Rhan 2: Mae diffyg DHHC21 yn Gwanhau Camweithrediad Arennol Yn ystod Anaf Septig

Cysylltwchtina.xiang@wecistanche.com

Trafodaeth

Yn y gwaith presennol, rydym yn adrodd ar DHHC21 fel rheolydd newydd ar gyfer darlifiad arennol a gweithrediad yn ystod anaf septig. Mae ein canfyddiadau newydd yn nodi: (1) Zdhhc21devde? mae llygod yn arddangos gwell swyddogaeth arennol a llai o niwed arennol ar ôl anaf septig o'i gymharu â llygod WT; (2) mae diffyg swyddogaethol DHHC21 yn cadw darlifiad meinwe arennol, dirlawnder ocsigen, a RBF mewn anaf septig; (3) DHHC 21-palmitoylation alAR catalyzed yw sy'n ofynnol ar gyfer actifadu llwybr signalau alAR a chyfyngiad rhydwelïau arennol a achosir gan alAR. Mae'r astudiaeth hon yn rhoi cipolwg mecanistig newydd ar reoleiddio darlifiad arennol a gweithrediad yn ystod anaf septig. Rydym yn awgrymu bod diffyg swyddogaethol DHHC21 yn rhoi effeithiau amddiffynnol iswyddogaeth yr arennaumewn anaf septig a gall atal DHHC21 fod yn strategaeth therapiwtig i frwydrocamweithrediad arennolyn ystod anaf septig.

Cliciwch yma i wybod manteision echdynnu cistanche tubulosa

Hypoperfusion meinwe arennol/hypocsia yw un o brif achosion camweithrediad arennol yn ystod anaf septig3-5. Fe wnaethom ganfod hypoperfusion arennol mewn llygod ar ôl CLP a welwyd gan ddwysedd signal gwannach MSOT o gyfanswm hemoglobin, gostyngiad mewn dirlawnder ocsigen mewn meinwe arennol, a llai o RBF ar ôl anaf septig. Yn gyson â'n canfyddiadau, mae'r gostyngiad mewn RBF wedi'i arsylwi mewn cleifion sepsis ag anaf i'r arennau yn ogystal ag mewn modelau anifeiliaid mawr o anaf septig7,10l1. Mae'n werth nodi bod sawl astudiaeth yn nodi y gall camweithrediad arennol ddatblygu mewn anifeiliaid sepsis heb newid. neu hyd yn oed wedi cynyddu RBF334. Gellir priodoli'r canfyddiadau anghyson hyn i wahanol fodelau anifeiliaid a dulliau a ddefnyddir i fesur llif gwaed. Er enghraifft, er bod anaf septig polymicrobaidd a achosir gan CLP wedi'i ddefnyddio'n gyffredin, mae rhai astudiaethau'n defnyddio chwistrelliad mewnwythiennol o Escherichia coli35.

Yn ddiweddar, adroddwyd bod palmitoylation protein yn rheolydd newydd o swyddogaeth protein, sy'n ymwneud â phathogenesis a dilyniant llawer o afiechydon. Fe'i nodwyd gyntaf fel math newydd o addasiad ôl-gyfieithu gan Schmidt et al.3637. Ers hynny roedd darganfod y teulu DHHC wedi hybu ehangiad cyflym y maes hwn38,39. Mae rolau palmitoylation a PATs wedi'u hadrodd mewn nifer o gyflyrau ffisiolegol a phatholegol, gan gynnwys metaboledd lipid,cancr, afiechydon cardiofasgwlaidd, ac anhwylderau niwrolegol23,0,4. Er bod cyfranogiad palmitoylation mewn clefyd yr arennau amlsystig a chanser yr arennau wedi'i adrodd yn flaenorol23., ychydig iawn o astudiaethau a fu yn archwilio rôl swyddogaethol PATs mewnafiechydon yr arennau, yn benodol mewn camweithrediad arennol yn ystod anaf septig. Hyd eithaf ein gwybodaeth, ni yw'r cyntaf i ymchwilio i rôl DHHC2l mewn camweithrediad arennol mewn anaf septig. Mae ein canfyddiadau'n dangos bod atal DHHC21 yn achub swyddogaeth yr arennau'n fawr ac yn cadw strwythur yr arennau mewn anaf septig.

Ein hastudiaeth gan ddefnyddio Zdhhc21dp/d4? mae llygod yn dangos bod effeithiau buddiol diffyg swyddogaethol DHHC21 ar weithrediad yr arennau yn cael eu priodoli i'w gallu i wella darlifiad meinwe arennol yn ystod anaf septig. O dan amodau gwaelodol, nid yw llygod Zdhhc21ewaeP yn dangos unrhyw arwyddion o anghydbwysedd halen / dŵr na difrod strwythurol / swyddogaethol arennol5. Ac eto, mae colli swyddogaeth DHHC21 yn atal y gostyngiad septig a achosir gan anaf mewn RBF, darlifiad arennol, a dirlawnder ocsigen arennol. Ystyrir bod ymwrthedd fasgwlaidd arennol cynyddol a achosir gan fasoconstriction arennol gormodol yn brif reswm dros ddarlifiad meinwe arennol amhariad mewn anaf septig6.9. Mae ein canlyniadau'n dangos cyfranogiad alAR mewn cyfryngu gorlifiad meinwe arennol a achosir gan anaf septig, fel y dangosir gan y cynnydd mewn palmitoylation alAR a gweithrediad llwybr signalau alAR mewn anaf septig. Fodd bynnag, mae diffyg swyddogaethol DHHC21 yn atal alARpalmitoylation ac yn arwain at allu di-finiog alAR i actifadu ei effeithydd i lawr yr afon ac i gyfryngu vasoconstriction a achosir gan ffenylphrine mewn rhydwelïau arennol.

"Mae'r mecanwaith moleciwlaidd sy'n sail i reoleiddio swyddogaeth alAR gan DHHC21 yn dal i fod heb ei egluro'n llawn. Gellir priodoli'r diffyg mewn swyddogaeth alAR a achosir gan golli swyddogaeth DHHC21 i newid cydffurfiad alAR. Mae llawer o GPCRs yn dibynnu ar palmitoylation ar gyfer eu priodol. cydffurfiad mewngellol, Mae'r palmitate sydd ynghlwm yng nghynffonau terfynell C GPCRs yn mewnosod i'r bilen plasma i greu'r bedwaredd ddolen fewngellog, sy'n hanfodol ar gyfer rhyngweithio GPCRs â'u proteinau partner a lluosogi signalau GPCR17, 4. Astudiaeth flaenorol wedi nodi bod palmitoylation Albar hefyd yn digwydd yn ei ranbarth C-terminal44. Felly, gall diffyg palmitoylation lAR cyfryngol DHHC newid cydffurfiad mewngellol alAR, gan rwystro lledaeniad signalau lAR. gan fod ein canlyniadau'n dangos bod actifadu ERK, digwyddiad signalau i lawr yr afon o actifadu alAR, wedi'i atal mewn llygod Zdhhc21devider sy'n destun sept anaf ic. Fodd bynnag, mae angen cadarnhau topoleg a reoleiddir gan DHHC ar gyfer terfynell carbocsyl alAR ymhellach gan ddefnyddio crisialeg pelydr-X.

Agwedd newydd arall ar ein hastudiaeth yw defnyddio MSOT i werthuso darlifiad arennau a gweithrediad yn ystod anaf septig. Mae MSOT wedi'i adrodd fel dull di-label i fesur darlifiad gwahanol organau a thechneg ddelweddu ddibynadwy i bennu swyddogaeth yr arennau2832,45. O'i gymharu â llifmedr Doppler nad yw'n caniatáu delweddu micro-fasgwlaidd45, mae MSOT yn cynhyrchu delweddau â chydraniad gofodol uchel ar 150 um tra'n darparu asesiad meintiol o statws darlifiad ym microfasgwlaidd yr arennau. Mae'r IRDye800CW sy'n hydoddi mewn dŵr yn olrheiniwr diogel i'w ddefnyddio ar gyfer mesur cliriad arennol, ac nid yw'n achosi gwenwyndra ar ddogn mor uchel ag 20 mg / kg. Mae symudiad dau gam IRDye800CW a welsom yn gyson ag astudiaethau a gyhoeddwyd yn flaenorol. Mae ein cofnodion MSOT yn dangos mwy o oedi Tmax mewn arennau sepsis, sy'n awgrymu nam ar glirio arennol. Mae astudiaeth neffropathi yn dangos bod cydberthynas sylweddol rhwng y swyddogaeth arennol â nam a ganfuwyd gan MSOTs â difrod histolegol glomerwlaidd30. Mae ein data, sy'n gyson â chyhoeddiadau blaenorol, yn awgrymu bod MSOT yn dechneg leiaf ymwthiol a dibynadwy i fonitro darlifiad a gweithrediad arennol.

Ar hyn o bryd, nid oes unrhyw atalyddion DHHC21-penodol ar gael. Yr atalydd PAT a ddefnyddir amlaf yw 2-BP sy'n cael effaith eang ar DHHCs lluosog ac sydd hefyd yn ymyrryd â metaboledd asid brasterog47. Felly, byddai datblygu atalyddion moleciwl bach sy'n targedu DHHC21 yn benodol yn gyfeiriad addawol. Mae'n werth nodi hefyd nad alAR yw'r unig swbstrad o DHHC21. Mae nifer o swbstradau DHHC21 eraill wedi'u nodi'n ddiweddar, gan gynnwys moleciwl adlyniad celloedd endothelaidd platennau (PFCA M-1), caveolin derbynnydd estrogen-1, synthase nitrig ocsid endothelaidd (eNOS), Fyn, superoxide dismutase (SOD{{). 8}}), a PLCB122,41,4s,49, Er y tu hwnt i gwmpas yr astudiaeth bresennol, ni allwn ddiystyru'r posibilrwydd y gallai'r swbstradau hyn hefyd effeithio ar swyddogaeth arennol yn ystod anaf septig.

I gloi, mae'r astudiaeth bresennol yn dangos am y tro cyntaf bod DHHC21 yn chwarae rhan hanfodol wrth reoleiddio darlifiad arennol yn ystod anaf septig trwy fecanweithiau sy'n cynnwys palmitoylation alAR a vaso-constriction cyfryngol alAR. At hynny, mae atal DHHC21 yn cael effeithiau amddiffynnol ar swyddogaeth arennol yn ystod anaf septig.

Defnyddiau a dulliau

Adweithyddion. Rhestrir yr holl adweithyddion yn Nhabl Atodol S1.

Anifeiliaid. Prynwyd llygod Zdhhc21depher a'u llygod rheoli math gwyllt (B6C3Fe) o Labordy Jackson. Mae genoteip Zdhhc21dephe? cadarnhawyd llygod trwy ddilyniannu (Genewiz, Inc., NJ, UDA). Y preimwyr a ddefnyddiwyd ar gyfer dilyniannu oedd: AGCTGACTGAAGGGCACC(ymlaen) ac AAAACCTGTAACGCATTTCCA (cefn)23. Roedd anifeiliaid yn cael eu cynnal o dan gylchred golau/tywyll 12/{7}}a gyda mynediad am ddim i fwyd a dŵr. Defnyddiwyd llygod (16-20 wythnos) o’r ddau ryw ar gyfer yr astudiaeth hon. Mae pob arbrawf anifeiliaid yn cael ei gymeradwyo gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Prifysgol De Florida ac yn cydymffurfio â Chanllaw NIH ar gyfer Gofalu a Defnyddio Labordy

Cecal ligation a thyllu, llygod eu anesthetized ag isoflurane (3 y cant sefydlu a chynnal a chadw 1 y cant). Gwnaethpwyd toriad llinell ganol yn y rhanbarth abdomenol eillio, ac roedd y cecum yn allanol, wedi'i glymu'n dynn ar 5 mm o dan y falf ileocecal, a'i dyllog ddwywaith gyda 20- distal nodwydd medrydd i'r pwynt ligation. Roedd un mm o feces yn cael ei allwthio o bob twll twll. Yna cafodd y cecum ei ailosod, a chaewyd yr abdomen mewn dwy haen. 37 C Defnyddiwyd hydoddiant Ringer Lactated yn topig i atal y cecum rhag sychu. Yna rhoddwyd 37 gradd 0.9 y cant o hallt i lygod yn isgroenol ar gyfer dadebru hylif. Rhoddwyd 0 cyn llawdriniaeth.5-1.5 mg/kg dos o Buprenorphine-Release Parhaus ar gyfer analgesia. Roedd llygod ffug yn destun yr un weithdrefn lawfeddygol ond heb ligation cecal a thyllu50,51.

Tomograffeg optoacwstig amlsbectrol. Asesiad o ysgarthu arennol IRDye800CW. Cafodd llygod eu hanestheteiddio trwy isoflurane a'u gollwng o amgylch y torso. Delweddwyd llygod gan ddefnyddio System Delweddu Altera Medical MSOT (Munich, yr Almaen) ar donfeddi lluosog: 700,730,760,775,785, 800,850 nm ar gyfradd o 10 ffrâm yr eiliad. Gosodwyd llygod mewn safle supine mewn daliwr a'u symud ar hyd y cam llinol llorweddol i osod yr arennau ar ben y trawsddygiadur ceugrwm wedi'i osod yn y gosodiad. Ar ôl cofnodi gwaelodlin, cafodd 60 nmol o RDve800CW hydoddi mewn 10 ul o 0.9 y cant halwynog ei chwistrellu'n fewnwythiennol dros gyfnod o l0 s. Cafodd delweddau eu hail-greu gan ddefnyddio'r fformiwla ôl-amcanestyniad a'u prosesu gyda dadansoddiad aml-sbectrol. Tynnwyd rhanbarthau o ddiddordeb (ROIs) o amgylch y cortecs arennol a'r rhanbarth medwla/pelvis, a darluniwyd newidiadau amser y signal MSOT mewn ROIs.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Histopatholeg yr arennau. Roedd yr arennau'n cael eu gosod, eu torri ar hyd yr awyren sagittal, a'u prosesu ar gyfer mewnosod paraffin. Cafodd adrannau (5 μm) eu dad-baraffinio, eu hailhydradu, a'u hocsidio ag asid cyfnodol am 8 munud ar dymheredd ystafell (RT), ac yna deor gyda hydoddiant Schiff am 25 munud. Yna cafodd rhannau eu gwrth-staenio â hematocsilin. Cafodd delweddau eu dal gan ddefnyddio Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, UDA). Gwerthuswyd difrod strwythurol arennol yn seiliedig ar y nodweddion canlynol: annormaledd glomerwlaidd, colli ymyl brwsh y tiwbyn agos, gwagio, ymledu epitheliwm tiwbyn, datiad celloedd tiwbaidd / necrosis, ac ymdreiddiad niwtroffil. Cafodd pob nodwedd ei graddio ar raddfa o 0-5 yn seiliedig ar y difrifoldeb.

Mesur creatinin a nitrogen wrea gwaed. Casglwyd gwaed y llygoden trwy dyllu cardiaidd 24 awr ar ôl anaf septig. Cynhyrchwyd plasma trwy allgyrchu'r gwaed ar 2500g am 15 munud ar RT. Mesur creatinin: dadbroteiniwyd plasma gan ddefnyddio 10-Colofn Troelli kDa; yna mesurwyd lefelau creatinin yn yr hidlif gan ddefnyddio Pecyn Assay Creatinin. Pennwyd lefel nitrogen wrea gwaed (BUN) gan ddefnyddio Pecyn Canfod Lliwimetrig Wrea Nitrogen yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Mesur RBF a MAP. Cafodd llygod eu hanestheteiddio gan ddefnyddio isoflurane. Roedd y trawsddygiadur pwysedd gwaed wedi'i ganniwleiddio i'r rhydweli carotid. Gwnaed toriad llinell ganol yn ardal yr abdomen ac yna toriad ardraws chwith i ddatgelu'r rhydweli arennol. Mesurwyd RBF gan ddefnyddio mesurydd llif amser cludo uwchsain (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA). Ar ôl gosod y stiliwr llif o amgylch y rhydweli arennol agored, caniatawyd i lygod gael eu sefydlogi am o leiaf 30 munud. Cofnodwyd RBF a MAP ar yr un pryd gan ddefnyddio PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, UDA). Dadansoddwyd data gan ddefnyddio meddalwedd fersiwn 7 LabChart Pro4,55

Dal â chymorth resin. Casglwyd rhydwelïau arennol a'u gorchuddio mewn byffer lysis (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA,10 μM palmostatin B, atalyddion proteas, pH 7.4）22, 56. Deorwyd lysates meinwe gyda byffer blocio (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2.5 y cant SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7.4) ar 50 gradd C am 30 munud gyda fortecs cyson. Ar ôl gwaddodi ag aseton oer, roedd proteinau yn ei beledu gan centrifugation ar 5000g am 30 munud a golchi bum gwaith gyda 70 y cant aseton oer. Rhannwyd pob sampl protein yn ddwy ran gyfartal, derbyniodd pob un yr un faint o fwclis isopropyl sepharose 6B, Hydroxvlamine (0.2 M, pH 7.4), a NaCl(0.2 M) wedi'i ychwanegu at bob rhan, yn y drefn honno Ar ôl 4 h o ddeor yn RT gyda chylchdroi cyson, cafodd proteinau palmitoylated eu hanwybyddu â 50 mM DTT mewn Clustogwr Sampl 1 × a'u casglu ar gyfer SDS-PAGE.

Blotio gorllewinol. Mesur lAR palmitoylated. Llwythwyd samplau a gasglwyd o RAC ar gel Tris-Glycine y cant 4-20 a'i drosglwyddo i bilen nitrocellwlos ar ôl electrofforesis. Ar ôl blocio am 1 awr yn RT, holwyd alAR â gwrthgorff cynradd gwrth-lAR cwningen (1:500) dros nos ar 4 gradd. Ar ôl golchi tair gwaith gyda TBST, deorwyd y bilen â gwrthgorff eilaidd gwrth-gwningen asyn IRDye800CW (1:20,000) am 45 munud yn RT.

Mesur ffosfforyleiddiad ERK. Cafodd rhydwelïau arennol eu gorchuddio mewn 1 × RIPA sy'n cynnwys atalyddion proteas a ffosffatas. Archwiliwyd y bilen â gwrthgyrff cwningen gwrth-ERK(1:1{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{1)}}))) y llygoden) a gwrthgyrff ERK (1:1000) gwrth-ffosfforyleiddiad llygoden. Defnyddiwyd gwrth-lygoden gwrth-lygoden asyn IRDye800CW a gwrthgyrff gwrth-gwningod asyn IRDye680RD ar gyfer deor eilaidd (1:20,000). Delweddwyd y pilenni a'u dadansoddi gan ddefnyddio Li-COR Odyssey CLx.

Asesu fasoreactivity trwy myograff gwifren. rhydwelïau arennol llygoden. Cafodd rhydwelïau arennol （{{0} μm mewn diamedr) eu hynysu o lygod WTand Zdhhc21dp/de a'u boddi i doddiant halwynog ffisiolegol oer-iâ (95 y cant O,/5 y cant CO.) (PSS,13{ {47}} mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.18 mM KH, PO, 1.17 mM MgSO.7H, O, 14.9 mM NaHCO, 5.5 mM glwcos, 0.026 mM EDTA, a 1.6 mM CaCl, pH 7.4).Segmentau llestri (~ 2 mm o hyd) wedi'u gosod ar y siambr myograff gwifren (Offeryniaeth Systemau Byw, VT, UDA) rhwng dwy wifren twngsten (30 um mewn diamedr). Cofnodwyd y tensiwn isomedrig gan ddefnyddio cyflyrydd signal Living Systems (MYO-SC-1) ynghyd â meddalwedd LabScribe v4 iWorks. Ar ôl ecwilibreiddio am 30 munud ar 37 gradd Cin PSS, perfformiwyd y weithdrefn normaleiddio i bennu cylchedd mewnol optimaidd L,=0.9×L(Lo=cylchedd mewnol sy'n cyfateb i bwysau transmural o 100 mmHg) . Nesaf, profwyd hyfywedd y llong gyda 60 mMKPSS (74.7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1.18 mM KH, PO.1.17 mM MgSO.7H, O,14.9 mM NaHCO, 5.5 mM glwcos, 0.026 mM EDTA, 1.6 mM CaClp, 7.4).Cafodd rhydwelïau nad oedd yn ymateb i KPSS eu taflu. Cafodd y rhydwelïau eu trin â chrynodiadau cynyddol o ffenylephrine （10 nM-30 μM）. Yna aseswyd uniondeb endothelaidd gan ddefnyddio acetylcholine （10 μM）. Lluniwyd y cromliniau ymateb crynodiad.

rhydwelïau bach o arennau dynol. Dyrannwyd rhydwelïau bach (~1000 um mewn diamedr) o arennau dynol hyfyw cyflawn a gafodd eu gwrthod ar gyfer llawdriniaeth drawsblannu. Roedd segmentau llestr (~ 2 mm o hyd) wedi'u gosod ar fariau I (250 um mewn diamedr) y siambr myograff gwifren. Perfformiwyd gweithdrefnau ecwilibreiddio a normaleiddio tebyg ar rydwelïau dynol. Nesaf, deorwyd y rhydwelïau â rheolaeth cerbydau (0.02 y cant DMSO yn PSS) am 1 h. Yna cafodd y cychod eu profi am hyfywedd gyda 60 mM KPSS a'u trin â chrynodiadau cynyddol o ffenylephrine(10 nM-30 uM). Ar ôl golchi, deorwyd y llestri â 2-BP(100 uM) am 1 awr; yna profwyd hyfywedd y llong gyda 60 mM KPSS gyda 100 uM 2-BP. Cafodd y rhydwelïau bach heb ddim neu lai o ymatebion i KPSS eu taflu. Yna cafodd y rhydwelïau eu herio gyda'r un crynodiadau o ffenylephrine ac yna acetylcholine(10 uM). Cafodd cromliniau ymateb crynodiad rhydwelïau rheoli cerbydau neu 2-wedi'u trin gan BP eu llunio a'u cymharu.

Immunofluorescence. Gosodwyd rhydwelïau arennol dynol mewn 10 y cant o formalin am 48 h, wedi'i fewnosod â pharaffin, a'i dorri'n doriad. Yna cafodd sleidiau eu dadbaraffinio, eu hailhydradu, a'u treiddio â PBS yn cynnwys 0.05 y cant Triton X-1002. Ar ôl blocio, labelwyd y sleidiau â gwrthgyrff gwrth-DHHC21 cwningen a gwrth-lAR gafr (1:100) dros nos ar 4 gradd C. Ar ôl golchi, gwnaed deor gwrthgyrff eilaidd gydag asyn gwrth-gwningen Alexa Fluor 488 ac asyn gwrth-gafr Alexa Fflwor 568(1:500). Ar ôl eu gosod gyda chyfrwng mowntio ProLong Diamond gyda DAPI, lluniwyd sleidiau gyda microsgop confocal sganio laser gwrthdro sbectrol Leica SP8.

Dadansoddiad ystadegol. Rhestrir gwybodaeth fanwl (ee, enw'r prawf, prawf post-hoc, gwerth n, lefel alffa, gwerth-p) ar gyfer pob prawf ystadegol yn Nhabl Atodol S2. Mae'r holl ddata yn bodloni'r rhagdybiaeth dosbarthiad arferol. Perfformiwyd prawf normalrwydd gan ddefnyddio Shapiro-Wilk Test gyda lefel alffa wedi'i gosod ar 0.05. Dadansoddwyd cymariaethau rhwng dau grŵp gan ddefnyddio prawf-t Myfyrwyr (dwy gynffon), a chymharwyd tri grŵp neu fwy trwy ANOVA Unffordd â dadansoddiad ôl-hoc Tukey. Perfformiwyd y gymhariaeth ar gyfer cromliniau myograff gwifren gan ddefnyddio Two-way ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">