Effaith Amddiffynnol Tubuloside B Ar Apoptosis a achosir gan TNF mewn Celloedd Niwronol

ABSENOLDEB

NOD: Ymchwilio i effaith niwro-amddiffynnol tubuloside B, un o'r ffenylethanoidau sydd wedi'u hynysu o goesynnauCistanche salsa, ar apoptosis a achosir gan ffactor-alffa tiwmor necrosis (TNF) mewn celloedd niwronol SH-SY5Y.DULLIAU: Dadansoddwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio assay MTT. Canfuwyd celloedd apoptotig gan ddefnyddio Hoechst33342staining, a'u cadarnhau gan ddarniad DNA a dadansoddiad cytometrig llif. Mesurwyd actifedd caspase-3 gyda phecyn assay arbennig. Pennwyd crynodiad calsiwm mewngellol rhydd gyda probeIndo-1 gan y sbectromedr. Cafodd lefel y rhywogaethau ocsigen adweithiol mewngellol a photensial y bilen mitocondriaidd eu pennu gan ficrosgopeg confocal sganio â laser (LSCM) ynghyd â probeH2DCFDA fflworoleuedd neu JC-1 yn y drefn honno. CANLYNIADAU: Dangosodd celloedd SH-SY5Y a gafodd eu trin â TNF 100 µg/L am 36 h newidiadau morffolegol nodweddiadol o apoptosis. Gellid arsylwi ysgol DNA gan electrofforesis gel agarose. Roedd y ganran uchaf o gelloedd apoptotig wedi cronni i 37.5 y cant. Yn dilyn triniaeth 36 h gyda TNF , gwelwyd crynhoad o ROS mewngellol a [Ca2 plus ] I a gostyngiad mewn potensial pilen mitocondriaidd, a chynyddodd gweithgaredd caspase tua phum gwaith o gymharu â rheolaethau. Fodd bynnag, roedd rhag-driniaeth gyda tubuloside B (1, 10, neu 100 mg/L) am 2 h yn gwanhau'r apoptosis trwy gyfrwng TNF. Gweithred gwrthiapoptotig tubuloside Byn rhannol ddibynnol ar effeithiau straen gwrth-ocsidiol, cynnal swyddogaeth mitocondria, gostyngiad yn y crynodiad o galsiwm mewngellol rhad ac am ddim, ac atal gweithgaredd caspase-3. CASGLIAD: Mae gan Tubuloside B y gallu niwro-amddiffynnol i antagonize apoptosis a achosir gan TNF mewn celloedd SH-SY5Y a gall fod yn ddefnyddiol wrth drin rhai clefydau niwroddirywiol.

RHAGARWEINIAD

Mae apoptosis yn chwarae rhan homeostatig bwysig mewn nifer o brosesau cellog yn ogystal ag yn natblygiad y systemau nerfol[1]. Gall marwolaeth celloedd wedi'i raglennu hefyd gyfrannu at gyflyrau patholegol amrywiol, megis isgemia ymennydd[2,3], anhwylderau niwroddirywiol, megis clefyd Alzheimer, clefyd Parkinson, clefyd Hunting ton, a sglerosis ochrol amyotroffig[4-7]; yn ogystal ag enseffalopathi gohiriedig ar ôl gwenwyno carbon monocsid acíwt[8]. Mae sawl llinell o dystiolaeth wedi awgrymu'n gryf bod straen ocsideiddiol, anghydbwysedd cellog rhwng cynhyrchu a dileu rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), wedi arwain at apoptosis andnecrosis niwronaidd[9-11]. Felly, mae'n werthfawr nodi cyfansoddion a all elyniaethu gweithredoedd niweidiol ROS a gweithredu fel gwrthocsidydd i amddiffyn niwronau rhag apoptosis.

Mae Tubuloside B yn un o'r ffenylethanoidau sydd wedi'u hynysu o goesynnauCistanche salsa, meddyginiaeth lysieuol Tsieineaidd, sy'n gyffur crai pwysig a ddefnyddir fel asiant gwrth-seleniwm a gwrth-blinder[12]. Dangoswyd bod sawl ffenylethanoid yn meddu ar briodweddau sborion radical rhydd ac yn amddiffyn anafiadau gwenwynig a achosir gan straen ocsideiddiol[13-15]. Mae tiwmor necrosis factor-alpha (TNF) yn gyfrwng gwenwynig-ymyrrol oherwydd ei rôl bwysig mewn clefydau niwroddirywiol. Mae marwolaeth naill ai gan necrosis neu apoptosis wedi'i weld mewn ymateb i TNF [16]. Mae llawer o astudiaethau'n awgrymu bod straen ocsideiddiol yn chwarae rhan hanfodol ym mecanwaith apoptosis celloedd TNF-mediated. Mae lefelau uwch o ROS wedi'u dogfennu mewn celloedd yn dilyn triniaeth â TNF [17,18] a gall marwolaeth trwy gyfrwng TNF gael ei atal gan sborionwyr radicalau rhydd[19]. Felly, buom yn astudio a yw tubuloside Bcanprotection yn erbyn apoptosis a achosir gan TNF a straen ocsideiddiol mewn celloedd niwronol diwylliedig SH-SY5Y.

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Adweithyddion

Prynwyd cyfrwng addasedig Eagle (MEM) a serwm buchol ffetws (FBS) oddi wrth GIBCO/BRL. Bisbenzimide lliw cromatin (Hoechst 33342), Poly-L-lysin, 3-(4,{5}}dimethylthiazal-z-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT), TNF , a 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) gan Sigma Chemical Company (St Louis, MO, UDA). Prynwyd pecyn canfod apoptosis apoptosis fflworoleuedd anecsin-V gan Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, yr Almaen). Prynwyd 5,5´,6,6´-Tetracloral-1,1´,3,3´-tetraethyl benzimidazole carbocyanine ïodide (JC-1) ac Indo-1/AM o Molecular Probes (Leiden, Yr Iseldiroedd). Cafwyd pecynnau profi Caspase a thynnu DNA gan Promega (UDA). Tubuloside B oCistanche salsaPeng-fei TU (Canolfan Ymchwil Fodern Prifysgol Peking ar gyfer Meddygaeth Tsieineaidd Draddodiadol) yn garedig iawn. Roedd purdeb y cyfansoddion yn fwy na 98 y cant ar gromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC). Roedd pob adweithydd neu gyffur arall o radd ddadansoddol.

Meithriniad celloedd a thriniaeth

Cadwyd celloedd niwronaidd SH-SY5Y5Y a gafwyd gan ATCC yn MEM ynghyd â 10 y cant FBS, 100 KU/L benzylpenicillin, a streptomycins 100 mg/L mewn fflasg feithrin poly-L-lysin mewn deorydd llaith gyda 5 y cant CO2 ar37ºC. Adnewyddwyd y cyfrwng diwylliant bob 2 i 3d. Cyn-driniwyd celloedd â chrynodiadau amrywiol o tubuloside B (1, 10, neu 100 mg / L) am 2 h ac yna eu trin â 100 µg / L TNF am 36 h cyn dadansoddi. Ystyriwyd celloedd normal fel y rheolydd.

Dadansoddiad o hyfywedd celloedd

Pennwyd hyfywedd celloedd trwy ddefnyddio assay MTT[20]. Cafodd celloedd eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon ar 1 × 104 o gelloedd y ffynnon a thyfu i 70 y cant o gydlifiad mewn cyfrwng diwylliant. Disodlwyd y cyfrwng gan gyfrwng sy'n cynnwys crynodiadau amrywiol o tubuloside B am 2 h ac yna gyda TNF am 36 h. Ychwanegwyd cyfanswm o 5 g/L MTT at bob ffynnon ar ôl 36 h, a pharhaodd y diwylliant i ddeor am 4 awr arall ar 37 °C. Ar ôl tynnu'r cyfrwng, solubileiddiwyd celloedd a chrisialau llifyn â 200 µL dimethylsulfoxide (Me2SO), a mesurwyd amsugnedd ar 570 nm trwy ddefnyddio darllenydd assay microplate model ELX{-800 (One Lambda Inc).

Hoechst 33342 staen

Ar ôl triniaeth gyda tubuloside B a / neu TNF , cynaeafwyd celloedd a'u gosod gyda 4 y cant o baraformaldehyd am 30 munud ar 25 ºC, yna eu golchi â halwynog clustog ffosffad wedi'i oeri ymlaen llaw (PBS) dair gwaith a'u hamlygu i 10 mg / L Hoechst33342 yn yr ystafell tymheredd yn y tywyllwch am 10 munud. Arsylwyd samplau o dan ficrosgopeg fflworoleuedd (Olympus RX 400)[21].

Dadansoddiad o ddarniad DNA

Echdynnwyd DNA trwy ddefnyddio pecyn echdynnu DNA (Promega) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, llwythwyd sampl DNA 10µL ar geliau agarose llorweddol 1.5 y cant yn cynnwys bromid ethidium. Cafodd geliau eu rhedeg ar 60 V am 1 h a delweddwyd darnau DNA gan ddefnyddio golau UV[22].

Arbrawf rhwymo Annexin-V

Defnyddiwyd pecyn canfod apoptosis AnnexinV-FITC i rwymo anexin-V, sydd â chysylltiad cryf â phosphatidylserine ac sy'n gallu archwilio apoptosis[23]. Yn gryno, cynaeafwyd celloedd a'u hatal mewn byffer rhwymo ar grynodiad celloedd terfynol o gelloedd 1 × 106 / ml. Deorwyd tua 1 × 105 o gelloedd yn y tywyllwch gydag anecsin-V a propidium ïodid am 15 munud. Yna dadansoddwyd yr ataliad trwy ddefnyddio cytomedr llif sgan FACS (Becton Dickinson, Heidelberg, yr Almaen). Cofnodwyd fflworoleuedd cysylltiedig ag Annexin-VFITC a propidium ïodid ar hidlwyr FL1-H (525 nm) a FL2-H (575 nm), yn y drefn honno.

Assay gweithgarwch Caspase-3

Canfuwyd gweithgarwch Caspase-3 drwy ddefnyddio pecyn assay HomogeneousCaspase Apo-ONETM-3 (Promega). Yn gryno, cafodd celloedd eu hadu i 96-blatiau ffynnon ar 1×104 cell/ffynnon. Ar ôl bod yn agored i grynodiadau amrywiol o tubulosideB a / neu TNF , golchwyd celloedd â PBS oer iâ. Yna, cymysgwyd byffer caspase 1 µL Z-DEVD-R110 a 99 µL i wneud yr adweithydd caspase homogenaidd. Ychwanegwyd cyfanswm o adweithydd caspase homogenaidd 100 µL-3 at bob ffynnon. Cymysgwyd y cynnwys yn ysgafn a'i ddeor am 4 awr ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch. Mesurwyd dwyster fflworoleuedd swbstrad Z-DEVD-R110 ar donfedd cyffro o 498 nm a thonfedd allyriadau o521 nm trwy ddefnyddio sbectrofluoromedr microplate (Wallac Victor2TM 1420 Multilabel Counter, UDA).

Pennu lefel ROS mewngellol mewngellol

Mesurwyd lefelau ROS trwy ddefnyddio dull staenio llifyn fflwroleuol H2DCFDA[24]. Mae H2DCFDA yn gyfansoddyn anpolar sy'n cael ei drawsnewid yn ddeilliad pegynol anfflworoleuol (H2DCF) gan esterasau cellog ar ôl ei ymgorffori mewn celloedd. Mae H2DCF yn bilen anhydraidd ac yn cael ei ocsidio'n gyflym i'r 2 hynod fflwroleuol,7-dichlorofluorescein (DCF) ym mhresenoldeb ROS mewngellol[25]. Cafodd celloedd wedi'u meithrin ar orchuddion gwydr ym mhob grŵp eu deor am 30 munud ar 37 ºC gyda H2DCFDA 20 µmo/L wedi'i hydoddi mewn PBS. Yna golchwyd slipiau clawr deirgwaith gyda PBS a'u dadansoddi o dan ficrosgopeg laser confocal (Leica, yr Almaen). Roedd DCF yn gyffrous ar 488 nm, ac roedd yr hidlydd allyriadau yn hidlydd rhwystr 510 nm. Cadwyd dwyster fflwroleuol a delweddau microsgopig confocal yn gyson i ganiatáu ar gyfer cymharu dwyster fflworoleuedd cymharol rhwng celloedd rheoli a chelloedd arbrofol.

Assay potensial pilen mitocondriaidd

Roedd potensial pilen mitocondriaidd celloedd yn fy marn i gyda'r defnydd o'r stiliwr JC-1[26]. Gall JC-1 fynd i mewn i mitocondria yn ddetholus, sy'n ymddangos yn wyrdd ar grynodiadau isel neu botensial pilen isel fel monomer. Fodd bynnag, mewn crynodiadau uchel, mae mitocondria yn dangos fel agregau fflwroleuol coch. Mae JC-1 yn sensitif i botensial pilen mitocondriaidd a gall y newidiadau yn y gymhareb rhwng fflworoleuedd gwyrdd a choch ddarparu gwybodaeth am botensial y bilen mitocondriaidd. Ar ôl i'r celloedd wedi'u trin gael eu llwytho â JC-1 1 µmol/L am 10 munud ar 37 ºC, roedd y llifyn fflwroleuol wedi'i gyffroi ar 490 nm, a chofnodwyd dwyster fflworoleuedd moleciwlau monomer a chyfun ar 590 nm o dan gydffocal sganio microsgopeg laser.

[Ca2 plws ]i mesuriadau

Penderfynwyd ar y crynodiad calsiwm mewngellol rhad ac am ddim ([Ca2 plws ]i) o gelloedd SHSYY gyda'r stiliwr Indo-1 trwy ddilyn y dull a ddisgrifiwyd gan Rego et al[27]. Ar ôl triniaeth TNF (ym mhresenoldeb neu absenoldeb tubuloside B), llwythwyd celloedd SHSYY â 3 µmol Indo-1/AM yn MEM am 45 munud, ar 37 ºC a'u deor ymhellach am 15 munud yn MEM i ganiatáu hydrolysis y acetoxymethyl ester rhagflaenydd y stiliwr. Ar ôl rinsio â hydoddiant halwynog sodiwm (gyda 1.5 mmol / L CaCl2), mesurwyd fflworoleuedd celloedd ar 37 ºC mewn sbectromedr ymoleuedd, gyda chyffro yn 335 nm ac allyriadau ar 410 nm. Cyfrifwyd y[Ca2 plus ] I yn ôl yr hafaliad:

[Ca2 plws ]i=250 nmol/L×[(F-Fmin)/(Fmax-F)] (nmol/L),

lle mae 250 nmol/L yn cyfateb i gysonyn daduniad y cymhlyg Indo-1–Ca2 plws , Fmax yw'r fflworoleuedd uchaf a geir wrth ychwanegu 3 ¦Ìmol/Lionomycin, a Fmin yw'r fflworoleuedd lleiaf a bennir yn dilyn yr hafaliad: Fmin =AF plws 1/12(Fmax-AF), lle AF yw'r awtofflworoleuedd a geir wrth ychwanegu 3 mmol/L MnCl2.

Dadansoddiad ystadegol

Mynegwyd canlyniadau fel cymedrig±SD o werthoedd triphlyg ar gyfer pob arbrawf. Roedd cymariaethau ystadegol yn cynnwys defnyddio'r prawf Myfyriwr-S. P<0.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

CANLYNIADAU

Effaith tubuloside B ar forffoleg niwclear celloedd

Defnyddiwyd y staen Hoechst 33342 sy'n sensitif i DNA i asesu newidiadau mewn morffoleg niwclear yn dilyn triniaeth tubuloside B a TNF. Roedd y niwclysau mewn celloedd normal yn normal ac yn arddangos staen gwasgaredig o'r cromatin (Ffig 1A). Fodd bynnag, ar ôl dod i gysylltiad â TNF 100 µg/L am 36 h, cafodd SH-SY5Ycells newidiadau morffolegol nodweddiadol o apoptosis fel cromatin cyddwys a chnewyllyn crebachu (Ffig 1B). Gwelwyd gostyngiad amlwg yn y celloedd a gafodd eu trin ymlaen llaw â thubuloside B (Ffig 1C-1E).

Effaith niwro-amddiffynnol tubuloside B ar hyfywedd celloedd

Ar ôl deori gyda TNF , cafodd tua 45.6 y cant o'r celloedd farwolaeth apoptosis. Gostyngodd cyn-driniaeth gyda tubuloside B (1, 10, neu 100 mg / L) gyfradd marwolaethau celloedd mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​(cyfradd marwolaeth celloedd oedd 30 y cant, 19.5 y cant, a 6.2 y cant, yn y drefn honno; Ffig 2), ond ni wnaeth tubuloside B yn unig achosi unrhyw sytowenwyndra ymddangosiadol (data heb ei ddangos).

Effaith tubuloside B ar ddarniad DNA

Ar ôl dod i gysylltiad â chelloedd SH-SY5Y â TNF am 36 h, gwelwyd ysgolion DNA amlwg yn nodweddiadol. Fodd bynnag, roedd celloedd rhag-driniaeth â thubuloside B yn atal ysgolion DNA trwy gyfrwng TNF, yn enwedig ar y crynodiad o 100 mg/L, sy'n atal darnio DNA yn llwyr (Ffig 3).

Effaith tubuloside B ar amlygiad ffosffolipid phosphatidylserine

Cadarnhawyd gweithred antiapoptotig tubuloside B hefyd trwy fesur presenoldeb ffosffatidylserine ar y gellbilen allanol. Yn y rheolaeth, mae tua 96.3 y cant o'r celloedd yn iach. Dangosodd Ffig 4 ganlyniadau arbrofion rhwymo anexin-V i fesur presenoldeb phosphatidylserine ar y gellbilen allanol. Canran yr apoptosis oedd 37.5 y cant ar ôl triniaeth TNF (Ffig 4B), ond gostyngodd y gyfran i 28.2 y cant, 19.29 y cant, a 7.9 y cant gyda rhag-driniaeth 1, 10 neu 100 mg/L tubulosideB, yn y drefn honno (Ffig 4C-4). E).

Effaith ataliol tubuloside B ar ffurfio ROS

Yn yr astudiaeth bresennol, cafwyd micrograffau laser confocal nodweddiadol o gelloedd SH-SY5Y am 36h yn absenoldeb neu bresenoldeb TNF a tubulosideB. Cynyddodd lefel y ROS a gynhyrchwyd mewn celloedd a achosir gan TNF yn sylweddol o gymharu â rheolaethau (Ffig 5B). Fodd bynnag, gostyngodd dwyster fflworoleuedd mewn celloedd wedi'u trin â thubuloside B 16.2 y cant , 56.4 y cant , ac 89.7 y cant gyda thriniaeth 1,10, neu 100 mg / L tubuloside B o'i gymharu â chelloedd wedi'u trin â TNF, yn y drefn honno (Ffig 5C -5). E).

Effaith tubuloside B ar botensial pilen mitocondriaidd

Roedd celloedd rheoli heb eu trin yn arddangos mitocondria niferus, llachar eu lliw a oedd yn allyrru fflworoleuedd coch-oren a chymhareb coch/gwyrdd oedd5.97±0.21, a oedd yn arwydd o botensial pilen uchel arferol (Ffig 5A). TNF -triniaeth a achosir gan drawsnewidiad mewn athreiddedd mitocondria a cholled sylweddol o botensial pilen (cymhareb coch/gwyrdd oedd 0.35±0.02) (Ffig 5B). Roedd triniaeth TubulosideB yn atal cwymp potensial pilen mitocondriaidd a achosir gan TNF mewn SH-SY5Ycells gyda dos cynyddol. Ailddechreuodd Tubuloside B botensial y bilen mitocondriaidd yn raddol gyda chrynodiadau cynyddol fel y dangosir trwy ailymddangosiad staen mitocondriaidd coch (Ffig6C-6E).Effaith tubuloside B ar weithgarwch caspase-3

Cynyddwyd gweithgarwch Caspase-3 tua phum gwaith o gymharu â rheolyddion ar ôl datguddiad TNF (Ffig 7). Mewn cyferbyniad, dangosodd celloedd SH-SY5Y a gafodd eu rhag-drin ar yr un pryd â tubuloside B 1, 10, neu 100 mg/L a gostyngiad sylweddol mewn gweithgarwch caspase-3 o gymharu â chelloedd wedi'u creu TNF ar yr un pwynt amser (Ffig 7).

Effaith tubuloside B ar lefel [Ca2 plws ]i

Cynyddodd lefel [Ca2 plws ] I mewn celloedd a achosir gan TNF yn sylweddol o'i gymharu â rheolaethau (rheolaeth: 105.5 ± 11.2nmol / L; 100 µg / L TNF : 238.4 ± 18.9 nmol / L), a gafodd ei leihau'n rhannol gan a gafodd ei drin ymlaen llaw â thubuloside B(10 neu 100 mg/L) (Ffig 8).

TRAFODAETH

Cistanchessalsa(CA Mey) G Beck, un rhywogaeth oCistanchessy'n perthyn i'r teulu Orobanchaceae, yn blanhigyn parasitig brodorol yng ngogledd-orllewin Tsieina. Mae coesyn y planhigyn hwn yn feddyginiaeth Tsieineaidd draddodiadol bwysig ac fe'i defnyddir ar gyfer diffyg arennau, anffrwythlondeb benywaidd, leucorrhea afiach, neurasthenia, a rhwymedd henaint oherwydd syrthni cytrefol. Prif gyfansoddion gweithredol y perlysiau hwn yw glycoside ffenylethanoid[28]. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, amlygodd canlyniadau nifer o astudiaethau swyddogaeth tubuloside B wrth hyrwyddo amrywiol weithgareddau ffarmacolegol a biolegol[13-15]. Fodd bynnag, nid yw'r mecanweithiau cellog a moleciwlaidd sy'n sail i'r gweithredoedd yn cael eu deall yn llawn. Dangosodd yr astudiaeth bresennol fod tubuloside B yn cael effeithiau niwro-amddiffynnol sylweddol ar apoptosis a achosir gan TNF mewn celloedd SH-SY5Yneuronal trwy gynnal y swyddogaeth mitocondriaidd, lleihau cynhyrchu ROS, lleihau lefel y calsiwm mewngellol, ac atal gweithgaredd caspase trwy mecanwaith gwrthocsidiad. Gall y mecanweithiau hyn fod trwy effaith niwro-amddiffynnol unigol tubuloside B neu ei ryngweithio â ffactorau eraill ac yna gallant arwain at gymhareb is o apoptosis mewn celloedd.

Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod ocsidyddion neu ragocsidyddion yn rheolyddion pwysig o apoptosis a gallant achosi apoptosis[29,30]. Mae straen ocsideiddiol yn elfen gyffredin o apoptosis a achosir gan ysgogiadau amrywiol megis TNF ac amlygiad tocsin amgylcheddol, nad ydynt fel arfer yn gweithredu'n uniongyrchol ocsidydd. Mae rôl ganolog straen ocsideiddiol mewn apoptosis yn cael ei gefnogi'n gryf gan allu gwrthocsidyddion cellog amrywiol i rwystro apoptosis a achosir gan asiantau amrywiol[31]. Gallai cyfansoddion â phriodweddau gwrthocsidiol gael effaith amddiffynnol mewn gwahanol sefyllfaoedd o gamweithrediad cellog trwy chwilota radicalau rhydd[32]. Ar ben hynny, adroddwyd bod sawl glycosidau ffenylpropanoid yn meddu ar briodweddau sborion radical rhydd ac yn amddiffyn anafiadau gwenwynig a achosir gan straen ocsideiddiol. Yn unol â'r syniad hwn, canfuom fod tubuloside B wedi gostwng lefel y ROS a achosir gan TNF, y gallai amddiffyn niwronau rhag apoptosis trwy chwilota'n uniongyrchol ar rywogaethau ocsigen adweithiol mewngellol.

Roedd llawer o dystiolaeth yn awgrymu bod newidiadau mawr mewn swyddogaeth mitocondriaidd yn rhan hollbwysig o'r broses apoptotig[33]. Canfuwyd bod anhwylderau homeostasis calsiwm a newidiadau i botensial pilen mitocondriaidd yn hyrwyddo agoriad mandwll trawsnewid athreiddedd mitocondriaidd (MPTP) neu'n achosi rhyddhau cytochrome c trwy fecanweithiau annibynnol MPTP, gan fod yn uniongyrchol gyfrifol am actifadu'r rhaeadr apoptotig a gall ragflaenu niwclear. arwyddion o apoptosis[34]. Gall y newidiadau biocemegol hyn ddeillio o newidiadau yn swyddogaeth mitocondria[35]. Mae'r ffeithiau bod tubuloside B wedi atal lleihau potensial pilen mitocondriaidd a lleihau'r cynnydd mewn calsiwm mewngellol a achosir gan TNF yn awgrymu y gallai tubuloside B fod â'r gallu i wrthweithio gwenwyndra TNF trwy atal agor MPTP ac atal camweithrediad mitocondria.

Gall ysgogiadau allanol gychwyn apoptosis trwy'r mecanweithiau uchod a gallant gydgyfeirio ar y llwybr caspase i weithredu cam olaf y broses apoptotig[36]. Mae'r teulu caspase o broteasau yn cynnwys o leiaf 14 aelod mamalaidd sy'n cael eu mynegi'n gyfansoddiadol ym mron pob math o gell fel proensymau anactif (zymogens) sy'n cael eu prosesu a'u actifadu mewn ymateb i amrywiaeth o ysgogiadau pro-apoptotig[37]. Caspase{{4 }} yn aelod i lawr yr afon o'r rhaeadru caspase ac yn gweithredu fel effeithydd canolog yn y cyfnod gweithredu. Pan fydd protein rhagflaenydd caspase CPP32 yn cael ei actifadu gan signalau i fyny'r afon fel rhyddhau cytochrome mitocondriaidd c, mae'r caspase gweithredol yn hollti gweddillion aspartate penodol mewn proteinau â swyddogaethau adeileddol, cadw tŷ a rheoleiddio amrywiol[{{ 8}}]. Gall y digwyddiadau proteolytig hyn arwain at apoptosis celloedd a chyfrannu at ddarnio DNA a newidiadau morffolegol niwclear. Felly, gallai sylweddau a all atal gweithgaredd caspase-3 amddiffyn celloedd rhag apoptosis[2,31]. Gan fod tubuloside B wedi atal y gweithgaredd caspase yn sylweddol yn y celloedd a driniwyd gan TNF, mae ganddo allu niwro-amddiffynnol.

I gloi, cafodd tubuloside B effaith amddiffynnol amlswyddogaethol ar niwronau a ddifrodwyd. Oherwydd ei weithgareddau gwrth-apoptosis pwerus a straen gwrthocsidiol, gallai fod at ddefnydd clinigol mewn anableddau niwroddirywiol a niwrolegol sy'n ymwneud â apoptosis niwron.