Penderfynu'n Gyflym ar Chwe Chydran Effeithiol mewn Cistanche Tubulosa Ger Sbectrosgopeg Isgoch Bron

1. Rhagymadrodd

Mae Cistanche (Hoffmg. et Link) yn genws ffarogamig lluosflwydd o deulu planhigion Orobanchaceae. Mae'r rhan fwyaf o rywogaethau sy'n perthyn i'r genws Cistanche wedi'u defnyddio fel planhigyn meddyginiaethol ers milenia yn Tsieina; bod ag enw da fel tonydd uwchraddol; ac fe'u gelwir yn "Ginseng yr Anialwch". Mae Cistanche tubulosa yn barasit gorfodol o wreiddiau'r planhigyn lluosflwydd Tamarix chinensis. Mae wedi'i ddogfennu yn y Pharmacopoeia Tsieineaidd fel ffynhonnell ddilysCistanches Herba(Enw Tsieineaidd: Roucongrong) o rifyn 2005. Cychwynnwyd ymchwil ffarmacolegol modern ar rywogaethau Cistanche yn yr 1980au. Dangosodd ymchwiliadau ffarmacolegol fod gan echdynion planhigion Cistanche sbectrwm eang o weithgareddau, megis gwella diffyg arennau a rhwymedd henaint, hyrwyddo'r gallu i ddysgu a chofio, clefyd gwrth-Alzheimer, gwella imiwnedd, gwrth-heneiddio, gwrth-blinder, ac ati. Yn ystod y tri degawd diwethaf, mae astudiaethau ffarmacolegol cynhwysfawr a systematig wedi'u cyfuno ag ymchwiliadau ffytocemegol i oleuo sail ddeunydd effeithiau buddiol gwreiddiau planhigion Cistanche. Mae'r arolygon hyn yn dangos mai glycosidau ffenylethanoid (PhGs) oedd y prif gydrannau effeithiol mewn planhigion Cistanche a chwaraeodd rolau allweddol wrth drin diffyg arennau, analluedd, gwrth-heneiddio, a chlefyd gwrth-Alzheimer. Roedd angen cynnwys dau PhG (echinacoside a verbascoside) yn Pharmacopoeia Tsieineaidd. Yn y cyfamser, mae carbohydradau fel manitol, swcros, glwcos, a ffrwctos mewn planhigion Cistanche yn berchen ar swyddogaeth garthydd a chlystyrau carbohydradau.Planhigion cistanchewedi cael eu defnyddio i drin rhwymedd.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA TESTOSTERONE PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Mae adnoddau gwyllt C. tubulosa yn cael eu dosbarthu'n bennaf yn yr ardal o amgylch Anialwch Taklamakan yn Rhanbarth Ymreolaethol deheuol Xinjiang yn Tsieina. Yn debyg i lawer o rywogaethau eraill a ddefnyddir fel meddyginiaethau Tsieineaidd traddodiadol (TCMs), mae C. tubulosa o werth economaidd mawr ac mae bron wedi diflannu yn ei gynefin gwyllt oherwydd gor-gasglu. Dechreuodd tyfu C. tubulosa yn y 1990au yn Tsieina i sicrhau cyflenwad o ddeunyddiau crai ar gyfer Cistanches Herba yn ogystal â diogelu adnoddau planhigion gwyllt. O 2017 ymlaen, mae bron i 13 mil ha o C. tubulosa wedi'i drin yn bodoli yn Hotan Prefecture yn Xinjiang. Mae angen datblygiadau mewn technoleg plannu ar gyfer ehangu amaethu yn ogystal â gwella ansawdd C. tubulosa.

Prif bwrpas tyfu C. tubulosa yw cynhyrchu Cistanches Herba, gan ei fod yn gyfoethog yn y cydrannau effeithiol hynny. Fodd bynnag, mae cynnwys y cydrannau effeithiol ynCistanches Herba, megis PhGs ac oligosacaridau, yn gallu cael eu heffeithio'n sylweddol gan lawer o ffactorau yn ystod cynhyrchu. Dylid archwilio system ganfod amser real o ansawdd C. tubulosa. Felly, mae angen datblygu dull trwybwn uchel i gyflawni'r gofyniad o ddadansoddi nifer fawr o samplau o fewn cyfnod byr. Yn draddodiadol, penderfynwyd ar y prif gydrannau effeithiol hynny, megis PhGs a charbohydradau, mewn C. tubulosa gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC). Er ei fod yn gywir ac yn ddibynadwy, mae'n cymryd llawer o amser ac yn llafurus ar gyfer casglu a phrosesu data. Yn ogystal, mae angen llawer iawn o amser ac ymdrech hefyd ar gyfer paratoi sampl sydd fel arfer yn cynnwys malurio, echdynnu a hidlo profion HPLC. Felly, mae angen egwyddor glir ac offeryn hawdd ei weithredu i gael swm cymharol fawr o ddata. Yn ffodus, defnyddiwyd sbectrosgopeg bron isgoch (NIRS) yn helaeth i asesu cynhyrchion amaethyddol, bwyd, samplau meddygol, a chynhyrchion fferyllol oherwydd ei fod yn gyflym yn ogystal ag yn annistrywiol. Felly, gallai NIRS gydweddu'n union â'r gofynion ar gyfer mesuriadau TCMs yn effeithlon, ac, nid yw'n syndod bod NIRS wedi'i gymhwyso ar gyfer adnabod ansoddol a meintioli cyfansoddion mewn TCMs.

Yn yr astudiaeth hon, mae cynnwys chwe chydran effeithiol, gan gynnwysechinacoside, verbascoside, mannitol, swcros, glwcos, a ffrwctosmewn 116 sypiau o samplau C. tubulosa a gasglwyd o Hotan Prefecture yn Xinjiang yn 2013-2015 a benderfynwyd gyntaf gan HPLC. Wedi hynny, sefydlwyd modelau graddnodi'r chwe chydran hyn gyda'r dull atchweliad rhannol sgwariau lleiaf (PLSR). Yna cafodd y modelau hyn eu dilysu gyda'r cyfernodau cydberthynas a'r gwallau rhagfynegi yn y setiau graddnodi. Dangosodd y canlyniadau y gellid defnyddio'r dull datblygedig fel dull dibynadwy ar gyfer dadansoddiad meintiol o C. tubulosa.

2. Canlyniadau

2.1. Dadansoddiad HPLC

Mae cynnwysechinacoside a verbascosideeu pennu gan ddull HPLC-UV wedi'i ddiffinio'n dda yn y llenyddiaeth a phennwyd pedwar carbohydrad (mannitol, swcros, glwcos, a ffrwctos) gan ddull HPLC-ELSD wedi'i ddiffinio'n dda yn y llenyddiaeth ar gyfer pob un o'r 116 sampl. Disgrifiwyd dulliau paratoi samplau a phenderfynu yn Adrannau 3.1 a 3.3. Mae Ffigur 1 yn dangos cromatogramau nodweddiadol y safonau cymysg. Gellir gweld bod pob un o'r chwe chydran effeithiol wedi'u gwahanu oddi wrth y llinell sylfaen ac felly gellid eu meintioli. Dilyswyd y dull HPLC cyn y prawf sampl. Rhestrir prif ganlyniadau'r dull HPLC yn Nhabl 1. Mae perthynas llinol ffafriol (r=0.9998) ac adferiad (98.5%) o'r dull penderfynu echinacoside yn cael eu dangos yn y canlyniadau, yr un canlyniad â phob un o'r pump cydrannau. Felly, gellir pennu cynnwys y chwe chydran effeithiol yn gywir. Mae’r holl ystodau cynnwys a bennwyd wedi’u crynhoi yn Nhabl 1.

2.2. Dadansoddiad NIRS

Mae Ffigur 2 yn dangos sbectra NIR (4000–10,000 cm−1 ) y samplau C. tubulosa. Ymddangosodd brigau amsugno sylweddol o 4000 cm−1 i 7500 cm−1 ym mhob sampl, tra bod amrywiadau ysgafn yn ymddangos o 7500 cm−1 i 10,000 cm−1. Digwyddodd drifft gwaelodlin y sbectra NIR oherwydd bod ffactorau megis maint a lliw gronynnau yn effeithio'n hawdd ar y sampl (Ffigur 2A). Defnyddiwyd rhag-driniaethau mathemategol o'r sbectra i leihau dylanwad gwybodaeth ddiangen i ryw raddau. Roedd y rhag-driniaethau mathemategol yn cynnwys tarddiad cyntaf (deilliad 1af), ail ddeilliad (2il ddeilliad), amrywiaeth arferol safonol (SNV), a chywiro gwasgariad lluosog (MSC). Dengys Ffigur 2B 2il ddeilliad sbectra NIR C. tubulosa, a gwelir yr amrywiadau sylweddol a ddigwyddodd o dri rhanbarth, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1, a 7000–7500 cm−1.

2.3. Sefydlu Modelau Graddnodi Meintiol

Mae atchweliad rhannol sgwariau lleiaf (PLSR) yn ddull modelu clasurol ac mae wedi'i gymhwyso'n eang mewn modelau meintiol oherwydd ansawdd uchel y canlyniadau. Mae manteision PLSR yn cynnwys ei allu rhagweld da a symlrwydd cymharol. Mae PLSR hefyd wedi'i gymhwyso'n eang wrth sefydlu modelau graddnodi meintiol o TCMs [25]. Yn seiliedig ar y sbectra NIR wedi'i drin ymlaen llaw, sefydlwyd model dadansoddi meintiol NIR ar gyfer y chwe chydran effeithiol yn C. tubulosa gan ddefnyddio'r dull PLSR gyda data dadansoddi HPLC fel y gwir werthoedd. Rhannwyd y 116 sampl ar hap yn setiau calibradu a dilysu gyda chymhareb 3:1. Dewiswyd yr amodau mwyaf addas ar gyfer y graddnodi gan RMSEC isel a chyfernod cydberthynas uchel.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH RHYWIOL PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

2.3.1. Dewis y Band Tonnau ar gyfer y Modelau Calibro

Roedd dewis band tonnau addas yn gam pwysig ar gyfer adeiladu model graddnodi. Yn yr astudiaeth hon, cymharwyd sbectra cyfwng NIR o 4000–7500 cm−1 (a argymhellir gan feddalwedd dadansoddwr TQ) a 4000–10,000 cm−1. Gwelwyd bod yr amrediad hwn yn anaddas ar gyfer y graddnodi ar y cyfwng rhwng 4000 cm−1 a 7500 cm−1 o Dabl 2. Felly, yn yr astudiaeth gyfredol, dewiswyd y cyfyngau sbectrol ar gyfer y chwe cyfansoddyn cemegol o'r cyfwng o 4000 i 10,000 cm−1 trwy gymharu perfformiadau RMSEC a chyfernod cydberthynas.

2.3.2. Dewis y Nifer Gorau o Ffactorau ar gyfer y Modelau Calibro

Mae'r PLSR yn esbonio uchafswm yr amrywioldeb yn y data trwy leihau dimensiwn y data sbectra trwy gyfrifo ffactorau. Roedd y broblem "tanffitrwydd" yn ymddangos oherwydd gwybodaeth annigonol a ddeilliodd o nifer cyfyngedig o ffactorau; fodd bynnag, bydd dewis y ffactorau sy'n fwy na'r gwerthoedd optimwm a gyflwynwyd yn y model yn arwain at y broblem "gorffitrwydd". Bydd naill ai "tanffitrwydd" neu "gorffitrwydd" yn lleihau pŵer rhagfynegol y modelau sefydledig [22]. Mae Ffigur 3 yn dangos y berthynas rhwng RMSECV a ffactorau ar gyfer pob un o'r chwe chyfansoddyn. Felly, dewiswyd y ffactorau hynny sy'n cyfateb i werthoedd isaf RMECV. Rhestrir y detholiad gorau o ffactorau ar gyfer y modelau graddnodi yn Nhabl 3.

2.3.3. Detholiad o Ragdriniaeth Sbectrol ar gyfer y Modelau Calibro

Ffactor dylanwadol hanfodol arall ar gyfer modelau graddnodi yw rhag-drin sbectrol sydd â'r nod o leihau dylanwad gwasgariad a drifft gwaelodlin, gwella cymarebau signal-i-sŵn, a chael gwared ar amrywiadau afreolaidd. Defnyddiwyd dulliau cywiro gwasgariad lluosog (MSC) a dulliau amrywiad arferol safonol (SNV) i ddileu dylanwad gwasgariad ymbelydredd. I ddatrys effeithiau drifft gwaelodlin, cymharwyd sbectra deilliadol 1af ac 2il a dewiswyd yr 2il ddeilliad. Ar gyfer yr effaith ddymunol, gwnaethom lyfnhau'r sbectra ag algorithm hidlo Savitzky-Golay (SG) cyn tarddiad i atal chwyddo sŵn. Mae Tabl 3 yn dangos y wybodaeth am ragdriniaeth sbectrol a'i ganlyniadau ar gyfer y modelau graddnodi.

2.4. Gwerthusiad o'r Modelau Sefydledig

Dylai model graddnodi NIRS da fod â gwerthoedd RMSEC a RMSEP isel, yn ogystal â chyfernod cydberthynas uchel (r) a gwahaniaethau bach rhwng RMSEC a RMSEP. Sefydlwyd modelau graddnodi'r chwe chyfansoddyn dethol yn unol â'r gweithdrefnau a grybwyllwyd uchod (Tabl 3). Gwerthoedd RMSEC ac r ar gyfer y set graddnodi o echinacoside oedd 27.6 a 0.9808, yn y drefn honno. Rhestrir paramedrau perfformiad modelau cyfansawdd cemegol eraill yn Nhabl 3, a gallwn ddod i'r casgliad bod y modelau sefydledig yn dod i'r amlwg canlyniadau rhagfynegiad boddhaol, a gellir eu defnyddio ar gyfer dadansoddiad meintiol cyflym o C. tubulosa. Dangosir lleiniau gwasgariad o'r chwe chyfansoddyn cemegol yn Ffigur 4 i wneud y modelau graddnodi yn fwy disgrifiadol ac yn cael eu harsylwi'n weledol. Fel y dangosir yn Ffigur 4, digwyddodd mân wahaniaethau rhwng y gwerthoedd rhagfynegol a mesuredig, oherwydd bod y rhan fwyaf o ddotiau wedi'u dosbarthu o amgylch y gromlin atchweliadol gyda hafaliad fel y=x. Felly, gwelwyd perfformiadau rhagfynegol rhagorol yn Ffigur 4.

3. Defnyddiau a Dulliau

3.1. Paratoi Sampl

Casglwyd cant un ar bymtheg o samplau C. tubulosa o Hotan Prefecture yn rhanbarth ymreolaethol Xinjiang o 2013 i 2015. Cafodd yr holl samplau eu meithrin, ond fe'u casglwyd ar wahanol gamau twf. Roedd pwysau ffres y samplau yn amrywio o 20 g i 1000 g. Ar ôl sychu yn yr haul, cafodd y samplau sych eu malu a'u hidlo trwy ridyll rhwyll 60-.

3.2. Casglu Data Sbectrosgopig NIR

Casglwyd sbectra NIR y samplau ar egwyl 8 cm−1 dros y rhanbarth sbectrol o 4000–10,000 cm−1 gyda System Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) wedi'i chyfarparu â addasydd adlewyrchiad ffibr optegol llaw. Cafwyd pob sbectrwm trwy gyfartaledd o 64 sgan. Caniatawyd i bob sampl gydraddoli i dymheredd ystafell (25 ◦C) cyn sganio sbectra NIR i sicrhau bod y samplau'n cael eu dadansoddi ar yr un tymheredd. Cadwyd y lleithder yn y labordy ar lefel amgylchynol.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH YR AREN PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

3.3. Casglu Data HPLC

3.3.1. Paratoi Echdynnu

Echdynnwyd un gram o bowdr C. tubulosa gyda 50 mL o 50% methanol mewn fflasg gonigol gyda ultra-sonigation (500 W, 40 KHz) am 30 munud. Storiwyd y darn ar 4 ◦C. Cafodd uwchnatur y dyfyniad ei hidlo i gael sampl ar gyfer dadansoddiad HPLC.

3.3.2. Penderfyniad ar yr un pryd o Echinacoside a Verbascoside gyda HPLC-UV

Cynhaliwyd dadansoddiad cromatograffig hylifol ar system Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan) yn cynnwys dwy uned danfon toddyddion LC{{0}ADXR, pwmp AD LC-20, SIL-20ACXR auto samplwr, popty colofn CTO-20AC, synhwyrydd DAD SPD-M20A, degasser DGU-20A3R, a rheolydd CBM-20A.

Cadwyd colofn ES Carbohydrad Grace Prevail (150 × 2.1 mm, 2.7 mm) a ddefnyddiwyd ar gyfer y gwahaniadau cromatograffig ar 35 ◦C. Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys acetonitrile (A) a 0.1% asid ffurfig dyfrllyd (B) ac fe'i cyflwynwyd yn dilyn y rhaglen graddiant fel a ganlyn: 0–7 mun, graddiant llinol o 10–20% A; 7–15 mun, 20% A; a 15–20 mun, graddiant llinol o 20–10% A. Cyfradd llif y cyfnod symudol oedd 0.4 mL/munud. Perfformiwyd monitro UV ar 330 nm.

3.3.3. Penderfynu Manitol, Swcros, Glwcos a Ffrwctos ar yr un pryd â HPLC-ELSD

Perfformiwyd HPLC ar system LC cyfres Agilent 1100 (Palo Alto, CA, UDA) sy'n cynnwys degasser G1322A, pwmp cwaternaidd G1311A, autosampler G1311A, rheolydd tymheredd colofn G1316A a synhwyrydd DAD G1315B.

Defnyddiwyd colofn ES Carbohydrad Sigma Prevail (4.6 × 250 mm, 5 µm) ar gyfer gwahaniadau cromatograffig a'i chynnal ar dymheredd colofn o 25 ◦C. Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys asetonitrile a dŵr (77:23, v/v) a chynghreiriad isocrataidd wedi'i gyflenwi ar gyfradd llif o 0.7 mL/munud. Cafodd yr elifiant ei fonitro gan ddefnyddio synhwyrydd gwasgaru golau anweddol (ELSD) gyda pharamedrau rhagosodedig.

3.4. Prosesu Data

Defnyddiwyd TQ Analyst (fersiwn 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) i rannu'r setiau graddnodi a dilysu, rhag-drin y sbectra yn fathemategol, sefydlu'r modelau graddnodi, a chyfrifiannau eraill . Defnyddiwyd tarddiad (fersiwn 9.1) i wneud y ffigurau.

4. Casgliadau

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom gynnig dull cyflym ac annistrywiol ar gyfer dadansoddi ar yr un prydechinacoside, verbascoside, mannitol, swcros, glwcos, a ffrwctosmewnC. tubulosagan NIRS. Dangosodd dadansoddiadau o werthoedd RMSEC, cyfernod cydberthynas, RMSEP, ac Rp y gellid defnyddio'r modelau NIR meintiol sefydledig i ragfynegi'n gywir gynnwys y chwe chydran effeithiol a ddewiswyd ynC tubulosa. O'i gymharu â HPLC, gall y dull NIRS a adroddwyd yn yr astudiaeth hon arbed llafur ac amser sylweddol, tra'n cynnal gallu dadansoddi meintiol boddhaol. Felly, mae gan y dull a adroddir yma y potensial i gael ei ddefnyddio i reoli ansawddC. tubulosaac felly i arwain datblygiad technoleg amaethu a phrosesu ar gyferC tubulosa.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH RHYWIOL PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%