Meintioli Dirywiad Niwrit Gyda Chywirdeb Ac Effeithlonrwydd Gwell Mewn Model In Vitro O Glefyd Parkinson Rhan 1

Haniaethol

Mae dirywiad niwrit yn gysylltiedig â chyfnodau cynnar anhwylderau niwroddirywiol fel clefyd Alzheimer, clefyd Parkinson (PD), a sglerosis ochrol amyotroffig. Mae un dull a ddefnyddir yn gyffredin i ddadansoddi dirywiad niwrit yn cynnwys cyfrifo Mynegai Dirywiad (DI) yn dilyn defnyddio offeryn Dadansoddi Gronynnau ImageJ i ganfod darnau niwrit mewn micrograffau o gelloedd diwylliedig. Fodd bynnag, mae dadansoddiadau DI yn dueddol o sawl math o wallau mesur, gallant gymryd llawer o amser i'w perfformio, ac maent yn gyfyngedig o ran cymhwysiad.

Mae niwroddirywiad yn cyfeirio at newidiadau sy'n digwydd mewn neu o gwmpas niwronau, a all effeithio ar weithrediad gwybyddol dynol, deallusrwydd, emosiwn, ymddygiad, ac ati. Mae llawer o bobl yn meddwl bod cysylltiad agos rhwng niwroddirywiad a dirywiad cof, ond efallai nad yw hyn yn wir.

Yn gyntaf, nid yw niwroddirywiad o reidrwydd yn golygu bod y cof yn dirywio gydag oedran. Gall rhai pobl gadw cof da a hyd yn oed gallu deall cyfiawnder. Mae hyn oherwydd bod cyfuniad o ffactorau fel ymarfer corff, diet a ffordd o fyw yn effeithio ar gof person.

Yn ail, gall yr ymennydd dynol ailsefydlu cysylltiadau niwral newydd a ffurfio atgofion newydd, a elwir yn blastigrwydd. Waeth beth fo'u hoedran, mae'r ymennydd yn dysgu'n gyson ac yn ffurfio atgofion newydd. Felly, yn syml, newid naturiol yn yr ymennydd yw niwroddirywiad ac nid yw o reidrwydd yn golygu y bydd y cof yn dirywio.

Yn olaf, gall cynnal agwedd optimistaidd hefyd wella cof person. Gall pryder a straen gael effeithiau andwyol ar yr ymennydd, gan arwain at golli cof. Gall agwedd gadarnhaol hybu iechyd yr ymennydd, a gwella cof a gallu gwybyddol.

I grynhoi, nid yw niwroddirywiad o reidrwydd yn arwain at golli cof, a gall agwedd optimistaidd tuag at fywyd ein helpu i gynnal cof da a gallu gwybyddol. Felly, dylem gynnal agwedd optimistaidd, a chryfhau ymarfer corff, diet, a rheolaeth ffordd o fyw i gynnal iechyd yr ymennydd a chof. Gellir gweld bod angen i ni wella ein cof. Gall Cistanche wella cof yn sylweddol, oherwydd gall Cistanche hefyd reoleiddio cydbwysedd niwrodrosglwyddyddion, megis cynyddu lefel acetylcholine a ffactorau twf. Mae'r sylweddau hyn yn bwysig iawn ar gyfer cof a dysgu. Yn ogystal, gall cig hefyd wella llif y gwaed a hyrwyddo darpariaeth ocsigen, a all sicrhau bod yr ymennydd yn derbyn digon o faeth ac egni, a thrwy hynny wella bywiogrwydd a dygnwch yr ymennydd.

Cliciwch gwybod ffyrdd i wella gweithrediad yr ymennydd

Yma, rydym yn disgrifio dull gwell ar gyfer cynnal dadansoddiadau DI. Gwellwyd cywirdeb mesuriadau trwy addasu meini prawf dethol ar gyfer canfod darnau niwrit, tynnu arteffactau delwedd a deunyddiau nad ydynt yn niwroit o ddelweddau, ac optimeiddio cyferbyniad delwedd. Gweithredwyd gwelliannau o'r fath i mewn i facro ImageJ sy'n galluogi dadansoddiad DI cyflym a llawn o ddelweddau lluosog. Mae'r macro yn cynnwys gweithrediadau ar gyfer tynnu celloedd celloedd yn awtomatig o ficrograffau, gan ehangu'r defnydd o ddadansoddiadau DI i'w defnyddio mewn arbrofion sy'n ymwneud â diwylliannau datgysylltiedig.

Rydym yn cyflwyno canfyddiadau arbrofol sy'n cefnogi, o'i gymharu â'r dull confensiynol, bod y dull dadansoddi gwell yn cynhyrchu mesuriadau gyda chywirdeb cynyddol ac yn gofyn am lawer llai o amser i berfformio.

At hynny, rydym yn dangos defnyddioldeb y dull o ymchwilio i ddirywiad niwrit mewn model meithrin celloedd o PD trwy gynnal arbrawf yn datgelu effeithiau c-Jun N-terminal kinase (JNK) ar ddirywiad niwrit a achosir gan straen ocsideiddiol mewn celloedd mesencephalic dynol. Gellir defnyddio'r dull dadansoddi gwell hwn i gael mewnwelediad newydd i'r ffactorau sy'n sail i ddirywiad niwritaidd a dilyniant anhwylderau niwroddirywiol.

Geiriau allweddol:

Dirywiad Axonal; mynegai dirywiad; dirywiad niwrit; niwroddirywiad; straen ocsideiddiol; clefyd Parkinson.

Datganiad o Arwyddocâd

Mae dirywiad niwrit yn ddigwyddiad cellog sy'n gysylltiedig â chamau cynnar mathau lluosog o anhwylderau niwroddirywiol. Nid oes llawer o ddealltwriaeth o hyd o’r ffactorau moleciwlaidd sy’n rheoleiddio dirywiad niwrit, ac mae’r dulliau presennol ar gyfer astudio dirywiad niwritaidd yn gyfyngedig o ran cymhwysiad ac effeithlonrwydd. Yma, rydym yn nodi addasiadau i weithdrefn a ddefnyddir yn eang ar gyfer dadansoddi dirywiad niwrit sy'n lleihau gwallau mesur.

Ymgorfforwyd gwelliannau methodolegol o'r fath mewn macro ImageJ, a thrwy hynny hwyluso dadansoddiad cyflym a hollol awtomataidd o ddirywiad niwrit gan ddefnyddio setiau mawr o ficrograffau. Gan ddefnyddio model meithrin celloedd o glefyd Parkinson (PD), rydym yn dangos bod y macro yn hwyluso mesuriadau dirywiad niwrit mwy cywir ac effeithlon tra'n ehangu addasrwydd y dull dadansoddi ar gyfer arbrofion sy'n cynnwys diwylliannau datgysylltiedig.

Rhagymadrodd

Mae dirywiad niwrit yn broses gell lle mae acsonau neu dendritau yn mynd trwy gamweithrediad cynyddol a newidiadau morffolegol, gan arwain at golli cyfanrwydd niwrit. Mae dirywiad niwrit yn broses a warchodir yn esblygiadol sy'n hanfodol ar gyfer sefydlu rhwydweithiau niwral yn briodol yn ystod datblygiad y system nerfol ganolog (Neukomm a Freeman, 2014).

Fodd bynnag, mae'r broses hefyd yn cael ei sbarduno mewn ymateb i wahanol fathau o anafiadau megis difrod mecanyddol neu amlygiad i gyffuriau a ddefnyddir ar gyfer cemotherapi (Salvadores et al., 2017). At hynny, mae dirywiad niwrit yn gysylltiedig â dilyniant amrywiaeth o anhwylderau niwroddirywiol sy'n gysylltiedig ag oedran, gan gynnwys clefyd Alzheimer, clefyd Parkinson (PD), clefyd Huntington, a sglerosis ochrol amyotroffig.

Yn ddiddorol, ar gyfer pob anhwylder niwroddirywiol o'r fath, mae tystiolaeth gronnus yn awgrymu bod dirywiad niwrit yn ddigwyddiad cyfnod cynnar allweddol sy'n rhagflaenu marwolaeth niwronaidd neu ddechrau symptomau clinigol (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert a Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Felly, gall astudiaethau sy'n archwilio ffactorau sy'n rheoleiddio'r broses gellog hon ddatgelu targedau newydd ar gyfer trin amrywiaeth o gyflyrau niwroddirywiol.

Mae ymchwilio i ddirywiad niwrit yn arbennig o bwysig ar gyfer deall PD, clefyd a nodweddir gan grynhoad o agregau protein sy'n cynnwys a-synuclein, colli niwronau dopaminergig yn raddol yn y substantia nigra pars compacta (SNpc), a datblygiad amrywiaeth o symptomau modur a gwybyddol. (Aarsland et al., 2017).

Mae tystiolaeth o astudiaethau postmortem a delweddu dynol yn dangos bod agregau a-synuclein yn fwy niferus mewn ffibrau niwronaidd nag yn y cyrff celloedd, ac mae diraddio acsonau dopaminergig yn digwydd i raddau mwy na cholli niwronau dopaminergig yn yr SNpc yn ystod y cyfnod sy'n arwain at gychwyn clinigol. (Tagliaferro a Burke, 2016).

Er nad yw’r rhyngweithiadau moleciwlaidd sy’n cyfrannu at ddirywiad cynyddol niwritiaid dopaminergig yn cael eu deall yn llwyr, mae tystiolaeth ddiweddar yn dangos y gall dirywiad niwritaidd gael ei gyfryngu gan ddigwyddiadau sy’n annibynnol ar raeadrau signalau sy’n sail i farwolaeth niwronaidd (Fukui, 2016; Geden a Deshmukh, 2016). Felly, mae astudiaethau sy'n gwerthuso'n uniongyrchol seiliau ffisiolegol dirywiad niwritaidd yn hanfodol i ddatblygiad therapïau sy'n rhwystro dilyniant PD cynnar.

Mewn ymateb i’r dystiolaeth o rôl ganolog i ddirywiad niwritaidd yn natblygiad anhwylderau niwroddirywiol, mae amrywiaeth o ddulliau wedi’u datblygu i fesur dirywiad niwritaidd gan ddefnyddio micrograffau o niwronau diwylliedig. Er enghraifft, mae sawl dull gwahanol wedi’u sefydlu i fesur dirywiad niwritau gan ddefnyddio meddalwedd i ganfod llai o nifer neu hyd niwrit (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Fodd bynnag, gan nad yw dulliau o'r fath yn gwerthuso darniad niwrit yn uniongyrchol, gall effeithiau posibl y newidyn ar alldyfiant niwrit ddrysu'r dehongliad o ganlyniadau i bennu effaith newidyn ar ddirywiad niwrit. Mae rhai grwpiau ymchwil hefyd wedi mesur dirywiad niwrit trwy sgorio'n oddrychol ddelweddau o niwritau yn seiliedig ar nodweddion morffolegol a graddau'r darnio ymddangosiadol (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Fodd bynnag, mae'r dull amgen hwn yn cymryd llawer o amser a gallai gyflwyno gwall ymchwilydd.

Mae un dull sy'n hwyluso mesuriad gwrthrychol ac uniongyrchol o ddarniad niwrit yn cynnwys defnyddio algorithm Dadansoddi Gronynnau ImageJ i fesur arwynebedd darnau niwrit mewn micrograffau o gelloedd diwylliedig. Defnyddir y mesuriadau i gyfrifo Mynegai Dirywiad (DI), graddfa rhwng {{0}}.0 ac 1.0 sy'n adlewyrchu graddau dirywiad niwrit (Sasaki et al., 2009).

Er y gellir defnyddio dadansoddiadau DI i ganfod graddau amrywiol o ddarniad niwrit, mae cywirdeb mesuriadau yn cael ei gyfyngu'n gyffredin gan sawl ffynhonnell gwall, ac mae cymhwyso'r dull wedi'i gyfyngu'n bennaf i ddiwylliannau allblannu neu gelloedd a dyfir mewn dyfeisiau microhylifol wedi'u rhannu. At hynny, mae dadansoddiadau DI yn cymryd llawer o amser wrth eu hallosod i setiau delwedd mawr. Felly, ceisiwyd goresgyn y cyfyngiadau hyn trwy addasu'r weithdrefn dadansoddi DI i hwyluso mwy o gywirdeb ac effeithlonrwydd, tra'n ehangu cymhwysedd.

Yn yr astudiaeth bresennol, rydym yn nodi sawl ffynhonnell gwall sy'n gysylltiedig yn aml â dadansoddiadau DI ac yn adrodd ar ddiwygiadau methodolegol sy'n lleihau'r gwahanol fathau o wallau. Rydym yn ymgorffori'r gwelliannau gweithdrefnol mewn macro ImageJ o'r enw Mynegai Dirywiad Niwritaidd Awtomataidd (ANDI) i awtomeiddio dadansoddiadau DI yn llwyr o setiau delwedd mawr. Dim ond meddalwedd a ffeiliau sy'n ffynhonnell agored ac sydd ar gael am ddim sydd eu hangen i weithredu'r ANDI Macro. Mae mesuriadau a geir gan ddefnyddio ANDI yn elwa o fwy o gywirdeb tra'n lleihau'n sylweddol yr amser sydd ei angen i gyflawni'r dadansoddiadau.

Ar ben hynny, rydym yn dangos sut y gellir cymhwyso'r dull dadansoddi newydd i berfformio mesuriad cywir a chyflym o ddirywiad niwrit mewn model meithrin celloedd o PD sy'n cynnwys celloedd datgysylltiedig a dyfir heb adrannu. Gyda'i gilydd, gall y gwelliannau methodolegol hyn arwain at fewnwelediad newydd i'r ffactorau sy'n sail i broses gellog bwysig sy'n gysylltiedig â niwroddirywiad.

Defnyddiau a Dulliau

Diwylliant celloedd

Sefydlwyd diwylliannau celloedd mesencephalic dynol Lund (LUHMES) yn sleidiau siambr wyth ffynnon Lab Tek II wedi'u gorchuddio â poly-L-ornithine (PLO) a ffibronectin, poly-D-lysin (PDL) a laminin, pob un o'r pedwar swbstrad, neu ddim swbstradau, fel y nodir. I'w gorchuddio â PLO a ffibronectin, deorwyd sleidiau dros nos ar dymheredd ystafell gyda hydoddiant yn cynnwys 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, catalog #P3655).

Ar ôl golchi â dŵr di-haint (Avantor), deorwyd y sleidiau â ffibronectin 2 mg/ml (Sigma-Aldrich, catalog #F0895) am 3 h ar 37 gradd. Yna cafodd y sleidiau eu golchi â PBS di-haint (Corning Life Sciences, catalog #21-040-CV) a'u caniatáu i sychu yn yr aer. I'w gorchuddio â PDL a laminin, deorwyd sleidiau ar dymheredd ystafell gyda hydoddiant yn cynnwys 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, catalog #P7280) a laminin 10 mg/ml (Corning, catalog #354232).

Yn dilyn deoriad dros nos, golchwyd y sleidiau â PBS di-haint a'u gadael i sychu yn yr aer. Er mwyn gorchuddio'r pedwar swbstrad, perfformiwyd y gweithdrefnau uchod yn olynol. Cafodd celloedd LUHMES (ATCC, RRID: CVCL_B056) eu platio yn y sleidiau siambr wedi'u gorchuddio ar y dwyseddau a nodwyd yn y cyfrwng gwahaniaethu sy'n cynnwys DMEM/F12 (Invitrogen, catalog #11330057) wedi'i ategu â 2 mM glutamine (VWR), 1% (v/v) Atodiad N-2, tetracycline 1 mg/ml (Sigma-Aldrich, catalog #87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryladenosine cAMP (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, catalog #BML-CN125-0100), a 2 ng/ml ffactor niwrotroffig sy'n deillio o linell gell glial (GDNF; R&D Systems, catalog #212-GD-010).

Ac eithrio lle nodir yn wahanol, roedd pob diwylliant wedi'i blatio ar ddwysedd o 115,000 o gelloedd fesul ffynnon. Perfformiwyd cyfnewid cyfrwng cyfaint o 50% bob 48 awr tan y driniaeth. Er mwyn atal drifft genetig, defnyddiwyd stociau celloedd a oedd wedi'u pasio chwe gwaith neu lai ar gyfer pob arbrawf.

Cymeradwywyd arbrofion yn ymwneud â diwylliannau sylfaenol niwronau sympathetig gan y Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid ym Mhrifysgol Dwyrain Kentucky neu Brifysgol Virginia. Dyrannwyd ganglia serfigol uwch o lygod y diwrnod ôl-enedigol 0–6 C56Bl/6, eu deor ar 37 gradd mewn byffer daduniad ensymatig, a'u golchi â chyfryngau twf i gael gwared ar ensymau proteolytig a'u triturated.

Cafodd ataliadau celloedd eu platio ar ddwysedd o 7000 cell fesul ffynnon yn sleidiau siambr wyth ffynnon Lab Tek II. Newidiwyd y cyfryngau ar ddiwrnod in vitro (DIV) 1, ac yna newidiwyd y cyfryngau bob yn ail ddiwrnod. Ychwanegwyd at y cyfryngau â cytosine arabinofuranoside (Ara-C, Millipore-Sigma) ar DIV1-DIV3 i atal twf celloedd nad ydynt yn niwronau, ac yna tynnu Ara-C o'r cyfryngau am o leiaf 24 h cyn y driniaeth fel y nodir. Ar gyfer arbrofion a gynhaliwyd ym Mhrifysgol Dwyrain Kentucky yn ymwneud â thriniaeth hydrogen perocsid, roedd sleidiau'r siambr wedi'u gorchuddio â 200 mg / ml PLO (Sigma-Aldrich, catalog # P3655), ffibronectin 2 mg / ml, 100 ng / ml PDL (Sigma-Aldrich, catalog #P7280) a laminin 10 mg/ml (Corning, catalog #354232) cyn eu defnyddio, a pherfformiwyd daduniad trwy 30-munud deori mewn byffer yn cynnwys DMEM (ThermoFisher, catalog #11960- 044) yn cynnwys 0.025% trypsin (Corning Life Sciences, catalog #25-053-CI) a 0.3% collagenase (Worthington Biochemical, catalog #LS004176).

Roedd y cyfryngau twf ar gyfer arbrofion o'r fath yn cynnwys DMEM wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10% (Invitrogen, catalog #26140-079), 2 mM L-glutamin (Corning, catalog #25-005-CI), a 40 ng/ml ffactor twf nerf (Fisher Scientific, catalog #13-257-019); Defnyddiwyd 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) i gael gwared ar gelloedd anneuronaidd.

Ar gyfer arbrofion a gynhaliwyd ym Mhrifysgol Virginia yn cynnwys tynnu NGF yn ôl, cafodd celloedd eu platio ar sleidiau siambr wedi'u gorchuddio â 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) a 10 mg/ml laminin (Invitrogen), a pherfformiwyd daduniad trwy 20-min deor mewn byffer sy'n cynnwys DMEM/F12 sy'n cynnwys BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), math collagenase 2 (4 mg/ml, Worthington Biocemegol), deoxyribonuclease 1 (Millipore Sigma), a hyaluronidase (Sigma-Aldrich). Roedd y cyfryngau twf ar gyfer arbrofion o'r fath yn cynnwys DMEM wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10% (Invitrogen), 1 U/ml penisilin/streptomycin (Invitrogen), a 45 ng/ml o NGF (wedi'i buro o chwarennau poer); Defnyddiwyd 10 mM Ara-C i gael gwared ar gelloedd nad ydynt yn niwronau.

Triniaethau celloedd

Amlygwyd celloedd LUHMES gwahaniaethol i'r crynodiadau a nodwyd o {{{0}}hydroxydopamine (6-OHDA; Sigma-Aldrich, catalog #162957) neu hydoddiant cerbyd ar eu pumed diwrnod yn y cyfrwng gwahaniaethu. Paratowyd stociau o 6- OHDA mewn PBS oer a oedd yn cynnwys 0.02% ascorbate (Sigma-Aldrich, catalog #A5960), a chafodd aliquots eu storio mewn ffiolau wedi'u diogelu rhag golau o dan nwy anadweithiol ar 80 gradd . Ar ôl 24 h o driniaeth, gosodwyd y celloedd trwy ddeor mewn PBS yn cynnwys paraformaldehyde 4% (PFA) am 25 munud ar dymheredd ystafell.

Er mwyn pennu rôl c-Jun N-terminal kinase (JNK) mewn dirywiad niwrit a achosir gan straen ocsideiddiol, cafodd diwylliannau eu trin ymlaen llaw am 1 h gyda 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, catalog #S5567) neu ddatrysiad cerbyd cyn disodli cyfryngau yn llwyr â chyfryngau sy'n cynnwys 7.5 mM 6-OHDA, 7.5 mM 6-OHDA a 10 mM SP600125, neu doddiannau cerbyd. Paratowyd stociau o SP600125 trwy hydoddi'r atalydd mewn dimethylsulfoxide di-haint (DMSO), a chafodd aliquots wedi'u rhewi eu storio mewn ffiolau wedi'u diogelu rhag golau wedi'u llenwi â nwy anadweithiol ar 20 gradd. Perfformiwyd triniaethau fel bod celloedd yn agored i ddim mwy na 0.1% DMSO.

Cafodd diwylliannau sylfaenol niwronau sympathetig eu trin ar DIV5. Ar gyfer arbrofion yn ymwneud â dirywiad niwrit a achosir gan hydrogen perocsid, roedd y diwylliannau'n agored i hydrogen perocsid 500 mM (Sigma-Aldrich, catalog #H1009-100ML) neu hydoddiant cerbyd yn cynnwys dŵr di-haint (Cytiva, catalog #SH30529.02) am 24 h.

Ar gyfer arbrofion yn ymwneud â thynnu'n ôl NGF, roedd diwylliannau SCG naill ai'n derbyn cyfrwng twf yn lle cyfryngau neu'n destun amddifadedd NGF. Cafodd diwylliannau SCG i gael eu hamddifadu o NGF eu rinsio deirgwaith gyda chyfryngau twf di-NGF ac yna eu deor mewn cyfryngau twf di-NGF am 80 h heb newidiadau cyfryngau. Ar ôl triniaeth, gosodwyd y celloedd trwy ddeor mewn 4% PFA yn PBS am 30 munud, ac yna tynnu'r PFA trwy rinsio gyda PBS.

Microsgopeg staenio a fflworoleuedd

Ar gyfer arbrofion gyda chelloedd LUHMES, yn ogystal â'r arbrofion yn ymwneud â niwronau sympathetig wedi'u trin â hydrogen perocsid, cafodd sleidiau siambr wyth-ffynnon yn cynnwys celloedd sefydlog eu treiddio â 0.1% Triton X-100 yn PBS a'u rhwystro am 1 h gyda 10% serwm gafr arferol yn PBS yn cynnwys 0.1% Triton X-100. Yna deorwyd y sleidiau gyda gwrthgorff cynradd penodol ar gyfer b I tubulin (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) mewn hydoddiant blocio ar 4 gradd dros nos. Yn dilyn hynny, golchwyd y sleidiau gyda PBS, eu deor â gwrthgorff eilaidd ynghyd â Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) am 90 munud ar dymheredd ystafell, a'u golchi'n ychwanegol.

Ar gyfer arbrofion yn ymwneud â staenio tyrosine hydroxylase (TH), bu'r sleidiau'n destun deoriad ychwanegol mewn PBS yn cynnwys 10% serwm gafr arferol, 0.1% Triton X-100, gwrthgorff penodol ar gyfer TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) ar 4 gradd dros nos. Yna golchwyd y sleidiau gyda PBS, eu deor â gwrthgorff eilaidd ynghyd â Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889), ac yn destun golchion PBS ychwanegol.

Ar ôl cwblhau imiwn-labelu ar gyfer b III-tiwbwlin neu TH, deorwyd sleidiau â 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-phenylindole (DAPI; catalog #D9542) yn PBS am 5 munud. Yna golchwyd y sleidiau gyda PBS, a chafodd gorchuddion eu gosod gan ddefnyddio cyfrwng mowntio Fluoromount G (Southern Biotech, catalog #0100-01).

Ar gyfer arbrofion yn ymwneud â niwronau sympathetig a gafodd eu tynnu'n ôl gan NGF, rhwystrwyd y sleidiau am 1 awr gan ddeoriad ar dymheredd ystafell mewn byffer a oedd yn cynnwys 5% o serwm gafr arferol (Life Technologies) a 0.0005% Triton X-100 yn PBS, wedi'i ddilyn gan ddeor mewn hydoddiant gwrthgyrff cynradd sy'n cynnwys gwrth-lygoden Tuj1 (1:1000, Covance) dros nos ar 4 gradd . Yn dilyn hynny, rinsiwyd sleidiau â PBS, eu deor am 1 h mewn IgG Alexa Fluor gwrth-lygoden gafr 488 (1:800, Invitrogen) a 0.1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) mewn byffer blocio, yn destun rinses PBS ychwanegol, a'i ganiatáu i sychu. Cafodd y sleidiau eu gosod gyda Fluoromount-G (Southern Biotech, catalog #0100-01) a'u storio ar dymheredd ystafell.

Delweddwyd sleidiau yn cynnwys celloedd LUHMES gydag amcan 20 o System Microsgop Gwrthdro Ti-U Nikon Eclipse II gyda ffynhonnell golau LED Sianel Lumencor Mira 4-. 1280 1024-Cafodd delweddau picsel eu dal gan ddefnyddio Camera CCD 5 MP Nikon DSQi1Mc a NIS Elements 3.22.15 (Adeiladu 738). Ac eithrio lle nodir yn wahanol, cafodd yr holl ddelweddau cyferbyniad cam eu dal gan ddefnyddio gosodiadau arddwysedd golau ac amser datguddio a gynhyrchodd ddwysedd cefndir cyfartalog o 165 mewn delweddau did 8-.

Er mwyn lleihau cysgod cefndir neu anghysondebau eraill, cyn pob sesiwn microsgopeg, cipiwyd delwedd o ffynnon wag a'i defnyddio ar gyfer cywiro cefndir yn ystod delweddu celloedd LUHMES. Delweddwyd sleidiau yn cynnwys niwronau sympathetig a feithrinwyd ym Mhrifysgol Dwyrain Kentucky neu Brifysgol Virginia gan ddefnyddio system microsgop Zeiss LSM 800 neu system microsgop Zeiss LSM 980, yn y drefn honno. Cafodd delweddau eu dal ar raddfa 20 chwyddo a chydraniad 1024 1024 gan ddefnyddio meddalwedd Zen (Carl Zeiss Microsgopeg).

Dadansoddiad hyfywedd celloedd

Sefydlwyd diwylliannau celloedd LUHMES gwahaniaethol ar sleidiau siambr wyth ffynnon Lab Tek II a oedd wedi'u gorchuddio fel y nodir â swbstradau amrywiol. Perfformiwyd newid cyfryngau 50% bob 48 awr, a gosodwyd y celloedd gyda 4% PFA yn PBS ar y chweched diwrnod o wahaniaethu. Cafodd sleidiau a oedd yn cynnwys celloedd sefydlog eu staenio â DAPI, a chafodd delweddau o staenio niwclear eu dal gyda System Microsgop Gwrthdro Ti-U Nikon Eclipse II a Camera Nikon DS-Fi1 5 MP CCD.

Cafodd celloedd eu sgorio fel rhai iach neu afiach gan ymchwilydd dallu ar sail ymddangosiad y niwclysau. Cafodd celloedd â llai o arwynebedd niwclear neu ddarniad niwclear eu sgorio fel rhai afiach. Sgoriwyd nifer y celloedd iach fesul delwedd ar gyfer o leiaf bum maes gweld fesul cyflwr ym mhob arbrawf.

mesuriadau DI

Perfformiwyd mesuriadau DI traddodiadol gan ddefnyddio pecyn Fiji Is Just ImageJ (FIJI) sy'n cynnwys ImageJ 1.52p trwy ddull sy'n cynnwys paramedrau a ddyfynnwyd yn eang ar gyfer dadansoddi DI (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin a Cho, 2020). Cafodd delweddau wyth-did o gelloedd LUHMES gwahaniaethol gyda darnau axon wedi'u gwahanu'n dda eu binareiddio gan ddefnyddio'r algorithm binareiddio rhagosodedig, gydag opsiynau deuaidd wedi'u ffurfweddu i gynhyrchu delwedd gyda chelloedd du yn y blaendir a chefndir gwyn.

Defnyddiwyd yr offeryn lluniadu llawrydd i olrhain yr holl ranbarthau delwedd sy'n cynnwys cyrff celloedd, a throswyd pob picsel du yn wyn yn y rhanbarthau a olrheiniwyd. Cymhwyswyd offeryn Mesur ImageJ i fesur cyfanswm arwynebedd du y delweddau deuaidd sy'n cynnwys niwritiaid yn unig. Yna cymhwyswyd yr offeryn Dadansoddi Gronynnau gan ddefnyddio gosodiad maint o 20–10,000 picsel a gosodiad cylchredeg o 0.2–1.0 i ganfod darnau niwrit. Yna rhannwyd arwynebedd cryno pob darn niwrit â chyfanswm arwynebedd du i gyfrifo DI y ddelwedd.

Ar gyfer arbrofion yn ymwneud ag optimeiddio paramedrau maint ar gyfer adnabod darnau niwrit, defnyddiwyd meini prawf cylchredeg {{0}}.2–1.00 ar gyfer pob mesuriad gronynnau. Cafwyd yr ategyn Particle Remover (fersiwn 20{{10}} 4/02/09), a ddatblygwyd gan Wayne Rasband, o https:// imagej.nih.gov/. Lle y nodir, perfformiwyd cymhwyso'r ategyn Particle Remover gan ddefnyddio paramedrau maint o 0-9 picsel a pharamedrau cylchredeg o 0.0-1.0 i dynnu gwrthrychau bach, di-niwrit o ddelweddau deuaidd a gafwyd o ficrograffau cyferbyniad cam.

Yn yr un modd, defnyddiwyd paramedrau maint {{0}}–4 picsel a pharamedrau cylchrededd o 0–1.0 i dynnu gwrthrychau bach o ddelweddau deuaidd a gafwyd o ficrograffau fflworoleuedd sy'n cynrychioli gwrthimiwnedd b III-tiwbwlin. Oni nodir yn wahanol, cyn y dadansoddiad DI, roedd yr holl ddelweddau cyferbyniad cam yn destun gwelliant cyferbyniad trwy ddefnyddio ImageJ i gymhwyso Tabl Edrych (LUT) gydag isafswm o 90 ac uchafswm o 205.

Mesur darnio artiffisial

Roedd diwylliannau sy'n cynnwys celloedd LUHMES iach yn sefydlog gyda 4% PFA ar eu chweched diwrnod o wahaniaethu ac wedi'u labelu imiwn ar gyfer b III-tiwbwlin. Gan ddefnyddio amcan 20, cafodd 1280 1024-micrograffau cyferbyniad cam-picsel a micrograffau fflworoleuedd, pob un yn darlunio meysydd golygfa union yr un fath, eu dal o ranbarthau a samplwyd ar hap. Cafodd cyfanswm o ddeg set o ddelweddau eu dal o naw diwylliant gwahanol.

Defnyddiwyd ImageJ i gynhyrchu copïau deuaidd o'r micrograffau cyferbyniad cam a fflworoleuedd gwreiddiol, yn ogystal â chopïau o ficrograffau cyferbyniad cam a gafodd eu binareiddio ar ôl gwella cyferbyniad trwy gymhwyso LUT gydag isafswm o 90 ac uchafswm o 205. Ar gyfer pob set o ddelweddau, nododd ymchwilydd dallu ranbarth bach, 150 150-picsel o'r micrograff cyferbyniad cam gwreiddiol yn cynnwys niwritiaid iach a chyfan yn unig.

Yna cafodd maint y rhanbarth a'r cyfesurynnau eu storio yn rheolwr rhanbarth diddordeb (ROI) ImageJ a'u defnyddio i berfformio mesuriadau DI mewn rhanbarthau tebyg o ddelweddau deuaidd o'r un set ddelwedd. Perfformiwyd y mesuriadau DI gan ddefnyddio'r dull traddodiadol sy'n cynnwys paramedrau maint darnau o 20 -10, 000 picsel. Gan fod pob rhanbarth a fesurwyd yn cynnwys niwronau cyfan gwbl, roedd unrhyw ddarnau a ganfuwyd yn cael eu hystyried yn ddarnau artiffisial.

ANDI Macro

Ysgrifennwyd y ANDI Macro gan ddefnyddio iaith ImageJ Macro. Mae'r macro yn cynnwys cyfres o weithrediadau sy'n galluogi'r defnyddiwr i ddewis llwybrau ar gyfer tri chyfeirlyfr, un cyfeiriadur sy'n cynnwys delweddau o niwronau wedi'u himiwneiddio ar gyfer marciwr niwronaidd fel b III-tubulin, ail gyfeiriadur sy'n cynnwys delweddau cyfatebol yn darlunio staenio niwclear, a thrydydd cyfeiriadur dynodedig ar gyfer arbed ffeiliau canlyniad. Yna cyfrifir yr ardaloedd darnau a chyfanswm ardaloedd niwrit y delweddau yn y cyfeiriaduron dethol trwy gyfres o weithrediadau ImageJ. Yn gryno, mae delwedd sy'n darlunio labelu niwclear yn cael ei hagor, yn destun gwelliant cyferbyniad, a'i binareiddio. Defnyddir yr ategyn tynnu gronynnau i dynnu arteffactau bach, nad ydynt yn niwclear o'r ddelwedd ddeuaidd, ac mae'r ddelwedd binarized yn destun cyfres o ymlediadau ac erydiadau.

Mae delwedd gyfatebol o gelloedd wedi'u himiwneiddio ar gyfer b III-tiwbwlin (neu farciwr niwronaidd arall) yn cael ei hagor ac yn destun gwelliant cyferbyniad. Yna mae'r ddelwedd ddeuaidd sy'n darlunio niwclysau celloedd chwyddedig yn cael ei thynnu o'r ddelwedd sy'n dangos celloedd wedi'u himiwneiddio ar gyfer b III-tiwbwlin, gan greu delwedd sy'n cynnwys niwritiaid yn unig. Yna mae'r ddelwedd niwrit yn cael ei binareiddio ac yn destun tynnu gronynnau rhwng 0 a 4 picsel. Mae arwynebedd darn Neurite yn cael ei gyfrifo trwy gymhwyso'r algorithm Dadansoddi Gronynnau i fesur gronynnau sydd â chylchedd rhwng 0.2 ac 1.0 a maint rhwng 5 a 10,0000 picsel. Cyfrifir cyfanswm arwynebedd niwrit trwy gymhwyso'r offeryn Mesur i gyfrifo cyfanswm yr arwynebedd du. Mae delwedd sy'n darlunio'r ardal niwrit deuaidd gyda darnau wedi'u hamlygu yn cael ei gadw i gyfeiriadur a ddynodwyd gan y defnyddiwr, ynghyd â ffeiliau .csv sy'n adrodd yr ardal niwrit dameidiog a chyfanswm mesuriadau arwynebedd niwrit.

Yn ogystal â'r gweithrediadau uchod, mae nifer o weithrediadau ychwanegol wedi'u cynnwys yn y macro i gefnogi rhwyddineb defnydd a chyfyngu ar gamgymeriadau defnyddwyr. Mae'r rhain yn cynnwys swyddogaethau sy'n tynnu gwybodaeth graddfa o ddelweddau ac yn sicrhau y ceir mesuriadau mewn unedau picsel; ffurfweddu gosodiadau lliw ImageJ ac opsiynau deuaidd ar gyfer tynnu delwedd a binareiddio priodol; gwirio bod y cyfeiriaduron a ddewiswyd ar gyfer delweddau o staenio b III-tiwbwlin a staenio DAPI yn cynnwys nifer cyfartal o ddelweddau; cau delweddau a ddefnyddiwyd yn flaenorol i wella amser prosesu; canlyniadau clir o ddadansoddiadau blaenorol cyn perfformiad dadansoddiadau newydd; ac atal gwallau sy'n gysylltiedig â chreu ffeil .ini gan Windows 10.

Ar gyfer arbrofion yn cynnwys dadansoddiadau o niwronau sympathetig, adolygwyd y Macro ANDI i gynnwys gweithrediad sy'n cyflwyno blwch deialog sy'n galluogi'r defnyddiwr i reoli'r nifer o weithiau y bydd delweddau deuaidd o niwclysau yn cael eu hamledu. Enw'r fersiwn o ANDI sy'n cynnwys yr adolygiad hwn oedd ANDI v1.1. Mae newid y gwerth yn y blwch deialog i rif uwch yn cynyddu maint tynnu soma tra bod newid y gwerth i rif is yn lleihau maint tynnu soma. Y gwerth rhagosodedig yw 12, sef nifer yr ymlediadau a ddefnyddir ar gyfer pob arbrawf sy'n cynnwys celloedd LUHMES. Defnyddiwyd gwerth 16 i gael gwared ar ranbarthau corff celloedd mwy yn ystod dadansoddiadau o niwronau sympathetig.

Mae'r ANDI Macro yn ffynhonnell agored ac ar gael am ddim i'w ddefnyddio neu ei addasu trwy'r URL canlynol: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Mae gweithrediad cywir ANDI wedi'i wirio gan ddefnyddio cyfrifiaduron personol lluosog sy'n cynnwys y system weithredu Windows 10. Mae set o ddelweddau sy'n dangos diwylliannau celloedd LUHMES sy'n arddangos gwahanol raddau o ddirywiad niwrit hefyd ar gael yn y cyfeiriad gwe uchod a gellir ei defnyddio i ymchwilio i weithrediad cywir y macro gan fathau eraill o gyfrifiaduron. Mae'r cyfeiriad gwe hefyd yn rhoi mynediad i brotocol sy'n disgrifio sut i ddefnyddio'r macro.

Amcangyfrifon amser

I werthuso'r amser sydd ei angen i wneud mesuriadau DI â llaw, mae micrograffau cyferbyniad cam yn darlunio celloedd LUHMES a gafodd eu trin â hydoddiant cerbyd, 2.5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA, neu Cafodd 7.5 mM 6-Cafodd OHDA sgôr DI gan ddefnyddio dulliau a sefydlwyd eisoes (Kraemer et al., 2014). Roedd pob delwedd yn destun gwelliant cyferbyniad a binarization. Yna defnyddiwyd offeryn llawrydd ImageJ i dynnu'n ddigidol yr holl gyrff celloedd a ddarluniwyd o'r delweddau deuaidd. Defnyddiwyd yr offeryn Dadansoddi Gronynnau i fesur darnau â chylchedd rhwng 0.2 a 1.0 a maint rhwng 20 a 10,000 picsel, a defnyddiwyd yr offeryn Mesur i bennu cyfanswm arwynebedd niwrit.

Trosglwyddwyd gwerthoedd am arwynebedd niwrit tameidiog a chyfanswm arwynebedd niwrit i daenlen yn Microsoft Excel, a defnyddiwyd gweithrediad mathemategol yn Excel i gyfrifo'r sgorau DI. Ar ôl agor delwedd gyda ImageJ, mesurwyd yr amser sydd ei angen i gyflawni pob un o'r gweithdrefnau hyn â llaw. Cyfrifwyd amseroedd dadansoddi cyfartalog o gyfanswm o 36 o ddelweddau. Cafwyd y delweddau o naw paratoad diwylliant celloedd annibynnol, a chynhaliwyd dadansoddiadau gan ddefnyddio un ddelwedd fesul cyflwr triniaeth o bob paratoad meithrin cell. Er mwyn pennu cyflymder mesuriadau DI a berfformiwyd gan ddefnyddio'r ANDI Macro, defnyddiwyd yr un setiau delwedd i bennu'r amser sydd ei angen i agor y macro yn ImageJ, rhedeg y gweithrediadau macro, trosglwyddo'r data i daenlen Excel, a chyfrifo'r DI.

Ystadegau

Cyflwynir cymariaethau meintiol ar ffurf plotiau blwch a wisger, lle mae’r llinell ganol yn cynrychioli’r canolrif, mae blychau’n ymestyn i’r 25ain a’r 75ain canradd, ac mae wisgers yn darlunio’r 5ed a’r 95ain canradd. Cymharwyd moddion yn ystadegol yn GraphPad Prism 9.1.2 trwy fesurau ailadroddus ANOVA gyda chymariaethau post hoc gan ddefnyddio cywiriad Sidák. Profwyd normalrwydd ar gyfer data meintiol gan ddefnyddio prawf Shapiro-Wilk yn IBM SPSS 26.

Pan fydd y rhagdybiaeth o normalrwydd ei sathru (Ffig. 1 C, 3D), cymariaethau grŵp yn cael eu cynnal drwy'r prawf Friedman nonparametric gyda Dunn prawf perfformio ar gyfer post hoc cymariaethau. Darlunnir dadansoddiadau cydberthynol fel plotiau gwasgariad ac maent yn cynnwys llinellau ffit orau. Dadansoddwyd perthnasoedd o'r fath gan ddefnyddio cydberthnasau moment-cynnyrch Pearson neu r Spearman pan gafodd y dybiaeth o normalrwydd ei thorri. Aseswyd normalrwydd gweddillion ar gyfer dadansoddiad cydberthynol trwy archwiliad gweledol o leiniau QQ cyfatebol.

Cymharwyd cyfernodau cydberthynas moment-cynnyrch Pearson â'i gilydd gan ddefnyddio prawf z asymptotig Steiger (Steiger, 1980; Lee a Preacher, 2013). Ni chafodd unrhyw allgleifion eu heithrio. Derbyniwyd arwyddocâd ystadegol yn t, 0.05. Mae gwerthoedd P yn cael eu talgrynnu i bedwar lle degol a'u hadrodd drwy'r prif destun. Mae meintiau effaith a chyfyngau hyder 95% hefyd yn cael eu hadrodd ar gyfer dadansoddiadau parametrig, gyda meintiau effaith yn cael eu disgrifio drwy’r prif destun a chyfyngau hyder a restrir yn Nhabl 1.

Argaeledd data

Bydd data ychwanegol am yr erthygl bresennol yn cael ei rannu ar gais rhesymol.

Hygyrchedd cod

Mae'r cod/meddalwedd a ddisgrifir yn y papur ar gael am ddim ar-lein yn https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Mae’r cod ar gael fel Data Estynedig 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com