Darganfuwyd Proteinau Gydag Amlder O Leiaf 2 Ym mhob Cyflwr Archwiliedig
Sep 06, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
At hynny, fel o'r siartiau bar yn Ffigurau 5B a 6B, mae'r dosbarthiad protein nodedig yn ôl rhag-gyflyru hypocsig cell secreting yn sylweddol. Yn yr achos hwn, er gwybodaeth gyflawn, adroddwyd hefyd am broteinau nad ydynt yn uwch na throthwy set DAve a DCI. Mae gan y ffetws ganlyniadau secretome wedi'u cyfoethogi â'r Protein Sioc Gwres 60 kDa (HSPD1, Ffigur 5B, panel chwith) yn ei fformiwleiddiad hypocsig, tra bod y cymar amenedigol yn mynegi'n fawr myosin contractile celloedd cyhyrau llyfn rheoliadol [52] polypeptid ysgafn 9(MYL9, Ffigur 5B, panel dde). Mae'n ymddangos bod cyfran bwysig o'r gwahaniaeth rhwng cyfnodau beichiogrwydd yn dibynnu mwy ar rag-gyflyru hypocsig mewn HAFS. EVs; Canfuwyd bod f-have-EVs a gafwyd o breimio celloedd hypocsig wedi'u cyfoethogi gan ffactorau gan gynnwys Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Is-uned Laminin -5, a -1(LAMA5 a LAMB1), Thrombospondin{{17 }} (THBS1, Ffigur 6B, panel chwith). Roedd p-hAFS-EVs hypocsig yn cynnwys Ferritin Heavy Chain (FTH1), proteinau sgaffaldiau fel Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexin A6(ANXA6), beta atalydd daduniad GDP Rab (GDI2), ynghyd â Thy -1 glycoprotein bilen (THY1), Neuropilin-1(NRP1) a Matrix Metalloprotein 14 (MMP14, Ffigur6B, panel dde).
Canfuwyd proteinau ag amlder o 2 o leiaf ym mhob cyflwr a archwiliwyd yn f-hAFS. Cymharwyd EVs a p-hAFS-EVs ymhellach â chronfa ddata Vesciclepedia [53]. Yn ôl y disgwyl, mae mwyafrif y proteinau a nodwyd (96 y cant) wedi'u disgrifio'n flaenorol mewn EVs ac exosomes yn y gronfa ddata gyfeirio (Ffigur S3A).buddion cistancheYn hyn o beth, perfformiwyd dadansoddiad cyfoethogi Gene Ontology (GO) trwy FunRich [54]. Cymharwyd helaethrwydd termau GO yn y set ddata yn erbyn eu swm naturiol yn y gronfa ddata gyfeirio i ddod o hyd i grwpiau o broteinau a orgynrychiolir yn ystadegol, yn ôl eu hymwneud â phrosesau biolegol, swyddogaeth foleciwlaidd, a chydrannau cellog (ar gyfer yr agwedd olaf hon nid yw data dangos, ond ar gael ar gais). O ran y dadansoddiad o'r swyddogaethau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â phroteinau a nodwyd, nododd ffracsiynau HAFS-CM gyfoethogi mewn cyfansoddyn strwythurol o fatrics allgellog a cytoskeleton, rhwymiad protein cytosgerbydol, a gweithgaredd moleciwlaidd strwythurol (Ffigur S2), tra bod HAFS-EVs wedi'u cyfoethogi â strwythur strwythurol. cyfansoddyn sytosgerbwd a ribosom, DNA a rhwymo RNA a GTPase a ffactorau rhwymo gwarchodwr (Ffigur S3C).
Dangosodd dadansoddiad cyfoethogi prosesau biolegol ar gyfer HAFS-CM a have-EVs fod mwyafrif y proteinau sydd wedi'u modiwleiddio yn ffracsiynau secretome AFS ffetws ac amenedigol yn perthyn i dwf/cynnal a chadw celloedd a metaboledd protein (Ffigurau 5C a 6C). O fewn HAFS-EVs fe wnaethom sylwi bod y term "cyfansoddion strwythurol matrics allgellog" yn gysylltiedig yn gyfan gwbl â f-hAF-EVs hypocsig; cyfoethogwyd y termau "rhwymo ïon calsiwm" a "gweithgaredd moleciwlaidd strwythurol" yn bennaf mewn samplau hypocsig f-hAFS a p-hAFS (Ffigur S3B).
Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I a DCI (hyder mynegiant gwahaniaethol) Yn fwy na neu'n hafal i I5I pasiodd yr hidlyddion ac ystyriwyd eu bod wedi'u mynegi'n wahaniaethol; gweler Tabl S3 am restr gyflawn a pharamedrau manwl y proteinau a adroddwyd. (C) Dadansoddiad cyfoethogi prosesau biolegol o broteinau a nodwyd ag amlder o leiaf 2 mewn f-hAFS-EVs (panel chwith) a p-hAFS-EVs (panel dde) ar ôl rhag-gyflyru hypocsig. Yn seiliedig ar yr offeryn FunRich, dangosir termau ontoleg genynnau mewn siartiau bar sy'n nodi canran y genynnau a gyfoethogwyd ar gyfer pob categori (bariau melyn tywyll ar gyfer f-hAFS-EVsnormo, bariau coch ar gyfer f-hAFS-EVShypo, bariau gwyrdd golau ar gyfer p-hAFS -EVsnormo a bariau gwyrdd tywyll ar gyfer p-hAFS-EVShypo). Termau ontoleg genyn â Bonferroni yn unig a gywirwyd*p<0.05 are="">
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
2.6.Mae'r Proffil Cytocin a Chemokine o Ffetws vs.Amenedigol wedi-CM ac wedi-EVs Datgelodd Patrymau Dosbarthu Gwahanol
Rydym wedi dilysu gallu adfywiol f-hAFS-CMhypo o'r blaen ar gelloedd cardiofasgwlaidd anafedig trwy effeithiau paracrine [34,35,49]. Yma gwnaethom gymharu cynnwys cytocin a chemocin f-hAFS-CMHypo â'r gwrthran cyfatebol p-hAFS (Ffigur 7A, Ffigur S4A, a Thabl S4) a chanfod rhai ffactorau gwahaniaethol.
Canfuwyd ANGIOGENIN, Inducer Metalloproteinase Matrics Allgellog (EMMPRIN), Interleukin 8 (IL-8), a Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) wedi'u cyfoethogi'n gyfan gwbl inf-haFS-CMNypo ac ni chawsant eu canfod mewn p-hAFS-CMhypo. Cafodd Protein Rhwymo Ffactor Twf tebyg i inswlin 2 (IGFBP2) ac Osteopontin (OPN) eu cynyddu'n sylweddol mewn f-hAFS-CMhypo dros p-hAFS-CMHypo o 3.5-a 3.{8-plyg (" p<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">
Er bod y ffetws-yn erbyn amenedigol have-CM yn dangos mynegiant gwahaniaethol yn eu proffil cytocine a chemocin, roedd y cyfatebol ffetws yn erbyn amenedigol EV wedi'u dosbarthu'n fwy homogenaidd, er gyda phroffiliau mynegiant is (Ffigur 7B, Ffigur S4B, a Thabl S5). Serch hynny, gellid gwerthfawrogi rhai gwahaniaethau: dim ond gan f-hAFS-EVSHypo y mynegwyd DiPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV), Ffactor twf/gwahaniaethu 15 (GDF-15), ac IL{8}}, er yn isel. lefelau; Dim ond mewn p-hAFS-EVShypo y canfuwyd ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND a Protein Rhwymo Fitamin D (VDBP), er iddynt gael eu canfod unwaith eto mewn symiau isel. Cytocinau eraill megis Ffactor Niwrotroffig sy'n Deillio o'r Ymennydd (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, Protein Rhwymo Ffactor Twf tebyg i Inswlin 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, Ffactor sy'n Deillio o Strom{ Canfuwyd {23}} alffa (SDF-1a), yn f-hAFS-EVShypo a p-haFS-EVSHvpo, gyda PAI-1 ac EMMPRIN yn cael eu mynegi’n uwch (Ffigur 7B)
Roedd BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3, a SDF-lo wedi'u cyfoethogi'n gyfan gwbl ym mhob has-EVs hypocsig o'i gymharu â'r HAFS-CM cyfatebol, waeth beth fo'r cam beichiogrwydd. Ar ben hynny, er na chanfuwyd EMMPRIN o fewn p-haFS-CMhypo, canfuwyd ei fod wedi'i gyfoethogi yn y ffracsiwn cyfatebol EV; i'r gwrthwyneb, roedd OPN yn fwy niferus mewn f-have-CMhypo nag yn f-have-EVShypo, tra roedd yn gymaradwy ymhlith y ffracsiynau secretome p-hAFS cyfatebol. Mynegwyd FGF-19, MIF, a PTX3 yn yr un modd mewn has-CM ffetws-ac amenedigol ac yn yr HAFS-EVs cyfatebol. Roedd PAI-1 wedi'i gyfoethogi'n fawr mewn ffracsiynau secretome hypocsig.
Ffigur 7. Proffilio cytocin a chemocin o fewn fformwleiddiadau secretome AFS y ffetws ac amenedigol. (A) Mae mynegiant cytocinau a chemocinau a ganfuwyd o fewn yr hypocsig ffetws-yn erbyn amenedigol have-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) yn cael eu hadrodd mewn dwysedd picsel fesul uned mympwyol [AU]. Mynegir gwerthoedd fel ±sem cymedrig arbrofion annibynnol a chânt eu hadrodd yn Nhabl S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Cytocin a chynnwys chemocine a ddarganfuwyd yn y ffetws hypocsig- yn erbyn HAFS-EVs amenedigol (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) ac wedi'i fynegi gan ddwysedd picsel mewn unedau mympwyol [AU].colesterol cistancheMynegir gwerthoedd fel ±sem cymedrig n=3 o arbrofion annibynnol a chânt eu hadrodd yn Nhabl S5. CST3: Cystatin C; EMMPRIN: Inducer Metalloproteinase Matrics Allgellog; FCFF-19: Ffactor Twf Fibroblast-19; IGFBP2: Ffactor Twf tebyg i Inswlin (IGF) Protein Rhwymo 2; IL-8: Interleukin -8;IL-17a:Interleukin-17a; MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1;MIF:Ffactor Atal Mudo Macrophage; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Atalydd Activator Plasminogen-1; BDNF: Ffactor Niwrotroffig sy'n Deillio o'r Ymennydd; DPPIV: Dipeptidyl Peptidase IV; GDF-15:Ffactor Gwahaniaethu Twf-15; IGFBP3:Ffactor Twf tebyg i Inswlin(IGF)Protein Rhwymo 3;SDF-1a: Ffactor sy'n Deillio o Strom-1 alffa; VDBP: Protein Rhwymo Fitamin D.
2.7.Mae gan y Ffetws ac Amenedigol-DdY yn cael eu Cyfoethogi â Gwybodaeth RNA yn Eu Cargo
Gan fod RNAs bach nad ydynt yn codio wedi cael eu hystyried yn brif reoleiddwyr dylanwad paracrine EV ar gelloedd targed [4,55], fe wnaethom ganolbwyntio'n bennaf ar ddadansoddiad dilyniannu RNA ar gynnwys microRNA (miRNA) o fewn f-hAFS-EVs a p-hAFS-EVs. Dangosodd proffilio RNA bach gyfoethogi miRNA mewn HAFS-EVs ffetws ac amenedigol (tua 35-36 y cant ) o'i gymharu â chyfanswm y swm RNA bach (Ffigur 8A). Roedd y gydran miRNA yn wir ymhlith y ddwy rywogaeth RNA a gynrychiolir fwyaf yn y ddau fformiwleiddiad EV, ynghyd â rRNA(***p) p < 0.0001).="" y="" mirnas="" canlynol="" oedd="" y="" rhai="" a="" gyfoethogwyd="" fwyaf="" yn="" y="" samplau="" ev="" a="" ddadansoddwyd:="" mir-31-5p;="" mir-196a{-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a{-5p;="" mir{20}}b-3p,gadewch-7a-5p,gadewch-7b-5p,gadewch{-7f{{-7a-5p),="" {27}}p,="" gadewch-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" a="" mir-221-3p).="" mae'n="" werth="" nodi,="" mae="" evs="" ffetws="" ac="" amenedigol="" wedi="" rhannu'r="" mwyafrif="" o="" mirnas="" o'r="" fath="" (sef="" gosod-7a-5p,let-7b-5p,let-7="" }}f-5p,="" gadael-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54)="" }}p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" a="" mir-221-3p,="" ffigur="" 7b).="" ar="" y="" llaw="" arall,="" canfuwyd="" tua="" 100="" mirnas="" yn="" y="" 30="" y="" cant="" sy'n="" weddill="" o'r="" cynnwys="" mirna="" pothellog="" (ffigur="">
Er mwyn nodweddu'r cynnwys miRNA ymhellach o fewn HAFS-EVs, gwnaethom ymchwilio i weld a allai cyfnod beichiogrwydd HAFS neu rag-gyflyru celloedd hypocsig in vitro ddylanwadu ar gyfoethogi miRNAs penodol. Canfuwyd y modiwleiddio cryfaf rhwng cyfnodau beichiogrwydd, lle cyfoethogwyd bron pob miRNA wedi'i fodiwleiddio mewn f-hAFS-EVs dros y cymar amenedigol (Ffigur 9A a Thabl 1). Roedd rhag-gyflyru hypocsig yn cael effaith fwynach ar gargo miRNA, ond yn y gymhariaeth hon roedd modiwleiddio i'r naill gyfeiriad neu'r llall, gyda rhai miRNA wedi'u cyfoethogi yn hypocsig-ac eraill mewn amodau rheoli normocsig (Ffigur 9A).
Fel dadansoddiad cyflenwol, fe wnaethom ganolbwyntio ar nodi miRNAs yr ymchwiliwyd iddynt gyda'r amrywioldeb isaf ar draws y gwahanol roddwyr a rhag-amod diwylliant, ar gyfer EVs sy'n deillio o'r ddau gyfnod beichiogrwydd yr ymchwiliwyd iddynt. Roedd miRNAs sy'n deillio o'r dadansoddiad hwn yn ymestyn o lefelau mynegiant uchel i isel (Ffigur 9B). O fewn y craidd miRNA mwyaf sefydlog o gargo HAFS-EVs, nodwyd rhai miRNA a rennir rhwng f-hAFS-EVs a p-hAFS-EVs (miR-21-5p, miR-29a-3) p, miR{9}}p ar lefel uchel; miR-221-3p,miR-221-5p a miR-22-3p ar lefel fach, Tabl 2).
Ffigur 9. Dadansoddiad o gyfoethogiad gwahaniaethol o miRNAs yn y ffetws- ac amenedigol HAFS-EVs. (A) Lleiniau llosgfynydd ar gyfer cyfoethogi gwahaniaethol o gargo miRNA HAFS-EV yn ôl y cam beichiogrwydd (panel chwith) a rhag-amod hypocsig in vitro o secretu celloedd (panel dde). Am fanylion miRNA, cyfeiriwch at Tabl 1. (B) Plot gwasgariad o'r gydberthynas rhwng amrywioldeb (echel X) a lefel cyfoethogi (echel Y) miRNAs sefydlog o fewn HAFS-EVs ffetws (panel chwith) a HAFS-EVs amenedigol (panel dde) yn ôl uchel (dotiau melyn), cyfoethogiad pylu (smotiau gwyrdd) ac isel (smotiau porffor tywyll). Am fanylion miRNA, cyfeiriwch at Dabl 2.RPM: darllen fesul miliwn.
3. Trafodaeth
Mae samplau o hylif amniotig dynol sydd wedi'u taflu dros ben wedi'u nodi fel ffynhonnell werthfawr o gelloedd stromal gyda photensial addawol mewn meddygaeth atgynhyrchiol a pheirianneg meinwe. Ychydig iawn o bryderon moesegol sy'n gysylltiedig â'u hynysu, oherwydd gellir eu cael naill ai o samplau dros ben o amniosentesis sgrinio cyn-geni arferol, yn ystod yr ail dymor o'r beichiogrwydd (HAFS y ffetws), neu o hylif amniotig sy'n cael ei daflu fel gwastraff clinigol yn adran C wedi'i amserlennu yn ystod trimester III. gweithdrefnau (HAFS amenedigol). Yn y blynyddoedd diwethaf, mae HAFS wedi cael eu cynnig fel therapiwteg posibl ar gyfer atgyweirio ac adfywio meinwe dynol o ystyried y dystiolaeth galonogol a gafwyd o fodelau clefyd arbrofol. Yn ddiddorol, maent hefyd wedi cael eu cynnig mewn therapi utero o glefydau niwrolegol ffetws-newydd-anedig; yn wir, roedd astudiaethau cyn-glinigol yn awgrymu bod HAFS a weinyddwyd cyn-geni trwy esgoriad mewn-amniotig yn diogelu llinyn y cefn yn ystod beichiogrwydd trwy weithgaredd paracrine mewn model llygod mawr o myelomeningocele [56-58], a lleihau'r difrod i'r coluddyn agored mewn gastroschisis cnofilod arbrofol[59 ]. O safbwynt trosiadol, gallai trawsblaniad yn y groth o HAFS gael ei ddisodli gan weinyddu'r paratoad mwyaf addas o'u secretom (hAFS-CM o HAFS-EVs).sgîl-effeithiau cistanche deserticolaByddai'r strategaeth hon yn caniatáu ymyrraeth brydlon ac amserol yn ystod beichiogrwydd trwy oresgyn cyfyngiadau therapi celloedd canonaidd (hy, ehangu celloedd in vitro sy'n cymryd llawer o amser) tra'n darparu fformwleiddiadau fferyllol parod i'w defnyddio oddi ar y silff.
Gall datblygiad diweddar technegau diagnostig cyn-geni llai ymwthiol arwain at ostyngiad mewn gweithdrefnau amniosentesis yn y dyfodol agos, gan hyrwyddo HAFS amenedigol fel yr opsiwn mwy hygyrch. Serch hynny, gan fod HAFS y ffetws yn fwy anaeddfed o ran datblygiad, gallant fod â photensial paracrine mwy effeithiol. O fewn y senario hwn, yma buom yn cymharu HAFS ffetws ac amenedigol c-KITt a chanolbwyntiwyd ar broffilio eu ffracsiynau secretome. Amlygwyd gwahaniaethau perthnasol gennym i'w hystyried ar gyfer y cyfieithiad clinigol posibl o'u gallu paracrine.
Mewn cytundeb ag astudiaethau annibynnol blaenorol, rydym yn dangos nad oedd y cyfnod beichiogrwydd yn dylanwadu ar forffoleg heterogenaidd HAFS a'u proffil antigen mesenchymal [25,26]. Yna fe wnaethom werthuso paramedrau a oedd yn fwy tebygol o effeithio ar weithgaredd secretory cell a paracrine y tu hwnt i imiwnoffoteip stromal canonaidd. Yn nodedig, dangoswyd yn ddiweddar bod presenoldeb is-boblogaeth CD146-positif, CD107a-uchel o fewn epilyddion mesenchymal mêr esgyrn yn cydberthyn â gweithgaredd paracrine modiwlaidd a therapiwtig rhyfeddol [47]. Yma fe ddatgelwyd bod HAFS ffetws ac amenedigol yn cael eu nodweddu'n gryf gan y llofnod moleciwlaidd hwn sy'n cefnogi eu gallu fel ysgrifennydd gyda goblygiadau trosiadol perthnasol. Ar ben hynny, nodweddwyd HAFS ffetws gan fetaboledd aerobig aneffeithlon, tra bod rhai amenedigol mwy aeddfed yn dangos cyfradd defnyddio ocsigen uwch a synthesis ATP. Gall hyn awgrymu proffil metabolaidd mwy anaeddfed o HAFS trimester II sy'n debyg i gelloedd stromal llinyn bogail babanod newydd-anedig cynamserol, sydd wedi dangos yr un duedd [60].
Er mwyn sbarduno potensial paracrine, roedd HAFS yn agored i preimio hypocsig di-serwm 24 h, strategaeth yr ydym wedi'i datblygu'n llwyddiannus yn flaenorol [34,35,37] ar gyfer celloedd ffetws ac y buom yn ymchwilio iddi yma ar eu cymar amenedigol am y tro cyntaf. Arweiniodd rhag-gyflyru HAFS ffetws ac amenedigol o dan hypocsia at duedd gadarnhaol yn y cynnydd yn eu crynodiad secretome ac yn y nifer o EVs a ryddhawyd, ond ni chafodd y cam beichiogrwydd unrhyw effaith ar gynnyrch secretome cell nac ar forffoleg EV a dosbarthiad maint.
Yn nodedig, datgelodd nodweddu cargo paracrine HAFS rai gwahaniaethau penodol, yn ôl y gwahanol amodau a werthuswyd gennym. Datgelodd proffilio proteomig secretome HAFS y ffetws ddosraniadau ffactor canfyddadwy yn seiliedig ar rag-gyflyru hypocsig cyfnod beichiogrwydd a chelloedd. Mae hyn yn dangos y gall y potensial paracrine HAFS gael hunaniaeth benodol yn ystod aeddfedu o Ⅱ i Ⅲ trimester beichiogrwydd y gellir yn ei dro fodiwleiddio trwy ysgogi'r celloedd secretu in vitro. Awgrymodd dadansoddiad cyfoethogi prosesau biolegol o HAFS-CM a HAFS-EVs y gallai'r rhan fwyaf o'r proteinau wedi'u modiwleiddio gyd-fynd â thwf/cynnal a chadw celloedd a metaboledd protein, gan gefnogi'r effeithiau paracrine buddiol i'r gell a adroddwyd yn bell. Yn benodol, canfuwyd bod secretome cyfanswm hypocsig HAFS y ffetws wedi'i gyfoethogi â'r protein sioc gwres HSPD1 (HSP60), y dangoswyd ei fod yn cefnogi iachâd clwyfau mewn model anaf croen llygoden diabetig ac i hyrwyddo gogwyddo i mewn i ffenoteip M2 sy'n pro-datrys macrophage [61] . Yn yr un modd, cyfoethogwyd HAFS-EVs ffetws hypocsig ar gyfer ffactorau sy'n hyrwyddo niwrogenesis (HSPG2 [62], hunan-adnewyddu celloedd, a datblygiad ymennydd a chardiofasgwlaidd (LAMA5[63] a LAMB1[64] a mudo (THBS1 [2]).) Y proteoglycan Canfuwyd AGRN hefyd mewn EVs yn dilyn preimio hypocsig o HAFS y ffetws.dos cistanche redditMae ein canfyddiadau yn unol â thystiolaeth flaenorol o AGRN yn cael ei uwchreoleiddio yn y proteome o gelloedd stromal mesenchymal o dan ysgogiadau addysgiadol llidiol a hypocsig[65]. Dangoswyd bod AGRN hefyd yn gysylltiedig â signalau synaps imiwnedd [66] ac i gyd-fynd ag adfywiad calon llygoden newyddenedigol [67], gan gefnogi rhagdueddiad amlwg o HAFS ffetws ifanc sy'n ddatblygiadol tuag at effeithiau paracrine adfywiol. Ar ben hynny, cadarnhawyd bod HAFS y ffetws yn fwy ymatebol i rag-gyflyru hypocsig fel y dangosir gan gyfoethogi rhagfynegyddion effeithiolrwydd adfywio fasgwlaidd, megis cytocin ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8, a MCP-1[68], yn eu cyfrwng cyflyru. Mae hyn yn cefnogi tystiolaeth flaenorol o allu paracrine HAFS-CM ffetws i hybu neo-arteriogenesis mewndarddol mewn modelau cnofilod cyn-glinigol o gnawdnychiant myocardaidd, isgemia braich ôl, a fflap fasciocutaneous isgemig [34,69-71] Ymhellach, yr AFS ffetws canfuwyd bod cyfanswm y secretome wedi'i gyfoethogi'n sylweddol fwy ag IGFBP2 ac OPN o'i gymharu â'r un amenedigol, gan awgrymu felly broffil modiwlaidd mwy amlwg o blaid datrys a gwrth-heneiddio[72-75]. Roedd y have-CM amenedigol, er ei fod wedi'i wella'n llai mewn ffactorau paracrine, yn cael ei ategu yn yr un modd â ffactorau niwrotroffig ac imiwnofodiwleiddio, megis CST3[76,77] a MIF[78].
O'i gymharu â chyfanswm HAFS-CM, dangosodd y cymheiriaid hypocsig ffetws- ac amenedigol-EV fynegiant is o cytocinau a chemocinau, ac eithrio'r cyfryngwr ailfodelu fasgwlaidd EMMPRIN [79], a oedd wedi'i gyfoethogi'n bennaf yn y rhan fesigl. Mae'r proffil cardio-actif a rhag-adfywio a adroddwyd yn flaenorol o HAFS-EVs y ffetws[34,37] wedi'i gadarnhau yma gan dystiolaeth o'u mynegiant unigryw o IL cardioprotective [80] a GDF-15, ffactor paracrine allweddol sy'n sbarduno niwrogenesis hippocampal oedolion mewndarddol [81,82], yn ogystal â gwrthweithio cardiowenwyndra a achosir gan anthracycline [78]. Roedd HAFS-EVs ffetws ac amenedigol yn dangos mynegiant tebyg ar gyfer y rheolydd masnachu mewn pobl ehedydd/bonyn SDF-1 [83-85]. Nododd y dadansoddiad proteomig fynegiant cynyddol o broteinau sy'n gysylltiedig ag angiogenesis, fel NRP1 [86] ac MP14[87] mewn HAFS-EVs amenedigol hypocsig; gall proffil ysgogol o'r fath esbonio canlyniadau blaenorol ar briodweddau adfywiol endothelaidd Ⅲ trimester HAFS mewn model llygoden preclinical o anaf isgemia cyhyrau ysgerbydol [25], er gwaethaf y dystiolaeth bod eu HAFS-CM yn llai pro-angiogenig na'r un ffetws cyfatebol. Yn nodedig, canfuwyd y ffactor twf niwral BDNF mewn cargo EV ffetws ac amenedigol, er mewn symiau isel, gan awgrymu gweithgaredd niwrotroffig tybiedig ar gyfer HAFS-EVs mewn prosesau goroesi niwronau a niwroddatblygiadol, fel y gwelwyd hefyd ar gyfer fesiglau allgellog sy'n cael eu rhyddhau gan asgwrn dynol. gwaed mêr a llinyn bogail-MSC[8889]. Dangoswyd bod y ddau fformiwleiddiad secretome o HAFS ffetws ac amenedigol sy'n cael ysgogiad hypocsig wedi'u cyfoethogi â PAI-1, hwylusydd actifadu endothelaidd [90] sydd hefyd wedi bod yn ymwneud â phegynnu macroffagau M2 yn y galon ac wedi'i chynysgaeddu â cardioprotective a photensial gwrth-ffibrotic [91].
Ymdriniwyd yn fras â microRNAs (miRNAs) fel rheolyddion hanfodol gweithgaredd paracrine celloedd-gelloedd stromatig bôn-gelloedd a mesenchymal stromal-EV [92,93]. Yma gwelsom fod y 15 rhywogaeth miRNA sydd wedi'u cyfoethogi fwyaf yn yr HAFS-EVs yn gorchuddio mwy na 60 y cant o gyfanswm y cynnwys miRNA ym mhob sampl. Adroddwyd bod y miRNAs hyn yn nodweddu cargo moleciwlaidd cell-EVs mesenchymal stromal (gadewch-7a-5p [4,95]), amddiffyn rhag isgemia myocardaidd trwy ddylanwadu ar adfywiad fasgwlaidd ac atal ffibrosis (let -7b-5p, gadael-7f-5p, miR-21-5p a miR-155-5p [96,97]), hyrwyddo iachau clwyfau trwy reoleiddio swyddogaeth keratinocyte (miR{{-16-5p [98])) a gwrthweithio marwolaeth niwronaidd ar ôl isgemia blaen yr ymennydd (miR-29a{-3p [99,100]). Ar y llaw arall, canfuwyd tua 1000 miRNAs yn y 30 y cant sy'n weddill o gynnwys miRNA pothellog. Mae dosbarthiad anghytbwys o'r fath yn gyson ag astudiaethau blaenorol [4] ac mae'n amlygu'r miRNAs sydd wedi'u cyfoethogi'n bennaf fel y rhai atebol tybiedig ar gyfer prif weithgaredd biolegol HAFS-EVs. Yn ddiddorol, roedd AFS-EVs ffetws ac amenedigol yn rhannu'r mwyafrif o 15 miRNA. O bwys, gwelsom hefyd fod AFS-EVs ffetws a rhai amenedigol yn cynnwys set o miRNAs sefydlog iawn ar draws gwahanol lefelau cyfoethogi. Gall tystiolaeth o'r fath awgrymu bod ystod eang o ymgeiswyr “cadw tŷ” i'w defnyddio fel rheolydd cyfeirio mewnol mewn arbrofion qPCR ar HAFS-EVs. Ar ben hynny, mae is-set gyson o miRNAs sefydlog o'r fath (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{-29a-3p,miR{{ {40}}y miR-221-5p) yn cael ei rannu rhwng y ddau gyfnod beichiogrwydd ac mae'n gorgyffwrdd â'r 15 sydd wedi'u cyfoethogi'n bennaf, gan awgrymu ymddygiad hyd yn oed yn fwy cyson a llofnod moleciwlaidd dibynadwy sy'n datrys ymlaen llaw([96,{{45 }}]). Mae'n werth nodi, mae cwpl o ymgeiswyr o fewn craidd mor nodedig wedi'u hadrodd yn ddiweddar fel miRNAs cyfeirio o fewn EVs niwro-amddiffynnol a gafwyd o gelloedd stromal mesenchymal sy'n deillio o hylif amniotig yn y tymor hir (miR{{-29a-3p a miR{{). 49}}p[95]). Serch hynny, gwnaethom sylwi hefyd y gallai oedran beichiogrwydd fodiwleiddio'r cargo miRNA yn fwy na rhag-amod hypocsig. Yn ddatblygiadol, cyfoethogwyd mwy o EVs ifanc a gafwyd o AFS ffetws III trimester gyda miRNAs a ddangoswyd yn flaenorol i gefnogi hyfywedd bôn-gelloedd embryonig (miR-302-3p [101]), amlhau celloedd, a gwahaniaethu osteogenig o gelloedd stromal mêr esgyrn (miR). -217 [102]), tra hefyd yn cynnal potensial atal tiwmor (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).
Yn seiliedig ar ein canlyniadau, yma rydym yn cadarnhau y gall HAFS ffetws ac amenedigol gynrychioli ffynonellau paracrine deniadol i'w hecsbloetio ar gyfer meddygaeth atgynhyrchiol. Er bod eu gweithgaredd ffeno-deip a chyfrinachedd yn debyg, rydym wedi tynnu sylw at rai agweddau hynod yn eu fformiwleiddiadau secretome fel mewnwelediadau defnyddiol ar gyfer eu cyfieithiad therapiwtig yn y dyfodol.
4. Defnyddiau a Dulliau
4.1.Ynysu Bôn-gelloedd Hylif Amniotig Dynol a Diwylliant In Vitro
Cafodd bôn-gelloedd hylif amniotig dynol (hAFS) eu hynysu o samplau dros ben o hylif amniotig (AF) a gasglwyd trwy sgrinio cyn-geni arferol trwy Ⅱ amniocentesis trimester (HAFS ffetws, f-hAFS), neu fel gwastraff clinigol yn ystod cyflwyno toriad cesaraidd a drefnwyd yn ystod Ⅲ trimester. (HAFS amenedigol, p-hAFS) yn yr Uned Diagnosis Cynenedigol a Meddygaeth Amenedigol, Ysbyty San Martino IRCCS, yn yr Uned Feddygol a Llawfeddygaeth Ffetws ac amenedigol a Labordy Geneteg Dynol yn ysbyty IRCCS Istituto Gaslini (Genova, yr Eidal). Cafwyd caniatâd ysgrifenedig gwybodus gan bob rhoddwr yn unol ag awdurdodiad pwyllgor moesegol lleol (protocol PR428REG2015)ac yn unol â chanllawiau Datganiad Helsinki. Cafwyd samplau AF y ffetws yn ystod y tymor II gan roddwyr benywaidd gydag oedran cyfartalog o tua 37.42 ± 0.32 mlwydd oed (n{10}} yn amrywio o 36-hyd at 41 oed);Ⅲ cafwyd samplau AF amenedigol y trimester gan rhoddwyr benywaidd gydag oedran cyfartalog o 34.25±1.31 mlwydd oed (n{17}} yn amrywio o 26- hyd at 42 oed). Cafwyd HAFS ffetws ac amenedigol o samplau a ddilyswyd ar gyfer caryoteip arferol ac a ynysu gan ddidoli imiwnomagnetig ar gyfer mynegiant c-KIT (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, yr Eidal) o gelloedd stromal mesenchymal AF ymlynol[16].buddion echdynnu cistanchec-KIT* Cafodd HAFS eu meithrin mewn Isafswm Hanfodol Canolig (MEM) - alffa gyda 15 y cant FBS (Serwm Buchol Ffetws, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal), 18 y cant Chang B, a 2 y cant Chang C Medium (Irvine Scientific , Santa Ana, CA, UDA) gydag 1 y cant L-glutamin ac 1 y cant penisilin / streptomycin (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal), mewn deorydd ar 37 gradd gyda 5 y cant CO2 a 20 y cant awyrgylch Oz a diwylliedig i fyny i 5 darn in vitro cyn cael eu defnyddio i ynysu eu secretom.
4.2.Gwerthusiad Biocemegol o Metabolaeth AFS
Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) defnyddiwyd celloedd ar gyfer pob arbrawf. I werthuso resbiradaeth gwaelodol, athreiddiwyd HAFS gyda 0.03 mg/mL digitonin am 10 munud a'i atal mewn halwynog byffer ffosffad (PBS). Ychwanegwyd pyruvate 10 mM ynghyd â 5 mM malate neu 20 mM succinate i ysgogi'r llwybr -ffyrdd a gyfansoddwyd gan Cymhlethau I, II, a IV neu Cymhlethau Ⅱ a IV, yn y drefn honno [60].
I werthuso'r cyfraniadau cymharol i resbiradaeth glutamine, ocsidiad asid brasterog cadwyn hir, a glwcos, ar ôl y athreiddedd digitonin, ataliwyd celloedd mewn cyfrwng twf a 4 uM o BPTES, 4 uM Etomoxir, a 4 uM UK5{{22} Ychwanegwyd }99 i atal glutaminase, carnitin palmitoyl-transferase 1A (CPT1A), neu'r cludwr pyruvate mitocondriaidd (MPC), yn y drefn honno. Canfuwyd gweithgaredd Fi-F.ATP synthase (ATP synthase) trwy fesur cynhyrchiad ATP trwy'r dull luciferin / luciferase hynod sensitif. Cynhaliwyd y profion ar 37 gradd, am 2 funud, a chasglwyd y data bob 30 s. Mewn set gyntaf o arbrofion, cafodd celloedd 10 gradd eu deor am 10 munud mewn cyfrwng yn cynnwys 50mM KCl, 1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6mMouabain,1mM P1P5-Di (adenosine-5')penta-ffosffad, 0.040 mg/mL ampicillin, a 10mM Tris-HCl pH7.4. Wedi hynny, ysgogwyd synthesis ATP trwy ychwanegu'r swbstradau anadlol (pyruvate 10mM ynghyd â 5 mM malate neu 20 mM succinate) a 0.1 mM ADP. Mesurwyd yr adwaith gan ddefnyddio pecyn asesu bioymoleuedd luciferin/luciferase ATP CLSII (Roche, Basel, y Swistir) mewn luminometer (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milan, yr Eidal) datrysiadau safonol ATP (Roche, Basel, y Swistir) yn amrywio {{ Defnyddiwyd 42}}/M ar gyfer graddnodi. Yn yr ail set o arbrofion, gwerthuswyd synthesis ATP ym mhresenoldeb 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir, neu 4 uM UK5099.Yn yr achos hwn, deorwyd 10 o gelloedd am 10 munud mewn cyfrwng twf yn absenoldeb neu bresenoldeb a atalydd metaboledd, a chafodd synthesis ATP ei ysgogi gyda 0.1 mM ADP. Cyfrifwyd effeithlonrwydd OxPhos (ffosfforyleiddiad ocsideiddiol) (cymhareb P/O) fel y gymhareb rhwng crynodiad yr ATP a gynhyrchir a faint o ocsigen a ddefnyddir ym mhresenoldeb swbstrad anadlol ac ADP. Pan fydd y defnydd o ocsigen wedi'i neilltuo'n llwyr i gynhyrchu ynni, dylai'r gymhareb P / O fod oddeutu 2.5 a 1.5 ar ôl pyruvate ynghyd â malate neu succinate ychwanegiad, yn y drefn honno [48] I werthuso cyfraniad glycolysis anaerobig i fetaboledd HAFS, gwerthuswyd crynodiadau glwcos a lactad. yn y cyfrwng twf. Gwerthuswyd y defnydd o glwcos gan y system gyplu hexokinase (HK) a glwcos-6-ffosffad dehydrogenase(G6PD), yn dilyn gostyngiad NADP ar 340 nm. Roedd y cyfrwng assay yn cynnwys 100mM Tris-HCl, pH7.4,2mM ATP, 10mMNADP, 2mMMgC12,2IU o hexokinase, a 2 IU o glwcos-6-ffosffad dehydrogenase. Assayed rhyddhau lactate yn dilyn gostyngiad NAD plus ar 340 nm. Roedd y cyfrwng assay yn cynnwys 100 mM Tris-HCl (pH8), 5 mM NAD plus, ac 1 IU/mL o lactad dehydrogenase. Dadansoddwyd samplau cyn ac ar ôl ychwanegu 4 ug o lactad dehydrogenase wedi'i buro. Yn y ddau achos, cafodd data ei normaleiddio i rif y gell a'i fynegi fel celloedd mM glwcos / 10 gradd neu lactad mM a ryddhawyd / celloedd 10 gradd, yn y drefn honno[107].
4.3.Flow Sytometreg Nodweddu HAFS
Cafodd can mil (105) o gelloedd ffetws a p-hAFS eu datgysylltu a'u deor â llygoden gwrth-ddynol-CD107a-Alexa Fluor 647-a CD gwrth-ddynol146-FITC- gwrthgyrff cyfun (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal). Aseswyd apoptosis celloedd gan ddefnyddio Pecyn Canfod Apoptosis Atodiad V FITC (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, yr Eidal) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafwyd digwyddiadau ar ddidolydd a dadansoddwr BD Bioscience FACS Aria II, gyda meddalwedd FACS Diva (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milan, yr Eidal). Dadansoddwyd data gan ddefnyddio meddalwedd FlowJo V9.0 (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milan , yr Eidal). 4.4.staenio Senescence
Gwerthuswyd ffenoteip heneiddedd HAFS a feithrinwyd hyd at daith 5 mewn amodau in vitro safonol gyda Phecyn Lliwio Senescence -Galactosidase (Technoleg Signalau Cell, Danvers, MA, UDA): gosodwyd p-haFS llaw-law gyda datrysiad Sefydlog 1x ar 70 y cant cydlif a'i staenio ar gyfer SA- -gal ar 37 gradd dros nos, yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafwyd digwyddiadau Senescent ar ficrosgop Leica DMil (wedi'i gyfarparu â meddalwedd Leica Acquire V3.4.4, Leica Microsystems, Milan, yr Eidal) a'u gwerthuso fel canran o gelloedd SA- -gal-positive dros gyfanswm y celloedd fesul maes.
4.5. Gwahanu a Chanolbwyntio Ffracsiynau Secretome HAFS
Diwylliwyd f-hAFS a p-hAFS am 24 h mewn cyfrwng di-serwm (SF) mewn 1 y cant o hypocsia O2 yn erbyn 20 y cant O2 normocsia (rheolaeth), a defnyddiwyd yr olaf ohonynt fel y cyfeirnod llinell sylfaen. Defnyddiwyd y strategaeth rhag-gyflyru hon i wella rhyddhau ffactorau paracrine bio-actif, fel yr adroddasom yn flaenorol [34,35,37,49]. Cafodd HAFS eu meithrin am 24h mewn cyfrwng di-serwm (SF) (glwcos uchel Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, gydag 1 y cant L-glutamin ac 1 y cant penisilin / streptomycin, i gyd o Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal), o dan normocsig (20 y cant O2 a 5 y cant CO2 ar 37 gradd) neu hypocsig (1 y cant O2 a 5 y cant CO2 ar 37 gradd mewn amodau deoryddion CellXpert C170i a Galaxy 48R CO2, o Eppendorf, Milan, yr Eidal).
casglwyd f-hAFS-CM a p-hAFS-CM a'u centrifugio ar 4 gradd ar 300x g am 10 munud a 2000 × g am 20 munud i gael gwared ar falurion celloedd; Crynhowyd HAFS-CM gan ddefnyddio pilenni ultrafiltration gyda thoriad dethol 3kDa (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, yr Almaen) ar 4 gradd ar 3000 × g am 90 munud ac yna canolbwyntio ymhellach ar 4 gradd ar 3000× g am 30 munud. Cafodd HAFS-EVs eu gwahanu a'u crynhoi gan ultracentrifugation cyfresol o HAFS-CM. Yn gryno, casglwyd a chanrifwyd HAFS-CM ar 4 gradd ar 300 × g am 10 munud, a 2000x g am 20 munud i gael gwared ar falurion celloedd. Yna cafodd y supernatant ei brosesu ar 10,000 × g am 40 munud. Taflwyd y belen i ffwrdd a phroseswyd y supernatant ymhellach trwy allgyrchiant mewn Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milan, yr Eidal) ar 10,000 × g am 120 munud gan ddefnyddio rotorau centrifuge bwced siglo Beckman Coulter SW55Ti. Golchwyd y belen sy'n cynnwys HAFS-EVs heterogenaidd yn PBS gyda centrifugio terfynol ar 100,000 × g am 120 munud ac yna'i ail-ddarparu mewn PBS wedi'i hidlo â philen hidlo mandwll 0,22 um. Mesurwyd crynodiadau protein mewn HAFS-CM ac ar wyneb HAFS-EVs gan ddefnyddio'r assay Asid BiCinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal). Cafwyd samplau ar Ddarllenydd Microplate Gen5 ar 570 nm i werthuso cynnyrch HAFS-CM ac HAFS-EVs o ran ug o gelloedd cynhyrchu hydoddiant / 10 gradd.
4.6. Nodweddu HAFS-EVs trwy Ficrosgopeg Darlledu Electron a Dadansoddiad Olrhain Nanoronynnau
Perfformiwyd dadansoddiad microsgopeg electron trawsyrru (TEM) ar ficrosgop Hitachi TEM (cyfres HT7800, Hitachi High Technologies, Monza, yr Eidal). Tynnwyd delweddau digidol gyda chamera Mega view 3 a meddalwedd Radius (EMSIS, Muenster, yr Almaen). gosodwyd f-hAFS a p-hAFS mewn hydoddiant paraformaldehyd 3.7 y cant (PA) wedi'i wanhau 1:1 gyda chyfrwng cyflawn HAFS, wedi'i olchi mewn 0. Byffer cacodylate 0.1 M yn cynnwys 2.5 y cant o glutaraldehyde (Gwyddoniaeth Microsgopeg Electron, Hatfield, PA, UDA). Roedd pelenni celloedd yn ôl-sefydlog mewn osmium tetroxide ar gyfer lh ac mewn datrysiad asetad wranyl 1 y cant am 1h. Cafodd samplau eu dadhydradu am 24 h ar 42 gradd a 48 h ar 60 gradd trwy gyfres ethanol graddedig a'u hymgorffori mewn resin epocsi (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, yr Almaen). Torrwyd adrannau ultrathin (50 nm) â microtome Leica Ultracut (Leica Microsystems, Milan, yr Eidal) a'u gwrth-staenio ag asetad wranyl 5 y cant mewn hydoddiant ethanol 50 y cant. Cafodd f-hAFS-EVs a p-hAFS-EVs eu haildynnu mewn hydoddiant 20 uL PBS a'u gosod trwy ychwanegu cyfaint cyfartal o baraformaldehyde 2 y cant mewn hydoddiant byffer ffosffad 0.1 M (pH7.4). Yna cafodd cerbydau trydan eu harsugno am 10 munud ar gridiau copr wedi'u gorchuddio â formvar-carbon trwy arnofio'r gridiau ar 5 diferyn μL ar baraffilm. Yn dilyn hynny, cafodd gridiau â EVs glynu eu rinsio mewn PBS a'u staenio'n negyddol gan hydoddiant asetad wranyl 2 y cant am 5 munud ar dymheredd ystafell. Roedd gridiau lliw wedi'u hymgorffori mewn methylcellulose 2.5 y cant ar gyfer gwell cadwraeth a'u sychu yn yr aer cyn yr arholiad. Mesurwyd dadansoddiad morffometreg o HAFS-EVs ar 10 micrograff a gymerwyd ar hap ar 40.000× g chwyddo. Cyfrifwyd y maint gan ddefnyddio'r swyddogaeth llinell fympwyol sydd wedi'i hymgorffori ym mlwch deialog mesur meddalwedd Radius (EMSIS, Muenster Germany). I ddelweddu dosbarthiad maint HAFS-EVs, plotiwyd y canlyniadau fel plot dot gwasgariad ac fel dosbarthiad amlder lle mae pob maint yn cael ei gynrychioli fel pwynt ynghyd â llinellau ar gyfer y gwerth canolrif a'r ystod.
dadansoddwyd f-hAFS-EVs a p-hAFS-EVs hefyd gan Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) i asesu gronynnau a ryddhawyd gan gelloedd 10 gradd. Cafodd HAFS-EVs eu gwanhau 1:100 mewn datrysiad PBS a'u caffael ar NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, UK) a gofnododd o leiaf 3 ffrâm wahanol o 60 s yr un. Dadansoddwyd tri chaffaeliad gwahanol o bob sampl gan ddefnyddio'r opsiwn Proses Swp yn y meddalwedd. 4.7.LC-MS/MS Dadansoddiad o HAFS-CM a HAFS-EVs 4.7.1.Treulio Mewn Atebion
Perfformiwyd dadansoddiad proteomig ar 3 atgynhyrchiad biolegol o HAFS-CM a HAFS. EVs o f-hAFS a p-hAFS ar ôl rhag-gyflyru normocsig neu hypocsig (n{4}} amodau gwahanol). Cafodd samplau hAFS-CM ac HAFS-EVs eu hatal yn 0.1M NHCO3 pH 7.9 a'u trin â RapigestIM Adweithydd SF (Waters Co, Aberdaugleddau, MA, UDA) ar y crynodiad terfynol o 0.25 y cant (w/v). Deorwyd yr ataliadau canlyniadol wrth droi ar 100 gradd am 2{{40}} mun. Cyflawnwyd y treuliad ar bob sampl trwy ychwanegu Trypsin Gradd Wedi'i Addasu mewn Dilyniant (Promega Inc, Madison, WI, UDA) ar gymhareb ensymau/swbstrad o 1:50(w/w) dros nos ar 37 gradd mewn 0.1 M NH4HCO3 pH7.9 byffer gyda 10 y cant CHSCN.Ychwanegwyd aliquot ychwanegol o trypsin (1:100 w/w) yn y bore, a pharhaodd y treuliad am 4 awr. At hynny, fe wnaeth ychwanegu 0.5 y cant o asid Trifluoroacetig (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, UDA) atal yr adwaith enzymatig, a chwblhaodd deoriad dilynol ar 37 gradd am 45 munud hydrolysis asid RapiGest[108]. Tynnwyd y cynhyrchion diraddio na ellir eu cymysgu â dŵr trwy allgyrchiad am 13.000 rpm am 10 munud. Yn olaf, cafodd y cymysgeddau treuliad tryptig eu dihalwyno gan ddefnyddio colofnau troelli PierceTM C{-18 (Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal), yn ôl protocol y gwneuthurwr, a chawsant eu hailddarlledu mewn asid fformig 0.1 y cant (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, UDA) mewn dŵr (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, UDA) mewn crynodiad o 0.1 ug/μL.
4.7.2.Cromatograffaeth Hylif
Dadansoddwyd cymysgeddau wedi'u treulio trypsin trwy gyfrwng platfform sy'n cynnwys system cromatograffig nano-hylif, Eksigent nanoLC-Ultra[2] System 2D (Eksigent, rhan o AB SCIEX Dulyn, Dulyn, CA, UDA) wedi'i ffurfweddu yn y modd trap-eliwt, ynghyd â sbectromedr màs cydraniad uchel. Yn gryno, cafodd samplau (0.8 ug eu chwistrellu) eu llwytho gyntaf ar drap peptid (200 um × 500 um ChromXP C18- CL, 3 um,120 A) a'i olchi gyda'r pwmp llwytho yn rhedeg yn y modd isocratig gyda 0.1 y cant o asid fformig mewn dŵr am 10 munud ar lif o 3 μL/min. Yna roedd newid awtomatig falf deg-porthladd yn osgoi'r cymysgedd a oedd wedi'i ddal ar golofn gwedd nano-wrthdroi (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um,120 A) trwy raddiant 150 munud o eluent B (eluent A,0.1 y cant asid ffurfig mewn dŵr; eluent B, 0.1 y cant asid ffurfig mewn acetonitrile) ar gyfradd llif o 300 nL/munud. Yn fanwl, y graddiant oedd: o 5-10 y cant Bin 3 munud,10-40 y cant Bin 130 munud,40-95 y cant Bin 10 munud ac yn dal ar 95 y cant B am 7 munud. 4.7.3.Sbectrometreg Màs
Perfformiwyd dadansoddiadau MS/MS ar sbectromedr màs LTQ-OrbitrapXL (Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal) gyda ffynhonnell ïon nanospray. Gosodwyd y foltedd capilari chwistrellu ar 1.7 kV a chafodd tymheredd y capilari trosglwyddo ïon ei gadw ar 220 gradd . Cofnodwyd sbectra MS llawn dros ystod 400-1600 m/z mewn modd ïon positif, gyda phŵer datrys o 60000 (lled llawn ar hanner mwyafswm) a chyfradd sgan o 2 sbectra/s. Dilynwyd y cam hwn gan bum digwyddiad MS/MS cydraniad isel a gynhyrchwyd yn ddilyniannol mewn modd sy'n dibynnu ar ddata ar y pum ïon uchaf a ddewiswyd o'r sbectrwm MS llawn (ar ynni gwrthdrawiad o 35 y cant), gan ddefnyddio'r eithriad deinamig o 0.5 munud ar gyfer Dadansoddiad MS/MS. Rheolwyd swyddogaethau sgan sbectromedr màs a graddiannau toddyddion cromatograffaeth hylif perfformiad uchel gan system ddata Xcalibur fersiwn 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal).
4.7.4.Proteomaidd Data Prosesu a Mwyngloddio Data
Chwiliwyd yr holl ddata a gynhyrchwyd gan ddefnyddio peiriant chwilio Sequest HT sydd yn y meddalwedd Thermo Scientific Proteome Discoverer, fersiwn 2.1. Cydberthynwyd y sbectra MS/MS arbrofol â dilyniannau peptid tryptig o'u cymharu â'r sbectra màs damcaniaethol a gafwyd trwy dreulio mewn silico o gronfa ddata proteome Uniprot Homo Sapiens (746{7}}0 cofnod), a lawrlwythwyd ym mis Ionawr 2 020 (www.uniprot.org, cyrchwyd ar 10 Mawrth 2021). Defnyddiwyd y meini prawf canlynol ar gyfer adnabod dilyniannau peptid a phroteinau cysylltiedig: trypsin fel ensym, tri holltiad a fethwyd fesul peptid, goddefiannau màs o ±50 ppm ar gyfer ïonau rhagflaenol, a ±0.8 Da ar gyfer ïonau darn. Defnyddiwyd nod percolator gyda strategaeth decoy targed i roi cyfradd darganfod ffug terfynol (FDR) ar lefel Cyfateb Sbectrwm Peptid (PSM) o 0.01 (llym) yn seiliedig ar werthoedd q, gan ystyried uchafswm deltaCN o 0.05 [109]. Dim ond peptidau ag isafswm hyd peptid o chwe asid amino a rheng 1 a ystyriwyd. Defnyddiwyd egwyddorion grwpio protein ac egwyddorion parsimony llym. Mae'r data MS wedi'u hadneuo i'r ProteomeXchange Consortium trwy ystorfa partner PRIDE [10] (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, a dderbyniwyd ar 10 Mawrth 2021) Cafodd y 48 o broteinau a gafwyd o'r algorithm SEQUEST eu halinio, eu normaleiddio , a heb label o'i gymharu. Defnyddiwyd algorithm mewnol, sef y Map Protein Algorithm Amlddimensiwn (MAProMa) ar gyfer y nod hwn, gan ddefnyddio'r cyfatebion sbectrwm peptid cyfartalog (aPSM) [111,112] sy'n cyfateb i gyfartaledd yr holl sbectra a nodwyd ar gyfer protein ac, o ganlyniad. , i'w helaethrwydd cymharol, ym mhob cyflwr a ddadansoddwyd. Yn fanwl, er mwyn dewis proteinau a fynegwyd yn wahaniaethol, cymharwyd is-grwpiau (ar gyfer ffetws yn erbyn amenedigol-hAFS-CM a HAFS-EVs, gan ystyried hefyd ysgogiad rhag-gyflyru celloedd hypocsig), mewn pâr trwy gymhwyso trothwy o 0.4 a 5 ar y ddau MAProMa mynegeion DAve (Cyfartaledd Gwahaniaethol) a DCI (Mynegai Hyder Gwahaniaethol), yn y drefn honno. Diffiniwyd DAve, sy'n gwerthuso newidiadau mewn mynegiant protein, fel (XY) / (X＋Y)/0.5, tra bod DCI sy'n gwerthuso hyder mynegiant gwahaniaethol, wedi'i ddiffinio fel (X ynghyd â Y) × (XY) / 2 Yr X ac Y mae termau'n cynrychioli PSM protein penodol mewn dau sampl o gymharu. Yn ogystal, roedd y rhestrau protein cyfartalog, a gafwyd o bob cyflwr a archwiliwyd, yn destun dadansoddiad gwahaniaethol llinol (LDA), a phroteinau gyda'r gymhareb F fwyaf (Yn fwy na neu'n hafal i 4.5) a'r gwerth-p lleiaf (Llai na neu'n hafal i 0.001) yn cael eu cadw a'u prosesu trwy glystyru hierarchaidd, gan gymhwyso dull Ward a metrig pellter Ewclidaidd gan ddefnyddio meddalwedd JMP 15.2. Yn benodol, roedd y gymhareb F yn cynrychioli'r sgwâr cymedrig model wedi'i rannu â'r sgwâr cymedrig cyfeiliornus, tra bod y gwerth-p yn dangos y tebygolrwydd o gael gwerth F yn fwy na'r hyn a gyfrifwyd os, mewn gwirionedd, nad oedd gwahaniaeth rhwng cymedrau'r grŵp poblogaeth. 4.8. Proffilio Cytokine a Chemokine o HAFS-CM ac wedi-EVs
Proffilio cytocin a chemocin o HAFS-CM a chael-EVs a gafwyd gan f-hAFS a p-hAFS ar ôl rhag-gyflyru hypocsig trwy gyfrwng pecyn Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array (System Ymchwil a Datblygu, Minneapolis, MN, UDA) yn ôl y cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Defnyddiwyd ugain ug o samplau HAFS-CM ac HAFS-EVs. Cafodd delweddau pilenni eu caffael gan Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, UK)Cafodd cynnwys cytocin/chemokine penodol ei werthuso trwy feintioli dwyster picsel positif (drwy gyfrwng yr uned fympwyol) ar gyfer pob cytocin canfyddadwy gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ (ar gael yn https: //imagej.nih.gov/ij/, cyrchwyd ar 10 Mawrth 2021 [13]). 4.9.RNA Echdynnu o HAFS-EVs a Next
Dilyniannu Cynhyrchu
Cafodd RNA ei ynysu oddi wrth f-hAFS-EVs a p-have-EVs gyda miReasy Micro Kit (Qiagen, Milan, yr Eidal) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Gwerthuswyd cywirdeb RNA a dosbarthiad maint gan ddefnyddio'r Pecyn RNA Agilent Bach gyda'r sglodion RNA noncoding bach er mwyn asesu cynnwys RNAs bach yn amrywio o 6 i 150 niwcleotidau (nt). Defnyddiwyd y Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, yr Eidal) i feintioli cynnwys microRNA (miRNAs), gan ddilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. paratowyd a helaethwyd llyfrgelloedd dilyniannu miRNA gan ddefnyddio pecyn Llyfrgell QIAseq miRNA (Qiagen, Milan, yr Eidal) gan ddefnyddio 18.5ng o miRNAs ynysig fel mewnbwn a dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cyfunwyd llyfrgelloedd ar ôl cynnal gwiriad ansawdd a meintioliad gan TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, UDA) gan ddefnyddio Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Aseswyd llyfrgelloedd cyfun ar gyfer rheoli ansawdd gan qPCR amser real yn dilyn y "Sequencing Library qPCR Quantification" Guide (Illumina Inc, San Diego, CA, UDA) a'u dilyniannu gan lwyfan Illumina NextSeq gan ddefnyddio High Output Hit v2.5(75 cycles) ( Illumina Inc, San Diego, CA, UDA). Perfformiwyd galwad sylfaen gyda llif gwaith rhagosodedig Illumina NextSeq500.
4.10.Dadansoddi Data Biowybodeg o Dilyniannu miRNA
Proseswyd ffeiliau Fastq yn gyntaf trwy docio'r addasydd 3' a seiliau ansawdd isel gan ddefnyddio Cutadapt [114]. Yn dilyn trimio, nodwyd y dilyniannau mewnosod a dilyniannau UMI. Yn darllen heb unrhyw ddilyniant addasydd, yn darllen gyda dilyniannau mewnosod llai na 16 bp, ac yn Darllen gyda llai na 10 bp. Cafodd dilyniannau UMI eu taflu. I anodi'r dilyniannau mewnosod, cafodd darlleniadau eu halinio i gynulliad genom dynol GRCh38 gan ddefnyddio Bowtie [15]Ar gyfer pob sampl, cyfrifwyd pob darlleniad a neilltuwyd i miRNA penodol, a chafodd yr UMIs cysylltiedig eu hagregu i gyfrif moleciwlau unigryw. Perfformiwyd dadansoddiad eilaidd gan sgriptiau R arferol sydd ar gael ar gais rhesymol. Perfformiwyd dadansoddiad cyfoethogi gwahaniaethol gan ddefnyddio pecynnau Limma [116] ac EdgeR Bioconductor [117].
4.11. Dadansoddiadau Ystadegol
Cyflwynir y canlyniadau fel ±sem cymedrig o leiaf dri(n{{{{0}})arbrawf annibynnol. Tynnwyd cymariaethau gan ANOVA unffordd ac yna prawf cymariaethau lluosog posthoc Tukey neu gan brawf-t Myfyriwr. Cynhaliwyd dadansoddiadau gan ddefnyddio Graph-Pad Prism Version 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, cyrchwyd ar 10 Mawrth 2021) gydag arwyddocâd ystadegol wedi'i osod ar * p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">
I gloi, canfuwyd bod HAF ffetws ac amenedigol yn cyfateb yn ffenoteipaidd â nerth cyfriniol tebyg a chyfoethogi EV o ran maint a dosbarthiad; eto gellid gwerthfawrogi rhai gwahaniaethau yn eu proffil cyfrinachol. Yn benodol, gall proffil datblygiad anaeddfed HAFS y ffetws gael ei ailadrodd gan eu fformiwleiddiadau secretome cynysgaeddir â secretome pro-fasgwlogenig, pro-atgenhedlol ac adfywiol mwy amlwg. Fodd bynnag, mae HAFS amenedigol yn dal i gadw proffil paracrine perthnasol trwy fynegi ffactorau sy'n ymwneud â mudo celloedd endothelaidd, potensial imiwn-fodiwlaidd, gwrthlidiol, a niwrotroffig tebyg i HAFS y ffetws. Gall y canfyddiadau hyn ddarparu mewnwelediadau defnyddiol sy'n cefnogi therapi paracrine yn y dyfodol o glefydau sy'n gysylltiedig ag anafiadau a chlefydau llidiol/isgemig. Felly, dylid gwerthuso'r dewis o HAFS ffetws neu amenedigol fel y ffynhonnell celloedd mwyaf delfrydol gan ystyried y senario clinigol penodol.
Mae'r erthygl hon wedi'i thynnu o Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms
