Mae Dysgu Rhag Ofn yn Galluogi Cymhathu Atgofion Ofn Newydd yn Gyflym i Rwydweithiau Cortigol Rhan 3

Dyluniad arbrofol

Aseswyd atgynhyrchedd data gyda gwahanol ddyblygiadau (Tabl S1). Perfformiwyd yr arbrofion anactifadu CNQX cyntaf yn Te2 (Ffig 1A-1C) mewn nifer uwch o atgynhyrchiadau oherwydd dyma'r arbrofion cyntaf a gynhaliwyd gennym ac a wasanaethodd i brofi prif ddamcaniaeth ein hastudiaeth. Roedd anifeiliaid yn flaenoriaeth a neilltuwyd i wahanol grwpiau ymddygiad mewn modd cytbwys o ran pwysau. Rhoddwyd anifeiliaid gwrywaidd o'r un nythaid ar hap i bob grŵp arbrofol. Aethom i'r afael yn gyntaf â phrif ddamcaniaeth ein hastudiaeth, hy, gall anactifadu cortigol effeithio'n wahanol ar gydgrynhoi cof ofn newydd mewn llygod mawr naïf arbrofol ac mewn anifeiliaid a oedd wedi dysgu digwyddiad ofn blaenorol.

Mae gan anifeiliaid gwrywaidd atgofion cryf iawn oherwydd bod ganddyn nhw reddf goroesi cryfach ac awydd i atgynhyrchu. Mae angen i anifeiliaid sy'n goroesi yn y gwyllt gofio llawer o wybodaeth ddaearyddol, mathau o fwyd, traciau ysglyfaethwyr, a lleoliadau aelodau'r grŵp i addasu'n well i'r amgylchedd a diogelu bywyd.

Er enghraifft, mae angen i lewod gwrywaidd gofio statws y diriogaeth gyfan, perthnasoedd aelodaeth, a lleoliadau cystadleuwyr i amddiffyn y diriogaeth a'u statws. Mae angen i sebras gwrywaidd gofio lleoliad ffynonellau dŵr a bwyd ar y glaswelltir er mwyn goroesi ac atgenhedlu. Bu cwmni soda unwaith yn rhedeg hysbyseb yn dangos bod arth wen gwrywaidd yn gallu cofio deifiwr a'i arogl unigryw fel y gallai ei adnabod y tro nesaf y byddent yn ei weld.

Felly, mae angen i anifeiliaid gwrywaidd gael atgofion cryf o ran amddiffyn eu tiriogaeth, darparu digon o fwyd, ac atgenhedlu epil. Mae hyn hefyd yn eu gwneud yn bynciau pwysig mewn ymchwil ddynol, er enghraifft, i archwilio clefydau fel nam ar y cof a chlefyd Alzheimer.

Yn y byd dynol, gallwn hefyd gymryd ysbrydoliaeth o gof anifeiliaid gwrywaidd. Gall amlygiad parhaus i bethau newydd, dysgu parhaus, a meddwl wella ein cof a'n gallu i addasu, a gwella ein safonau byw a'n heffeithlonrwydd gwaith. Felly, gadewch inni ddysgu oddi wrth anifeiliaid gwrywaidd, parhau i gronni gwybodaeth a phrofiad, meddu ar reddfau goroesi cryf a dyheadau atgenhedlu, a chreu dyfodol gwell. Gellir gweld bod angen i ni wella ein cof. Gall Cistanche deserticola wella cof yn sylweddol oherwydd bod Cistanche deserticola yn ddeunydd meddyginiaethol Tsieineaidd traddodiadol gyda llawer o effeithiau unigryw, ac un ohonynt yw gwella cof. Mae effeithiolrwydd briwgig yn dod o'r gwahanol gynhwysion gweithredol sydd ynddo, gan gynnwys asid, polysacaridau, flavonoidau, ac ati. Gall y cynhwysion hyn hybu iechyd yr ymennydd mewn amrywiaeth o ffyrdd.

Cliciwch gwybod ffyrdd o wella gweithrediad yr ymennydd

Yn achos gwahaniaethau ystadegol rhwng y grwpiau hyn, yn y pen draw fe wnaethom berfformio grwpiau rheoli ychwanegol trwy chwistrelliad halwynog. Defnyddiwyd dull tebyg i'r arbrofion optogenetig, lle perfformiwyd y grŵp rheoli AAV dim ond ar ôl canfod gwahaniaethau ystadegol rhwng llygod mawr naïf a llygod mawr a hyfforddwyd yn flaenorol. Roedd yr atodlenni arbrofol hyn yn ein galluogi i osgoi grwpiau rheoli diangen a'r defnydd o anifeiliaid diangen, mater allweddol yn y ddeddfwriaeth Ewropeaidd ac Eidalaidd ar arbrofi anifeiliaid (egwyddor 3 Rs).

Gweithdrefnau ymddygiad

Cynhaliwyd yr holl arbrofion yn ystod cyfnod golau'r dydd (8 AM i 4 PM). Roedd anifeiliaid yn cael eu cludo'n unigol o'r cyfleuster i'r ystafelloedd arbrofol o fewn gwahanol fwcedi tryloyw bach yn dibynnu ar y gofynion arbrofol.

Hyfforddiant clywedol: Sesiwn ymddygiadol gyntaf. Anifeiliaid â chyflwr ofn clywedol (CS1-CS2). Yn y grŵp hwn, roedd llygod mawr yn cael eu cymryd yn ysgafn o gawell eu cartref a'u cludo o'r ystafell dan do i'r ystafell gwrthsain. Unwaith yr oeddent yno, gosodwyd anifeiliaid y tu mewn i'r offer cyflyru a oedd yn cynnwys cawell du hirsgwar (35 × 40 cm) gyda grid gwiail dur gwrthstaen (1 cm mewn diamedr, wedi'i wahanu 1.5 cm oddi wrth ei gilydd) wedi'i gysylltu â set cyflenwi sioc.

Gadawyd llygod mawr heb eu haflonyddu am 1 munud. Ar ôl yr amser hwn, gweinyddwyd 7 ysgogiad cyflyredig (CSs) yn cynnwys naws pur o 15 kHz o amlder (15 s o hyd yr un, 80 dB, cyfwng treialon 36 s). Cafodd y 1 s olaf o bob tôn ei baru â U.S. poenus (0.5 mA, 1 s). Ar ddiwedd y sesiwn cyflyru, daethpwyd â llygod mawr yn ôl i'w cawell cartref.

Anifeiliaid sioc yn unig (sioc-CS2). Yn y grŵp hwn, gosodwyd llygod mawr yn yr un modd y tu mewn i'r un cyfarpar cyflyru. Yn syth ar ôl hynny, cafodd pob llygoden fawr o dan 7-siociau traed (1 s, 0.5 mA) un yn syth ar ôl y llall. Ar ddiwedd y symbyliad, daethpwyd ag anifeiliaid yn ôl i'w cawell cartref. Roedd y sefydlogrwydd amser yn y cawell cyflyru yn llai na 9 eiliad. Dangosodd astudiaethau blaenorol fod y driniaeth hon yn caniatáu ar gyfer osgoi prosesau cysylltiadol rhwng ysgogiadau poenus ac ysgogiadau synhwyraidd [29,30].

Arogleuon anifeiliaid â chyflwr ofn (arogl-CS2). Yn y grŵp hwn, gosodwyd llygod mawr y tu mewn i'r un cawell hirsgwar du a ddefnyddiwyd yn y grwpiau arbrofol uchod a'u cysylltu â chyfluniad cyflenwi sioc. Gadawyd llygod mawr heb eu haflonyddu am 2 funud. Ar ôl yr amser hwn, rhoddwyd 7 CS yn cynnwys arogleuon fanila (10 s yr un, cyfwng prawf o 24 s). Cafodd y 1 s olaf o bob arogl ei baru â US poenus (0.5 mA, 1 s). Gosodwyd y modiwl cyflyru ger ffynhonnell awyru er mwyn osgoi parhad yr ysgogiadau a gyflwynwyd ar ôl eu gwrthbwyso. Sicrhawyd y cawell gyda grid uchaf. Cyflwynwyd arogleuon gan ddefnyddio olfactometer gwanhau llif. Roedd aer glân (1.5 L/min) yn cael ei gyfeirio at falf solenoid, a oedd, o'i weithredu, yn trosglwyddo'r aer i botel 15 ml yn cynnwys 10 ml o arogl fanila.

Anifeiliaid tôn yn unig (Tôn-CS2). Gosodwyd llygod mawr yn y grŵp hwn y tu mewn i'r un cawell du a chyflwynwyd y tôn 15-kHz (7 ysgogiad, 15 s o hyd, 36 s ITI) iddynt yn absenoldeb yr UD.

Anifeiliaid sy'n agored i niwed (Tone-CS1-CS2). Gosodwyd llygod mawr y tu mewn i'r cawell cyflyru ac, 1 munud yn ddiweddarach, cyflwynwyd y tôn 15-kHz yn unig iddynt 20 gwaith, a 24 awr yn ddiweddarach parwyd yr un naws â'r UD yn dod yn CS1.

Anifeiliaid â chyflwr ofn sŵn gwyn (WN-CS2). Yn y grŵp hwn, gosodwyd llygod mawr y tu mewn i'r cawell hirsgwar du a'u gadael heb eu haflonyddu am 1 munud. Ar ôl yr amser hwn, gweinyddwyd 7 CS yn cynnwys WN (15 s o hyd yr un, 75 dB, cyfwng rhwng treialon 36 s). Cafodd y 1 s olaf o bob tôn ei baru â U.S. poenus (0.5 mA, 1 s). Ar ddiwedd y sesiwn cyflyru, daethpwyd â llygod mawr yn ôl i'w cawell cartref.

Dysgu ofn clywedol: Ail hyfforddiant ymddygiadol. Bythefnos ar ôl y gweithdrefnau a ddisgrifir yn y paragraff uchod, roedd anifeiliaid yn cael eu hyfforddi mewn tasg cyflyru ofn clywedol gwahanol arall. Rhoddwyd llygod mawr mewn blwch skinner safonol, fel yn ein gwaith blaenorol [10], a'u gadael heb darfu am 2 funud. Ar ôl yr amser hwn, darparwyd 7 CS yn cynnwys arlliwiau pur o 3 kHz o amledd (8 s o hyd yr un, 80 dB, cyfwng rhwng treialon 22 s). Cafodd y 1 s olaf o bob tôn ei baru â U.S. poenus (0.5 mA, 1 s). Ar ddiwedd y sesiwn cyflyru, daethpwyd â llygod mawr yn ôl i'w cawell cartref.

Ofn cadw cof. Profwyd cadw cof ofn clywedol a gafwyd yn ddiweddar i'r CS2 (3 kHz) 4 diwrnod yn ddiweddarach. Ar gyfer arbrofion optogeneteg, perfformiwyd y prawf cof diweddar gyda danfoniad laser 24 h ar ôl dysgu CS2-US mewn cyfatebiaeth i'r cyfnod amser pan wnaethom berfformio anactifadu cortigol trwy weinyddu'r CNQX (hy, 24 h ar ôl hyfforddiant). Roedd llygod mawr yn ymgynefino â chyfarpar gwahanol i'r un a ddefnyddir ar gyfer cyflyru a'u gosod mewn ystafell wahanol i osgoi ymddygiad ofn cyflyru i giwiau cyd-destunol [10,62].

Roedd yr offer newydd yn cynnwys cawell plastig tryloyw gydag ochr wedi'i phaentio'n ddu wedi'i hamgáu o fewn blwch gwanhau sain wedi'i gyfarparu â gwyntyll gwacáu, a oedd yn dileu aer ag arogl o'r lloc ac yn darparu sŵn cefndir o 60 dB. Caniatawyd i anifeiliaid archwilio'r cawell am 5 munud y dydd yn ystod y sesiwn cynefino. Ar ddiwrnod y prawf cadw cof ofn, ar ôl 2 funud o archwilio am ddim, fe wnaethom gyflwyno 4 CS2 o 3 kHz (8 s—22 ITI) heb ei ddilyn gan unrhyw UD.

Os yw'n ofynnol gan y galw arbrofol, cafodd llygod mawr eu profi wedyn i gadw'r cof ofn o bell, a gaffaelwyd 2 wythnos cyn yr ail dreial cyflyru ofn clywedol. I'r nod hwn, 7 diwrnod ar ôl y prawf cadw cof ofn i'r tôn 3-kHz, rhoddwyd anifeiliaid mewn amgylchedd newydd (cawell streipiog du a gwyn) ac yna cyflwynwyd y tôn 15-kHz iddynt. Cyflwynwyd pedair tôn bob 36s.

Hyfforddiant cyd-destunol: Sesiwn ymddygiadol gyntaf. Grŵp cyflyru ofn cyd-destunol (CtxA-CtxB). Yn y grŵp hwn, roedd llygod mawr yn cael eu cymryd yn ysgafn o gawell eu cartref, eu rhoi mewn bwced, a'u cario o'r ystafell dan do i'r ystafell gwrthsain. Unwaith yr oeddent yno, gosodwyd anifeiliaid y tu mewn i'r offer cyflyru a oedd yn cynnwys y cawell hirsgwar du uchod, gyda'r grid gwiail dur di-staen wedi'i gysylltu â set cyflenwi sioc. Gadawyd llygod mawr heb eu haflonyddu am 1 munud. Ar ôl yr amser hwn, gweinyddwyd 5 UD (0.5 mA, 1 s) gyda chyfnodau amser o 51 s. Ar ddiwedd y sesiwn, daethpwyd â'r anifeiliaid yn ôl i'w cawell cartref.

Grŵp sioc yn unig (sioc-CtxB). Roedd llygod mawr, unwaith y cawsant eu gosod y tu mewn i'r offer cyflyru, yn derbyn 5-siociau traed (1 s, 0.5 mA) ar unwaith un yn syth ar ôl y llall. Roedd y sefydlogrwydd amser yn y cawell cyflyru yn llai na 7 eiliad. Dangosodd astudiaethau blaenorol fod y driniaeth hon yn caniatáu ar gyfer osgoi prosesau cysylltiadol rhwng ysgogiadau poenus ac ysgogiadau synhwyraidd [29,30].

Grŵp sioc yn unig (sioc-CtxB). Roedd llygod mawr, unwaith y cawsant eu gosod y tu mewn i'r offer cyflyru, yn derbyn 5-siociau traed (1 s, 0.5 mA) ar unwaith un yn syth ar ôl y llall. Roedd y sefydlogrwydd amser yn y cawell cyflyru yn llai na 7 eiliad. Dangosodd astudiaethau blaenorol fod y driniaeth hon yn caniatáu ar gyfer osgoi prosesau cysylltiadol rhwng ysgogiadau poenus ac ysgogiadau synhwyraidd [29,30].

Cyflyru ofn cyd-destunol newydd a chadw cof ofn diweddar. Bythefnos ar ôl y gweithdrefnau a ddisgrifir yn y paragraff uchod, hyfforddwyd pob grŵp i gysylltu amgylchedd cyd-destunol newydd (y modiwl blwch skinner, wedi'i osod mewn ystafell wahanol) ag Unol Daleithiau poenus (0.5 mA, 1 s) . Rhoddwyd pob anifail y tu mewn i'r siambr newydd a'i adael heb ei aflonyddu am 2 funud. Yna, roedd yn agored i 5 UD wedi'u gwahanu gan gyfnodau o 30 s.

Profwyd cadw cof ofn cyd-destunol 4 diwrnod ar ôl y weithdrefn cyflyru ofn trwy roi llygod mawr eto yn siambr bocs Skinner am 3 munud. Ar gyfer arbrofion optogeneteg, perfformiwyd y prawf cof diweddar gyda chyflwyniad laser 24 h ar ôl dysgu CtxB-US mewn cyfatebiaeth i'r cyfnod amser pan wnaethom berfformio anactifadu cortigol trwy weinyddu'r CNQX (hy, 24 h ar ôl hyfforddi). Os yw'n ofynnol gan y galw arbrofol, cafodd llygod mawr eu profi wedyn i gadw'r cof ofn o bell trwy roi anifeiliaid yn y cyd-destun wedi'u paru â'r UD 2 wythnos cyn y gymdeithas newydd.

Cludwyd anifeiliaid mewn 2 fwced gwahanol i'r siambrau cyflyru yn unol â'r gweithdrefnau cyd-destunol gwahanol.

Mesur rhewi. Ym mhob gweithdrefn arbrofol, penderfynwyd yr asesiad o gadw cof ofn fel ymateb rhewi [10], wedi'i ddadansoddi fel absenoldeb cyflawn symudedd somatig ac eithrio symudiadau anadlol. Ar gyfer pob anifail, cafodd yr amser (mewn eiliadau) a dreuliwyd yn rhewi ei fesur all-lein gan 2 arsylwr annibynnol a gafodd eu dallu i'r grwpiau anifeiliaid.

Gweithdrefnau llawfeddygol

Er mwyn gweinyddu'r sylweddau a ddewiswyd yn y safleoedd targed, anestheteiddiwyd llygod mawr ag isoflurane: Perfformiwyd yr anwythiad ar 4% [cyfrol / cyf] mewn aer meddygol 2 L / mun ac fe'i hymestynnwyd i amlygiad parhaus o 2% [cyfrol / cyf]) pan gafodd llygod mawr eu gosod yn y cyfarpar stereotacsig.

Gwnaethpwyd toriad o'r benglog, a drilio tyllau byrr bach i ganiatáu treiddiad nodwydd trwyth medrydd 28-. Defnyddiwyd chwistrell Hamilton 10-ul wedi'i osod ar bwmp trwyth i ddosbarthu sylweddau. Ar ôl arllwysiadau, gadawyd y nodwydd yn ei lle am 3 munud ychwanegol. Yna caewyd y toriad gyda chlipiau clwyfau dur di-staen, a rhoddwyd chwistrelliad isgroenol i'r anifail o'r cetoprofen analgesig / gwrthlidiol (2 mg / kg o bwysau'r corff), a chadwyd yr anifail yn gynnes ac o dan arsylwi nes gwella o anesthesia.

Fel mewn astudiaethau blaenorol [10,32-34], roedd caniwleiddio anifeiliaid yn ddiangen, gyda'r cyfansoddion gweithredol yn cael eu gweinyddu'n uniongyrchol mewn stereotacs. Mae'r driniaeth hon yn fanteisiol oherwydd bod y trawma llawfeddygol sy'n gynhenid ​​i'r weithdrefn cannu parhaol yn cael ei osgoi, gan gyfyngu trawma i dreiddiad nodwydd sengl [10,32-34]. Yn wir, nid yw anesthesia cyffredinol yn effeithio'n sylweddol ar gydgrynhoi cof [10,32-34]. Er mwyn sicrhau bod amseriad gweinyddu cyfansoddion sy'n gysylltiedig â'r treial dysgu yn gywir fel bod llygod mawr yn derbyn y cyfansoddion dethol tua 1 h ac oddeutu 1 diwrnod ar ôl hyfforddiant, ysgogwyd anesthesia isoflurane 5 munud cyn amseriad y pigiad a gynlluniwyd, ee, yn 55 min mewn llygod mawr a gafodd eu trin 60 munud ar ôl hyfforddi a 23 h a 55 munud mewn anifeiliaid sy'n cael eu chwistrellu am 24 awr ar ôl hyfforddi. Roedd pob llygoden fawr wedi'i chyflyru ac yna'n cael ei gweithredu ar wahân. Roedd anifeiliaid sy'n perthyn i'r gwahanol grwpiau ymddygiad yn cael eu trin mewn ffordd ryngddalennog.

Atalydd dewisol derbynyddion glwtamad AMPA/kainate CNQX ({{0}}Cyano-7-nitroquinoxaline-2,{3}}dione) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] wedi'i hydoddi mewn hydoddiant halwynog di-haint (NaCl, 0.9%) a'i addasu i pH 7.4 gyda HCl. Diddymwyd yr atalydd synthesis protein anisomycin (Merck, 125 ug/ul) mewn HCl equimolar, ei wanhau â halwynog di-haint, a'i addasu i pH 7.4 gyda NaOH. Defnyddiwyd halwynog di-haint (0.9% NaCl) i reoli cerbydau. Chwistrellwyd y sylweddau hyn yn ddwyochrog ar gyfradd o 0.1 ul/min a chyfaint o 0.5 ul fesul safle yn y cyfesurynnau stereotacsig canlynol a gymerwyd o atlas Paxinos a Watson [26], gyda maes cortigol Te2 yn cyfeirio at atlas Zilles [25]:

Cortecs clywedol eilaidd (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Cortecs cingulate anterior (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Dewiswyd cyfaint y pigiad (0.5 ul fesul safle) yn seiliedig ar astudiaethau blaenorol lle chwistrellwyd cyfansoddion gweithredol yn Te2 [10,34] ac ACC [55,63] mewn llygod mawr sy'n oedolion.

Er mwyn anactifadu'r hipocampws dorsal, cafodd cyfansoddion gweithredol eu chwistrellu ar gyfaint o 0.6 ul fesul safle yn y cyfesurynnau stereotacsig canlynol:

Hippocampus Dorsal: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Achoswyd briwiau di-droi'n-ôl yr hippocampal dorsal trwy roi NMDA (Tocris, 18 ug/ul, wedi'i hydoddi mewn hydoddiant halwynog di-haint, 0,4 ul fesul safle) ar gyfradd o 0.1 ul/ min ar bwyntiau yn y cyfesurynnau uchod. Defnyddiwyd yr un cyfesurynnau ar gyfer rheolyddion â chwistrelliad halwynog ac anifeiliaid a weithredir â ffug.

Chwistrellwyd BLA yn ôl y cyfesurynnau canlynol: AP: −2.8; L: ±5.4; DV: −8.3.

Ar ddiwedd yr arbrofion, dilyswyd y traciau nodwydd yn achos CNQX, anisomycin, neu chwistrelliadau halwynog neu ymestyn y briwiau yn achos pigiadau NMDA yn histolegol. Cafodd llygod mawr eu hanestheteiddio'n ddwfn a'u darlifo'n fewngardiaidd gyda 4% o fformaldehyd. Rhannwyd eu hymennydd ar 30 μm ar cryostat. Paratowyd adrannau cyfresol wedi'u staenio â Nissl gan ddefnyddio'r weithdrefn gonfensiynol a dilyswyd yr adrannau'n histolegol o dan ficrosgop wedi'i chwyddo ar 2.5 ×.

Arbrofion optogenetig

Chwistrelliad firws. Cafwyd y feirws adeno-gysylltiedig AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry and control fector AAV5:CaMKII -cherry o Brifysgol Gogledd Carolina Vector Core (Chapel Hill, Gogledd Carolina, Unol Daleithiau America). Y frawddegViraltiterwas5:8 titer firaol oedd 5.8 × 10^12 vg/ml ar gyfer y ddau firws. Mae defnyddio hyrwyddwr CaMKII yn galluogi mynegiant trawsgenaidd sy'n ffafrio niwronau pyramidaidd. Cafodd firysau eu cadw mewn rhewgell −80˚C. Perfformiwyd arllwysiadau firaol yn targedu'r Te2 neu'r ACC ar y cyfesurynnau stereotacsig uchod ar gyfeintiau 0.5 ul ar gyfer pob twll. Chwistrellwyd y firws ar gyfradd o 0.1 ul/munud, a gadawyd y nodwydd yn ei lle am 5 munud ychwanegol. Perfformiwyd pigiadau firaol 4 wythnos cyn arbrofion optogeneteg.

Goleuo.

Mewnblannwyd y ffibrau optig (Plexon, 200/230 μm craidd; hyd 10 mm) yn ddwyochrog yn y BLA (AP=−2.8, L=± 5.4, V=−8.2 mm o bregma). Sicrhawyd ataliad optogenetig rhag amcanestyniadau Te2 i BLA neu ragamcanion ACC i BLA trwy ddefnyddio System Ysgogi Optogenetig PlexBright ynghyd â deuod laser (Laserglow Technologies). Mae golau melyn (589 nm) yn cael ei gynhyrchu a'i basio trwy ffibr optegol. Y dwysedd pŵer a amcangyfrifwyd ar flaen y ffibr optig oedd 10 i 15 mW ar gyfer goleuo safleoedd taflunio. Yn ystod cadw cof ofn, cychwynnwyd allyriad golau 4 s cyn i'r tôn ddechrau, parhaodd trwy gydol y tôn, a chafodd ei atal 4 s ar ôl gwrthbwyso'r tôn. Derbyniodd anifeiliaid sy'n perthyn i grwpiau cyflyru ofn cyd-destunol ysgogiad ysgafn yn ystod yr archwiliad cyd-destun cyfan (3 mun). Roedd llygod mawr yn gyfarwydd â llinyn y clwt am 2 ddiwrnod cyn y treial cadw cof.

Imiwnohistocemeg. Ar ôl cwblhau arbrofion optogeneteg, cafodd llygod mawr eu anestheteiddio'n ddwfn a'u darlifo'n fewngardiaidd gyda 4% PAF i archwilio trylediad y firws. Cafodd yr ymennydd ei rannu, ei storio dros nos ar 4˚C, a'i drosglwyddo'n olaf i 30% o swcros. Cafodd adrannau coronaidd (30 μm) eu torri ar cryostat a'u casglu yn PBS. Deorwyd adrannau sy'n arnofio'n rhydd mewn datrysiad blocio am 1 h yn RT. Yna, cawsant eu deor mewn gwrthgorff llygoden monoclonaidd cynradd gwrth-mCherry (gwanhad 1:500, Abcam) yn yr ateb blocio dros nos yn RT. Yn dilyn hynny, cafodd adrannau eu golchi â PBS a'u deor am 1 awr yn RT gyda gwrthgorff gwrth-lygoden fflwroleuol eilaidd -568 (1:600, Invitrogen) wedi'i wanhau yn PBS. Cafodd adrannau eu golchi mewn PBS, eu gosod gyda chyfryngau mowntio yn cynnwys DAPI (Vector), a'r clawr wedi'i orchuddio.

Yn yr un modd casglwyd ymennydd llygod mawr a gafodd bigiadau NMDA. Cafodd adrannau sy'n arnofio'n rhydd, ar ôl sawl rinsiad, eu deor â gwrthgorff gwrth-Neun llygoden monoclonaidd cynradd (1:1, 000 gwanhau, Merck) yn yr hydoddiant blocio dros nos ar dymheredd ystafell. Yn dilyn hynny, cafodd adrannau eu golchi â PBS a'u deor am 1 awr ar dymheredd ystafell gyda gwrthgorff gwrth-lygoden ceffyl biotinylated (1:200 gwanhau, Vector). Cyplyswyd y cymhleth avidin-biotin (cymhleth ABC 1:100, Vector, 2 h a hanner y deor) â diaminobenzidine (0.03%, Merck) i staenio Neun. Yna cafodd adrannau eu rinsio mewn PBS a'u trosglwyddo i sleidiau wedi'u gorchuddio â gelatin, eu dadhydradu a'u gorchuddio â slip clawr.

Cafodd adrannau Te2 o lygod mawr wedi'u chwistrellu â gleiniau retro eu deori â gwrthgorff gwrth-Fos cwningen polyclonaidd cynradd (1:2,000, Signaling Cell) yn yr ateb blocio dros nos yn RT. Yn dilyn hynny, golchwyd tafelli gyda PBS a'u deor am 1 awr yn RT gyda gwrth-gwningen Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, yn PBS). Yn olaf, golchwyd adrannau imiwn-labelu mewn PBS, eu gosod ar sleidiau wedi'u gorchuddio â gelatin, a'u gorchuddio â chyfrwng mowntio wedi'i ychwanegu at DAPI.

Microsgopeg

Archwiliwyd labelu mCherry trwy ddefnyddio microsgop confocal Zeiss Airyscan: Defnyddiwyd dau laser (405 a 561 nm), pob un yn cyfateb i'r sbectrwm allyriadau brig ar gyfer DAPI (staen Nissl ar gyfer niwclysau celloedd) a Alexa 568 (mCherry ), yn y drefn honno. I ddadansoddi trylediad y firws yn y safleoedd pigiad, cafwyd micrograffau o Te2 ac ACC fel delweddau mosaig (cafwyd pob sengl trwy ddefnyddio amcan 10 ×). Dadansoddwyd terfynellau Axon i mewn i BLA trwy ddefnyddio amcan 40 × fel pentwr z o 10 adran, gyda bylchau 1 μm rhyngddynt (159 μm sgwâr; ffracsiwn chwyddo, 1.0).

Ar gyfer anifeiliaid â chwistrelliad ôl-gleiniau a gafodd imiwn-labelu cFos, cafwyd delweddau ar chwyddhad 40 × (159 μm sgwâr; ffracsiwn chwyddo, 1.0) gyda 3 laser gwahanol, yn cyfateb i'r sbectrwm allyriadau brig ar gyfer DAPI (staen Nissl ar gyfer cnewyllyn celloedd), AlexaFluor 488 (cFos), a Texas Red (Retrobeads), yn y drefn honno. Cafwyd darnau o 0.7 μm ar hyd 10-μm z-stac. Cafodd nifer y niwclysau sy'n mynegi cFos, wedi'u labelu â gleiniau, a dwbl-bositif (gleiniau cFos + wedi'u labelu) ei feintioli ar gyfer pob anifail yn rhanbarth Te2 yn y cyfesurynnau anteroposterior o 6.7 i 7.3 mm o'r bregma [10]. Yna cyfartaleddwyd data i gynhyrchu cymedr pob anifail a chymharwyd y canlyniadau yn ystadegol. Dadansoddwyd delweddau o adrannau â staen DAB o Neun gan ddefnyddio meddalwedd Neurolucida wedi'i gysylltu â microsgop trwy gamera CCD lliw [10].

Dadansoddiad data a meini prawf eithrio

Sefydlwyd yr n ar gyfer pob grŵp a priori yn ôl ein hastudiaethau blaenorol [10,16,17], gweithiau a gyhoeddwyd yn flaenorol yn y maes (gweler y cyfeiriadau ar gyfer ACC [6,22,55] a Te2 [10,59]), a thrwy amcangyfrifon G-power, yn ôl y tabl canlynol (Tabl 1):

Ar gyfer pob dadansoddiad, gwnaethom amcangyfrif nifer cymedrig terfynol o 8 i 10 anifail ar gyfer pob grŵp. Cynhaliwyd grwpiau gyda rheolaethau mewnol yn yr un sesiwn arbrofol (Tabl S1). O ystyried amrywioldeb gweithdrefnau llawfeddygol ac ymddygiadol, fe wnaethom gynnwys a priori nifer fwy o bynciau arbrofol (hyd at 15% yn fwy) a oedd mewn rhai achosion yn bodloni'r meini prawf arbrofol ac yn cael eu cynnwys, gan osgoi gwaharddiad mympwyol. Yn achos astudiaethau hippocampal, er mwyn asesu effeithiau pigiadau NMDA a CNQX ar gyfnodau amser penodol, gwnaethom gydbwyso cyfanswm yr anifeiliaid rheoli rhwng llygod mawr â cherbydau a llygod mawr a weithredir â ffug ymhlith y gwahanol grwpiau.

Perfformiwyd dadansoddiad ymddygiadol, archwiliadau histolegol, a chyfrif celloedd yn ddall. Cafodd anifeiliaid â lleoleiddiad annigonol o'r trac nodwydd neu'r briw yn achos briwiau anwrthdroadwy NMDA eu heithrio o'r dadansoddiad data (Tabl S1). Mewn astudiaethau ffarmacolegol, fe wnaethom wahardd 57 o anifeiliaid dros gyfanswm o 465 o anifeiliaid oherwydd lleoliad nodwydd anghywir (22/255 ar gyfer Te2, 31/179 ar gyfer ACC, a 4/31 ar gyfer hippocampus). Mewn astudiaethau olrhain, ar 21 o anifeiliaid, fe wnaethom ddileu 3 phwnc lle methodd y pigiad o retrobeads y BLA. Mewn astudiaethau optogeneteg Te2, dros gyfanswm o 30 o anifeiliaid, fe wnaethom wahardd 1 llygoden fawr oherwydd nad oedd lleoliad y ffibrau optig yn uwch na'r rhanbarth targed, sef 1 llygoden fawr. Wedi'r cyfan, roedd y firws yn absennol yn Te2, a 2 lygod mawr oherwydd bod y trylediad firws yn y drefn honno yn llai na 4.7% a 5.3% o ardal Te2 yn y safleoedd pigiad. Mewn llygod mawr a gynhwyswyd yn y dadansoddiad ystadegol, roedd y trylediad firws lleiaf yn 39.6% yn y cyfesuryn stereotacsig mwy blaenorol a 50.2% yn y cyfesuryn stereotacsig mwy ôl.

Yn yr un modd, yn arbrofion optogeneteg ACC, dros gyfanswm o 32 o anifeiliaid, cafodd 2 lygod mawr eu dileu oherwydd nad oedd lleoliad ffibrau optig yn uwch na'r rhanbarth targed. Cafodd dau lygoden fawr eu heithrio oherwydd bod y firws yn ACC yn absennol, 1 anifail oherwydd bod y firws i mewn i'r cortecs modur eilaidd cyfagos, ac 1 llygoden fawr oherwydd bod y trylediad firws yn llai na 2.3% o ardal ACC yn y safleoedd pigiad. Yn y llygod mawr sy'n weddill, y trylediad firws lleiaf oedd 33.3% yn y cyfesuryn stereotacsig mwy blaenorol a 42.2% yn y cyfesuryn mwy ôl.

Yn astudiaethau briwiau NMDA, roedd briwiau’n targedu rhanbarth CA1 yr hipocampws dorsal yn bennaf. Yr estyniad lleiaf (coch) ac uchaf (pinc) o friwiau hippocampal dros holl ardal yr hippocampus dorsal yn y drefn honno oedd 23.2% a 53,5% yn y cyfesuryn stereotacsig mwy blaenorol a 28.3% a 62.3% yn y cyfesuryn mwy ôl. Dros gyfanswm o 73 o anifeiliaid, cafodd 4 llygod mawr eu dileu oherwydd bod y briw yn absennol, tra bod 3 anifail ychwanegol wedi'u taflu oherwydd bod estyniad y briwiau yn llai na 5.0% (sef 4.8%, 4.3%, 3.1 %) yn ymwneud â'r ardal hippocampal yn y 2 gyfesuryn.

Cyflawnwyd dadansoddiad cyfuchlin ardal trwy archwiliad gweledol a meintioli â llaw gan ddefnyddio offeryn cyfuchlin rhanbarth meddalwedd ZEN 3.0. Yna cafodd gwerthoedd arwynebedd eu normaleiddio ar gyfanswm arwynebedd y rhanbarth. Roedd cyfesurynnau stereotacsig Te2, ACC, a hippocampus yn seiliedig ar atlas Paxinos [26] ac, yn achos Te2, gyda maes cortigol wedi'i gyfeirio at Zilles atlas [25].

Dadansoddiad ystadegol

Cyflwynir yr holl ddata fel cymedr ± SEM. Roedd yr holl ddata wedi pasio prawf Levene ar gyfer amrywiaethau cyfartal. Felly, defnyddiwyd ystadegau parametrig trwy gydol yr holl arbrofion. Cymharwyd data o 2 grŵp gan ddefnyddio 2-profion t Myfyrwyr cynffon heb eu paru. Aseswyd cymariaethau grŵp lluosog gan ddefnyddio prawf ANOVA 1-ffordd â phrawf post hoc Tukey. Er mwyn mynd i'r afael â'r gwahaniaethau rhwng ac o fewn grwpiau, fe wnaethom gyfrifo model ANOVA cynllun cymysg 3 × 2 gyda grŵp (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) fel y rhwng- newidyn pynciau a chyflwr (cyn ac ar ôl cyflyru diweddar + pigiad) fel y newidyn o fewn-pynciau. Lle'r oedd y rhyngweithiad cyflwr grŵp × yn arwyddocaol, fe wnaethom gynnal dadansoddiad prif effeithiau syml ac fe wnaethom addasu pob gwerth-p gyda'r cywiriad Bonferroni. Ar gyfer pob model ANOVA cymysg, fe wnaethom asesu'r rhagdybiaeth Sphericity trwy Brawf Sphericity Mauchly.

Mae'r paramedrau ystadegol (hy, union werth n ar gyfer pob grŵp, SEM, y prawf ystadegol, maint yr effaith, a'r union werth-p) yn cael eu hadrodd yn y chwedlau. Ar gyfer meintiau sampl cyfartal, pennwyd meintiau effaith ar gyfer profion t heb eu paru trwy gyfrifo d Cohen neu Glass's yn ôl tebygrwydd SDs tra, ar gyfer meintiau sampl gwahanol, Hedges'g. Cyfrifwyd cydberthnasau rhwng cyfrif celloedd a rhewi gan ddefnyddio cyfernod Pearson. Er mwyn pennu a oedd y data'n bodloni rhagdybiaethau'r dull ystadegol, fe wnaethom wrthod y rhagdybiaeth nwl ar lefel P < {{ }} .05. Perfformiwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio SPSS Statistics 22 (IBM).

Gwybodaeth ategol

S1 Ffig. Chwyddiad traciau nodwydd cortecs Te2 (A) a ACC (B) wedi'u chwistrellu â CNQX, wedi'u dewis fel enghreifftiau. (C) O'u cynrychioli â'r un cyd-destun bythefnos ar ôl y driniaeth, dangosodd anifeiliaid sioc-yn-unig ymateb ofn isel, gan ddangos nad oedd y driniaeth yn arwain at rewi wedi'i gyflyru yn y cyd-destun lle rhoddwyd y sioc. (D) Cafwyd canlyniadau tebyg fel yn Ffig 1 trwy wrthbwyso'r 2 dôn a ddefnyddiwyd fel CSs (CS1, 3 kHz a CS2, 15 kHz) (Prawf t Myfyrwyr, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) Yn y llygod mawr cyflyru arogl-CS roedd rhewi i'r arogl, 2 wythnos ar ôl cyflyru, yn uchel hyd yn oed pe bai wedi'i brofi mewn amgylchedd gwahanol yn ymwneud â'r cyd-destun cyflyru, a thrwy hynny ddangos bod ofn yn gysylltiedig yn benodol â'r cyflenwad ciw hwn. Bariau graddfa, 300 μm. ��P < 0.01. Mae'r holl ddata yn gymedr ac yn SEM. Mae'r data cryno ar gyfer Ffig S1 i'w weld yn y wybodaeth ategol yn y ffeil o'r enw Data Ffigur Ategol S1. (TIF)

S2 Ffig. Fe wnaeth pigiad CNQX amharu ar gadw atgofion ofn clywedol diweddar mewn llygod mawr lle roedd cyffredinoli ofn yn cael ei ostwng gan naws yn unig cyn-amlygiad neu drwy ddefnyddio tôn sŵn gwyn fel CS1. ANOVA dyluniad cymysg 3 × 2 (prif effaith y grŵp: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, prif effaith cyflwr: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grŵp × rhyngweithio cyflwr F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) yn dangos bod rhewi i'r tôn 3 kHz cyn ei gysylltiad â'r UD yn is mewn anifeiliaid a gafodd y rhag-amlygiad tôn 15 kHz cyn y paru 15 kHz-US (n=10, p=0.001) neu mewn llygod mawr wedi'u cyflyru i sŵn gwyn (n=13 , p=0.008) o gymharu ag anifeiliaid CS1-CS2 (n=22) a ddangosodd ymateb cyffredinoli ofn amrywiol. Fodd bynnag, ar ôl dysgu CS-US a pigiadau cnqx yn y cortecs Te2, roedd nam ar y cof ofn diweddar ym mhob grŵp (p> 0.05). Prif effaith syml o fewn grwpiau (cyn ac ar ôl dysgu CS-US ac yna chwistrelliad cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Tôn-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0.05, ��P < 0.01. Mae'r holl ddata yn gymedr ac yn SEM. Gellir dod o hyd i'r data cryno ar gyfer Ffig S2 yn Gwybodaeth ategol yn y ffeil o'r enw Data Ffigur Ategol S1. (TIF)

S3 Ffig. (A) Enghraifft ar hap o bigiad ôl-gleiniau yn targedu BLA. (B ac C) Enghreifftiau o leoliadau ffibr optegol uwchben y BLA o anifeiliaid wedi'u chwistrellu â fectorau AAV yn Te2 (B) a cortecs ACC (C). Bariau graddfa, 500 μm.

Diolchiadau

Diolchwn i Dr. E. Manassero am eu cefnogaeth a chyngor parhaus.

Cyfraniadau Awdur

Cysyniadoli: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Curadu data: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Dadansoddiad ffurfiol: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Caffael cyllid: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Ymchwiliad: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Methodoleg: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Goruchwyliaeth: Benedetto Sacchetti.

Dilysiad: Benedetto Sacchetti.

Ysgrifennu – drafft gwreiddiol: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Ysgrifennu – adolygu a golygu: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Cyfeiriadau
1. Frankland PW, Bontempi B. Trefniadaeth atgofion diweddar ac anghysbell. Nat Parch Neurosci. 2005; 6:119-130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Niwrobioleg cydgrynhoad, neu, pa mor sefydlog yw'r engram? Annu Parch Seicoleg. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Sgweier LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Cydgrynhoi cof. Oer Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Sgweier LR. Cydgrynhoi'r cof a'r llabed amseryddol medial: model rhwydwaith syml. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Pam mae systemau dysgu cyflenwol yn yr hippocampus a neocortecs: mewnwelediadau o lwyddiannau a methiannau modelau cysylltiadol o ddysgu a chof. Seicoleg Parch. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com