RHANⅠ: Effeithiau A Mecanwaith Moleciwlaidd Asid Pachymig Ar Anaf Atgyfnerthu Isgemia Arennol
Mar 25, 2022
Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO, L-LI HUANG, XU-JIAZENG & XIAO-HUI LIAO
Rhagymadrodd
Anaf acíwt i'r arennau (AKI)yn glefyd clinigol cyffredin a achosir gan etiolegau lluosog ac sydd â phroses pathoffisiolegol gymhleth(1). Mae'r cyfraddau morbidrwydd a marwolaethau ar gyfer AKI yn uchel ymhlith oedolion a phlant, gan arwain at gostau ysbyty sylweddol (2,3). Roedd meta-ddadansoddiad o nifer yr achosion byd-eang o gyfraddau mynychder AKI a ddatgelwyd yn 21.6 y cant mewn oedolion a 33.7 y cant mewn plant ac roedd cyfraddau marwolaethau sy'n gysylltiedig ag AKI yn 23.9 y cant mewn oedolion a 13.8 y cant mewn plant (4). Mae AKI yn digwydd mewn ~20 y cant o gleifion mewn ysbytai, y mae angen therapi amnewid arennol ar 10 y cant ohonynt, ac mewn cymaint â 50 y cant o gleifion mewn unedau gofal dwys, gan gynyddu'n sylweddol hyd a chost mynd i'r ysbyty (5). gostyngiad sydyn yn y gyfradd hidlo glomerwlaidd yn y tymor byr, ynghyd â chynnydd mewn creatinin serwm, oliguria, neu'r ddau; gall y newidiadau hyn arwain at glefyd cronig yn yr arennau neu afiechyd arennol cyfnod olaf(6). Oherwydd amrywioldeb anafiadau arennol, diffyg biofarcwyr cynnar dibynadwy, a heterogenedd y llwybrau sy'n ymwneud â phathoffisioleg, ar hyn o bryd nid oes unrhyw ddulliau atal ac ymyrryd effeithiol ac eithrio triniaeth geidwadol a therapi amnewid arennol(7). Felly, mae nodi trefnau triniaeth a chyffuriau newydd ar gyfer AKI yn arbennig o bwysig. Mae'r degawd diwethaf wedi gweld cyfoeth o ymchwil yn ehangu'r farn draddodiadol o necrosis. Mae ymchwil diweddar wedi herio safbwyntiau traddodiadol am farwolaeth celloedd trwy nodi llwybrau newydd lle mae celloedd yn marw mewn modd rheoledig, ond yn arddangos nodweddion morffolegol necrosis(7-9). Mae'r necrosis rheoledig hwn ar sawl ffurf: Necroptosis, ferroptosis, pyroptosis, necrosis athreiddedd mitocondriaidd a yrrir gan drawsnewid, a parthanatos(10). Necroptosis a ferroptosis yw'r ffurfiau o necrosis rheoledig sy'n cael eu hastudio fwyaf yn yr aren(11). Dangosodd astudiaeth flaenorol fod atal ferroptosis yn effeithiol yn lleddfu AKI (12).
cistanche pharma specialcanysaren
Mae Ferroptosis yn fath newydd o farwolaeth celloedd rheoleiddiol, a gynigiwyd gyntaf gan Dixon et al yn 2012(13). Mae'r math hwn o farwolaeth celloedd yn ddibynnol ar haearn ac yn cyd-fynd â hyn mae crynhoad haearn enfawr a pherocsidiad lipid yn ystod marwolaeth celloedd(13). Mae ferroptosis yn chwarae rhan reoleiddiol bwysig yn nigwyddiad a datblygiad nifer o afiechydon, gan gynnwys tiwmorau, afiechydon niwrolegol, ac AKI(14). Mewn astudiaeth in vivo, gweinyddwyd ferrostatin 1 neu 16-86 15 munud cyn isgemia mewn llygod â difrifolanaf isgemia-atlif(IRI) -AKI, a difrod meinwe arennol, creatinin serwm, ac wrea i gyd wedi gostwng yn y llygod 48 h ar ôl isgemia, gan awgrymu bod gan ferroptosis rôl hanfodol yn pathogenesis IRI (anaf isgemia-atlif)(15). Felly, gall rheoleiddio homeostasis haearn, gwrthsefyll perocsidiad lipid, ac atal ferroptosis ddarparu strategaeth therapiwtig addawol ar gyfer AKI.
Asid pachydermig(PA), triterpenoid tebyg i lanostane o Poria cocos, yn cael nifer o effeithiau ffarmacolegol, megis antitumor, gwrthlidiol, gwrthocsidiol, hypoglycemig, tawelydd, a gweithgareddau hypnotig (16-20).(Asid pachymic)yn gallu gwella anaf arennol yn ystod sepsis mewn llygod mawr trwy atal ymatebion llidiol ac actifadu'r llwybr ffactor niwclear sy'n deillio o erythroid 2 fel 2 (NRF2) / heme oxygenase 1 (HO-1) trwy straen gwrthocsidiol (21). Yn ogystal, mae asid Poricoig A yn gwella ataliad melatonin yn effeithiol wrth drosglwyddo o AKI i glefyd cronig yn yr arennau yn dilyn anaf arennol isgemia / atlifiad (22). PA(Asid pachymic)yn amddiffyn rhag AKI, fodd bynnag, mae angen ymchwilio ymhellach i'r mecanwaith amddiffynnol hwn. PA(Asid pachymic)adroddwyd ei fod yn actifadu NRF2 mewn astudiaeth o anaf arennol mewn sepsis(21). Yn nodedig, mae'r ddau gyfrwng ysgogi ferroptosis cyntaf (RSL-3 ac elastin) a nodwyd mewn astudiaethau ferroptosis yn cychwyn y rhaeadru ferroptosis trwy atal glutathione peroxidase 4 (GPX4) a'r system cludo cystin / glwtamad (xC-/xCT), yn y drefn honno, y ddau ohonynt yn dargedau i lawr yr afon o NRF2 (23). PA(Asid pachymic)rhagdybir ei fod yn rheoleiddio ei broteinau i lawr yr afon, GPX4, a xCT trwy actifadu NRF2 ac ymyrryd â ferroptosis yn AKI. Nod yr astudiaeth bresennol oedd ymchwilio i effaith PA(Asid pachymic)ar ferroptosis mewn llygod ag anaf i'r arennau isgemia-atlifiad a phennu ei fecanwaith gweithredu moleciwlaidd gwaelodol i ddarparu syniadau newydd ar gyfer trin AKI clinigol.
Defnyddiau a dulliau
Adweithyddion ac anifeiliaid.
PA(Asid pachymic)(powdr crisialog gwyn gyda phurdeb Yn fwy na neu'n hafal i 99.9 y cant ) gan MedChemExpress (cat.no.HY-N0371) a'i storio i ffwrdd o olau yn 4C. Prynwyd cyfanswm o 30 C57BL/6 o lygod gwrywaidd (8-10 wythnos;20-25g pwysau corff) gan Brifysgol Feddygol Chongqing (Chongqing, Tsieina). Roedd amodau'r tai fel a ganlyn: 12 h golau / 12 h tywyll, ~ lleithder 60 y cant, 25 gradd, mynediad am ddim i ddŵr yfed a bwyd, ac ailosod dillad gwely bob 3 diwrnod; diheintiwyd y dŵr yfed a'r deunyddiau gwely cyn eu defnyddio. Cynhaliwyd pob arbrawf ar anifeiliaid yn unol â'r Canllaw ar Ofalu a Defnyddio Anifeiliaid Labordy, a gyhoeddwyd gan y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol ym 1996(24). Cymeradwywyd yr astudiaeth bresennol gan Bwyllgor Sefydliadol Gofal a Defnydd Anifeiliaid Prifysgol Feddygol Chongqing (Chongqing, Tsieina; rhif cymeradwyo2018-019).
Anafiad isgemia-atlif-AKI model.
Cafodd llygod eu bwydo o dan yr un amodau am 1 wythnos i gynhyrchu'r model arennolanaf isgemia-atlif, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (25). Anestheteiddiwyd y llygod â 50-60 mg/kg o sodiwm pentobarbital (cat.no. P3761; Sigma-Aldrich; Merck KGaA)drwy chwistrelliad mewnperitoneol; cafodd y croen yn yr ardal lawfeddygol ei sychu gyda 70 y cant o alcohol. Roedd y toriad wedi'i leoli ar ochr chwith a dde'r asgwrn cefn (0.5 cm), a hyd y toriad oedd 1-1.5 cm ar hyd y cefn. Yn dilyn hynny, tynnwyd yr arennau allan o'r toriad i ddatgelu'r pedicle arennol. Defnyddiwyd clip microaniwrysm i glampio'r pedicle i rwystro llif y gwaed i'r aren ac achosi isgemia arennol. Isgemia cyflawn fel y nodir gan newid yn lliw yr aren o goch i borffor tywyll o fewn ychydig eiliadau. Ar ôl 40 munud o isgemia, rhyddhawyd y clipiau microaniwrysm i ganiatáu i bob aren ddechrau atlifiad, a nodwyd gan newid lliw yr arennau i goch. Cafodd croen y cyhyr ei bwytho ar ôl i liw'r aren ddychwelyd i normal. Cwblhawyd y weithdrefn isgemia arennol gyfan ar bad thermostatig, a chadwyd tymheredd corff y llygod yn gyson ar 36.50-60 gradd . Rhoddwyd cyfanswm o 0.8 ml o halwynog di-haint cynnes yn fewnberitoneol i bob llygoden. Rhoddwyd pob anifail ar bad gwresogi nes iddo adennill ymwybyddiaeth lawn a'i ddychwelyd wedyn i'w gawell. Aberthwyd y llygod trwy ddadleoliad ceg y groth 24 awr ar ôl llawdriniaeth, a chasglwyd y gwaed o'r sinws orbitol. Defnyddiwyd traean o'r meinwe arennol ar gyfer dadansoddiadau histopatholegol, a chafodd y ddwy ran o dair arall eu storio'n gyflym ar -80 gradd gradd .
Grwpiau anifeiliaid.
Rhannwyd llygod C57BL/6 yn bum grŵp (n=6/group) yn ôl tabl rhif ar hap, fel a ganlyn: Grŵp Sham (Sham), grŵp model (IRI), grŵp dos isel (IRI a PA)) , grŵp dos cymedrol (IRI ynghyd â PAw), a grŵp dos uchel (IRI ynghyd â PAg). Derbyniodd anifeiliaid yn y tri grŵp triniaeth arbrofol chwistrelliad mewnperitoneol gyda PA(Asid pachymic)ar ddognau o 5, 10, ac 20 mg / kg. ond am 3 diwrnod, cyn i'r model gael ei ysgogi. Y ffug a'r IRI(anaf isgemia-atlif) chwistrellwyd grwpiau gyda'r un cyfaint o dimethyl sulfoxide am 3 diwrnod cyn sefydlu'r model. Perfformiwyd y dull modelu fel y disgrifiwyd yn flaenorol (25). Cafodd pedicels arennol dwyochrog y llygod yn y grŵp ffug eu hamlygu a'u trin fel y crybwyllwyd uchod, ond ni chawsant eu clampio. Cafodd y toriad llawfeddygol ei bwytho ar ôl 40 munud.
Dadansoddiad biocemegol serwm.
Cafodd y llygod eu haberthu 24 h ar ôl llawdriniaeth, a 0.8-1 ml o waed yn cael ei gasglu o'r sinws orbitol, gadael iddo orffwys am 30 munud, a'i allgyrchu ar 900xg am 10 munud ar 4C. Cafodd yr haen serwm uchaf ei chasglu, ei phacio a'i storio ar -80 gradd . Aseswyd creatinin serwm (Scr; cat.no.c011-2-1)a nitrogen wrea gwaed (BUN: cat.no.cO13-2-1) gan ddefnyddio citiau adweithydd, yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng). ).
Archwiliad histopatholegol.
Ar 24 h ar ôl IRI(anaf isgemia-atlif), roedd darnau o feinwe'r arennau wedi'u gosod mewn fformalin â byffer niwtral o 10 y cant ar gyfer 24-48 h ar dymheredd ystafell, wedi'i brosesu'n rheolaidd trwy fewnosod paraffin. Cafodd y sbesimenau meinwe sefydlog paraffin eu sleisio'n adrannau 4 μm o drwch, a gafodd eu gosod ar sleidiau gwydr a'u staenio â hematoxylin am 10 munud ar dymheredd ystafell ac eosin am 3 munud ar dymheredd ystafell. Defnyddiwyd microsgop golau BX51 (Olympus Corporation) i ganfod y newidiadau histopatholegol arennol (chwyddiad, x200, a x400). Defnyddiwyd sgôr Paller i raddio necrosis tiwbaidd arennol mewn IRI arennol(anaf isgemia-atlif)(26). Dewiswyd cyfanswm o 10 ardal nad oedd yn gorgyffwrdd ar hap o dan chwyddhad uchel gan ddefnyddio microsgop golau optegol (chwyddiad, x400), a dewiswyd 10 tiwb arennol ar hap ym mhob maes golwg. Dewiswyd adrannau patholeg arennol tri llygod ym mhob grŵp arbrofol ar hap i'w harsylwi. Dewiswyd cyfanswm o 10 maes gweledol ar hap ar gyfer pob adran patholegol, a sgoriwyd 10 tiwb arennol ym mhob maes gweledol. Arsylwyd cyfanswm o 100 tiwbyn ar gyfer pob llygoden, gan roi cyfanswm o 300 o diwbiau arennol a arsylwyd ym mhob grŵp. Po uchaf yw'r sgôr, y mwyaf difrifol yw maint y difrod i'r tiwbiau arennol.
Microsgopeg electron trawsyrru (TEM).
Casglwyd meinwe arennol 24 awr ar ôl llawdriniaeth. Yn dilyn anesthesia, tynnwyd meinwe arennol 1 mm² mewn vivo a'i socian mewn hydoddiant gosod meinwe a oedd yn cynnwys hydoddiant byffer glutaraldehyde 2.5 y cant ac asid ffosfforig (cat.no.G7776; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) am 2 h ar 4 gradd gradd, wedi'i ddadhydradu yn ethanol graddol (50-100 y cant) a propylen ocsid, wedi'i fewnosod yn Epon 812 (cat. rhif. GP18{{20}} 10; Bejing Zhongjingkeyi Technology Co.Ltd. am 1 awr ar 35 gradd gradd a solidified am 24 h ar 60 gradd . Gosodwyd darnau ultrathin (trwch, 50-70 nm) ar 200-gridiau copr rhwyll a'u staenio â 2 y cant o asetad wranyl am 30 munud ar dymheredd ystafell a sitrad plwm 0.04 y cant am 15 munud ar dymheredd ystafell. Edrychwyd ar y samplau o dan ficrosgop electron (JEM-1400 plws, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.; chwyddhad, x5,000 a x10,{{27} }) Cafwyd delweddau gan ddefnyddio camera dyfais cyplydd gwefr SlowScan a meddalwedd TEM analySIS5.0 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH).
Canfod glutathione gwrthocsidiol (GSH) a malondialdehyd perocsidiad lipid (MDA).
Casglwyd meinwe arennau (50-100mg), ac ychwanegwyd hydoddiant halwynog ffisiolegol (cat.no. B020; Nanjing Jiancheng Biobeirianneg Institute) at y feinwe ar gymhareb pwysau 1:9(g): cyfaint (ml). Cafodd y meinwe ei homogeneiddio, i gynhyrchu homogenad meinwe 10 y cant, a gafodd ei allgyrchu ar 13,800 xg am 15 munud ar 4 gradd. Tynnwyd y supernatant a phennwyd cyfanswm cynnwys protein y supernatant gan ddefnyddio'r dull asid bicinchoninic (21). Aseswyd GSH(cat.no.A006-2-1) ac MDA(cat.no.A003-2-2) gan ddefnyddio'r citiau adweithydd, yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng).
Blotio gorllewinol.
Echdynnwyd cyfanswm y protein o feinweoedd aren y llygoden gan ddefnyddio byffer lysis cell RIPA (cat. rhif. WO{{{{0}}; Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng) a phennwyd y crynodiadau protein drwy assay BCA(cat.no. A{ {1}}; Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng）.Cafodd symiau cyfartal o broteinau （50μug） eu gwahanu drwy SDS-PAGE(Cox-2,10.0). ;NRF2,1{0.0;xCT,12.5;HO{-1, 12.5; GPx4.15.0 y cant) a'u trosglwyddo i bilennau PVDF (GE Healthcare Life Sciences). powdr llaeth sgim am 1 awr ar dymheredd ystafell, a'i ddeor â gwrthgyrff cynradd yn erbyn y canlynol: Cyclooxygenase 2(COX-2;1:1,{000; cat. no.ab179800; Abcam), GPX4( 1:5,000;cat.no.ab125066;Abcam),xCT(1:2,000;cat.no.ab175186;Abcam), HO-1(1:1 ,000 cat.no.101147;Gentex)a NRF2 (1:1,000;cat.no.D1Z9C;CST)dros nos ar 4 gradd. Cafodd pilenni eu golchi wedyn gyda TBST(0.1 y cant Tween -20)dair gwaith. Yn dilyn y prif gynnwys ubation, cafodd pilenni eu deor â gwrthgyrff eilaidd wedi'u cyfuno â rhuddygl poeth (1:10,000; 40295G; BIOSS) am 1 awr ar dymheredd ystafell. Cafodd y pilenni eu hail-olchi deirgwaith gyda TBST a'u delweddu gyda BeyoECLPlus (cat. rhif. P00185; Sefydliad Biotechnoleg Beyotime), gan ddefnyddio System Delweddu Chemi Doc (Labordai Bio-Rad, Inc.) Pennwyd dwyster bandiau protein gan ddefnyddio Meddalwedd ImageJ v1.8.0 (Y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol). Perfformiwyd yr holl arbrofion yn driphlyg.
Trawsgrifiad gwrthdro-meintiol(RT-g)PCR.
Tynnwyd cyfanswm RNA o arennau llygod mewn gwahanol grwpiau gan ddefnyddio adweithydd TRIzol (Takara Bio, Inc.) a chafodd cDNA ei syntheseiddio gan ddefnyddio pecyn Adweithydd RT PrimeScript gyda gDNA Eraser (cat.no.RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) . Pennwyd lefelau cymharol y genynnau targed trwy qPCR gan ddefnyddio Ultra SYBR Mixture (Takara Biotechnology Co., Ltd.). Perfformiwyd RT-qPCR mewn cyfrol 25 ul gyda 2 ul cDNA, 400 nM pob paent preimio synnwyr ac antisense, a 12.5 ul Gwych SYBR Green QPCR Master Mix (Takara Bio, Inc. ar system ABI PRISM 7000 (Biosystemau Cymhwysol; Thermo Fisher). Gwyddonol, Inc.). Perfformiwyd yr adwaith am 40 cylch o ddadnatureiddio ar 95 gradd am 30 eiliad, anelio ar 53 gradd am 30 eiliad, ac estyniad ar 72 gradd am 10 eiliad Defnyddiwyd y dilyniannau preimio canlynol ar gyfer qPCR:GPX4 ymlaen ,5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT-3' a cefn,5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3';NRF2 ymlaen,5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT-3' a chefn,5'-GTTGAAACTGAGCGAAAA AGGC{ {28}}';xCT ymlaen, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G-3' a cefn,5-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3';COX-2 ymlaen,5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC{{ 37}}'a gwrthdroi,5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3';HO-1 ymlaen.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3' a gwrthdroi,5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; a -gweithredu ymlaen,5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' a gwrthdroi,5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT-3'.
Defnyddiwyd gwerth cyfartalog mynegiant genynnau ar ôl normaleiddio -actin fel calibradwr i bennu lefelau cymharol y genynnau targed. Cyfrifwyd lefelau mynegiant cymharol y genynnau targed gan ddefnyddio'r dull 2-△C (27).
Dadansoddiad ystadegol.
Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software, Inc.) a meddalwedd SPSS 23 (IBM Corp..Data yn cael eu cyflwyno fel y gwyriad safonol ± o dri ailadroddiad annibynnol oni nodir yn wahanol. Defnyddiwyd ANOVA ac yna prawf post hoc Tukey i gymharu gwahaniaethau rhwng grwpiau lluosog<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Canlyniadau
PA(Asid pachymic)yn lleihau anaf arennol mewn llygod ag IRI(anaf isgemia-atlif). Mae Scr a BUN yn ddau ddangosydd pwysig o swyddogaeth arennol (5). Roedd lefelau Scr a BUN yn sylweddol uwch yn yr IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp o gymharu â’r rhai yn y grŵp ffug (P<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Asid pachymic)lliniaru'n sylweddol y cynnydd mewn creatinin serwm ac wrea o'i gymharu â'r IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp (P<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Asid pachymic)grŵp triniaeth a'r IRI(anaf isgemia-atlif) group (P>0.05; Ffig. 1A a B).
Fel y cyflwynir yn Ffig. 1D, ni ddangosodd staenio H&E meinweoedd yr arennau yn y grŵp ffug unrhyw newidiadau sylweddol yn strwythur meinwe arennol. I'r gwrthwyneb, yr IRI(anaf isgemia-atlif)dangosodd y grŵp oedema a cholli celloedd epithelial tiwbaidd arennol, ymlediad tiwbaidd, llid interstitial, ymdreiddiad celloedd llidiol, dyddodiad colagen, a deunydd necrosis tiwb dyddodiad (Ffig. 1 D). Roedd sgôr Paller, dangosydd o anaf i feinwe arennol (26), yn sylweddol uwch yn yr IRI(anaf isgemia-atlif)grwpiau o gymharu â’r grŵp ffug (P<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Asid pachymic)roedd therapi wedi lleddfu'r briwiau hyn yn sylweddol, ac roedd sgôr Paller yn sylweddol is o'i gymharu â sgôr yr IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp (P<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(anaf isgemia-atlif) model group and the low-dose group (P>0.05; Ffig. 1C).
Ffigur 1. PA(Asid pachymic)yn lleddfu anaf arennol yn dilyn isgemia-atlifiad.(A) BUN a (B) creatinin serwm eu mesur mewn llygod yn y Sham, IRI(anaf isgemia-atlif), IRI ynghyd â PAL, IRI ynghyd â PAM, ac IRI ynghyd â grwpiau PAH (isgemia arennol 40 munud ac yna 24 awr o atlifiad; n=6/group). (C) Defnyddiwyd sgorau Paller i raddio anafiadau tiwbaidd arennol yn y grwpiau Sham, IRI, IRI ynghyd â PAL, IRI ynghyd â PAM, ac IRI ynghyd â PAH (n=3/group). (D) Delweddau hematocsilin ac eosin o'r arennau o lygod yn y Sham, IRI(anaf isgemia-atlif), IRI ynghyd â PAL, IRI ynghyd â PAM, ac IRI ynghyd â grŵp PAH. Bar graddfa, 50 µm. Cyflwynir data fel y gwyriad cymedr ± safonol. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Asid pachymic), asid pachydermig; BUN, nitrogen urea gwaed; IRI,anaf isgemia-atlif; L, grŵp dos isel; M, grŵp dos cymedrol; H, grŵp dos uchel.
Effeithiau PA(Asid pachymic)ar y newidiadau morffolegol mewn mitocondria ym meinwe arennol llygod yn dilyn IRI arennol(anaf isgemia-atlif). Ni ddangosodd TEM unrhyw newidiadau sylweddol yn adeiledd mitocondriaidd y meinwe arennol yn y grŵp ffug. Yn y grŵp model, gwelwyd newidiadau mitocondriaidd sy'n gysylltiedig â ferroptosis, megis gostyngiad mewn cyfaint mitocondriaidd, mwy o ddwysedd pilen, a christae mitocondriaidd gostyngol neu absennol, mewn meinwe arennol (Ffig.2A). O'u cymharu â'r rhai yn y grŵp model, roedd mitocondria'r grŵp dos cymedrol yn arddangos oedema yn bennaf, ac roedd y newidiadau penodol sy'n nodweddiadol o ferroptosis yn brin (Ffig.2A). Fodd bynnag, yn y PA dos uchel(Asid pachymic)grŵp, ni welwyd unrhyw newidiadau nodweddiadol o ferroptosis yn y mitocondria y meinwe arennol, a dim ond oedema ysgafn a arddangoswyd (Ffig. 2 A). Roedd y newidiadau yn y mitocondria yn y grŵp dos isel yr un fath â'r rhai yn y grŵp model (Ffig.2A).
Effeithiau PA(Asid pachymic)ar fynegiant GSH ac MDA mewn IRI arennol(anaf isgemia-atlif). Mae GSH yn gydffactor angenrheidiol ar gyfer swyddogaeth GPX4. Mae synthesis GSH yn effeithio'n uniongyrchol ar weithgaredd GPX4. Mae MDA yn gynnyrch ocsidiad lipid, sy'n adlewyrchu graddau perocsidiad lipid mewngellol ac yn adlewyrchu'n anuniongyrchol y digwyddiad o ferroptosis (28,29). Fel y cyflwynir yn Ffig. 2B, roedd gan feinweoedd yr arennau lefelau sylweddol is o GSH yn yr IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp o gymharu â'r grŵp ffug. Ymhlith y grwpiau trin cyffuriau, roedd mynegiant GSH yn sylweddol uwch yn y grwpiau IRI ynghyd â PA ac IRI plws PAn o gymharu â'r IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp model (P<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). I'r gwrthwyneb, fel y'i cyflwynir yn Ffig. 2C, roedd perocsidiad lipid meinwe yn fwy (yn seiliedig ar lefelau MDA) yn yr IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp o gymharu â'r grŵp ffug. Ymhlith y grwpiau trin cyffuriau, roedd lefelau MDA yn sylweddol is yn y grwpiau IRI ynghyd â PA ac IRI plws Pau o gymharu â'r IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp (P<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
Ffigur 2. PA(Asid pachymic)yn lleihau ferroptosis mewn IRI(anaf isgemia-atlif)- anaf acíwt i'r arennau.(A) Trosglwyddo delweddau microsgopeg electron yn y Sham, IRI(anaf isgemia-atlif), IRI ynghyd â PAL, IRI ynghyd â PAM, ac IRI ynghyd â grwpiau PAH (isgemia arennol 40 munud ac yna 24 awr o atlifiad). Chwyddiad, x20,000; bar graddfa, 1 µm. Mae'r saethau du yn nodi bod y cyfaint mitocondriaidd wedi gostwng, dwysedd y bilen wedi cynyddu a gostwng, neu wedi diflannu cristae mitochondrial a welwyd mewn meinwe arennol. Mae'r saethau glas yn dynodi oedema mitocondriaidd. Aseswyd lefelau (B) GSH a (C) MDA mewn meinweoedd arennol (n{5}}/grŵp). Cyflwynir data fel y gwyriad cymedr ± safonol. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(anaf isgemia-atlif)grwp. PA(Asid pachymic), asid pachydermig; IRI,anaf isgemia-atlif; L, grŵp dos isel; M, grŵp dos cymedrol; H, grŵp dos uchel; GSH, glutathione; MDA, malondialdehyde.
PA(Asid pachymic)yn rheoleiddio mynegiant proteinau sy'n gysylltiedig â ferroptosis mewn IRI arennol(anaf isgemia-atlif). Yn yr astudiaeth bresennol, canfuwyd lefelau mynegiant y proteinau cysylltiedig â ferroptosis GPX4, xCT, a HO-1 trwy ddadansoddiadau blotio gorllewinol (Ffig.3A a B) a RT-qPCR (Ffig.3C). Dangosodd y canlyniadau fod lefelau protein GPX4, xCT, a HO-1 wedi'u hisreoleiddio'n sylweddol yn yr IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp o'i gymharu â'r grŵp ffug (P<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Asid pachymic)cynyddu’n sylweddol lefelau mynegiant protein ac mRNA GPX4, xCT, a HO-1 o gymharu â’r IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp (P<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(anaf isgemia-atlif)a PA dos isel(Asid pachymic) treatment groups (P>0.05; Ffig.3B ac C).
Ffigur 3. PA(Asid pachymic)yn cynyddu lefelau mynegiant y proteinau sy'n gysylltiedig â ferroptosis, GPX4, xCT, a HO-1.(A) Perfformiwyd blotio gorllewinol i ganfod lefelau mynegiant y proteinau sy'n gysylltiedig â ferroptosis, GPX4, xCT, a HO-1 yn IRI(anaf isgemia-atlif)-llygod anaf i'r arennau acíwt (n=3). (B) Mynegiant cymharol o werthoedd llwyd ar gyfer GPX4, xCT, a HO-1. (C) Perfformiwyd dadansoddiad PCR meintiol trawsgrifio gwrthdro i ganfod lefelau mynegiant mRNA y proteinau sy'n gysylltiedig â ferroptosis (n=3). Cyflwynir data fel y gwyriad cymedr ± safonol. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(anaf isgemia-atlif)grwp. PA(Asid pachymic), aci pachydermigd; GPX4, glutathione peroxidase 4; xCT, system cludo glwtamad; HO‑1, heme oxygenase 1; IRI,anaf isgemia-atlify; L, grŵp dos isel; M, grŵp dos cymedrol; H, grŵp dos uchel.
Dangosodd y canlyniadau fod lefelau protein a mRNA y protein perocsidiad lipid sy'n gysylltiedig â ferroptosis, COX-2 wedi'u huwchreoleiddio'n sylweddol yn ystod IRI(anaf isgemia-atlif)(Ffig.4). Triniaeth gyda PA dos cymedrol a dos uchel(Asid pachymic)gostwng mynegiant COX-2 yn sylweddol o gymharu â'r IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp (P<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(anaf isgemia-atlif)a PA dos isel(Asid pachymic) treatment groups (P>0.05; Ffig.4).
Ffigur 4. PA(Asid pachymic)yn lleihau lefelau mynegiant y protein sy'n gysylltiedig â ferroptosis, COX-2.(A) Perfformiwyd blotio gorllewinol i ganfod lefelau mynegiant y protein marciwr perocsidiad lipid ferroptosis, COX-2 mewn llygod anaf i'r arennau acíwt IRI. (B) Mynegiant cymharol o werthoedd llwyd ar gyfer COX-2. (C) Perfformiwyd dadansoddiad PCR meintiol trawsgrifio gwrthdro i ganfod mynegiant mRNA COX-2 (n=3). Cyflwynir data fel y gwyriad cymedr ± safonol. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(anaf isgemia-atlif)grwp. PA(Asid pachymic), asid pachydermig; COX-2, cyclooxygenase 2; IRI,anaf isgemia-atlif; L, grŵp dos isel; M, grŵp dos cymedrol; H, grŵp dos uchel.
PA(Asid pachymic)yn hyrwyddo actifadu llwybr signalau NRF2 mewn IRI arennol(anaf isgemia-atlif).Ymchwilio i effaith PA(Asid pachymic)ar lwybr signalau NRF2, aseswyd lefelau protein a mRNA NRF2 (Ffig.5). Dangosodd y canlyniadau fod mynegiant NRF2 yn sylweddol is yn yr IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp o gymharu â'r grŵp ffug. Yn ogystal, roedd mynegiant NRF2 yn sylweddol uwch yn y grwpiau IRI ynghyd â PAw ac IRI ynghyd â PAH o gymharu â'r IRI(anaf isgemia-atlif)grŵp (P<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Ar ben hynny, triniaeth gyda PA(Asid pachymic)hefyd yn cynyddu mynegiant NRF2 mewn modd dos-ddibynnol (Ffig.5).
Ffigur 5. PA(Asid pachymic)yn actifadu llwybr signalau NRF2.(A) Perfformiwyd blotio gorllewinol i ganfod mynegiant protein NRF2 yn IRI(anaf isgemia-atlif)-llygod anaf i'r arennau acíwt. (B) Mynegiant cymharol o werthoedd llwyd ar gyfer NRF2 (n=3). (C) Perfformiwyd dadansoddiad PCR meintiol trawsgrifio gwrthdro i ganfod mynegiant mRNA NRF2 (n=3). Cyflwynir data fel y gwyriad cymedr ± safonol. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(anaf isgemia-atlif)grwp. PA(Asid pachymic), asid pachydermig; NRF2, ffactor niwclear erythroid-deillio 2 fel 2; IRI,anaf isgemia-atlif; L, grŵp dos isel; M, grŵp dos cymedrol; H, grŵp dos uchel.
