Rhan 2: Effeithiau Adnofasgwlaidd Nitrad Anorganig Yn dilyn Atlifiad Isgemia O'r Arennau

Am fwy o wybodaeth. cyswllttina.xiang@wecistanche.com

3. Canlyniadau

3.1.Mae ychwanegiad nitrad yn cynyddu marcwyr DIM bioactifedd ac yn gwanhau camweithrediad arennol yn dilyn IR

Cynyddwyd lefelau nitrad a nitraid a thueddwyd cGMP i gynyddu mewn llygod yn dilyn triniaeth nitrad (Ffig. 1A-C). Roedd camweithrediad arennol, fel a adlewyrchwyd gan newidiadau mewn BUN a GFR, hefyd wedi'i wella gan nitrad (Ffig.1D ac E).

3.2. Mae nitrad yn gwanhau'r ymateb pwysedd gwaed a lefelau Ang II arennol yn dilyn IR

Yn dilyn pythefnos o atlifiad, roedd y pwysedd gwaed ychydig yn uwch yn y grŵp IR o'i gymharu â rheolaethau ffug. Roedd triniaeth â nitrad yn atal y drychiad hwn o bwysedd gwaed (Ffig. 2A-C). Er mwyn ymchwilio i'r cysylltiad â newidiadau yn y system renin-angiotensin fe wnaethom fesur lefelau Ang II mewn plasma ameinweoedd yr arennau. Mae ein data yn dangos bod Ang II yn y plasma yn debyg ymhlith y grwpiau, wedi cynyddu yn yr aren isgemig, ond heb newid yn sylweddol yn yr aren nad yw'n isgemig (Ffig. 2D-F). Ataliodd nitrad y cynnydd o Ang Ⅱ yn y meinweoedd arennol yn dilyn IR, a allai gyfrannu at ei effeithiau ar bwysedd gwaed.

Cliciwch i wybod mwy o wybodaeth. am fuddion cistanche

3.3. Mae nitrad yn lleddfu newidiadau histopatholegol arennol, llid, ac apoptosis yn dilyn IR

Nesaf, dadansoddwyd y newidiadau histopatholegol arennol ar ôl IR trwy ddefnyddio staen H&E a PAS. Dangosodd y grŵp IR ddifrod glomerwlaidd dwys ynghyd â necrosis tiwbaidd o'i gymharu â rheolaethau ffug (Ffig. 3A-F a Thabl 1). o'r bilen islawr tiwbaidd, a mwy o adfywiad tiwbaidd a thiwbiau necrotig mewn adfywio (Ffig. 3A-F a Thabl 1). Ar ben hynny, dangosodd imiwno-yno F4/80 ymdreiddiad sylweddol o macroffagau yn yr aren isgemig yn dilyn IR, a gafodd ei atal gan driniaeth nitrad (Ffig.4A a B). Cafodd staenio TUNEL, i ganfod apoptosis, ei godi'n sylweddol ar ôl anaf IR, a gafodd ei leihau'n sylweddol eto gan nitrad (Ffig.4C a D)[6].

3.4 Mae nitrad yn gwella anaf mitocondria yn dilyn IR arennol trwy fecanweithiau sy'n adfywio adferiad lefelau protein TFAM

Mae annormaleddau a chamweithrediad mitocondriaidd arennol, ynghyd â chynhyrchu ROS gormodol, yn ymwneud â phathogenesis dos arennol. gan gynnwys AN [27.28]. Mae ein data yn dangos bod y ffactor trawsgrifio mitocondriaidd A (TFAM), sy'n rheolydd allweddol mynegiant genynnau mitocondriaidd [29], wedi gostwng yn sylweddol yn yr aren IR (Hg.5A-C). Nid oedd triniaeth nitrad yn gysylltiedig ag unrhyw newidiadau sylweddol mewn TFAM yn yr aren IR ond cynyddodd ei fynegiant yn yr aren nad yw'n isgemig yn dilyn IR (Ffig 5A-C).

3.5. Mae triniaeth nitrad yn gwanhau contractedd rhydwelïau rhynglobar a rhydwelïau afferol a achosir gan Ang II yn dilyn R arennol

Nesaf, gwnaethom ddefnyddio'r dechneg myograffeg i asesu effeithiau IR ar swyddogaeth fasgwlaidd mewn pibellau mewnreenol mawr yn yr aren chwith yn dilyn atlifiad. Nid oedd contractioldeb ffenylephrine yn sylweddol wahanol rhwng y grwpiau arbrofol (Ffig 6A). Fodd bynnag, cynyddwyd contractedd a achosir gan Ang I yn sylweddol yn yr aren IR (Hg.6B), a gafodd ei atal gan driniaeth nitrad. Mewn rhydwelïau afferol ynysig a thraidd (Ffig.6C), cynyddwyd y sensitifrwydd a'r ymatebion cywasgol mwyaf posibl i Ang II hefyd yn yr aren IR, a gafodd ei atal i raddau helaeth gan driniaeth nitrad (1. 6D)

3.6.Mae apoptosis celloedd wedi'i yswirio gan Ffypocsia-Treoxygenation ac annormaleddau mi chandndl mewn celloedd endothelaidd glomerwlaidd yn cael eu lleddfu gan nitie

Mewn astudiaethau mecanistig fasgwlaidd pellach. gyda'r nod o ddynwared y model IR in vivo, defnyddiwyd GECs gennym. Yn yr astudiaeth hon o gelloedd defnyddiwyd nitraid yn lle nitrad i osgoi, y cam cyntaf yn y llwybr nitrad-nitraid-NO sy'n gofyn am facteria cymesurol in vivo. Roedd hypocsia wedi'i ddilyn gan ail-ocsigeniad mewn GECs yn lleihau hyfywedd celloedd/cynnydd mewn marwolaethau (Fg.7A a B).

Roedd hyn yn gysylltiedig â lefelau uwch o caspase hollti-3, llai o gymhlethdod mitocondriaidd IⅡ a mynegiant TFAM (Ffig.7C-G), a chynhyrchiad ROS mitocondriaidd, fel y nodir gan MitoSox (Ffig. 7H). Cafodd yr holl annormaleddau hyn sy'n gysylltiedig â hypocsia ac ail-ocsigeniad eu lleddfu trwy driniaeth ar yr un pryd â nitraid.

Roedd ein data in vivo yn nodi bod anafiadau fasgwlaidd a chamweithrediad a achosir gan IR yn cael eu cyplysu â lefelau uwch o Ang II arennol a sensitifrwydd (Ffigs.2E a 6B a D). Cynhyrchu ROS (Ffig S1 a Ffig.8), a gafodd ei leihau eto gan driniaeth nitraid.

3.7. Mae effeithiau amddiffynnol nitraid yn dilyn hypocsia-ailocsigeniad mewn celloedd endothelaidd glomerwlaidd yn cael eu diddymu trwy atal xanthine oxidoreductase

Ystyrir XOR yn un o'r ensymau allweddol sy'n ymwneud â lleihau nitraid i NO a rhywogaethau bioactif nitrogen ocsid eraill. Yma rydym yn dangos, ym mhresenoldeb yr atalydd XOR dethol febuxostat, bod effeithiau buddiol nitraid ar hyfywedd celloedd, mynegiant TFAM, a ROS mitochondrial (Ffig.9A-D) yn dilyn hypocsia-reoxygenation ynghyd ag Ang I mewn GECs wedi'u diddymu. Dangosir data ar hyfywedd celloedd yn absenoldeb Ang II yn y grŵp cerbydau yn Ffig S2.

4. Trafodaeth

Yn yr astudiaeth hon, rydym yn dangos bod triniaeth nitrad anorganig yn union cynisgemia arennolyn lleihau iawndal glomerwlaidd a thiwbaidd yn sylweddol yn ogystal â cholli gweithrediad arennol yn dilyn 2 wythnos o atlifiad. Mae'r effeithiau ffafriol hyn o nitrad yn gysylltiedig ag ymatebion llidiol llaith ac angiotensin II, ynghyd â modiwleiddio mitocondriaiddstraen ocsideiddiola hyfywedd celloedd.

Dyma’r disgrifiad cyntaf o sut y gall rhoi hwb i’r llwybr nitrad-nitraid-NO cyn digwyddiad isgemig amddiffyn yr aren rhag camweithrediad arennol ac endothelaidd dilynol sy’n gysylltiedig ag atlifiad ac anafiadau.

DIM cenhedlaeth sy'n deillio o NOS yn hanfodol i lawer o gardiofasgwlaidd aswyddogaethau arennol, gan gynnwys modiwleiddio pwysedd gwaed ac awtoreoleiddio arennol yn ogystal â thrin electrolytau tiwbaidd [30-32]. Fodd bynnag, mewn amodau gyda thensiwn ocsigen isel a pH isel, mae'r system enzymatig hon yn cael ei chyfaddawdu gan arwain at DIM diffyg neu hyd yn oed ddadgyplu NOS, sy'n cynyddu cynhyrchiant rhywogaethau ocsigen adweithiol [6,30]. Mae'r llwybr amgen nitrad-nitraid-NO yn annibynnol ar y system NOS a gellir ei hybu trwy ein diet bob dydd. Yn bwysig, mae effeithlonrwydd y llwybr nitrad-nitraid-NO yn cael ei wella'n fawr mewn amodau ag isgemia neu hypocsia pan fydd y system NOS yn cael ei beryglu [9,33]. Mae astudiaethau arbrofol a chlinigol wedi dangos effeithiau cardiofasgwlaidd ffafriol ychwanegiad nitrad, gan gynnwys gwell swyddogaeth endothelaidd a gostyngiad mewn pwysedd gwaed mewn unigolion normotensive a gorbwysedd [1]. Rydym wedi dangos o'r blaen bod y microfasgwleiddiad arennol yn ymatebol iawn i fasodilatiad trwy gyfrwng nitraid [23], yn enwedig yn ystod amodau asidig ac ocsigen isel sy'n dynwared yr amgylcheddau isgemia in vivo [20]. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gall triniaeth nitrad fod yn gysylltiedig ag amddiffyn organau yn dilyn IR.

Mae astudiaethau blaenorol gan ddefnyddio ymyriadau nitraid wedi cynhyrchu canlyniadau braidd yn groes o ran ei werth therapiwtig mewn modelau cnofilod o anaf IR [16,17,34,35]. Mae Triptatara et al. yn dangos bod rhoi nitraid arennol acíwt ar y pryd (30 nmol) yn amddiffyn yr arennau llygod mawr rhag 60 min o isgemia dwyochrog ac anafiadau a chamweithrediad in vivo a achosir gan atlifiad 6h, yn rhannol o leiaf, trwy XOR- dibynnol NO cynhyrchu [16]. Gan ddefnyddio dull trawsenynnol llygoden, mae canfyddiadau Milsom et al. Awgrymodd fod eNOS yn chwaraewr hanfodol, trwy gyfrannu at leihau nitraid yn ystod IR, a thrwy hynny gyfryngu amddiffyniad [35]. Mewn cytundeb, dangosodd Cantor a chydweithwyr fod gweinyddu systemig acíwt o nitraid (0.172 a ddilynwyd gan 0.057 mg/h/kg) yn gwella'n sylweddol atocsidiad arennol ac atlifiad yn dilyn isgemia unochrog (45 mun) ac atlifiad 60 munud mewn llygod mawr [ 34]. Mewn cyferbyniad, ni welodd Basireddy et al. unrhyw effeithiau amddiffynnol o weinyddu systemig acíwt o nitraid (0.12-12 nmol/g/kg) mewn llygod mawr a oedd yn destun neffrectomi unochrog ac yna 45 munud o isgemia'r aren sy'n weddill a 24-48 h reperfusion [17]. Gall esboniadau posibl ar gyfer yr anghysondebau hyn fod yn wahanol ddulliau arbrofol (hy model IR, hyd y cyfnodau IR), trefn dos, llwybr gweinyddu, a gwahaniaethau rhwng rhywogaethau. Ar hyn o bryd, mae llai o wybodaeth am werth therapiwtig defnyddio nitrad anorganig yn lle nitraid. Gellir rhoi nitrad yn ddiogel mewn dosau uwch na nitraid ac mae ganddo hanner oes llawer hirach (6 h vs.30 min), sy'n caniatáu i nitraid, NO, ac ocsidau nitrogen bioactif eraill ffurfio'n barhaus dros gyfnod llawer hirach. Yn y cyd-destun hwn, gellid ystyried nitrad yn gynnyrch ar gyfer cenhedlaeth fwy parhaus o nitraid.

Mewn astudiaeth llygoden flaenorol, dangoswyd bod rhag-drin nitrad dietegol am 2 wythnos yn amddiffyn yr aren rhag anaf IR trwy fecanweithiau sy'n cynnwys modiwleiddio ffenoteip celloedd imiwnedd ac eiddo gwrth-ocsidiol [18]. Yn hytrach na dynwared senario o gymeriant nitrad uchel cronig, profodd yr astudiaeth gyfredol effeithiau gweinyddiaeth acíwt cyn sarhad isgemig. Mae'r dull hwn yn fwy deniadol o safbwynt clinigol a therapiwtig, gan y gallai hyn fod yn debyg i ymyrraeth acíwt cyn isgemia mewn claf sydd mewn perygl o ddatblygu AKI. Nododd ein hastudiaeth gyfredol fod triniaeth nitrad acíwt ac yna ychwanegiad nitrad dietegol parhaus am bythefnos wedi cynyddu'n sylweddol y lefelau nitrad, nitraid, a cGMP yn y cylchrediad. Dangosodd y dadansoddiad morffolegol fod triniaeth nitrad yn lleddfu anafiadau a achosir gan IR o gymharu â rheolaethau IR heb eu trin. Ynghyd â lleihau difrod strwythurol arennol, cadwodd y driniaeth nitrad swyddogaeth yr arennau ar ôl anaf IR. Oherwydd bod creatinin plasma fel arfer yn dychwelyd i lefelau arferol wythnos ar ôl atlifiad [36,37, fe wnaethom fesur BUN a GFR i asesu swyddogaeth arennol yn dilyn 2 wythnos o atlifiad. Ni newidiwyd GFR a BUN yn sylweddol yn dilyn IR o'i gymharu â rheolaethau ffug, a esbonnir yn ôl pob tebyg gan yr aren cyfochrog sy'n cydadfer. Fodd bynnag, mae ein data yn dangos bod y ddau baramedr hyn wedi'u gwella'n sylweddol gan nitrad o gymharu â'r grŵp IR heb ei drin.

Ymatebion llidiolac mae apoptosis celloedd yn brosesau biolegol allweddol yn ystod anaf IR, sy'n cyfrannu at glirio malurion cellog ac atgyweirio meinwe digonol [18,24]. Fodd bynnag, gall llid hir a heb ei ddatrys waethygu anaf meinwe ymhellach [7,38,39].Llid arennol, fel y'i canfuwyd gan staenio F4/80 o ymdreiddiad macrophage, wedi'i leihau'n sylweddol gan nitrad yn dilyn IR. Mae hyn yn cyd-fynd ag astudiaethau a gyhoeddwyd yn ddiweddar gan Yang et al. [18] a Khambata et al. [40] Ar ben hynny, eglurodd assay TUNEL ar gyfer apoptosis fod anaf IR yn cynyddu'r apoptosis celloedd yn aren isgemig llygoden, a gafodd ei atal yn rhannol gan driniaeth nitrad. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu'n glir y gall triniaeth nitrad atal llid arennol a apoptosis celloedd sy'n digwydd yn dilyn IR.

Mae tystiolaeth gronnus yn dangos bod camweithrediad mitocondriaidd yn cyfrannu'n bwysig at ddatblygiad AKI yn dilyn IR, ac felly efallai y bydd gan ddulliau newydd sy'n modiwleiddio swyddogaeth mitocondriaidd werth therapiwtig [41-45]. Er enghraifft, mewn aren isgemig, mae mitocondria mewn celloedd endothelaidd yn cael eu newid yn sylweddol yn swyddogaethol ac yn forffolegol, ac yn dod yn hynod adweithiol a niweidiol eu hunain a hefyd mitocondria o amgylch [44]. Rydym wedi dangos yn gynharach bod nitrad dietegol yn gwella effeithlonrwydd mitocondriaidd mewn bodau dynol [46]. Mae ysgogi'r llwybr nitrad-nitraid-NO mewn nifer o astudiaethau arbrofol diweddar wedi bod yn gysylltiedig ag effeithiau ffafriol ar swyddogaeth mitocondriaidd yn ystod anhwylderau metabolaidd, gan gynnwys diabetes math 2, trwy fecanweithiau sy'n cynnwys lleddfu straen ocsideiddiol [47]. At hynny, mae Shiva a chydweithwyr wedi dangos bod triniaeth cyn ac acíwt â nitraid anorganig yn cael effeithiau cytoprotective ac o bosibl yn cyfyngu ar anafiadau atdlifiad cardiaidd a hepatig trwy fodiwleiddio cadwyn trafnidiaeth electronau mitocondria a lleihau ROS [48]. Yn ein model IR in vivo, cynyddwyd TFAM yn yr aren nad yw'n isgemig, ond ni chafodd ei newid yn sylweddol yn yr aren isgemig. O ystyried bod nitraid wedi adfer mynegiant TFAM in vitro yn dilyn hypocsia-ailocsigeniad rydym yn dyfalu y gallai hyn fod yn gysylltiedig â gwahaniaethau mynegiant amser-ddibynnol. Yn y model in vivo, dim ond ar ôl pythefnos y gwnaed dadansoddiad o TFAM ac mae'n bosibl y byddai hyn wedi bod yn wahanol yn gynharach yn dilyn atlifiad.

Mae'n hysbys bod cynyddu signalau Ang I yn ysgogi cynhyrchiad ROS sy'n deillio o NADPH oxidase a mitocondria, gan arwain at straen ocsideiddiol [49-51]. Dangosodd Cao a chydweithwyr fod atgyrch reno-cerebral wedi actifadu'r system renin-angiotensin yn dilyn IR, a oedd yn hyrwyddo straen ocsideiddiol a dilyniant anafiadau arennol [52]. Rydym wedi dangos yn flaenorol bod triniaeth nitrad yn lleihau cyfangedd Ang I-gyfryngol mewn rhydwelïau arteriol a gorbwysedd arennol trwy fecanweithiau sy'n cynnwys lleihau gorfywiogrwydd sympathetig a lleddfu straen ocsideiddiol, yn ogystal â mynegiant llai o dderbynnydd math 1 Ang [{{7} }]. Yn gyson â chanfyddiadau blaenorol, mae ein data yn dangos bod triniaeth nitrad yn lleihau pwysedd gwaed a oedd yn gysylltiedig â lefelau Ang II is yn yr arennau yn dilyn IR a chyfyngder cyfryngol Ang IⅡ yn y rhydwelïau rhynglobar a'r rhydwelïau afferol.

Gan fod cysylltiad agos rhwng annormaleddau celloedd endothelaidd yn dilyn IRis ag anafiadau arennol a gweithrediad yr arennau dan fygythiad, fe wnaethom ddefnyddio celloedd endothelaidd glomerwlaidd (GECs) nesaf ar gyfer astudiaethau mecanistig. Defnyddiwyd model hypocsia-ailocsigeniad in vitro, gyda thriniaeth nitrad ar yr un pryd a hebddo, i ddynwared y senario IR in vivo. Mae ein canlyniadau in vitro yn dangos bod hypocsia-ailocsigenation wedi cynyddu marwolaethau celloedd, cynhyrchu ROS mitocondriaidd, a caspase hollt-3, wedi lleihau hyfywedd celloedd a mynegiant protein o gymhleth OXPHOS I a TFAM. Cafodd yr holl newidiadau annormal hyn eu lleddfu'n sylweddol gan nitraid.

Gan fod ein data in vivo yn dangos bod lefelau Ang I wedi cynyddu yn yr arennau yn dilyn IR, buom hefyd yn astudio effeithiau triniaeth nitraid mewn GECs yn dilyn hypocsia-ailocsigeniad ym mhresenoldeb Ang. Mae ein data yn dangos bod hypocsia-ailocsigeniad ar y cyd ag Ang I wedi lleihau hyfywedd celloedd ymhellach a chynyddu cynhyrchiant ROS mitocondriaidd, a gafodd ei atal eto gan driniaeth nitrad ar yr un pryd.

Yn ystod normocsia a pH arferol, mae NOS sy'n deillio o NOS yn cael ei ocsidio i nitraid a nitrad, ond yn ystod amodau hypocsia ac asidig, gellir lleihau nitraid yn ôl i NO trwy weithred reductase nitraid XOR. Diddymodd cyd-deoriad â'r atalydd XOR dethol febuxostat effeithiau amddiffynnol nitraid yn dilyn hypocsia-ailocsigeniad mewn GECs. Mae'r data hyn yn awgrymu bod XOR yn cataleiddio gostyngiad nitraid i NO, sydd yn ei dro yn cyfryngu amddiffyn celloedd rhag anaf a achosir gan hypocsia-ailocsigeniad.

Mae rhai o gyfyngiadau'r astudiaeth gyfredol yn cynnwys na chynhwyswyd grŵp â thriniaeth nitrad yn unig mewn anifeiliaid sy'n cael eu gweithredu â ffug. Y prif reswm am hyn oedd nad yw astudiaethau blaenorol mewn llygod mawr a llygod arferol wedi gweld unrhyw effeithiau dwys, gan ddefnyddio dosau tebyg o nitrad, ar bwysedd gwaed, swyddogaeth arennol, neu adweithedd fasgwlaidd. Cyfyngiad arall yw mai dim ond ar ôl pythefnos o atlifiad y gwnaed pob nodweddiad in vivo. Gallai pwyntiau amser ychwanegol fod wedi cynhyrchu mwy o fewnwelediad mecanistig.

I gloi, triniaeth acíwt gyda nitrad anorganig cyn digwyddiad isgemia arennol, wedi'i ddilyn gan driniaeth nitrad dietegol barhaus yn ystod pythefnos o atlifiad, wedi'i ddiogelu rhag camweithrediad arennol ac anafiadau trwy fecanweithiau sy'n cynnwys lleihau lefelau ymdreiddio celloedd llidiol a angiotensin I yn yr isgemia. aren yn ogystal â modiwleiddio swyddogaeth mitocondriaidd. Gall treialon clinigol yn y dyfodol egluro a all ymyriadau â nitrad anorganig ddarparu effeithiau buddiol mewn cleifion sydd â risg uchel o gael anaf IR arennol.