Rhan Ⅰ Mae'r Chelator Haearn, PBT434, yn Modylu Masnachu Haearn Trawsgellol yng Nghelloedd Endothelaidd Microfasgwlaidd yr Ymennydd
Apr 28, 2023
Haniaethol
Mae haearn a metelau trosiannol eraill, fel copr a manganîs, yn hanfodol ar gyfer cefnogi gweithrediad yr ymennydd, ond eto mae gor-gronni yn sytotocsig. Mae'r gor-gronni hwn o fetelau, yn enwedig haearn, yn gyffredin i sawl anhwylder niwrolegol; mae'r rhain yn cynnwys clefyd Alzheimer, clefyd Parkinson, ataxia Friedrich, ac anhwylderau eraill sy'n cyflwyno niwroddirywiad a chroniad haearn yr ymennydd cysylltiedig. Mae rheoli fflwcs haearn gan y rhwystr gwaed-ymennydd yn darparu'r amddiffyniad cyntaf yn erbyn gor-gronni haearn mewn ffisioleg arferol a'r amodau patholegol hyn. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom benderfynu bod y chelator haearn PBT434, sy'n cael ei ddatblygu ar hyn o bryd ar gyfer trin clefyd Parkinson ac atroffi systemau lluosog, yn modiwleiddio'r defnydd o haearn gan gelloedd endothelaidd microfasgwlaidd ymennydd dynol (hBMVEC) trwy chelation of allgellog Fe.2 plws. Mae trin hBMVEC â PBT434 yn arwain at gynnydd yn nifer y trawsgrifiadau ar gyfer derbynnydd transferrin (TfR) a ceruloplasmin (Cp). Mae dadansoddiadau blot gorllewinol ac ELISA yn datgelu cynnydd cyfatebol yn y proteinau hefyd. O fewn y gell, mae PBT434 yn cynyddu'r lefel canfyddadwy o elusennol, labile Fe2 plws; mae data yn dangos bod y Fe2 plwsyn cael ei ryddhau o ferritin. Yn ogystal, mae PBT434 yn potentiates efflux haearn yn debygol oherwydd y cynnydd mewn haearn fferrus cytosolig, y swbstrad ar gyfer yr allforiwr haearn, ferroportin. Mae PBT434 yn cydbwyso'n gyflym ac yn ddeugyfeiriol ar draws rhwystr gwaed-ymennydd hBMVEC. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos nad yw'r cymhlyg haearn PBT yn swbstrad ar gyfer derbyniad hBMVEC ac felly'n cefnogi model lle byddai PBT434 yn celu haearn rhyng-ranol ac yn atal ail-gymeriad haearn gan gelloedd endothelaidd y rhwystr gwaed-ymennydd, fel yn ogystal ag atal ei dderbyniad gan gelloedd eraill yr uned niwrofasgwlaidd. Ar y cyfan, mae hyn yn cyflwyno mecanwaith newydd ac addawol ar gyfer chelation haearn therapiwtig.
Cliciwch yma i gaelbeth yw manteision Cistanche
Rhagymadrodd
Mae therapi chelation metel (MCT) wedi cael ei ddefnyddio ers tro fel triniaeth ar gyfer gwenwyn metel trosiannol ac ar gyfer anhwylderau genetig ym metaboledd ïon metel hanfodol sy'n arwain at or-gronni'r metel [1-3]. Dwy enghraifft o'r olaf yw hyper-groniad copr yng nghlefyd Wilson [4] ac o haearn mewn hemochromatosis etifeddol [5]. Mae copr a haearn yn gatalyddion straen ocsideiddiol ac felly maent yn sytotocsig mewn crynodiadau sy'n fwy na gallu'r gell a'r organeb i 'hebryngwr' y metelau trosiannol rhydocs-weithredol hyn [6, 7]. Mae cronni haearn, yn arbennig, yn idiopathig yn fras; yn wir, mae cynnydd mewn haearn yn nodwedd o ymennydd sy'n heneiddio [8–10]. Yn patholegol, mae'r croniad haearn hwn o'r ymennydd yn nodwedd o fwtaniadau mewn genynnau nad ydynt yn gysylltiedig â metaboledd haearn [11-15] yn ogystal ag amrywiaeth o glefydau niwroddirywiol eraill, ac nid oes gan rai ohonynt gysylltiad genetig penodol megis heneiddio [16], Clefyd Alzheimer [16]. 17], Ataxia Friedreich [18] a Chlefyd Parkinson [19]. Fel grŵp, gellir meddwl am anhwylderau o'r fath fel niwroddirywiad gyda chroniad haearn yr ymennydd (NBIA) er bod yr acronym hwn yn aml wedi'i gyfyngu i'r rhai y nodwyd cysylltiad genetig ar eu cyfer [11, 13, 14].
Yn achos gorlwytho haearn, yr amcan yw 'glanhau' y corff o haearn gormodol oherwydd diffyg mewn cymeriant haearn cell neu efflux. Yma yr amcan yw gor-gystadlu chelators haearn ffisiolegol gyda'r cyffur; cyfansoddyn sydd â ffarmacocineteg dda ac affinedd uchel â haearn fferrus yw'r cyffur targed. Gan fod y corff yn orlawn â'r metel hanfodol, nid oes llawer o bryder ynghylch achosi diffyg yn ystod y driniaeth. Mae trin clefyd yr ymennydd â therapi chelation haearn yn gofyn am strategaeth wahanol. Nid problem o orlwytho haearn systemig yw hon, ond problem o haearn yn cronni mewn meysydd patholeg gyda sequelae niweidiol i lawr yr afon. Mae cronni haearn sy'n gysylltiedig ag oedran mewn clefyd Parkinson (PD), er enghraifft, o bosibl yn cyfrannu at ddifrod cellog ocsideiddiol sy'n gysylltiedig â straen [20]. Mae haearn labile gormodol yn hyrwyddo cam-blygu -synuclein mewn niwronau substantia nigrol. Gall defnyddio chelator affinedd uchel arwain at rywfaint o leihad yn llwyth haearn yr ymennydd ond yn sicr bydd yn achosi diffyg haearn sydd yn y boblogaeth oedrannus, o leiaf, yn cael ei wrthgymeradwyo o ystyried y diffyg haearn systemig sy'n gyffredin i'r grŵp oedran hwnnw [21] . Mae gan gelator sydd â'r affinedd optimaidd y potensial i leihau cronni haearn yn ogystal â'r straen ocsideiddiol cysylltiedig oherwydd gormodedd o haearn labile a phrosesau afiechyd sylfaenol.
Cistanche tubulosaaEffeithiau Cistanche
Un chelator a gymeradwywyd i'w ddefnyddio i drin gorlwyth haearn a achosir gan drallwysiad mewn cleifion thalasaemia yw deferiprone (DFP, enw brand Ferriprox) [5, 22]. Mae DFP hefyd wedi'i ddefnyddio wrth drin ataxia Friedreich [23] a chlefyd Parkinson [24, 25]. Mewn meta-ddadansoddiad, dangoswyd bod DFP yn darparu gostyngiadau sylweddol yn y cynnwys haearn myocardaidd yn ogystal â mwy o amddiffyniad cardiaidd mewn cleifion thalasaemia na deferoxamine, yr asiant chelating haearn clasurol [5]. Ar y llaw arall, mae DFP yn cael ei fetaboli'n gyflym gan yr afu [26] ac mae gwaith mwy diweddar wedi dangos ei fod yn chelates Fe2 plus ar safle gweithredol demethylases histone lysin sy'n ddibynnol ar haearn, gweithgaredd sy'n cydberthyn â sytowenwyndra nas cydnabuwyd yn flaenorol [27]. Mae'r canfyddiad hwn yn tanlinellu cyfyngiad allweddol yn y defnydd o therapi chelation haearn, sef cystadleuaeth gan y cyffur ar gyfer haearn sy'n hanfodol yn ffisiolegol, boed mewn storfa haearn neu brotein sy'n gartref i rywogaeth haearn brosthetig. Serch hynny, mae DFP, er enghraifft, wedi dangos effeithiolrwydd mewn triniaeth prawf Cam 2 o glefyd Parkinson fel y nodir gan ddadansoddol (llwyth haearn ymennydd llai gan T2- MRI pwysol) a mynegeion ymddygiadol (gweithrediad niwronau gwybyddol a motor) [ 24, 25].
Fodd bynnag, mae affinedd DFP ar gyfer Fe3 a mwy yn parhau i fod yn bryder. Y rhywogaeth sefydlog DFP-haearn yw'r tris-cymhleth, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Er bod niwtraliaeth y cyfadeilad hwn yn ddelfrydol ar gyfer symud haearn allan o'r gell, mae'r sefydlogrwydd cyson ar ei gyfer, ~1037, yn gwneud DFP yn sborionwr haearn go iawn; yn y cyd-destun hwn, mae ei ataliad o ensym haearn fel lysin demethylase yn rhagweladwy [27]. Mae'r pryder hwn yn adlewyrchu'r angen i ddatblygu chelators haearn sydd â'r athreiddedd pilen o DFP ond affinedd sylweddol wannach ar gyfer Fe2 plus a Fe3 plus . Mae'r nodwedd olaf hon yn cyfyngu ar ysborion cyffuriau metel prosthetig a photensial thermodynamig yr asiant chelating i gataleiddio'r awto-ocsidiad haearn fferrus sy'n arwain at gynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol. Yn y bôn, mae chelators haearn fferrig cryf yn cataleiddio eiddo pro-oxidant Fe2 plws [29]. Yn yr astudiaeth hon, rydym yn adrodd sut mae chelator haearn o'r fath gyda chysylltiadau haearn fferrig a fferrus cymedrol yn modiwleiddio'r fflwcs haearn yng nghelloedd endothelaidd microfasgwlaidd yr ymennydd sy'n ffurfio'r rhwystr gwaed-ymennydd (BBB).
Pils Cistanche
Mae'r cyffur hwn, PBT434 [5,7-dichloro-2-((methylamino)methyl)-8-hydroxy-3-methylquinazolin-4 (3H)-one, Ffig 1A] , yn ffurfio cyfadeilad haearn bis gyda chysonion sefydlogrwydd boncyff o ~11 a ~15 ar gyfer Fe2 plwsa Fe3 plws, yn y drefn honno [30]. Fe wnaeth PBT434 atal colli niwronau substantia nigra pars compacta (SNpc), gostwng croniad nigral -synuclein, lleihau cynnwys haearn cysylltiedig â model clefyd PD yn y midbrain, ac achub perfformiad modur mewn dau fodel llygoden o glefyd Parkinson heb unrhyw ddisbyddiad ymddangosiadol o siopau haearn systemig [30]. Mae PBT434 hefyd yn effeithiol mewn modelau murine o Atroffi System Lluosog (MSA) [30, 31], anhwylder modur sy'n debyg o ran cyflwyniad i Parkinson's ond a nodweddir gan -synuclein cam-blygu a chroniad dilynol sy'n achosi ffurfio cynhwysiant cytoplasmig glial sy'n nodnod. patholeg y clefyd [32]. Yn arwyddocaol, gostyngodd PBT434 farcwyr straen ocsideiddiol mewn modelau PD llygoden [30] gan nodi 1) bod PBT434 wedi targedu siopau haearn a oedd fel arall wedi'u paratoi i weithredu fel pro-ocsidyddion a 2) nad oedd PBT434 yn cryfhau'r cytotoxicity eginol hwn sy'n seiliedig ar ocsidiad. Mae PBT434 wedi cwblhau astudiaeth Cam 1 yn foddhaol [33].
Cynlluniwyd y gwaith a gyflwynir yma i archwilio'r effaith y mae PBT434 yn ei chael ar fasnachu haearn yng nghelloedd rhwystr yr ymennydd, y celloedd endothelaidd microfasgwlaidd sydd ynghyd â'r glia gwaelodol yn ffurfio'r rhwystr gwaed-ymennydd. Mae'r astudiaethau hyn wedi defnyddio llinell gell endothelaidd anfarwoledig sydd wedi'i dilysu'n dda mewn fformatau diwylliant monolayer a thrawswell [34-37]. Prif amcan yr astudiaethau hyn oedd pennu cineteg y cymeriant haearn a'r elifiad o'r celloedd hyn a'u modiwleiddio erbyn PBT434. Defnyddiwyd model Transwell BBB hefyd i ddangos y fflwcs trawsgellog PBT434 deugyfeiriadol ar draws y rhwystr celloedd endothelaidd. Dangosodd y model mewn termau moleciwlaidd bod PBT434 yn atal cymeriant haearn trwy chelation tra'n ysgogi alllif haearn. Mae astudiaethau delweddu celloedd yn dangos bod PBT434 yn cael mynediad i'r un pwll haearn labile a archwiliwyd gan Fe2 plwsasiant chelating, 2,2'-bipyridine neu bipyridyl, a stiliwr fflwroleuol ar gyfer haearn fferrus. Mae'r canlyniadau'n awgrymu mecanwaith gweithredu posibl ar gyfer PBT434 sy'n cynnwys ataliad rhag cymryd haearn systemig yn y BBB, a dal a storio haearn yr ymennydd yn y gofod rhyngosodol.
Canlyniadau
1. Nid oes gan PBT434 unrhyw effeithiau sytotocsig ar gelloedd endothelaidd microfasgwlaidd yr ymennydd
Er mwyn pennu ystod briodol o grynodiadau gweithio ar gyfer PBT434 yn ein diwylliant celloedd in vitro, gwnaethom ddefnyddio'r assay MTT i fonitro swyddogaeth mitocondriaidd hBMVEC mewn ymateb i PBT434. Yn seiliedig ar adroddiadau blaenorol [30], wedi cael eu trin ag ystod o grynodiadau PBT434 hyd at 100 μM am 24h. Ni welsom unrhyw newidiadau sylweddol yn hyfywedd hBMVEC gydag unrhyw grynodiad a brofwyd (Ffig 2).
2. Mae PBT434 yn cael ei ddefnyddio'n gyflym a'i fasnachu ar draws rhwystr hBMVEC
Mae PBT434 yn gyffur bio-ar gael ar lafar a all dreiddio'n hawdd i'r BBB, fel y gwelir mewn astudiaethau a gynhaliwyd mewn llygod a bodau dynol [30, 38, 39]. Gwnaethom fonitro'r casgliad o PBT434 mewn hBMVEC a dyfwyd mewn haenau mono gan ddefnyddio PBT434 â label 14C fel traciwr radio. Dangosodd y data, yn y cam cyntaf, fod 14C-PBT434 wedi cydbwyso'n gyflym rhwng y cyfrwng derbyn a'r gell. Dilynwyd y defnydd cychwynnol hwn gan groniad araf ychwanegol dros 3 h a ddangosodd gyfradd o 30.1 ± 9.8 pmol/mg/h (Ffig 3A). Yn y protocol derbyn, caiff y nifer sy'n ei dderbyn ei ddiffodd a chaiff celloedd eu golchi ar 4˚C cyn prosesu ar gyfer croniad 14C-PBT434 (Dulliau). Mewn arbrawf ar wahân, fe wnaethom archwilio alllif 14C-PBT434 o hBMVEC ar ôl cyfnod llwytho o 30 munud. Yn y protocol efflux, mae celloedd yn cael eu golchi ar 25˚C. Mae'r data yn Ffig 3B yn dangos, yn y golchiad 25˚C, bod tua 92 y cant o'r 14C-PBT434 a gronnwyd mewn celloedd wedi'i golli (cf 550 pmol 14C-PBT434/mg protein yn 3A ar 30 munud i 43 pmol 14C-PBT434/mg protein ar t=0 mewn 3B). Bu colled araf pellach o'r 14C-PBT434 oedd yn weddill (Ffig 3B). Mae'r data'n awgrymu dwy agwedd ar groniad ac alllifiad PBT434 gan hBMVEC. Mae fflwcs ar draws y bilen plasma yn prysur gyrraedd yr hyn sy'n ymddangos yn gydbwysedd, boed yn ystod y cymeriant neu'r alllif. Fodd bynnag, yn y ddwy broses, mae'n ymddangos bod proses arafach arall. Mae hyn yn awgrymu, o fewn y gell, bod rhyw ffracsiwn o gell PBT434 mewn locale/cyflwr sydd mewn perthynas cyflwr cyson cinetig â'r ffracsiwn mewn cydbwysedd â'r ardal allgellog. Amcangyfrifodd y dadansoddiad cinetig a nodwyd yn Ffig 3B fod y gronfa hon o PBT434 wedi'i chynrychioli gan 27 ± 4 pmol / mg o brotein yn y lysate cell pan gafodd celloedd eu trin ag adweithydd 20 μM.
I archwilio fflwcs trawsgellog PBT434, fe wnaethom ddefnyddio model BBB in vitro wedi'i ddilysu'n dda gan ddefnyddio wedi tyfu ar ochr apigol pilen drawswellt [35, 36, 40, 41]. Dilyswyd priodweddau rhwystrol y diwylliannau trawswellt hyn trwy feintioli eu gwrthiant trydanol trawsendothelaidd (TEER) a'u hanathreiddedd i dextran â label FITC (Ffig S1). Cymharwyd y nifer a oedd yn cael 14C-PBT434 ar yr ochr luminal (neu apigol, gwaed) (Ffig 4A) â'r nifer a oedd yn cael ei dderbyn ar y bilen abluminal (neu fasochrol, ochr yr ymennydd) (Ffig 4C). Yn yr un arbrawf, cafodd yr efflux cyfatebol (fflwcs trawsgellog) ei feintioli gan ymddangosiad 14C-PBT434 yn y siambr efflux (Ffig 4 paneli B a D). Darperir cyfraddau'r prosesau hyn yn Nhabl 1. Mae'r data màs a ddangosir yn Ffig 4 (paneli B a D) yn dangos bod fflwcs net PBT434 ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd model hwn yr un fath i'r ddau gyfeiriad. Roedd 976 ±185 pmol 14C-PBT434 wedi cronni yn y siambr waelodol (Ffig 4B) a 1033 ± 210 pmol wedi'i feintioli yn y siambr waelodol (Ffig 4D). Adlewyrchwyd y cywerthedd agos hwn hefyd yn y cyfraddau tebyg iawn o alllif PBT434 ar y ddwy bilen rhwystr (Tabl 1). Fodd bynnag, roedd nifer sylweddol uwch o PBT434 yn y bilen fasochrol yn y model rhwystr hwn fel y dangosir gan y colled cyfansawdd ~50 y cant yn uwch o'r siambr waelodol (Ffig 4C) a oedd yn cyfateb i gyfradd ~ 40 y cant yn uwch o gyfradd cymeriant celloedd ymddangosiadol. (Tabl 1). Rhagfynegwyd y byddai defnydd mwy cadarn yn arwain at fwy o gronni. Dangosodd dadansoddiad o'r celloedd ar 3h eu bod wedi cadw ~6 μM PBT434 waeth beth fo'r cyfeiriad fflwcs. Y gwerthoedd oedd 8.1 ± 1.3 μM (apical i gwaelodol) a 4.7 ± 1.2 μM (sylfaenol i apigol). Fel y nodwyd uchod, mae'r dadansoddiad hwn yn dilyn golchi'r celloedd cyn lysis a meintioli cyfanswm protein celloedd a 14C-PBT434. Yn ogystal, roedd y cyfrwng yn y siambr apical yn cynnwys RPMI ynghyd â 10 y cant FBS a 10 y cant NuSerum tra bod y siambr 'ymennydd' gwaelodol yn cynnwys RPMI (Dulliau) yn unig. Casgliad rhesymol oedd bod y 'defnydd' uwch yn y bilen waelodol yn adlewyrchu arsugniad arwyneb celloedd o PBT434 a oedd wedi'i gyfyngu yn y siambr apigol gan bresenoldeb cydrannau protein yn y serwm. Ar ôl golchi'r celloedd ar gyfer cronni PBT434, tynnwyd y deunydd arsugniad hwn (a gofrestrwyd fel 'defnydd'). Roedd ailadrodd yr arbrawf fflwcs hwn ond gyda serwm yn y siambr waelodol yn dangos, yn wir, bod serwm wedi atal yr arsugniad PBT434 arwyneb celloedd tebygol hwn (S2 Ffig).
3. Nid yw PBT434, yn wahanol i bipyridyl, yn cyfyngu ar argaeledd mewngellol haearn labil
Gan fod gan PBT434 affinedd mwy cymedrol ar gyfer haearn o'i gymharu â chelators haearn clasurol fel deferiprone neu bipyridyl, archwiliwyd sut y gwahaniaeth hwnnw yn cael ei adlewyrchu yn yr effaith PBT434 ar y pwll haearn labile cellog (LIP) o hBMVEC. I wneud hyn, cymerasom fantais ar yr athraidd, Fe2 plws-lliw fflwroleuol penodol FerroOrange, sy'n adweithio â haearn cytoplasmig elusennol. Gwelsom abladiad sylweddol o fflworoleuedd mewn celloedd pan gânt eu trin â bipyridyl, sy'n gyson â chelation yr LIP gan y chelator haearn fferrus affinedd uchel hwn ac felly'n rhwystro gweithrediad y dangosydd haearn fflwroleuol (Ffig 5A). Mewn cyferbyniad, ni chystadlodd PBT434 â FerroOrange for Fe2 plws, ymddygiad sy'n gyson â'i affinedd mwy cymedrol [30]. Dangosodd y canlyniadau fod PBT434, ond nid y PBT434-wedi cwrdd â deilliad anactif, wedi achosi cynnydd o 34 ± 9 y cant mewn Fe hygyrch FerroOrange.2 plwsgan awgrymu bod yr asiant chelating hwn yn cynnull haearn o fewn y gell heb wenwyndra cydamserol. Mae'r data a gyflwynir isod yn awgrymu bod yr haearn hwn wedi dod o ferritin.
Dangoswyd PBT434 yn flaenorol i adfer mynegiant protein ferroportin wedi'i ddihysbyddu mewn llygod sydd wedi'u trin â MPTP i lefel debyg i lygod anlesioned [30]. Awgrymodd y canlyniad hwn, ynghyd â'r cynnydd mewn staenio haearn fferrus mewngellol mewn ymateb i PBT434, effaith bosibl ar y system ymateb haearn cellog a swyddogaeth proteinau sy'n gysylltiedig â haearn i lawr yr afon. Er mwyn asesu hyn, fe wnaethom yn gyntaf gynnal dadansoddiad meintiol PCR (qPCR) o'r effaith PBT434 ar helaethrwydd y trawsgrifiadau ar gyfer nifer o broteinau trin haearn (Ffig 6). Er na chafodd y trawsgrifiadau ar gyfer y protein efflux haearn, ferroportin (Fpn), a'r ddau warchodwr haearn cytoplasmig, PCBP1 a 2 eu heffeithio, roedd digonedd y mRNAs ar gyfer y derbynnydd transferrin (TfR), a'r ferroxidase, ceruloplasmin (Cp), yn gwneud hynny. newid. Cynyddodd trawsgrifiadau TfR a Cp 2.8 a 3.{6-plyg, yn y drefn honno. Mae mynegiant derbynnydd transferrin (TfR) yn gysylltiedig â'r system elfen sy'n ymateb i haearn (IRE) / protein rheoleiddio haearn (IRP) [42-44]. Mae'r cynnydd mewn mRNA TfR yn awgrymu bod PBT434 yn cystadlu â'r cyflenwad haearn dibynnol PCBP ar gyfer cydosod y clwstwr Fe, S sy'n trosi'r IREBP rheoleiddiol o brotein sy'n rhwymo RNA i aconitase cytosolig [45]. Felly, mae PBT434 yn symud y modiwleiddio rheoliadol hwn tuag at rwymo RNA a'r ataliad cyfatebol o ddiraddiad mRNA TfR. Mewn diffyg haearn cell, mae mynegiant Cp, yn rhannol, yn cael ei reoleiddio gan HIF-1 [46]. Mae cynnydd mewn ffwythiant HIF-1 yn dilyn o ganlyniad i ddymchwel ei hydroxylation gan actifedd prolyl hydroxylase mewn adwaith haearn-ddibynnol [47]. Fel yn achos yr IREBP, mae'n ymddangos bod PBT434 yn lleihau'r gronfa haearn sy'n gweithredu fel cyd-ffactor mewn hydroxylation a diraddiad HIF. Yn y model hwn, mae'r cynnydd yn lefel cyflwr cyson yr actifydd trawsgrifio hwn yn cynyddu trawsgrifiad Cp.
Gan ddefnyddio cyfuniad o ddadansoddiad ELISA a blotio gorllewinol, gwnaethom archwilio mynegiant proteinau trin haearn mewn PBT434 neu PBT434-hBMVEC wedi'i drin; rhoddir enghreifftiau o'r dadansoddiadau WB yn Ffig 7A. Roedd y data'n dangos bod digonedd monomer TfR a dimer wedi'u cynyddu'n sylweddol o 24 awr ynghyd â Cp (Ffig 7B a 7C). Roedd y ddau gynnydd yn gyfochrog â'r cynnydd dibynnol PBT yn y trawsgrifiadau priodol (Ffig 6), Mewn cyferbyniad, roedd mynegiant y protein efflux haearn, Fpn, yn ansensitif i driniaeth PBT434 (Ffig 7D).
Fe wnaethom ddefnyddio ELISA fel dull ychwanegol i feintioli'r newidiadau plyg a nodir gan y data blot gorllewinol. Felly, cafodd hBMVEC eu trin â PBT434 am 24 awr a chafodd lysates celloedd eu hasesu gan ELISA ar gyfer TfR (Ffig 8A). Roedd y cynnydd plyg mewn TfR mewn ymateb i driniaeth PBT434 a fesurwyd gan ELISA yn cyfateb i'r hyn a ddarparwyd gan ddadansoddiad o'r blotiau gorllewinol (Ffig 7B). Defnyddiwyd ELISA hefyd i asesu helaethrwydd protein Cp sydd wedi'i secretu a'i gysylltu â GPI, gan ddefnyddio celloedd HepG2 fel rheolaeth gadarnhaol. O ran Cp sy'n cael ei gyfrinachu i'r cyfryngau twf, roedd y dull hwn yn gyfyngedig o ran bod digonedd scp mewn cyfryngau cyflyredig HepG2 a hBMVEC ar neu'n is na therfyn sensitifrwydd is y assay hwn (Ffig S3). Fodd bynnag, roedd yn galluogi asesu helaethrwydd GPI-Cp. Yn y dull hwn, cafodd celloedd eu trin â phosphatidylinositol-benodol phospholipase C (PI-PLC), sy'n hollti'r angor GPI; cafodd y cyfryngau a gyflyrwyd felly eu crynhoi a'u dadansoddi gan y Cp-ELISA. Er bod y dull hwn yn dangos bod PBT434 wedi cynyddu faint o GPI-Cp mewn celloedd HepG2, methodd eto â chanfod unrhyw Cp a ryddhawyd gan y PI-PLC (Ffig 8B). Roedd ELISA hefyd yn cynnig dull uniongyrchol ar gyfer meintioli ferritin. I wneud hynny, llwythwyd hBMVEC â 1 uM Fe-citrate am 24 awr, ac yna triniaeth yn absenoldeb neu bresenoldeb PBT434 am 1 awr ychwanegol. Bu'r lysates celloedd canlyniadol yn destun dadansoddiad ELISA ar gyfer ferritin (Ffig 8C). Mewn cyferbyniad â'r cynnydd mewn TfR, fe wnaeth triniaeth â PBT434 ostwng protein ferritin (Ft) ~18 y cant . Yn wir, roedd y golled hon o brotein Ft yn amlwg ar ôl triniaeth 1h yn unig gyda'r adweithydd. Gellir cydberthyn natur amserol y canlyniad hwn â'r cynnydd mewn Fe2 plws elusennol a nodir uchod yn dilyn triniaeth 30 munud gyda PBT434. Fel y trafodwyd yn ddiweddarach, mae dymchwel ferritin wedi'i ddangos yn dilyn triniaeth gyda chyfryngau chelating eraill sy'n parhau i fod yn gell, Fe2 ynghyd â chyfryngau celu [48].
4. 55Ab2 plwscaiff y nifer sy'n eu derbyn ei rwystro gan gymhlethdodau â PBT434
O ystyried cydbwysedd cyflym PBT434 yn hBMVEC o fewn 30 munud, o'i gymharu â'r nifer araf, deuphasig sy'n cael Fe2 ynghyd â dros 24h [49], roeddem yn rhagdybio nad oedd PBT434 a Fe2 plus yn rhannu'r un mecanwaith derbyn. Er mwyn profi hyn, cafodd monohaenwyr eu deor â radiolabel 55Fe2 a mwy yn absenoldeb neu bresenoldeb PBT434 neu PBT434-met, a chafodd 55Fe2 a mwy na 3 h ei fonitro (Ffig 9A). Gostyngodd PBT434 gyfradd derbyn 55Fe2 a mwy yn sylweddol, yn ogystal â lleihau'r casgliad cyffredinol o 55Fe2 a mwy mewn lysates cell (Ffig 9C). Ni welwyd yr effaith hon gyda PBT{434-met. Mae cymhariaeth o gyfraddau derbyn PBT434 i 55Fe yn dangos bod llwybrau trafnidiaeth ar wahân yn defnyddio PBT434 ac Fe2 plus. Ymhellach, mae'r ataliad o dderbyn 55Fe-ym mhresenoldeb PBT434 ond nid PBT434-met yn awgrymu nad yw cyfadeilad haearn PBT allgellog yn ligand ar gyfer y cludwyr haearn fferrus yn hBMVEC, sef ZIP8, a ZIP14.
Atchwanegiadau Cistanche
Er mwyn archwilio ymhellach rôl PBT434 mewn croniad haearn, gwnaethom brofi'r effaith a gafodd ei rag-amlygiad ar 55Fe2 a mwy. Roedd celloedd a gafodd eu trin ymlaen llaw â PBT434 a oedd, ar ôl golchi, yn agored i 55Fe2 a mwy yn dangos cynnydd yn y gyfradd derbyn a chronni o 55Fe2 plws ar ôl 3h (Ffig 9, paneli B a D). Cynhaliwyd y croniad cynyddol hwn am o leiaf 24 awr. Mae'r data hyn yn awgrymu bod cyn-amlygiad celloedd i PBT434 yn barhaus yn cryfhau'r defnydd o haearn. Yn annisgwyl, dangosodd PBT434-bod y rhag-driniaeth gynnydd hefyd yn y nifer sy'n cael eu derbyn a'r cronni (Ffig 9B), ond nid oedd yr effaith hon mor sylweddol na pharhaus â'r hyn a ddangoswyd gan PBT434.
Rydym wedi dangos bod y defnydd o haearn o 59Fe-transferrin yn cael ei gefnogi gan ferri-reduction a ferro-treiddiad yn y bilen plasma o have [50, 51]. Un canlyniad arbrofol i gefnogi'r model defnydd haearn TBI hwn oedd chwalu'r defnydd hwn trwy atal gweithgaredd all-cytoplasmig ferrireductase; canlyniad arall oedd ataliad o 60 y cant o'r defnydd o haearn TBI gan ferrozine, asiant chelating haearn fferrus cryf [50]. Defnyddiwyd y strategaeth olaf hon i ddangos bod PBT434, ond nid PBT434-wedi bodloni, hefyd yn atal cymeriant haearn TBI (Ffig 10).
5. Mae PBT434 yn ysgogi 55Fe2 ynghyd ag efflux sy'n ddibynnol ar Fpn
Mae gan PBT434 tua 20 y cant o allu deferiprone i gynhyrchu ysgogiad ymddangosiadol o Fe2 ynghyd ag alllif o gelloedd niwronaidd [30]. Fe wnaethom asesu alllif 55Fe2 a mwy o hBMVEC yn absenoldeb neu bresenoldeb PBT434 mewn celloedd rheoli neu gelloedd wedi'u trin â hepcidin bach, PR73. Mae Hepcidin yn hormon peptid a geir yn systemig ac yn interstitium yr ymennydd sy'n clymu i Fpn ac yn targedu'r cludwr ar gyfer diraddio. Mae effeithiau hepcidin ar swyddogaeth allforio haearn Fpn wedi'u hastudio'n helaeth [52-54]. Rydym wedi dangos yn flaenorol bod alllif Fe2 a mwy o hBMVEC yn ddibynnol ar Fpn [35, 49]. Mae gan PR73 EC50 o ~4 nM ar gyfer diraddio Fpn mewn assay gohebydd GFP [55]. hBMVEC mewn monolayers eu llwytho gyda 55Fe2 plws am 24 h yn absenoldeb neu bresenoldeb PR73. Yna cafodd 55Fe-efflux ei fesur dros gyfnod o 5h yn absenoldeb neu bresenoldeb parhaus PR73 ar y cyd ag absenoldeb a phresenoldeb PBT434 (Ffig 11). Er bod PR73 wedi dymchwel 55Fe alllifiad o'r diwylliannau rheoli a PBT{434-wedi'u trin, roedd PBT434 yn atal yn rhannol yr ataliad oherwydd y mini-hepcidin. Yn absenoldeb PBT434, cafodd alllif haearn o'r diwylliannau a gafodd eu trin gan PR ei daro i lawr ~75 y cant tra bod dymchwel yn y diwylliannau a driniwyd gan PBT yn ~50 y cant yn unig (Ffig 11 a Thabl 2). Gellir dod i ddau gasgliad o'r canlyniadau hyn. Yn gyntaf, mae dymchwel Fpn gan PR73 i lawr-reoleiddio 55Fe-efflux ym mhresenoldeb yn ogystal ag absenoldeb PBT434. Yn ail, o dan y naill amod neu'r llall, mae PBT434 yn cefnogi ysgogiad sylweddol er mai bach o alllif haearn.
Cyfeiriadau
1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Selators haearn synthetig a naturiol: potensial therapiwtig a defnydd clinigol. Cemeg Med y Dyfodol. 2009; 1(9): 1643-70.
2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Safbwyntiau Newydd mewn Therapi Chelation Haearn ar gyfer Trin Clefydau Niwro-ddirywiol. Fferyllol (Basel). 2018; 11(4):109.
3. Tosato M, Di Marco V. Therapi Chelation Metel a Chlefyd Parkinson: Adolygiad Beirniadol ar Thermodynameg Ffurfiant Cymhleth Rhwng Ionau Metel Perthnasol a Chyffuriau Addawol neu Sefydledig. Biomoleciwlau. 2019; 9(7).
4. Hedera P. Diweddariad ar reolaeth glinigol clefyd Wilson. Appl Clin Genet. 2017; 10:9-19.
5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Effeithiolrwydd a diogelwch cymharol deferoxamine, deferiprone a deferasirox ar thalasaemia difrifol: meta-ddadansoddiad o 16 o dreialon rheoledig ar hap. PLoS Un. 2013; 8(12): e82662.
6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Metelau catalytig, ascorbate, a radicalau rhydd: cyfuniadau i'w hosgoi. Radiat Res. 1996; 145(5):532–41. PMID: 8619018
7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Straen Oxidative: Modulator Allweddol mewn Clefydau Niwro-ddirywiol. Moleciwlau. 2019; 24(8).
8. Ashraf A, Clark M, Felly PW. Heneiddio Dyn Haearn. Neurosci Heneiddio Blaen. 2018; 10:65.
9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M, et al. Mapio R2* ar gyfer haearn yr ymennydd: cysylltiadau â gwybyddiaeth wrth heneiddio'n normal. Heneiddio Neurobiol. 2015; 36(2):925-32.
10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Haearn, heneiddio ymennydd, ac anhwylderau niwroddirywiol. Nat Parch Neurosci. 2004; 5(11):863–73.
11. Di Meo I, Tiranti V. Dosbarthiad a phathogenesis moleciwlaidd syndromau NBIA. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.
12. Levi S, Finazzi D. Niwroddirywiad gyda chroniad haearn yr ymennydd: diweddariad ar fecanweithiau pathogenig. Ffarmacol blaen. 2014; 5:99-.
13. Levi S, Tiranti V. Niwroddirywiad ag Anhwylderau Cronni Haearn yr Ymennydd: Modelau Gwerthfawr sy'n anelu at Ddeall Pathogenesis Dyddodiad Haearn. Fferyllol (Basel). 2019; 12(1).
14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Niwroddirywiad gyda Chroniad Haearn yr Ymennydd: Amrywiaeth Genetig a Mecanweithiau Pathoffisiolegol. Annu Parch Genomeg Hum Genet. 2015; 16:257-79.
15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Niwroddirywiad gyda chroniad haearn yr ymennydd: trosolwg. Iran J Neurol Plentyn. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764
16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogi P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Mae Modelu Bôn-gelloedd o Neuroferritinopathi yn Datgelu Haearn fel Penderfynydd Senescence a Ferroptosis yn ystod Heneiddio Niwronaidd. Adroddiadau Bôn-gelloedd. 2019; 13(5):832–46.
17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Haearn a Chlefyd Alzheimer: O Pathogenesis i Oblygiadau Therapiwtig. Neurosci blaen. 2018; 12:632.
18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Rôl Haearn yn Ataxia Friedreich: Mewnwelediadau O Astudiaethau mewn Meinweoedd Dynol a Modelau Cellog ac Anifeiliaid. Neurosci blaen. 2019; 13:75.
19. Puschmann A. Genynnau Newydd sy'n Achosi Clefyd Parkinson Etifeddol neu Parkinsonism. Cynrychiolydd Curr Neurol Neurosci 2017; 17(9):66.
20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Targedu metaboledd haearn wrth ddarganfod a dosbarthu cyffuriau. Nat Parch Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.
21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Nifer yr achosion o anemia mewn pobl 65 oed a hŷn yn yr Unol Daleithiau: tystiolaeth o gyfradd uchel o anemia anesboniadwy. Gwaed. 2004; 104 (8):2263–8.
22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Triniaeth Deferasirox, deferiprone a desferrioxamine mewn cleifion mawr thalasaemia: haearn cardiaidd a chymhariaeth swyddogaeth a bennir gan ddelweddu cyseiniant magnetig meintiol. Haematologica. 2011; 96(1):41–7.
23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Deferiprone yn Friedreich ataxia: hap-brawf rheoledig 6-mis. Ann Neurol. 2014; 76(4):509–21.
24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. Chelation haearn ymennydd trwy deferiprone yng ngham 2 hap-dreial clinigol wedi'i reoli gan blasebo dwbl-ddall ar gyfer clefyd Parkinson. Cynrychiolydd Gwyddonol 2017; 7(1):1398.
25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Targedu haearn chelate fel dull therapiwtig ar gyfer clefyd Parkinson. Arwydd rhydocs gwrthocsid. 2014; 21(2): 195-210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381
26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et al. Proffiliau metabolig wrinol mewn bodau dynol a llygod mawr o 1,2-dimethyl- ac 1,2-unau 3-hydroxy pyridine-4-wedi'u hamnewid â dietyl. Metabolaeth a Gwarediad Cyffuriau. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218
27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Pontydd A, et al. Deferiprone: Histone Lysine Pan-ddetholus Demethylase Gweithgaredd Ataliad a Gweithgaredd Strwythur Astudiaeth Perthynas. Cynrychiolydd Gwyddonol 2019; 9(1): 4802.
28. Hider R. Roedd datblygiadau diweddar yn canolbwyntio ar chelators haearn llafar. Adroddiadau Thalasaemia. 2014; 4 (2).
29. Kosman DJ. Metabolaeth haearn mewn aerobau: rheoli hydrolysis haearn fferrig ac awtocsidiad haearn fferrus. Coord Chem Parch. 2013; 257(1):210–7.
30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Meistri CL, et al. Mae'r cyfansoddyn newydd PBT434 yn atal niwroddirywiad trwy gyfrwng haearn a gwenwyndra alffa-synuclein mewn modelau lluosog o glefyd Parkinson. Cymun Acta Neuropathol. 2017; 5(1):53.
31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, golygyddion. Mae PBT434 yn Cadw Neuronau Dopaminergig, Yn Lleihau Oligomerization alffa-Synuclein, ac yn Gwella Swyddogaeth Modur mewn Model Atroffi System Lluosog Murine Trawsgenig. Annals of Neurology; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ USA.
32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: O fecanweithiau sylfaenol i therapiwteg arbrofol. Anhwylder Perthynas Parkinsonism. 2020; 73:94-104.
33. Dawson VL, Dawson TM. Therapïau addawol i addasu clefydau ar gyfer clefyd Parkinson. Gwyddoniaeth Meddygaeth Drosiadol. 2019; 11(520):eaba1659.
34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Astudiaeth gymharol o bedair llinell celloedd endothelaidd capilari ymennydd dynol anfarwoledig, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, a BB19, ac optimeiddio amodau diwylliant, ar gyfer model rhwystr gwaed-ymennydd in vitro ar gyfer astudiaethau athreiddedd cyffuriau. Hylifau a Rhwystrau'r CNS. 2013; 10(1):33.
35. McCarthy RC, Kosman DJ. Mae ceruloplasmin celloedd glial a hepcidin yn rheoleiddio effwcs haearn yn wahanol i gelloedd endothelaidd microfasgwlaidd yr ymennydd. PLoS Un. 2014; 9(2): e89003.
36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Mae'r cludwyr hydoddyn ZIP8 a ZIP14 yn rheoleiddio croniad manganîs yng nghelloedd endothelaidd microfasgwlaidd yr ymennydd ac yn rheoli lefelau manganîs yr ymennydd. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.
37. Stins MF, Moch Daear J, Sik Kim K. Ymlediad bacteriol a thrawscytosis yng nghelloedd endothelaidd microfasgwlaidd yr ymennydd dynol a drawsluniwyd. Pathog Microb. 2001; 30(1):19–28.
38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Astudiaeth Ddynol Gyntaf o PBT434, Atalydd Moleciwl Bach Newydd o -Agregu Synuclein (S4.001). Niwroleg. 2019; 92(15 Atodiad):S4.001.
39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Astudiaeth Cam 1 o PBT434, Atalydd Moleciwl Bach Newydd o Gydgrynhoi -Synuclein, mewn Gwirfoddolwyr Oedolion ac Oedolion Hŷn (4871). Niwroleg. 2020; 94(15 Atodiad):4871.
40. McCarthy RC, Kosman DJ. Ysgogi mynegiant ceruloplasmin cell glioblastoma C6 gan interleukinau cyfagos sy'n deillio o endothelia yn yr ymennydd dynol mewn system model rhwystr gwaed-ymennydd in vitro. Cyfathrebu a Signalau Celloedd: CCS. 2014; 12:65.
41. McCarthy RC, Parc YH, Kosman DJ. Mae sAPP yn modiwleiddio alllif haearn o gelloedd endothelaidd microfasgwlaidd yr ymennydd trwy sefydlogi'r allforiwr haearn fferrus ferroportin. Adroddiadau EMBO. 2014; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889
42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Dau i Tango: Rheoleiddio Metabolaeth Haearn Mamaliaid. Cell. 2010; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012
43. Zhou ZD, Tan EK. Llwybr signalau protein rheoleiddio haearn (IRP) - elfen sy'n ymateb i haearn (IRE) mewn clefydau niwroddirywiol dynol. Niwroddirywiad Moleciwlaidd. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s13024-017-0218-4 PMID: 29061112
44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Metabolaeth haearn yr ymennydd a'i aflonyddwch mewn clefydau niwrolegol. J Neural Transm. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066
45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. Mae cyfadeilad gwarchodwr PCBP1-BolA2 yn darparu haearn ar gyfer cydosod clwstwr cytosolig [2Fe-2S]. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370
46. Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Llwynog PL. Rôl ffactor hypocsia-anwythol-1 wrth actifadu ceruloplasmin trwy ddiffyg haearn. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.
47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Hydroxylation Protein yn ôl Ffactor Anwythol Hypocsia (HIF) Hydroxylases: Unigryw neu Hollbresennol? Celloedd. 2019; 8(5).
48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. Mae defnyddio haearn ferritin trwy gyfrwng Ferroportin yn rhagflaenu diraddiad ferritin gan y proteasome. Embo j. 2006; 25(22):5396–404.
49. McCarthy RC, Kosman DJ. Mae angen gweithgaredd ferroportin a ferroxidase ecsocytoplasmig ar gyfer efflux haearn celloedd endothelaidd microfasgwlaidd yr ymennydd. The Journal of Biological Chemistry. 2013; 288(24):17932-40.
50. McCarthy RC, Kosman DJ. Dadansoddiad mecanyddol o groniad haearn gan gelloedd endothelaidd y BBB. Biometelau. 2012; 25(4):665–75.
51. Kosman DJ. Telos lleihau Metallo a metallo-ocsidiad mewn masnachu haearn a chopr ewcaryotig. Metelomeg. 2018; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341
52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Mae dadansoddiad strwythur-swyddogaeth o ferroportin yn diffinio'r safle rhwymo a mecanwaith gweithredu amgen hepcidin. Gwaed. 2018; 131(8):899-910.
53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin a homeostasis haearn. Biochim Bioffys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.
54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. Mae endocytosis a achosir gan hepcidin o ferroportin yn dibynnu ar hollbresennol ferroportin. Cell Metab. 2012; 15(6):918–24.
55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Mae minihepcidins wedi'u deillio o Thiol yn cadw gweithgaredd biolegol. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.
Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J Kosman
Adran Biocemeg, Ysgol Feddygaeth a Gwyddorau Biofeddygol Jacobs, Prifysgol Talaith Efrog Newydd yn Buffalo, Buffalo, NY, Unol Daleithiau America
