RHAN Ⅰ:Mae'r Broses Llidiol yn Modylu Mynegiant a Lleoli WT1 mewn Podocytes sy'n Arwain at Niwed i'r Arennau
Mar 23, 2022
Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
Rhagymadrodd
Genyn-1 tiwmor Wilm(WTI) yw un o'r prif enynnau sy'n ymwneud â goroesiad podocytes a hidlo arennol aneffeithlon. Mae prosesau llidiol yn arwain atarenmethianta gallai hyn ddigwydd o bosibl trwy fodiwleiddio WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm). WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) yn amgodio ffactor trawsgrifio, protein bys sinc sydd â phedwar isoform mawr trwy splicing amgen yn exon 5(17AA±) ac exon 9(KTS±)(1). Mae gan yr isoform KTS affinedd uwch ar gyfer DNA, mae KTS yn ogystal yn cyd-leoli â phroteinau spliceosome yn y cytoplasm (2, 3). WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) yn chwarae rhan hanfodol mewn embryogenesis, yn bennaf mewn gonadal aarendatblygiad; mewn oedolion, mae ei fynegiant yn gyfyngedig i gelloedd visceral arbenigol yn yaren(podocytes)ac mae'n hanfodol ar gyfer cynnal a chadw a modiwleiddio sawl genyn, megis podocalyxin, nephrin (NPHS1), a ffactor trawsgrifio blwch pâr (4-6). Gall mwtaniadau neu leihad mewn mynegiant WTl arwain at fynegiant llai o nephrin a phodocalyxin ac mae'n gysylltiedig â neffropathi fel glomerwlosclerosis(5, 7-10).
Syndrom nephrotic yw'r syndrom arennol amlaf yn ystod plentyndod, ei ddosbarthiad histolegol yw'r newid neffrotig lleiaf posibl, glomerwlosclerosis segmentol ffocal, a sglerosis mesangial gwasgaredig, ac yn ôl maint yr ymateb i steroidau mae'n cael ei ddosbarthu fel syndrom nephrotic sensitif a gwrthsefyll (11) .
effeithiau cistanche: gwrth-llid
Treiglad WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) yn cael ei adrodd yn gyffredin mewn plant â syndrom nephrotic sy'n gwrthsefyll steroid, clefyd prin sy'n effeithio ar 10-15 y cant o gleifion â syndrom nephrotic(12,13). Mae tua 80 y cant o'r holl blant â syndrom nephrotic achlysurol yn ymateb i driniaeth steroid, fodd bynnag, ni ddarganfuwyd unrhyw fwtaniadau yn WT1 (Genyn-1 tiwmor Wilm) mewn astudiaeth carfan fawr(14).Llai o fynegiant o syndrom nephrotic sy'n gwrthsefyll steroid ac i raddau llai mewn cleifion â syndrom neffrotig sy'n sensitif i steroid(15).Mewn model murine o lid systemig a achosir gan lipopolysacarid (LPS), 24 awr ar ôl gweinyddu LPS, WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) wedi'i drawsleoli i'r cytoplasm ac roedd yn gysylltiedig â gostyngiad yn y mynegiant o nephrin, elfen allweddol ar gyfer cynnal y diaffram hollt mewn podocytes ac yn hanfodol ar gyfer hidlo glomerwlaidd cywir, a thrwy hynny yn dangos WT1 (Genyn-1 tiwmor Wilm) yn gweithredu fel ffactor trawsgrifio ar gyfer uwch-reoleiddio genyn nephrin(16).
Yn A459 celloedd canser yr ysgyfaint sy'n cael eu trin â ffactor-alffa necrosis tiwmor (TNFa), trawsleoli WT1 (Genyn-1 tiwmor Wilm) protein i cytoplasm wedi'i arsylwi, sy'n awgrymu y gall ysgogiad llidiol newid ei leoleiddio mewngellol a'i swyddogaeth drawsgrifio (17). Gall ffosfforyleiddiad chwarae rhan mewn modiwleiddio gweithgaredd rheoleiddio trawsgrifiadol WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) trwy ymyrraeth â thrawsleoli niwclear, yn ogystal â thrwy atal WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) Rhwymo DNA(18) gan ffosfforyleiddiad protein cAMP-ddibynnol o Ser-365 a Ser{5}} yn y parth bys sinc (19).
Mae sepsis yn ganlyniad i'r ymateb llidiol systemig ac fe'i nodweddir gan ryddhad cytocinau pro-a gwrthlidiol a achosir gan haint. Mae anaf arennol acíwt yn gyffredin mewn cleifion difrifol wael ym mhresenoldeb llid acíwt ac mae ganddo gysylltiad cryf â dilyniant difrod arennol cronig (20,21). Mae tystiolaeth bod llid yn chwarae rhan bwysig mewn difrod i organau amrywiol, gan gynnwysarennau(22).Yn y gwaith hwn, fe wnaethom werthuso effaith cytocinau pro-llidiol ar fodiwleiddio WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) mynegiant a'i drawsleoliad i'r cytoplasm.
budd cistanche tubulosa: gwrth-cncer a gwrth-tiwmor
Defnyddiau a Dulliau
Model anifeiliaid. Cafwyd llygod BALB/c benywaidd(8-10 wythnos oed) o Harland Mexico (Dinas Mecsico, Mecsico). Cafodd y llygod eu cewyll o dan dymheredd ystafell reoledig, lleithder, a golau (cylchred golau-tywyll 12/12h) gyda dŵr a bwyd ad libitum.LPS o Escherichia coli O111:B4(Sigma Aldrich, Toluca, Dinas Mecsico, Mecsico) ac un chwistrelliad o LPS yn cael ei roi ar ddogn o 8 mg/kg mewnperitoneally(16); defnyddiwyd yr hydoddiant halwynog ar gyfer rheoli, llygod heb eu trin. Aberthwyd y llygod â chwistrelliad mewnperitoneol o 200 mg/kg o hydoddiant pentobarbital sodiwm ar 12,24,36,48 a 72 h, gyda n=5 ar bob pwynt amser, ac ynaarencasglwyd meinwe a gwaed. Casglwyd yr wrin cyn aberthu'r anifeiliaid.
Dau lygod ar gyferarenchwistrellwyd ecsbloetio ag 1 mg/kg o LPS bob 2 ddiwrnod i gymell cronigaren anaffel rheolaeth gadarnhaol (21). Cynhaliwyd yr holl arbrofion yn unol â chymeradwyaeth ymlaen llaw gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Cyfadran y Gwyddorau Biolegol (CEIBA-2016-034).
Arennauecsbloetiaid. O'rareno lygod BALB/c, paratowyd sleisys meinwe 250-300 um o drwch gyda sleiswr meinwe Krumdieck (Alabama Research and Development, Munford, AL, UDA) ar 4 gradd gyda llif cyson byffer bicarbonad Krebs Henseleit (KB) a gafodd ei awyru gyda 5 y cant o CO2. Cynaeafwyd y tafelli mewn byffer KB ar 4 gradd gradd.Arennaucafodd ecsbloetiaid eu platio mewn 12-platiau ffynnon gyda chyfrwng Eagle/F12 addasedig Dulbecco wedi'i ategu â 10 y cant o serwm buchol ffetws a 5 y cant o asiant gwrthfiotig-gwrthffyngol, a'u deor ar 37 gradd C, gyda 5 y cant o CO, a'i droi ar 25 rpm. Cafodd yr elifion eu trin â 10 ng/ml o TNFa (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml o interleukin 1 (IL1; R&D Systems) a 100 ng/ml o LPS a'u dadansoddi yn 6, 12 a 24 awr yn ddiweddarach.
Protein wrinol. Casglwyd samplau wrin ar bob pwynt amser uchod. Mesurwyd y crynodiad protein gan ddefnyddio pecyn DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA) a gwerthuswyd albwminwria gan ddefnyddio electrofforesis gel sodiwm dodecyl sylffad-polyacrylamid ac yn seiliedig ar faint band albwmin serwm buchol (16).
Cytocinau pro-llidiol. Mesurwyd lefelau IL6, IL1 , a TNFa gan ddefnyddio pecynnau assay immunosorbent rhyngosod sy'n gysylltiedig â ensymau (PeproTech, Dinas Mecsico, Mecsico).
Adwaith cadwyn polymeras meintiol (qPCR). Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu oddi wrth feinweoedd arennol gan ddefnyddio Adweithydd Trizolw (Invitrogen, Carlsbad, CA, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafodd cDNA un llinyn ei syntheseiddio trwy drawsgrifio o chwith gan ddefnyddio Pecyn Trawsgrifio Gwrthdro cDNA Capasiti Uchel (Cymhwysol Biosystems, Foster City, CA, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Perfformiwyd PCR amser real gan ddefnyddio'r System PCR Amser Real 7500 (Biosystemau Cymhwysol) gyda phrofion mynegiant genynnau TaqMan. Perfformiwyd profion PCR amser real cymharol ar gyfer pob sampl yn driphlyg. Y paent preimio ar gyfer WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) wedi'u hanfon ymlaen:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; gwrthdroi:5-CACATCCTGAATGCCT GAAGA-3'; a chwiliwch am FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ; perfformiwyd y protocol ar gyfer 95 gradd am 10 munud a 40 cylch ar 94 gradd am 30 s a 64 gradd C am y 30au. Mynegiad cymharol y WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) cyfrifwyd genyn gan ddefnyddio'r hafaliad 2-AACT(23) gyda glyseraldehyde-3-genyn dehydrogenas ffosffad (GAPDH) (Biosystemau Cymhwysol) yn cael ei ddefnyddio ar gyfer normaleiddio.
trin clefyd yr arennau dyfyniad cistanche
Penderfynwyd ar fynegiad nephrin mRNA gyda 3 ug o cDNA a'r preimwyr canlynol: Ymlaen: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'a chefn:5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'ar 94 gradd am 30 s,60 gradd gradd am 30 s a 72 gradd am 30au am 30 cylch(372 bp)(16).Ar gyfer mynegiant GAPDH, y paent preimio a ddefnyddiwyd oedd: Ymlaen:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',cefn:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', gyda'r amodau adwaith canlynol: 94 gradd am 40au, 60 gradd am 30au a 72 gradd am 40au am 35 cylch(452 bp). Mynegiant WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm): Ymlaen 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', cefn 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3'ar 94 gradd am 40 s, 64 gradd am 30au a 72 gradd am 30au am 35 cylch (160 bp). Mynegiad WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) isoforms KTS±a 17 AA±(F2-preimwyr R2 i ganfod 17 AA plws /-a F3-R3 i ganfod KTS plws /-sblecio isoforms) gan PCR confensiynol yn ôl Oji et .al.(24). Perfformiwyd penderfyniad mynegiant -actin yn ôl Lauxet al. (25). Gwelwyd y cynhyrchion yn defnyddio electrofforesis gel polyacrylamid 10 y cant ar gyfer yr isoform KTS ± a gel agarose 2 y cant ar gyfer yr isoform 17AA±.
Immunofluorescence. Mae'rarennauo lygod wedi'u trin â LPS a rheolyddion wedi'u gosod mewn fformalin 10 y cant a'u prosesu ar gyfer staenio hematocsilin ac eosin, imiwnhistocemeg, ac imiwnofflworoleuedd.
I bennu lleoliad WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) mewn llygod a gafodd eu trin â LPS, defnyddiwyd adrannau trwchus o feinwe arennol wedi'u gosod ar sleidiau microsgop. Cafodd y sbesimenau eu dewaxed, permeabilized gyda Triton X-100 [0.1 y cant Triton gyda 1 y cant sodiwm sitrad mewn ffosffad-buffer hallt (PBS)], a golchi dair gwaith gyda PBS. Cafodd y meinweoedd eu rhwystro â serwm buchol ffetws 20 y cant yn PBS am 30 munud a'u deor ar 4 gradd dros nos gyda gwrthgorff monoclonaidd i WT1 (Genyn-1 tiwmor Wilm) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, UDA) wanhau 1:100 mewn serwm buchol ffetws o 10 y cant yn PBS. Ar ôl golchi gyda PBS, canfuwyd presenoldeb gwrthgorff rhwymedig trwy ei staenio â gwrth-lygoden gafr IgG Texas Red sc-2979(Santa Cruz Biotechnology). Cafodd y sleidiau eu gwrth-staenio â 4',6-dimidino-2-phenylindole. Yn olaf, cafodd y sleidiau eu gosod a'u harchwilio'n ansoddol gan ddefnyddio microsgop confocal Olympus BX61W1 gydag amcan trochi dŵr 40 × a meddalwedd Fluoview 4.0a (Olympus, Tokyo, Japan).
Imiwnohistocemeg. I ganfod ffosfforyleiddiad (p)-WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) mewn podocytau o lygod wedi'u trin â LPS, gwrthgyrff polyclonaidd i p-WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) serine 393,sc-12933 a 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA）). Cafodd sleidiau yn cynnwys 4-μm o adrannau o feinwe arennol eu diwyro a'u athraidd ■ Perfformiwyd imiwnohistocemeg gan ddefnyddio Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, UDA) yn ôl protocol y gwneuthurwr.Archwiliwyd y sleidiau gan ddefnyddio microsgop golau gydag amcan trochi olew 100 × (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, yr Almaen) .
Blot gorllewinol. Cafodd cyfanswm y protein ei ynysu gyda 200 ul o glustogiad lysis (1 y cant Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6), a mesurwyd y crynodiad gan ddefnyddio pecyn DC Protein Assay (Bio-Rad). Gwahanwyd protein(50 ug) gan ddefnyddio electrofforesis gel dodecyl sylffad-polyacrylamid 12 y cant a'i ddadansoddi trwy blotio gorllewinol gyda WT1 (Genyn-1 tiwmor Wilm) [F6] sc gwrthgyrff-7585(Biotechnoleg Santa Cruz). Cafodd samplau eu normaleiddio gan ddefnyddio gwrth-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, UDA). Delweddwyd proteinau gan ddefnyddio system Blotio Gorllewinol Lumi-Light sc-2048(Biotechnoleg Santa Cruz).
budd cistanche: amddiffyn yr arennau
Canlyniadau
Sefydlu oarendifrodmewn llygod BALB/c gan LPS. Mae wedi'i hen sefydlu bod anaf podocyte yn gysylltiedig â phroteinwria cynyddol. Cafodd albwmin a chyfanswm protein mewn wrin eu pennu gan electrofforesis gel sodiwm dodecyl sylffad-polyacrylamid a phecyn Assay Protein DC (Bio-Rad). Gwelwyd cynnydd sylweddol (p{2}}.001)o albwmin wrinol 12 h ar ôl triniaeth LPS, gyda chynnydd uchaf o 24 h (215.87 ± 1.41 ug/ml) o'i gymharu â'r rheolydd (15.53) ±5.0 ug/ml） (Ffigur 1A) Gwelwyd bod crynodiad cyfanswm y protein wrinol ar ei uchaf ar 36 h (26.02 ± 2.43 mg/ml) ac roedd yn sylweddol uwch o'i gymharu â'r rheolydd(p=0.01) fel y dangosir yn Ffigur 1. Dadansoddwyd y difrod arennol a achosir gan LPS gan histoleg.Ar 24 h ar ôl triniaeth, gwelwyd glomerulonephritis ffocal yn meinwe'r arennau, gyda'r difrod mwyaf yn cael ei ganfod yn 36 h, gan gynyddu maint y glomerwlws, gyda mesangial amlhau celloedd Ar ôl 48 awr, gwelwyd adferiad graddol o'r glomerwlws tan 72 h, fel y dangosir yn Ffigur 1C.
Ffigur 1. Effaith llid systemig ar yr aren.Crynodiadau o albwmin wrinol(A) a phrotein wrinol (B) fel marcwyr niwed i'r arennau mewn llygod sydd wedi'u trin â lipopolysaccharid. C: Delwedd gynrychioliadol o histoleg arennol llygoden (staenio hematocsilin a eosin) ar wahanol adegau (12,24,36,48, a 72 h) ar ôl pigiad lipopolysaccharid, gyda chymhariaeth model o lid cronig, chwyddo 100 ×. Yn sylweddol wahanol yn: *n<><0,0]><0.00>
Cynhyrchu'r cytocinau pro-llidiol TNFa ac IL1 mewn serwm o lygod wedi'u trin â LPS. I gadarnhau bod niwed i'r arennau wedi'i achosi gan LPS, mesurwyd lefelau cytocinau pro-llidiol gan assay immunosorbent sy'n gysylltiedig ag ensymau. Gwelwyd cynnydd o TNFa ac I1 ar ôl 12 h(3.6±0.9 ng/ml, 11.9±5ng/ml) a hyd at 36h(4.44±0.1 ng/ml,18 ±0.9 ng/ml yn y drefn honno)o driniaeth ag LPS, yn dechrau dirywio wedi hynny (Ffigur 2A a B). Cynyddwyd mynegiant IL6 ar 12 h (49.5 ng/ml) a 36 h (23.5 ng/ml) ar ôl y driniaeth, sy'n sylweddol uwch na'r rheolaeth (Ffigur 2C).
Ffigur 2. Cwrs amser o lefelau cytocinau pro-llidiol tiwmor necrosis factor-alpha (TNFa).(A), interleukin 1 (LL1 )(B), ac IL6(C) mewn serwm o lygod ar ôl rhoi lipopolysaccharid mewnperitoneol. Sylweddol wahanol ar: *p Llai na neu'n hafal i 0.05,**p Llai na neu'n hafal i 0.01 a ***p Llai na neu'n hafal i 0.001 .
Mynegiant genyn WTI mewn meinwe arennau o lygod wedi'u trin gan LPS. Er mwyn ateb ein cwestiwn canolog a yw WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) wedi'i fodiwleiddio gan y broses ymfflamychol, a chafodd hyn effeithiau arennol, cyfanswm mynegiant y WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) pennwyd genyn mewn samplau arennol o lygod â llid systemig ar wahanol adegau yn ystod llid. WT1(Genyn-1 tiwmor Wilm) roedd mRNA yn is bob amser wedi'i ddadansoddi mewn perthynas â'r rheolaeth, gyda'r mynegiant cymharol isaf yn 36 h a'r uchaf ar 12 h ar ôl sefydlu llid systemig fel y dangosir yn Ffigur 3A.Yn ogystal, penderfynwyd a oedd y driniaeth â LPs addasiad ysgogedig i fynegiad exon5(17 AA±) yr isoform a KTS± o WTI gan PCR. Dangosodd y data nad oedd unrhyw ddadreoleiddio mynegiant yr isoformau hyn gan fod yr un ymddygiad wedi'i arsylwi â'r grŵp rheoli heb driniaeth trwy gydol y broses ymfflamychol systemig a achosir gan LPS (Ffigur 3B). Dangosodd blotio gorllewinol fod protein WT1 yn lleihau trwy gydol y broses ymfflamychol, gydag adferiad bach ar 36 h ar ôl triniaeth, fodd bynnag, roedd swm WT1 yn llai na'r rheolaeth heb ei drin (Ffigur 3C a D).
Ffigur 3. Effaith lipopolysaccharide(LPS) ar fynegiant genyn Wilms'tumor I (WT1) ym meinwe'r arennau o lygod â llid systemig.A: Mynegiant cymharol mRNA.B WTI: Mynegiant cymharol isoformau KTS± a 17IAA±o WT1.C: Lefelau protein WTI trwy imiwnoblotting ar ôl triniaeth LPS a D: Dwysedd imiwnoblotting ar gyfer WT1.Sylweddol wahanol ar:**p Llai na neu'n hafal i 0.01 a ***p Llai na neu'n hafal i 0.001,
Ffosfforyleiddiad a lleoleiddio WTI mewn biopsïau arennau llygod wedi'u trin â LPS. Digwyddiad pwysig ym modyliad ôl-drosiadol protein WTI yw ffosfforyleiddiad asid amino 393, sy'n cymell dadleoli'r protein i'r cytoplasm. Penderfynwyd ar ffosfforyleiddiad a lleoleiddio WT1 mewn samplau arennau o lygod a gafodd eu trin â LPS. Dadansoddwyd ffosfforyleiddiad WT1 gan histocemeg, gan nodi presenoldeb WT1 ffosfforylaidd yn cytoplasm y celloedd mewn rhannau o feinwe arennol yn dechrau 12 h ar ôl sefydlu llid systemig ac yn cael ei gynnal nes bod 72 h.WT1 wedi'i ffosfforyleiddio mewn asidau amino 393 a 363 fel y dangosir yn Ffigur 4A. Dadansoddwyd lleoliad y protein WT1 yn ôl immunofluorescence. Roedd lleoliad WT1 mewn podocytau mewn samplau arennau o lygod a gafodd eu trin â LPS yn sytoplasmig yn bennaf, ond yn y podocytau o'r samplau rheoli, roedd y lleoliad yn aneglur (Ffigur 4B).
Ffigur 4. Ffosfforyleiddiad a lleoleiddio Wilms'tumor I (WTI) mewn samplau arennau o lygod wedi'u trin â lipopolysaccharid.A: Staeniad imiwnohistocemegol ar gyfer ffosfforyleiddiad (p) - WTI yn dangos cynnydd mewn ffosfforyleiddiad yn serine 393 a 363 gan ddechrau 12 h ar ôl gweinyddu LPS (chwyddiad 100 × ar y microsgop golau). B: Lleoli WTI gan imiwnfflworoleuedd yn yr aren; enghreifftiau yn dangos mân leoleiddio niwclear o WT1(sgwariau)36 h ar ôl rhoi lipopolysaccharid (chwyddiad 40 × ar y microsgop confocal).DAP1:4,6-Diamidino-2-phenylindole.
Modiwleiddio mynegiant WTI a nephrin mewn arennau o lygod wedi'u trin â LPS. Mae lleoliad WT1 yn y gell yn dylanwadu ar ei gweithgaredd biolegol. Dywedwyd nad yw cytoplasmig WT1 yn cyflawni gweithgaredd trawsgrifio; am y rheswm hwn, dadansoddwyd mynegiant WT1 a nephrin mRNA gan PCR mewn samplau arennau o lygod a gafodd eu trin â LPS (Ffigur 5A). Dangosodd PCR ostyngiad mewn mRNA nephrin o 24 i 48 h, gyda chynnydd o 72 h (Ffigur 5B ), tra cynyddodd mynegiant mRNA WTI ar 12 h ac wedi hynny dirywio yn ystod oriau critigol llid a niwed i'r arennau (24 a 36 h) a (Ffigur 5B).
Ffigur 5. Dadansoddiad o fynegiad mRNA nephrin (NPHS1) a Wilms'tumor 1(WT1).A: Yn y dadansoddiad o fynegiant mRNA, gostyngodd NPHSI a WTI ar 24,36 a 48 h ar ôl sefydlu llid systemig gan ddefnyddio lipopolysaccharide. B: Meintioli'r bandiau a ddangosir yn A yn ôl densitometreg a'u normaleiddio trwy fynegiant i glyseraldehyde 3-ffosffad dehydrogenas.
Mae elifion arennau sy'n cael eu trin â TNFa ac IL1 yn modiwleiddio mynegiant WTI a nephrin. Er mwyn pennu a yw'r cytocinau'n modiwleiddio mynegiant WT1, cafodd ecsbynnau arennol eu meithrin a'u trin â'r cytocinau TNFa ac IL1 am 6,12, a 24 h i ddadansoddi mynegiant WT1 a nephrin gan PCR. Gostyngodd mynegiant mRNA Nephrin a chynyddodd mynegiant mRNA WTI ar 24 h mewn ecsbyniadau arennol a gafodd eu trin â TNFa ac ILLb (Ffigur 6).
Ffigur 6.Dadansoddiad o fynegiant nephrin (NPHS1) a Wilms'tumor 1 (WT1)mRNA mewn ecsôsts arennol.A: lefelau mynegiant mRNA o NPHSi a WTI ar wahanol adegau mewn ecsôsts arennol sy'n agored i 10 ng/ml o ffactor-alffa necrosis tiwmor (TNF ), ac 20 nglml o interleukin 16 (IL16)B: Mynegiant cymharol a gafwyd gan ddefnyddio dadansoddiad densitometrig o'r cynnyrch signal. Cafodd y bandiau eu mesur trwy normaleiddio i glyseraldehyd 3-ffosffad dehydrogenas.
Lleoli WTI mewn echlynion arennol trwy imiwnfflworoleuedd. Er mwyn penderfynu a oedd TNFa ac IL yn gyfrifol am y newid yn lleoleiddio'r protein WT1, cafodd ecsôsts aren llygoden eu trin â TNFa a L1 a LPS am 24 h. Mewn ecsbloitiaid a gafodd eu trin ag ILlb a LPS, roedd lleoleiddio cnewyllyn/cytoplasmig o brotein WTl i'r amlwg, ac yn yr elifion a gafodd eu trin â TNFa, arsylwyd lleoleiddiad cytoplasmig o brotein WT1; yn y cyfamser, mewn rheolaethau heb eu trin, arsylwyd lleoleiddio niwclear WT1 yn bennaf (Ffigur 7).
Ffigur 7. Lleoli'r protein tiwmor Wilms'1(WTI) yn ôl imiwnfflworoleuedd gan ddefnyddio Red TX (WT1) a 4',6-diamidino-2-ffenylindole (DAPI)(cnewyllyn) mewn podocytau o ecsbloetio arennau a gafodd eu trin gyda l0 ng/ml o ffactor-alffa necrosis tiwmor (TNFa), 20 ng/ml o interleukin 16(L1B), a lipopolysaccharid (LPS).Llai o leoleiddio niwclear WTas a ddangosir yn yr elifion a gafodd eu trin â TNFa o gymharu â lleoleiddio niwclear/cytoplasmig WTI o dan driniaethau IL1 a LPS. Chwyddiad, 40 ×.
