactifadu gwres Proteinase K ar 96 gradd . Roedd darnau o -1 kb dros y treigladau missense wedi'u chwyddo PCR (rhestrir paent preimio dilyniannu yn Nhabl S1) ac yna dilyniannu Sanger gan ddefnyddio naill ai'r preimiwr blaen neu'r cefn.

Llinellau cell

Sefydlwyd llinellau celloedd ffibroblast o fiopsïau croen gan unigolion a rhieni yr effeithiwyd arnynt. Cafodd yr holl linellau cell (a restrir yn nhabl S2) eu meithrin ar 37 gradd mewn awyrgylch o 5 y cant CO2 indium (Thermo Fisher Scientific) wedi'i ategu â phenisilin / streptomycin (Sigma-Aldrich) a 10 y cant FBS (Bodinco BV). Roedd pob llinell gell yn cael ei phrofi'n rheolaidd am haint mycoplasma.

Anfarwoli ffibroblast gyda hTERT

Anfarwolwyd y ffibroblastau WT (48BR) a PV50LD gan niwcleofiad p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) gan ddefnyddio'r Amaxa Nucleofector (rhaglen U23). Roedd pob electro-poration yn cynnwys 400,000 o ffibroblastau a 2.5 µg DNA plasmid. Ar ôl electroporation, cafodd celloedd eu hadu mewn fflasgiau meithrin meinwe 25-cm2 yn cynnwys 5 ml DMEM a 10 y cant FBS. Ar ôl 2 d, disodlwyd y cyfrwng diwylliant â chyfrwng sy'n cynnwys 20 µg/ml neomycin.

/streptomycin (Sigma-Aldrich) a 10 y cant FBS (Bodinco BV). Roedd pob llinell gell yn cael ei phrofi'n rheolaidd am haint mycoplasma.

Plasmid yn adeiladu

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>T treigladau yn ERCC1. Mewnosodwyd y cynnyrch PCR gorgyffwrdd fel darn NheI ac AgeI i gynhyrchu digon-CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus. Mewnosodwyd ERCC1WT ac ERCC1R156W fel darnau NheI ac AgeI i pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 i gynhyrchu pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFP a pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. Defnyddiwyd mutagenesis a gyfeiriwyd at y safle i gyflwyno treigladau pwynt yn pMacro Bac-XPF-ERCC1WT gan ddefnyddio'r pecyn mutagenesis KOD-plus (Toyobo) fel y disgrifir ym mhrotocol y gwneuthurwr, gan ddefnyddio'r pri mers a restrir yn Nhabl S1. Dilyswyd pob dilyniant trwy ddilyniannu Sanger.

Cynhyrchu cell KO

llinellau i gynhyrchu KOs sengl, U2OS(FRT) a chelloedd RPE1-hTERT (PuroR/TP{53-dKO) wedi'u cyd-drawsgludo â pLV-U6g-PPB gan amgodio RNA canllaw o Ganolfan Feddygol Prifysgol Leiden/Sigma -Llyfrgell RNA (sgRNA) un canllaw Aldrich (gweler Tabl S3 am plasmidau a Thabl S4 am ddilyniannau sgRNA) yn targedu genyn theERCC1 ynghyd â fector mynegiant amgodio Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138) gan ddefnyddio Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dewiswyd celloedd U2OS (FRT) wedi'u trawsyrru ar puromycin (1 µg/ml) am 3 d a'u platio ar ddwysedd isel, ac ar ôl hynny cafodd clonau unigol eu hynysu. Cafodd celloedd hTERTcellau RPE a drawsnewidiwyd eu didoli ar BFP/GFP a'u platio ar ddwysedd isel, ac ar ôl hynny cafodd clonau unigol eu hynysu. Dilyswyd clonau KO gan ddadansoddiad blot y Gorllewin. Cadarnhawyd absenoldeb integreiddio Cas9/mynegiant sefydlog gan Western blot.

Cynhyrchu llinellau celloedd sefydlog

Defnyddiwyd clôn ERCC1 KO sengl yn y cefndir U2OS(FRT) (gweler tabl S2) i fynegi ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP, neu GFP-NLS yn sefydlog trwy gyd-drawsnewid pcDNA5-FRT-TO-Puroplasmid gan amgodio'r rhain cDNAs (2 µg), ynghyd â pOG44plasmid amgodio'r ailgyfuniad Flp (0.5 µg). Cafwyd poblogaeth celloedd polyclonaidd ar ôl dethol ar 1 µg/ml puromycin a 4 µg/ml blasticidin S. Ysgogwyd mynegiant o broteinau ERCC1 wedi'u tagio gan GFP neu GFP-NLS drwy ychwanegu 2 µg/ml doxycycline am 24 h.

Cynhyrchu llinellau cell KI

I gynhyrchu KI homosygaidd, cafodd celloedd RPE HTERT eu trin gyntaf am 30 munud gydag atalydd DNA-PK 1 µM (NU7441) i atal atgyweiriad DSB sy'n dueddol o wallau a chynyddu'r defnydd o atgyweiriad sy'n dibynnu ar homoleg. Yn dilyn hynny, cafodd 350,{8}} o gelloedd eu haildynnu mewn byffer niwcleofector 20 µl (V4XP-3032; Lonza) ym mhresenoldeb 4.5 µg plasmid yn cynnwys Cas9 a sgRNA yn targedu'r genyn ERCC1 (gweler Tabl S3 am plasmidau a Thabl Dilyniannau forsgRNA S4) a 100 µM rhoddwr sengl DNA-yn cynnwys y treiglad claf yn ogystal â threigladau mud i ddinistrio'r safle PAM i atal recutting gan Cas9 a threigladau tawel i gyflwyno safle cyfyngiad HindIII i hwyluso sgrinio clonau KI. Cafodd celloedd eu trydanu gan ddefnyddio Uned Niwcleoffector Amaxa 4D-X (Lonza) gan ddefnyddio'r rhaglen EA-104. Yn dilyn electroporation, cafodd celloedd eu platio ar ddwysedd isel mewn cyfrwng McCoy gyda 10 y cant FBS. Y diwrnod wedyn, disodlwyd y cyfrwng gan DMEM (10 y cant FBS ac 1 y cant penisilin / streptomycin), a chaniatawyd i gelloedd ffurfio cytrefi. Cafodd tua 400 o gytrefi eu hynysu a'u hehangu. Cafodd DNA genomig ei ynysu, a chafodd darn yn cynnwys y treiglad a gyflwynwyd a'r safle cyfyngu a gyflwynwyd (HindIII) ei chwyddo gan PCR nythu (gweler Tabl S1 ar gyfer paent preimio). Cafodd darnau PCR eu treulio gyda HindIII (NEB) am 3 h ar 37 gradd ac yna eu gwahanu gan electrofforesis gel. Dadansoddwyd y clonau a oedd â'r safle cyfyngiad HindIII a gyflwynwyd yn ôl dilyniannu Sanger (gweler Tabl S1 ar gyfer paent preimio). Cawsom ddau glon KI homosygaidd ymhlith 400 o glonau ynysig, sy'n cyfateb i effeithlonrwydd KI o ∼0.5 y cant.

Trawsgludiad lentifeirws

ar gyfer trawsgludiad lentifeirol, cafodd mVenus-ERCC1WT neu mVenus ERCC1R156W ei fewnosod i fector lentiviral pLenti-CW57-TO. Trawsnewidiwyd HEK293T gyda fectorau yn amgodio'r ymasiadauERCC1 hyn, VSV-G, RRE, a REV gan ddefnyddio JetPEI (Sigma Aldrich) i gynhyrchu'r firws. Casglwyd yr uwch-natur sy'n cynnwys firws ar ôl 24 awr a'i hidlo â 0.44-µm hidlydd. Trosglwyddwyd ffibroblastau cynradd PV46LD a PV50LD yn lentifeiraidd ym mhresenoldeb polybren (Sigma-Aldrich). Dewiswyd celloedd gyda 15 µg/ml puromycin. Ysgogwyd mynegiant y proteinau ERCC1 â thag mVenus gan ychwanegu doxycycline 2 µg/ml am 24 h.

Profion goroesiad clonogenig

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >Sgoriwyd 20 cell. Perfformiwyd arbrofion goroesi yn ddyblyg a'u hailadrodd o leiaf ddwywaith.

Imiwneddodiad ar gyfer Cyd-IP

Cafodd celloedd eu ffug-drin neu eu harbelydru UV-C (2- J/m2) a'u cynaeafu ar ôl 1 h. Rhoddwyd pelenni celloedd am 20 munud ar rew mewn byffer EBC-150 (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 y cant NP-40, 2 mM MgCl2, ac atalydd proteas coctel [Roche]) wedi'i ategu â 500 U/ml Benzonase Nuclease (Novagen). Deorwyd lysates celloedd am 1.5 h ar 4 gradd gyda gleiniau GFP-Trap A (Chromotek). Yna golchwyd y gleiniau chwe gwaith gyda byffer EBC-150 (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 y cant NP-40, 1 mM EDTA, a choctel atalydd proteas) a'u berwi ynLaemmli-SDS byffer sampl.

Blot gorllewinol

Cafodd celloedd eu nyddu, eu golchi â PBS, a'u berwi am 10 munud mewn byffer Laemmli (40 mM Tris, pH 6.8, 3.35 y cant SDS, 16.5 y cant glyserol, 0.0005 y cant Bromophenol Blue, a 0.05 M dithiothreitol). Gwahanwyd proteinau ar geliau Maen Prawf XT Bis-Tris 4 y cant -12 y cant (# 3450124; Bio-Rad) mewn byffer rhediad NuPAGE MOPS (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) a'u blotio ar bilenni fflworid polyvinylidene (IPFL00010; EMD Millipore ). Cafodd y bilen ei rhwystro gyda byffer blocio (MB-070-003; Rock land) am 1 awr ar dymheredd ystafell. Yna archwiliwyd y bilen â gwrthgyrff (a restrir yn Nhabl S5) fel y nodir. Defnyddiwyd system Odyssey CLx (BIowyddorau LI-COR) ar gyfer canfod.

Assay adfer RNA (RRS)

Cafodd 30,{1}} o gelloedd eu hadu ar 12-mm o blatiau ffynnon mewn 24-blatiau ffynnon yn DMEM gydag 1 y cant FBS. Ar ôl 24 h, cafodd celloedd eu harbelydru â UV-C ar ddogn o 6 J/m2 a'u deor mewn cyfrwng cyflyru am wahanol gyfnodau amser ({{20}} h, 3 h, a 18 h). Yn dilyn deori, labelwyd trawsgrifiadau eginol trwy ddeor y celloedd â 400 µM 5-ethynyl-uridine (CLK-N002-10; Jena Bioscience), a gafodd ei ddelweddu wedyn gyda chymysgedd Click-iT yn cynnwys 50 mM byffer Tris, pH 8.0, 60 µM Atto Azide (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, asid L-ascorbig 10 mM (A0278; Sigma-Aldrich), a 0.1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) am 1 h. Cafodd celloedd eu golchi deirgwaith am 5 munud gyda PBS a'u gosod ar sleidiau microsgop (Thermo Fisher Scientific) gan ddefnyddio Aqua Polymount (Brunschwig).

Immunofluorescence

Ar gyfer staenio imiwnfflworoleuol, cafodd 25{4}},000 o gelloedd eu hadu ar lethrau gwydr 18-mm. Y diwrnod wedyn, cafodd celloedd eu trwsio gyda 4 y cant o baraformaldehyd, ac yna athreiddedd gyda{{10}}.5 y cant Triton X-100 am 10 munud. Cafodd celloedd eu trin â 100 glycin yn PBS am 10 munud i rwystro grwpiau aldehyde heb adweithio, eu rinsio â PBS, a'u cydbwyso mewn byffer golchi (PBS yn cynnwys 0.5 y cant BSA a 0.05 y cant Tween-20; Sigma-Aldrich) am 10 munud. Roedd grisiau a golchiadau gwrthgyrff mewn byffer golchi. Deorwyd y gwrthgyrff cynradd am 2 h ar dymheredd yr ystafell, ac yna gwrthgyrff eilaidd am 1 h a DAPI am 5 munud. Rhestrir gwrthgyrff cynradd ac uwchradd yn NhablS5. Deorwyd celloedd â 0.1 µg/ml DAPI a'u gosod gan ddefnyddio Aqua Polymount.

staenio H2AX

Cafodd 200,{1}} o gelloedd eu hadu ar 18-mm o orchuddion gwydr mewn 24-blatiau ffynnon gyda DMEM (10 y cant FBS ac 1 y cant P/S). Y diwrnod wedyn, cafodd y celloedd eu hamlygu i IR gan gynhyrchydd pelydr-x YXlon International (200 KV, 4 mA; cyfradd dos 2 Gy/min). Ar y pwyntiau amser a nodwyd, gosodwyd celloedd gyda 3 y cant o baraformaldehyd yn PBS am 10 munud a'u staenio ar gyfer H2AX am 1 h (gweler uchod). Cafodd delweddau eu meintoli gan ddefnyddio macro a adeiladwyd yn arbennig yn ImageJ a alluogodd ddadansoddiad awtomatig a gwrthrychol o nifer y ffocws fesul cell, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Typas et al., 2015).

Dadansoddiad microsgopig o gelloedd sefydlog

Cafwyd delweddau o samplau sefydlog ar ficrosgop fflworoleuedd maes eang Zeiss AxioImagerM2 neu D2 gyda 63 × PLAN APO (agorfa rifiadol 1.4 [NA])) amcanion trochi olew (Zeiss) a lamp halid metel HXP 120 a ddefnyddir ar gyfer cyffro. Canfuwyd stilwyr fflwroleuol gan ddefnyddio'r hidlwyr canlynol ar gyfer DAPI (hidlydd cyffro: 350/50 nm; drych deucroig: 400 nm; hidlydd allyriadau: 460/50 nm), Alexa 555 (hidlydd cyffro: 545/25 nm; drych deucroig: 565 nm ; hidlydd allyriadau: 605/70 nm), neu Alexa 647 (hidlydd cyffro: 640/30 nm; drych dichroic: 660 nm; hidlydd allyriadau: 690/50 nm). Recordiwyd delweddau gan ddefnyddio meddalwedd ZEN 2012 a'u dadansoddi yn ImageJ.

Micro-arbelydru laser UV

Tyfwyd celloedd ar slipiau gorchuddio 18-mm cwarts (UV-C) neu wydr (UV-A) a'u gosod mewn siambr magnetig Chamlide CMB lle disodlwyd y cyfrwng twf gan CO2-Independent Leibovitz L{ {4}} cyfrwng (Thermo Fisher Scientific). Gwnaed traciau laser UV-C gan ddefnyddio laser cyflwr solet pwmp deuod 266-mm yttrium Aluminium Garnet (pŵer cyfartalog 5 mW, cyfradd ailadrodd hyd at 10 kHz, a hyd curiad y galon 1 ns). Cyn arbelydru UV-Amicro-arbelydru, roedd celloedd naill ai'n cael eu sensiteiddio â 6 µM trioxsalen am 1 h i gynhyrchu ICLs neu gyda 15 µM BrdU am 24 h i gynhyrchu DSBs. Gwnaed traciau laser UV-A gan laser cyflwr solet pwmp deuod 355-nm Yttrium Aluminium Garnet (pŵer cyfartalog 14 mW a chyfradd ailadrodd hyd at 200 Hz). Cafodd y ddau laser eu hintegreiddio i system UGA-42-Spot Illumination Caliburn/2L (Rapp OptoElectronic).

Cyfunwyd micro-arbelydru â delweddu celloedd byw mewn siambr amgylcheddol wedi'i gosod i 37 gradd ar ficrosgop fflworoleuedd maes eang chwarts Zeiss Axio Observer 7, gan ddefnyddio amcan trochi glyserol ultrafilter 100 × (1.2NA) (UV-C). ) neu amcan trochi olew Cynllun-Neofluar 63 × (1.25 NA) (UV-A). Mae'r system laser yn cael ei chyplysu â'r microsgop trwy TriggerBox, ac mae hidlydd dwysedd niwtral (ND-1) yn blocio 90 y cant o'r golau laser. AnHXP 120-Defnyddiwyd lamp halid metel V ar gyfer cyffro. Cafwyd delweddau yn Zeiss ZEN a'u meintioli yn ImageJ.

Assay torri cromosomau

Cafodd 2 × 1{{20}}6 ffibroblasts eu hadu mewn fflasgiau meithrin meinwe 175-cm2 gyda DMEM (10 y cant FBS) a'u meithrin ar 37 gradd ym mhresenoldeb neu absenoldeb 50 nM MMC. Ar ôl 48 h, ychwanegwyd 600 µl o ddemecolcine (10 µg/µl) at bob fflasg feithrin, a deorwyd celloedd am 30 munud ychwanegol ar 37 gradd i gyfoethogi ar gyfer trosiadau. Yna cafodd celloedd eu trypsineiddio a'u hailddarparu mewn 75 mM KCL a'u deor am 20 munud ar dymheredd ystafell. Cafodd y celloedd eu nyddu i lawr, eu hailddarparu mewn gosodiad 10 ml (75 y cant methanol a 25 y cant asid asetig), eu deor am 30 munud ar dymheredd yr ystafell, a'u centrifugio. Cafodd pelenni eu hailddarparu mewn 10 ml o sefydlyn a'u deor am 5 munud ar dymheredd ystafell. Ailadroddwyd y cam hwn, ac yn olaf, ail-ddarlledwyd y belen mewn gosodiad 0.5-1.0 ml. Gollyngwyd ataliad y gell ar sleid a'i ganiatáu i sychu. Cafodd sleidiau eu staenio am 5 munud mewn hydoddiant Giemsa 3 y cant, eu rinsio mewn dŵr tap, a'u caniatáu i sychu. Cafodd sleidiau eu codio, ac o bob diwylliant wedi'i godio, archwiliwyd 50 metaffas am ddifrod cromosomaidd. Ar ôl sgorio, cafodd y sleidiau eu datgodio, a dadansoddwyd y canlyniadau fel y'u cyflwynwyd (Stoepker et al., 2011).

UDS

Cafodd 180,{1}} o gelloedd eu hadu ar 18-mm o blatiau ffynnon mewn 12-blatiau ffynnon yn DMEM gydag 1 y cant FBS. Ar ôl 24 h, cafodd celloedd eu harbelydru'n lleol trwy hidlydd 5-µm gyda 30 J/m2 UV-C. Yn dilyn hynny, cafodd celloedd eu labelu curiad y galon gyda 20 µM EdU (VWR) ac 1 µM5-fflworo-deoxyuridine (Sigma-Aldrich) am naill ai 1 awr neu 4 h. Ar ôl labelu, aethpwyd ar drywydd celloedd canolig gyda thymidin 10 µM mewn DMEM heb atchwanegiadau am 30 munud a'u gosod am 15 munud gyda 3.7 y cant o fformaldehyd yn PBS. Cafodd celloedd eu treiddio am 20 munud yn PBS gyda 0.5 y cant Triton-X100 a'u rhwystro mewn 3 y cant BSA (Thermo Fisher Scientific) yn PBS. Cyplyswyd yr EdU corfforedig ag Attoazide Alexa Fluor 647 gan ddefnyddio cemeg Click-iT yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Invitrogen). Ar ôl cyplu, cafodd y celloedd eu gosod yn ôl gyda 2 y cant o fformaldehyd am 10 munud ac yna eu rhwystro â glycin 100 mM. Cafodd DNA ei ddadnatureiddio gyda 0.5 M NaOH am 5 munud, ac yna blocio gyda 10 y cant BSA am 15 munud. Nesaf, deorwyd y celloedd â gwrthgorff yn erbyn dimers pyrimidine cyclobutane (gweler Tabl S5) am 2 h, ac yna gwrthgyrff eilaidd am 1 h, a DAPI am 5 munud. Gosodwyd celloedd yn Polymount (Brunschwig).

Caffael data MS

Perfformiwyd MS yn y bôn fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Salas Lloret et al., 2019). Perfformiwyd yr holl arbrofion ar system EASY-nLC 1{000 (Proxeon) wedi'i gysylltu â Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) trwy ffynhonnell ïon nano-electrochwistrellu. Cyplyswyd y Q-Exactive ag allyrrydd silica 25-cm (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) yn fewnol yn llawn â gleiniau 1.9 µm C{18-AQ (Reprospher -DE;Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, Germany). Cafodd samplau eu rhedeg mewn graddiant cromatograffaeth 40-munud o 0 y cant i 30 y cant acetonitrile ac yna'n cynyddu i 95 y cant acetonitrile cyn ail-gydbwysedd colofn gyda chyfradd llif o 200 NL/mun. Gweithredwyd y sbectromedr màs mewn modd caffael sy'n dibynnu ar ddata gyda dull saith uchaf ac ystod sgan o 300–1,600 m/z. Cafwyd sbectra MS llawn-sgan ar werth targed o 3 × 106 a chydraniad o 70,000, a chofnodwyd y sbectra màs tandem daduniad gwrthdrawiadol uwch (MS/MS) ar werth targed o 105, a gyda phenderfyniad o 35,000, ffenestr ynysu o 2.2 m/z, ac egni gwrthdrawiad normaleiddio o 25 y cant. Y targed rheoli ennill awtomatig lleiaf oedd 104. Uchafswm yr amseroedd pigiad MS1 a MS2 oedd 250 a 120 ms, yn y drefn honno. Cafodd masau ïon rhagflaenol ïonau wedi'u sganio eu heithrio'n ddeinamig o ddadansoddiad MS/MS am 30 s. Cafodd ïonau â gwefr 1 ac uwch na 6 eu heithrio rhag sbarduno dadansoddiad MS2.

Dadansoddi data MS Dadansoddwyd yr holl ddata crai gan ddefnyddio MaxQuant (fersiwn 1.6.6.0) fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Tyanova et al., 2016a). Cynhaliwyd y chwiliad yn erbyn proteome cyfeirio UniProt mewn silico ar gyfer Homo sapiens, gan gynnwys dilyniannau canonaidd ac isoform (Mai 27, 2{{0}19). Perfformiwyd chwiliadau cronfa ddata yn unol â gosodiadau safonol gyda'r addasiadau canlynol. Defnyddiwyd treuliad gyda Trypsin/P, gan ganiatáu pedwar holltiad a fethwyd. Caniatawyd ocsidiad (M) ac asetyl (protein N-term) fel addasiadau amrywiol gydag uchafswm o dri. Roedd carbamido-methyl (C) yn anabl fel addasiad sefydlog. Galluogwyd meintioli di-label (LFQ), heb ganiatáu LFQ Cyflym. Proseswyd data allbwn Max-Quant ymhellach gan ddefnyddio platfform cyfrifiannol Perseus (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b). Trawsnewidiwyd gwerthoedd dwyster LFQ log2, a dilëwyd halogion posibl a phroteinau a nodwyd yn ôl safle yn unig neu beptidau gwrthdro. Cafodd samplau eu grwpio mewn categorïau arbrofol, a chafodd proteinau nas nodwyd mewn pedwar o bob pedwar atgynhyrchiad mewn o leiaf un grŵp eu dileu hefyd. Cyfrifwyd gwerthoedd coll gan ddefnyddio gwerthoedd a ddosberthir yn normal gyda symudiad i lawr o 1.8 (log2) a lled 0.3 ar hap (log2) gan ystyried gwerthoedd matrics cyfan. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol (profion t) i bennu pa broteinau a gyfoethogwyd yn sylweddol. Cynhyrchwyd plotiau llosgfynydd, a phroseswyd tablau allbwn dadansoddi ystadegol ymhellach yn Microsoft Excel. Mae’r data proteomeg MS wedi’u hadneuo i’r ProteomeXchange Consortium trwy ystorfa bartner PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) gyda’r dynodwr set ddata PXD017940.

Puro ERCC ailgyfunol1-XPF

Perfformiwyd cynhyrchu bacwlofirws fel y disgrifiwyd gan ddefnyddio lluniadau pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA (Enzlin a Sch¨ arer, 2002). Cafodd ERCC1WT ac ERCC1R156W eu cyd-gyfleu ag XPFWT o bacwlovirws sengl mewn celloedd pryfed Sf9. Cafodd yr heterodimerau eu puro dros affinedd nicel, eithrio maint, a chromatograffeg heparin fel y disgrifiwyd (Enzlin a Sch¨ arer, 2002). Cafodd ERCC1-XPF ei hepgor o'r golofn heparin ar tua 600 mM NaCl. Roedd crynodiadau protein yn amrywio o 0.1 i 0.2 mg / ml.

Assay niwclear

Aneliwyd swbstrad dolen bonyn (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC)yn cynnwys llifyn fflwroleuol Cy5 (50 pmol) ar 39 termini (IDT) mewn byffer anelio 100-µl (10 mM Tris, pH 7.5, a 50 mM NaCl) trwy wresogi ar 95 gradd am 5 munud ac oeri'n araf dros gyfnod o 2 h. Defnyddiwyd 200 fmol o swbstrad anelio mewn 20-µl adweithiau sy'n cynnwys 25 mM HEPES, pH8.0, 2 mM MgCl2, glyserol 10 y cant, 0.5 mM -mercaptoethanol, 0.1mg/ml BSA, 40 mM NaCl, a 0–40 nM o brotein. Deorwyd yr adweithiau ar 30 gradd am 30 munud a'u hatal trwy ychwanegu 10 µl90 y cant formamide / 10 mM EDTA. Ar ôl gwresogi ar 95 gradd am 5 munud ac oeri ar rew, llwythwyd 15 µl o bob sampl ar gel polyacrylamid dadnatureiddio 15 y cant. Roedd geliau'n cael eu rhedeg ar 30 mA am 30 munud a chafodd bandiau eu delweddu gan fflworoleuedd gan Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

Assay NER in vitro

Cynhyrchwyd echdynion celloedd diffygiol XPF (XP2YO) a'r plasmid sy'n cynnwys anaf dG-AAF safle-benodol fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999) . Ar gyfer pob adwaith, 2 µl o glustog atgyweirio (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM phosphocreatine, a 1.8 mg / ml BSA, pH terfynol 7.8), 0.2 µl byffer creatine phosphokinase (2.5 mg / ml creatine phosphokinase o gyhyr cwningen [Sigma Aldrich], glycin 10 mM, pH 9.0, a 50 y cant glyserol), 3 µl o gell diffygiol XPF echdyniad, NaCl (i grynodiad terfynol o 70 mM), a phroteinau XPF ERCC wedi'u puro mewn cyfanswm cyfaint o 9 µl eu cynhesu ymlaen llaw ar 30 gradd am 10 munud. Ychwanegwyd 1 µl plasmid yn cynnwys dG-AAF (50 ng/µl) at bob adwaith, a deorwyd yr adweithiau ar 30 gradd am 45 munud. Yna cafodd cymysgedd yr adwaith ei oeri ar rew am 5 munud, ac yna ychwanegu 0.5 µl llinyn cyflenwol 1 µM d (GGGGCATGTGGCCGGTATAGC TACGTAGCTC), a dadnaturiwyd y cymysgedd adwaith trwy wresogi ar 95 gradd am 5 munud. Yn dilyn 15 munud o anelio ar dymheredd ystafell, ychwanegwyd cymysgedd dilyniant 1 µl (yn cynnwys 0.13 U o ddilyniant a 2.0 µCi [ -32P] dCTP ar gyfer pob adwaith). Ar ôl predeori ar 37 gradd am 3 munud, ychwanegwyd cymysgedd triffosffad deoxyribonucleotide 1.2 µl (50 µM dCTP, 100 µM dTTP, 100 µM dATP, a 100 µM dGTP). Deorwyd cymysgedd yr adwaith ar 37 gradd am 12 munud, a stopiwyd yr adwaith trwy ychwanegu llifyn llwytho 8 µl (80 y cant o formamid a 10 mM EDTA). Cynheswyd samplau ar 95 gradd am 5 munud, eu hoeri ar rew, a'u llwytho ar gel polyacrylamid dadnatureiddio 14 y cant. Cafodd geliau eu rhedeg ar 45 W am 2.5 h a delweddwyd bandiau gan ddefnyddio PhosphorImager (Typhoon RGB).

Deunydd atodol ar-lein

Mae Ffig. S1 yn dangos gwerthoedd labordy swyddogaethau'r iau a'r arennau yn brawd neu chwaer 1 a brawd neu chwaer 2. Mae Ffig. S2 yn dangos data dilyniannu genomig sy'n cadarnhau'r treiglad missense a'r dilead mewngenig yn y genyn ERCC1. Mae Ffig. S3 yn dangos mynegiant protein ERCC1 ac XPF mewn ffibroblastau cleifion. Mae Ffig. S4 yn dangos proteinau ERCC1 ac XPF ailgyfunol puredig a Co-IP o ERCC1WT ac ERCC1R156W. Mae Ffig. S5 yn dangos delweddau microsgopeg o UDS, y ffocysau H2AX, a lleoliad treigladau cleifion yn ERCC1-XPF. Mae Tabl S1 yn cynnwys dilyniannau'r holl preimwyr a stilwyr a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon. Mae Tabl S2 yn rhestru'r holl linellau cell a brofwyd yn yr astudiaeth hon. Mae Tabl S3 yn rhestru'r holl plasmidau a gymerodd ran yn yr astudiaeth hon. Mae Tabl S4 yn darparu dilyniannau sgRNA yr astudiaeth ac mae Tabl S5 yn dangos y gwrthgyrff. Mae Tabl S6 yn rhoi nifer y celloedd a ddefnyddiwyd ar gyfer meintioli yn y ffigurau. Mae Data S1 yn dangos yr holl ffeiliau blotiau Gorllewinol heb eu torri.

Diolchiadau

Mae'r awduron yn cydnabod brodyr a chwiorydd a'u rhieni am gyfrannu at y papur hwn, Sylvie Noordermeer (Canolfan Feddygol Prifysgol Leiden [LUMC], Leiden, yr Iseldiroedd) am fector mynegiant lentifeirws thepLenti-CW57-TO-GFP a chyngor ar gynhyrchu KI celloedd, Joachim Goedhart (Prifysgol Amsterdam, Amsterdam, yr Iseldiroedd) ar gyfer y mVenus cDNA, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, yr Iseldiroedd) ar gyfer yr atalydd DNA-PK, Wim Vermeulen ac Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, yr Iseldiroedd) am ddarparu Celloedd 165TOR, Tomoo Ogi (Prifysgol Nagoya, Japan) ar gyfer darparu celloedd CS20LO, Alan Lehman (Prifysgol Sussex, y DU) am ddarparu celloedd hTERT CSL16NG a CSL16NG, a Joost Schimmel (LUMC, Leiden, yr Iseldiroedd) am gyngor ar gynhyrchu celloedd KI .

Ariannwyd y gwaith hwn gan Gymrodoriaeth Ymchwil Canolfan Feddygol Prifysgol Leiden a Sefydliad Nederlandse voor Rydym yn tenschappelijk Onderzoek VIDI grant (ALW.016.161.320) i MSLuijsterburg, grant cychwynnol Cyngor Ymchwil Ewropeaidd (310913) i ACO Vertegaal, grant KWFIn YoungKankerbestriator sy'n dyfarnu 11367) i R. Gonz’alez-Prieto, grant kerbestrijding KWF Kan (VU 2013-5983) i MA Rooimans, a grantiau gan Sefydliad Corea ar gyfer Gwyddoniaeth Sylfaenol (IBS-R022-A1)a’r Genedlaethol Sefydliad Canser (P01CA092584) i ODSch arer.

Cyfraniadau Awdur: K. Apelt cynhyrchu celloedd KO, celloedd KI, a llinellau cell sefydlog; perfformio blot Gorllewinol a immunostainings ar gyfer mynegiant ERCC1 a XPF, trosglwyddiadau lentifeirws, goroesiad clonogenig (UV, MMC, IR), arbrofion Cyd-IP ar gyfer dadansoddi blotiau Gorllewinol, arbrofion UDS, arbrofion Co-IP ar gyfer MS, a staeniau H2AX; ac ysgrifennodd y papur. A. Kragten performUDS, RRS, a immunostainings ar ôl UV lleol. Cynhyrchodd AP Wonder gem gelloedd KO a KI a pherfformio arbrofion UDS, Western blot, a dilyniannu Sanger i gadarnhau'r treiglad missense. Darparodd SM White gwnsela i'r cleifion, dadansoddi data exome, perfformio biopsïau, cynhyrchu ffibroblastau cynradd, ac ysgrifennodd y disgrifiad claf clinigol. Cynhyrchodd S. Lunke a BT Wilson ddata NGS. Perfformiodd S. Pantaleoand D. Flanagan qPCR i ddilysu'r dileu. Ysgrifennodd C.Quinlan y disgrifiad clinigol o'r aren. Ysgrifennodd W. Hardikar y disgrifiad clinigol o'r afu. Cynhyrchodd MA Rooimans acR.MF Wolthuis ffibroblastau 48BR a PV50LD a anfarwolwyd gan hTERT a chyflawnodd y profion torri cromosom a ysgogwyd gan MMC. Dadansoddodd R. Gonzalez-Prieto ac ACO Vertegaal yr holl arbrofion MS. Perfformiodd WW Wiegant a H. vanadium oroesiadau clonogenig mewn celloedd U2OS (IR). Bu J.-E.Yeo a HS Kim yn puro proteinau ailgyfunol ac yn perfformio'r assay niwcleas a'r profion NER in vitro. Cyfrannodd OD Sch¨arers¨arolygydd gwaith NER in vitro at ddehongliad strwythurol yr alel R156W a golygodd y papur. Goruchwyliodd MS Luij sterburg y prosiect ac ysgrifennodd y papur.

Cyfeiriadau

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky, a SM Elsayed. 2011. Colestasis mewn cleifion â syndrom Cockayne ac awgrymwyd meini prawf addasedig ar gyfer diagnosis clinigol. OrphanetJ. Dis Prin. 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown, a PJ McHugh. 2017. Mae RPA yn actifadu'r endonuclease XPF-ERCC1 i gychwyn prosesu croesgysylltiadau rhynglinol DNA. EMBO J. 36: 2047–2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson, ac RS Nairn. 2000. Rôl ERCC1 wrth gael gwared ar gynffonau hir nad ydynt yn homologaidd yn ystod ailgyfuno homologaidd wedi'i dargedu. EMBO J. 19:5552–5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers, ac LJ Niedernhofer. 2008. ERCC1-Mae endonuclease XPF yn hwyluso atgyweirio toriad llinyn dwbl DNA. Mol. Cell. Biol. 28:5082–5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers, et al. 2010. Mae camleoli cnewyllyn XPF-ERCC1 yn cyfrannu at lai o atgyweirio DNA mewn cleifion XP-F. PLoS Genet. 6:e1000871.

Auerbach, OC 2009. Fanconi anemia a'i ddiagnosis. Mutat. Res. 668:4-10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa, a N. Tebib. 2017. Ymwneud Arennol mewn 2 Brodyr a Chwiorydd â Syndrom Cockayne. Iran. J. Arennau Dis. 11:253-255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski, ac RD Wood. 1993. Cyd-gywiro'r ERCC1, ERCC4, a xeroderma pigmentosum grŵp F namau atgyweirio DNA in vitro. EMBO J. 12:3685–3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol , et al. 2013. Mae treigladau yn ERCC4, sy'n amgodio'r endonuclease XPF â thrwsio DNA, yn achosi anemia Fanconi. Yn. J. Hum. Genet. 92:800-806.

Ceccaldi, R., P. Sarangi, ac AD D'Andrea. 2016. Llwybr anemia Fanconi: chwaraewyr newydd a swyddogaethau newydd. Nat. Parch Mol. Cell Biol. 17:337–349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers, a JH Hoeijmakers. 1998a. Elfennau adeileddol DNA sydd eu hangen ar gyfer gweithgaredd endonuclease ERCC1-XPF. J. Biol. Cemeg. 273:7835-7842.

de Laat, WL, AC Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers, a JH Hoeijmakers. 1998b. Mapio parthau rhyngweithio rhwng proteinau atgyweirio dynol ERCC1 ac XPF. Asidau Niwcleig Res. 26:4146–4152.

nar/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg, a SJ Verbeek. 1995. Mwy o dueddiad i uwchfioled-B a charsinogenau llygod heb y genyn atgyweirio toriad DNA XPA. Natur. 377:169–173.

DiGiovanna, JJ, a KH Kraemer. 2012. Tywynnu golau ar xeroderma pigmentosum. J. Buddsoddi. Dermatol. 132:785-796.

Enzlin, JH, ac OD Schrer. 2002. Mae safle gweithredol yr endonuclease XPF-ERCC1 atgyweirio DNA yn ffurfio motiff niwcleas tra chadw. EMBO J. 21:2045–2053.

Funaki, S., S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada, a H. Kitamura. 2006. Syndrom Cockayne gyda neffritis tubulointerstitial acíwt rheolaidd. Pathol. Int. 56:678-682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer, ac OD Schrer. 2005. Ymgorffori N- (deoxyguanosine-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) yn benodol i oligonucleotidau gan ddefnyddio synthesis DNA 'uwch-ysgafn' wedi'i addasu. Asidau Niwcleig Res. 33: 1961-1969.

Gregg, SQ, AR Robinson, ac LJ Niedernhofer. 2011. Canlyniadau ffisiolegol diffygion yn ERCC1-trwsio endonuclease DNA XPF. Atgyweirio DNA (Amst.). 10:781-791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama, et al. 2015. Mae diffyg XRCC4 mewn pynciau dynol yn achosi ffenoteip niwrolegol amlwg ond dim diffyg imiwnedd amlwg. J. Alergedd Clin. Imiwnol. 136:1007–1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker, et al. 2020. Mae colli ZBTB24 yn amharu ar ailgyfuno diwedd unhomologaidd ac ailgyfuniad newid dosbarth mewn cleifion â syndrom ICF. J. Exp. Med. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeij- makers, a W. Vermeulen. 1999. Gweithred atgyweirio DNA endonuclease ERCC1/XPF mewn celloedd byw. Gwyddoniaeth. 284:958-961. h

gwyddoniaeth.284.5416.958

Jaspers, N.G., A. Raams, M.C. Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, W. J. Kleijer, J. H. Hoeij- makers, a W. Vermeulen. 2007. Mae gan y claf cyntaf yr adroddwyd amdano â diffyg ERCC1 dynol syndrom Cerebro-ocwlofacio-sgerbydol gyda diffyg ysgafn mewn atgyweirio toriad niwcleotid a methiant datblygiadol difrifol. Yn. J. Hum. Genet. 80:457–466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald, ac F. Arwert. 1997. Tystiolaeth ar gyfer o leiaf wyth o enynnau Fanconi anemia. Yn. J. Hum. Genet. 61:940-944.

Jones, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Iarll, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch, ac NQ McDonald. 2020. Mae strwythurau Cryo-EM yr endonuclease XPF-ERCC1 yn datgelu sut mae ymgysylltiad cyffordd DNA yn amharu ar gydffurfiad awto-ataliedig. Nat. Cymmun. 11:1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau, a VA Bohr. 2017. Syndrom Cockayne: Nodweddion clinigol, systemau model, a llwybrau. Heneiddio Res. Dat. 33:3-17.002

Kashiyama, K., Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr, et al. 2013. Mae camweithio niwclease ERCC1-XPF yn arwain at amlygiadau clinigol amrywiol ac yn achosi syndrom Cockayne, xeroderma pigmentosum, ac anemia Fanconi. Yn. J. Hum. Genet. 92:807-819.