Effeithiau Modylu ROS Lingonberry (Vaccinium Vitis-idaea L.) Polyffenolau Ar Gortroffedd Adipocyte Gordew A Camweithrediad Endothelaidd Fasgwlaidd Rhan 1
Apr 28, 2022
Cliciwch os gwelwch yn ddaoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Crynodeb:Mae straen ocsideiddiol a secretiad adipocytokine wedi'i ddadreoleiddio sy'n cyd-fynd â meinwe adipose hypertroffig yn achosi llid cronig, sy'n arwain at gamweithrediad endothelaidd fasgwlaidd. Ymchwiliodd yr astudiaeth bresennol i allu ffracsiynau polyphenol anthocyanin (ACN) a di-anthocyanin (PP) o ffrwythau lingonberry i liniaru hypertroffedd meinwe adipose a chamweithrediad endothelaidd gan ddefnyddio adipocytes 3T3-L1 a chelloedd endothelaidd gwythiennau umbilical dynol (HUVECs). Dangosodd yr astudiaeth hon fod y ffracsiwn PP wedi lleihau cenhedlaeth ROS mewngellol mewn adipocytes hypertroffig trwy wella mynegiant ensymau gwrthocsidiol (SOD2) ac atal mynegiant ensymau ocsidol (NOX4, iNOS). Ar ben hynny, roedd ffracsiynau PP ac ACN yn lleihau cynnwys triglyserid mewn adipocytes ynghyd ag is-reoleiddio mynegiant genynnau lipogenig fel aP2, FAS, a DAGT1. Roedd triniaeth gyda'r ddau ffracsiynau yn modiwleiddio mynegiant mRNA a secretiad protein adipocinau allweddol mewn adipocytes hypertroffig. Roedd mynegiant a secretiad leptin ac adiponectin, yn y drefn honno, wedi'u his-reoleiddio a'u huwchreoleiddio. Ymhellach, roedd ffracsiynau PP ac ACN yn lleddfu'r ymateb llidiol mewn HUVECs a achoswyd gan TNF trwy atal mynegiant genynnau pro-llidiol (IL-6, IL{-1) a moleciwlau adlyniad (VCAM{{). 14}}, ICAM-1, SELE). Mae'r canlyniadau a gafwyd yn awgrymu y gallai bwyta ffrwythau lingonberry llawn polyphenol helpu i atal a thrin gordewdra a chamweithrediad endothelaidd oherwydd eu gweithredoedd gwrthocsidiol a gwrthlidiol.
Geiriau allweddol:polyffenolau; anthocyaninau;lingonberry; potensial gwrthocsidiol; gwrth-ordewdra; gwrthlidiol;dyfyniad cistanche tubulosa;3T3-Ll adipocytes; hypertroffedd;adipocinau; camweithrediad endothelaidd
1. Rhagymadrodd
Mae gordewdra yn ffactor risg annibynnol ar gyfer clefyd cardiofasgwlaidd ac yn un o brif achosion y risg uwch o ddyslipidemia, ymwrthedd i inswlin, gorbwysedd, ac atherosglerosis mewn oedolion a phlant [1]. Mewn gordewdra, mae meinwe adipose gwyn (WAT) trwy grynhoi gormod o fraster mewn adipocytes hypertroffig yn dod yn gamweithredol, sy'n arwain at lid cronig, straen ocsideiddiol, a secretiad adipokine wedi'i ddadreoleiddio sy'n cyfrannu at diabetes mellitus math 2 ac sydd hefyd yn gysylltiedig yn annibynnol â chamweithrediad endothelaidd coronaidd [2 ,3]. Adipocytes hypertroffig yw'r ffactor hanfodol sy'n cysylltu cydbwysedd egni cadarnhaol, diabetes, a chlefydau cardiometabolig [2]. Mae WAT yn gweithredu fel organ endocrin a thrwy adipocinau a sytocinau wedi'u secretu mae'n cyfryngu croes-siarad rhwng WAT visceral neu isgroenol a meinweoedd cardiofasgwlaidd.cistanche tubulosa redditAdipocinau megis leptin, adiponectin a resistin, cytocinau, TNF- , IL-1 , IL-6, IL-8, a MCP-1, a rhywogaethau ocsigen a nitrogen adweithiol ( ROS a RNS) yn effeithio ar ddatblygiad camweithrediad endothelaidd trwy fecanweithiau uniongyrchol ac anuniongyrchol [4]. Yn ogystal, mae meinwe adipose perifasgwlaidd (PVAT), yn bennaf o unigolion gordew, yn hyrwyddo llid lleol a nam swyddogaeth endothelaidd.
Mae PVAT yn cyfrannu at homeostasis fasgwlaidd trwy gynhyrchu cyfansoddion fasoweithredol fel adipocinau, ROS, ac ocsid nitrig (NO). Trwy gyfrinachu ystod eang o foleciwlau bioactif, mae PVAT yn dylanwadu ar gyfangiad celloedd cyhyrau llyfn fasgwlaidd, amlhau a mudo [4].
Gall cistanche wella imiwnedd
Mae'r celloedd endothelaidd sy'n leinio wal fewnol y fasgwleiddiad yn rheoleiddio swyddogaethau homeostatig, ac mae eu camweithrediad yn rhagfynegydd cynnar o atherosglerosis a chlefydau cardiofasgwlaidd [5]. Mae straen ocsideiddiol yn cyfrannu at actifadu celloedd endothelaidd, gan ei ragflaenu ar gyfer adlyniad, ymdreiddiad, ac actifadu celloedd imiwnedd, gan arwain at ffenoteip llidiol gradd isel yn y fasgwlaidd [5,6]. Gall ROS newid ymlaciad fasgwlaidd sy'n ddibynnol ar endotheliwm trwy ddiraddiad uwch o NO [6]. Gellir gwrthdroi camweithrediad endothelaidd, a allai oedi neu hyd yn oed atal dilyniant atherosglerosis a gwella swyddogaeth rhydwelïol a lleihau nifer yr achosion o ddigwyddiadau cardiofasgwlaidd I5]. Mae astudiaethau clinigol diweddar wedi dangos bod therapïau anffarmacolegol a ffarmacolegol sy'n targedu gordewdra ac ymwrthedd i inswlin yn lleddfu swyddogaeth endothelaidd ac yn lleihau llid gradd isel [7]. Mae'r canfyddiadau hyn wedi dangos y cysylltiad rhwng gordewdra, ymwrthedd i inswlin, a chamweithrediad endothelaidd; felly, dylai lleihau swyddogaeth adipocyte patholegol mewn gordewdra fod yn nod o atal clefyd cardiofasgwlaidd. Gall strategaethau therapiwtig a maethol sy'n lleihau straen ocsideiddiol a llid mewn meinwe adipose hypertroffig ddod yn darged allweddol i atal clefyd cardiofasgwlaidd [7].
Mae aeron yn ffynonellau cyfoethog o polyffenolau, fel flavonols, asidau ffenolig, ac anthocyaninau, ac mae astudiaethau epidemiolegol wedi nodi cysylltiad rhwng cynnydd mewn cymeriant ffrwythau aeron â gostyngiad mewn gordewdra a chlefyd cardiofasgwlaidd ]8]. Gelwir ffrwythau aeron yn gwrthocsidyddion naturiol, ac oherwydd eu potensial gwrthocsidiol uchel, cyfeirir atynt yn fwyfwy aml fel bwydydd swyddogaethol naturiol [9]. Mae lingonberries yn cael eu dosbarthu fel "superfruits", gan eu bod yn arbennig o gyfoethog mewn gwrthocsidyddion fel fitaminau C, A, ac E (tocopherol) a polyffenolau [10]. Mae astudiaethau in vitro ac in vivo wedi nodi amrywiol effeithiau llesol iechyd o lingonberries megis gwrthlidiol [11], gwrthocsidiol [11], a gweithgareddau gwrth-ymledol [8,9]. Ar ben hynny, dangoswyd bod lingonberries yn atal gordewdra a achosir gan ddeiet a llid gradd isel mewn anifeiliaid diabetig [12]. Dangosodd ein hastudiaeth flaenorol botensial gwrthlidiol echdyniad dyfrllyd o ffrwythau lingonberry sy'n rhewi-sychu [11]. Roedd y dyfyniad yn rheoleiddio mynegiant genynnau pro-llidiol (IL-6, MCP-1, ac IL-1) a gwrthlidiol (IL-10) mewn TNF llidus{{20} }ysgogodd adipocytes 3T3-L1 ac atal yr ymateb ymfflamychol mewn macroffagau RAW 264.7 actifedig trwy is-reoleiddio mynegiant cyfryngwyr proinflammatory(TNF- , IL-1 , IL-6, MCP{{30) }}, iNOS, COX-2). Yn ogystal, gwelwyd effeithiau gwrthocsidiol sylweddol mewn adipocytes llidus a gafodd eu trin â dyfyniad ffrwythau lingonberry. Gostyngodd y croniad ROS mewngellol o ganlyniad i fynegiant gwell o ensymau amddiffyn gwrthocsidiol (SOD, catalase, GPx) ac ensym pro-oxidant ataliedig (NADPH oxidase 4)[11].
Ymchwiliodd yr astudiaeth bresennol i'r ffracsiwn ffrwythau lingonberry anthocyanin (ACN) a gallu ffracsiwn polyphenol anthocyanin (PP) i atal a thrin gordewdra hypertroffig a chamweithrediad endothelaidd a ddynwaredwyd yn y modelau in vitro. Dadansoddwyd effaith ffracsiynau ACN a PP ar y llwybrau moleciwlaidd mewn straen ocsideiddiol, llid, a secretiad adipokine wedi'i ddadreoleiddio mewn adipocytes 3T3-L1 hypertroffig gordew. Gwerthuswyd potensial amddiffynnol yn erbyn camweithrediad endothelaidd gan ddefnyddio celloedd endothelaidd gwythiennau umbilical dynol a achosir gan TNF-x (HUVECs).
2. Defnyddiau a Dulliau
2.1.Paratoi Ffracsiynau Polyphenol Anthocyanin a Di-Anthocyanin
Cafodd y ffrwythau lingonberry wedi'u rhewi (Vaccinium Vitis-idea L.) a gafwyd gan y cwmni DANEX (PHU "DANEX", Wielen, Gwlad Pwyl) eu homogeneiddio i fwydion ffrwythau, a gafodd ei rewi wedi hynny ar -80 gradd a'i rewi-sychu. yn unol â'r weithdrefn a ddisgrifiwyd yn flaenorol[11]. Ataliwyd y powdr ffrwythau mewn hydoddiant dŵr o 0.75 y cant (v/v)asid asetig. Cyfran y solidau(g)a'r echdynnydd (mL) oedd 1:10. Ar ôl cymysgu mewn cymysgydd fortecs am y 30au, gosodwyd yr ataliad mewn bath sonig (5 mun, 20 gradd). Unwaith eto, trowyd y cymysgedd echdynnu mewn cymysgydd fortecs am y 30au a'i adael i sefyll ar 20 gradd.
Ar ôl 10 munud, cafodd y sampl ei allgyrchu ar 3600 × g (10 munud, 20 gradd), a chasglwyd y supernatant a gafwyd. Arllwyswyd yr echdynnydd ffres i'r solidau oedd yn weddill i ddechrau'r ail gam echdynnu. Roedd gweithdrefn yr ail gam yr un peth â'r un cyntaf. Cafodd echdynion y ddau gam eu cyfuno a'u centrifugio ar 12,000×g i gael gwared ar weddillion ffrwythau bach.
Yn y cam nesaf o baratoi ffracsiynau, perfformiwyd tynnu siwgrau ac asidau organig o'r dyfyniad. Cyflawnwyd y gwahaniad gyda system cromatograffaeth AKTA Explorer 100 Air(GE Healthcare, Chicago, IL, USA) gyda cholofn wydr XK 26/20 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) ). Cafodd y golofn ei llenwi â 40 ml o resin arsugniad macroporous Amberlite XAD{-7 HP (DuPont, Wilmington, DE, UDA). Cyn heintiad i'r golofn, cafodd yr hydoddiant (50 ml o'r echdyniad a gafwyd yn y cam echdynnu) ei hidlo gan ddefnyddio hidlydd chwistrell maint mandwll 0.45-um (Millex-HV Durapore PVDF) gyda rhag-hidlo ffibr gwydr (Merck). Millipore, Burlington, MA, UDA). Cymhwyswyd tri eluents: A - 5 y cant (v / o) asid fformig, B - methanol, a C - 0.1 y cant (u / o) asid fformig. Paratowyd hydoddiannau asid fformig trwy gymysgu swm priodol o asid fformig â dŵr wedi'i ddadïoneiddio. Addaswyd y gyfradd llif eluent ar 5 mL/munud. Yn ystod gwahanu, defnyddiwyd y rhaglen gromatograffig ganlynol: Cydbwysedd colofn: 95 y cant A, 5 y cant B, 3 CV (cyfaint colofn); chwistrelliad sampl-50 mL o'r dyfyniad; golchi sylweddau heb eu rhwymo-1:100 y cant C,6 CV; golchi sylweddau heb eu rhwymo-2:100 y cant A,1 CV; elution:20 y cant A,80 y cant B,5 CV; golchi colofn: 100 y cant B, 2.5 CV.
Anweddwyd elifiant cyfan y cam elution a ddangosodd yr amsugnedd (a fonitrwyd ar λ{{{0}},320, a 520 nm) i sychder ar 30 gradd gan ddefnyddio anweddydd cylchdro (rheolaeth Laborota 4003 HB, Heidolph, Yr Almaen) Diddymwyd y solidau mewn hydoddiant dŵr o 0.75 y cant (o/o) asid asetig. Trosglwyddwyd yr hydoddiant i ffiolau gwydr a'i rewi ar -85 gradd , ac yna ei roi mewn sychwr rhewi Beta {{8} }}(Martin Christ, yr Almaen) Rhewi-sychu am 48 h. Digwyddodd y sychu gwirioneddol o dan bwysau o 10 Pa am 40 h (20h ar dymheredd silff o -15 gradd a 20 h yn 15 gradd )) Perfformiwyd y sychu terfynol ar dymheredd o 22 gradd am 8 h heb reolaeth pwysau. Roedd paratoadau solet yn cael eu storio mewn ffiolau wedi'u selio'n hermetig o dan yr atmosffer nitrogen ar -85 C.
Cafodd y cynnwys solet vial ei hydoddi yn yr hydoddiant dŵr o 5 y cant (o/o) asid fformig a'i hidlo gan ddefnyddio hidlydd maint mandwll 0.45- μm (Merck Millipore). Perfformiwyd gwahanu anthocyaninau oddi wrth y cyfansoddion polyphenol eraill yn y samplau gan ddefnyddio cromatograff AKTA Explorer 100 Air, gyda synhwyrydd UV / VIS a cholofn Agilent Zorbax SB C18 (250 × 21.2 mm). Cynhaliwyd y gwahaniad ar 20 gradd. Cyfradd llif y cyfnod hylif oedd 21 mL/munud. Defnyddiwyd dau eluent: A-5 y cant (v/v)asid fformig mewn dŵr a B-methanol. Ar ôl y cydbwysedd colofn (95 y cant A, 5 y cant B, 3 CV) a chwistrellu sampl yn y cyfaint o 2 mL, y gwahaniad ei berfformio mewn graddiant cymhleth. Roedd y rhaglen graddiant fel a ganlyn: 5 y cant B-0.5 CV; 20 y cant B-2 CV; 20 y cant B-1.2 CV; 30 y cant B-3. 5 CV; 30 y cant B-1.2CV; 45 y cant B-3.5 CV; 45 y cant B-1.2CV;100 y cant B-2.5 CV;100 y cant B-2.5 CV.Casglwyd yr elifiant ag amsugnedd ar λ=520 nm a'i ddynodi fel ffracsiwn anthocyanin (ACN). Cafodd yr all-lif sy'n dangos amsugnedd yn 入=320 nm hefyd ei gasglu a'i ddynodi fel y ffracsiwn polyphenol anthocyanin (PP). Cafodd y ddau ffracsiynau eu hanweddu, eu diddymu mewn hydoddiant dŵr o asid asetig, eu rhewi-sychu, a'u storio fel y disgrifir uchod. Prynwyd yr holl gemegau a ddefnyddiwyd i baratoi'r ffracsiynau ACN a PP gan Sigma-Aldrich (Merck Group, Poznan, Gwlad Pwyl).
2.2. Adnabod a Meintioli Polyphenol mewn Ffracsiynau ACN a PP
Dadansoddwyd cyfansoddiad polyphenol ffracsiynau ACN a PP gan y dull HPLC-DAD-ESI-MS ar system HPLC cyfres Agilent 1200 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, UDA) wedi'i gyfarparu â synhwyrydd arae ffotodiode G1315D a'i gyplysu ar-lein gyda system MS amser hedfan Agilent 6224. Cyflawnwyd gwahaniadau cromatograffig ar golofn 150×2.1 mm, 3-μm C18 （Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, yr Alban). Mae astudiaeth a gyhoeddwyd yn flaenorol yn manylu ar yr amodau gwahanu (cyfnod symudol, rhaglen elution graddiant, cyfradd llif, cyfaint pigiad sampl)[11].
Cofnodwyd cromatogramau HPLC ar 280,325,355, a 520 nm, a argymhellir i ganfod flafan-3-ols, deilliadau asid hydroxycinnamig, flavonols, ac anthocyaninau, yn y drefn honno.
Cafodd cyfansoddion polyphenol mewn ffracsiynau ACN a PP eu meintioli fel cyanidin -3-O-glucoside (anthocyaninau), catechin ((epi) catechin a procyanidins), 4-asid hydroxybenzoic (deilliadau asid hydroxybenzoic), asid ferulic (deilliad asid ferulic), asid clorogenig (3-O-caffeoylquinic acid), asid p-coumaric (deilliad asid coumaric), trihydroxy asid benzoig-gallig asid (asid benzoig a deilliadau arbutin), a quercetin (glycosidau quercetin) . Chwistrellwyd yr holl samplau mewn triphlyg o doddiannau a baratowyd yn annibynnol o ffracsiynau ACN a PP.
Ar ôl pasio trwy'r synhwyrydd DAD, cyfeiriwyd colofn eluate at y system MS wedi'i ffitio â ffynhonnell ionization electrospray (ESI) a weithredir mewn modd ïon positif a ïon negyddol. Mae erthygl a gyhoeddwyd yn flaenorol yn cyflwyno paramedrau ESI-MS a ddefnyddir ar gyfer nodi cyfansoddion ffenolig mewn ffracsiynau ACN a PP [11]. Llwyddwyd i reoli offerynnau, casglu data a dadansoddi gyda meddalwedd MassHunter B.04.{00 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, UDA). Darparodd Sigma-Aldrich safonau ffenolig ac adweithyddion eraill ar gyfer dadansoddiad HPLC/DAD/MS.
2.3. 3T3-L1 Diwylliant a Thriniaeth Adipocyte
Cafwyd celloedd preadipocyte Llygoden 3T3-L1 o'r Casgliad Diwylliant Math Americanaidd (ATCC, CL-173). Cafodd y celloedd eu meithrin ar 37 gradd o dan 5 y cant CO, yr atmosffer yng nghyfrwng eryr addasedig Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl) gyda 10 y cant (o/o) serwm buchol ffetws (FBS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific Polska, Warsaw, Gwlad Pwyl)atodiad. Bu preadipocytes 3T3-L1 yn destun y broses wahaniaethu yn dilyn y protocol a ddisgrifiwyd yn flaenorol [11]. Cafodd preadipocytes eu hadu ar ddwysedd o 2.5×104cells/cm² i 12-blatiau ffynnon a’u meithrin nes iddynt gyrraedd cydlifiad. Yna cawsant eu hysgogi am 2 ddiwrnod gan gymysgedd gwahaniaethu a oedd yn cynnwys 0.25 μM o dexamethasone (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl), 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl). ac 1 μM o inswlin （Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl） yn DMEM gyda 10 y cant FBS. Disodlwyd y cyfrwng gyda DMEM wedi'i ategu â 10 y cant FBS ac 1 μM inswlin. Ar ôl 2 ddiwrnod, disodlwyd y cyfrwng diwylliant gan DMEM gydag ychwanegiad FBS o 10 y cant a'i adnewyddu bob 2-dyddiau nes bod dadansoddiad ar ddiwrnod 12.3T{35}}trin adipocytes L1 am 24 awr gyda ffracsiynau ACN a PP yn crynodiadau o 5, 10, ac 20 ug/mL.
2.4.Diwylliant a Thriniaeth HUVEC
Cafwyd celloedd endothelaidd gwythiennau bogail dynol (HUVECs) gan ATCC(CRL{{{{{{{0}}). Cafodd HUVECs eu tyfu yn F-12Kmedium (ATCC) ynghyd â 10 y cant FBS (Gibco), atodiad twf celloedd endothelaidd o feinwe niwral buchol (30 ug/mL)(Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl), a heparin ( 100ug/mL)(Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl). Cafodd HUVECs eu hadu ar ddwysedd o 6 × 103 o gelloedd/cm² ar 24-blatiau ffynnon wedi'u gorchuddio â hydoddiant colagen cynffon llygod mawr (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl). Yna cafodd 24-h diwylliannau o HUVECs eu hamlygu am 3 h i ffracsiynau ACN a PP ar grynodiadau o 0.1,1, a 10 ug/mL ac wedi hynny eu trin â TNF- (10ng/mL)(Sigma-Aldrich, Poznan , Gwlad Pwyl) am 3 h ychwanegol i gymell llid.
2.5. Assay Hyfywedd Celloedd
Dadansoddwyd hyfywedd adipocytes 3T{1}L1 hypertroffig a HUVECs a achosir gan TNF{{- -wedi'u hysgogi, heb eu trin a'u trin â ffracsiynau ACN a PP, gan ddefnyddio'r MTT(3-(4,{{7) }}dimethylthiazol-2-yl)-25-assay diphenyltetrazolium bromid) (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl) yn dilyn y driniaeth a ddisgrifiwyd eisoes[13]. Nid oedd crynodiadau isel o ffracsiynau ACN a PP a gymhwyswyd ar gyfer triniaeth celloedd yn effeithio ar liw'r cyfrwng a darlleniad amsugno yn y prawf MTT.
2.6.Penderfynu Cynhyrchu ROS Mewngellol
Mesurwyd cynhyrchu ROS mewn adipocytes 3T3-L1 gan ddefnyddio'r assay tetrazolium nitro glas (NBT) yn seiliedig ar y weithdrefn a ddisgrifiwyd yn flaenorol [14]. Ar ôl 90-munud deori mewn 0.2 y cant o hydoddiant NBT (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl), golchwyd celloedd â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad a'u gosod â methanol. Ar ôl echdynnu'r formazan gan ddefnyddio KOH a DMSO, darllenwyd amsugnedd ar 620 nm （Tecan Infinite M200, Tecan Group Ltd., Männedorf, y Swistir).
2.7.Mesur Cynnwys Lipid Mewngellol
Pennwyd effaith ffracsiynau PP ac ACN ar gynnwys lipid mewn adipocytes hypertroffig gan y dull staenio Oil Red O (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl) a ddisgrifiwyd yn flaenorol [13] a thrwy fesuriad cyfanswm triglyseridau (TG) gan ddefnyddio'r Pecyn Assay Adipogenesis ( Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafodd cynnwys TG mewngellol ei bennu gan assay ensymau. Mesurwyd cynnyrch lliwimetrig sy'n cyfateb i'r presennol TG ar 570nm. Cyfrifwyd crynodiad TG yn seiliedig ar y gromlin a luniwyd ar gyfer y safon TG.
2.8.RNA Echdynnu a Dadansoddiad PCR Amser Real
Cafodd adipocytes 3T3-L1 a HUVECs eu trin â TRI-Reagent (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl) ar gyfer ynysu RNA yn llwyr. Perfformiwyd synthesis cDNA llinyn cyntaf gydag 1 ug o gyfanswm RNA gan ddefnyddio Pecyn Synthesis cDNA Llinyn Cyntaf Trawsgrifydd （Roche Diagnostics, Gwlad Pwyl) yn seiliedig ar gyfarwyddyd y gwneuthurwr. Cynhaliwyd meintioli mynegiant genynnau gan ddefnyddio system PCR amser real (SmartCycler DX amser real PCR System Cepheid, Sunnyvale, CA, UDA ）. Roedd cymysgedd PCR mewn cyfrol derfynol o 25 μL yn cynnwys sampl cDNA （1 μL）, ymlaen penodol a paent preimio cefn (5 μM/1 μL), a SYBR⑧ Dewiswch Master Mix (12.5 μL) (Life Technologies, Carlsbad, CA, UDA) Dangosir dilyniannau preimio yn Nhabl S1. Roedd amodau beicio PCR yn cynnwys dadnatureiddio cychwynnol ar 94 gradd ar gyfer 10 munud, ac yna 40 cylchred PCR: 40au ar 95 gradd, y 30au ar 59 gradd C, a 30au ar 72 gradd . Cyfrifwyd mynegiant y genyn cymharol gan ddefnyddio'r dull 2-△ACT. Cafodd lefelau trawsgrifio eu normaleiddio i -actin ar gyfer adipocytes 3T3-L1 a GAPDH ar gyfer HUVECs Mynegwyd mynegiant cymharol mRNA fel newid plyg o'i gymharu â chelloedd rheoli (heb eu trin). Perfformiwyd pob adwaith yn driphlyg.
2.9.Penderfynu Cynhyrchu Adipokine
Mesurwyd crynodiadau leptin ac adiponectin gyda chitiau ELISA (Sigma-Aldrich, Poznan, Gwlad Pwyl) yn dilyn protocolau'r gwneuthurwr. Perfformiwyd meintioli gan ddefnyddio graddnodi safonau. Assayed pob safon a sampl yn driphlyg. Cyfrifwyd cyfernodau amrywioldeb rhyng-assay a intra-assay yn y drefn honno ar 12.5 y cant a 9.3 y cant ar gyfer leptin ac 11.2 y cant a 7.9 y cant ar gyfer adiponectin.
2.10.Dadansoddiad Ystadegol
Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd fersiwn STATISTICA 13.3 (Stat-soft, Inc., Tulsa, OK, UDA). Defnyddiwyd dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) a phrawf post hoc Tukey i amcangyfrif y gwahaniaethau rhwng gwerthoedd cymedrig grwpiau lluosog. Dilysodd prawf Levene y dybiaeth gyfartal o ran amrywiannau. Gosodwyd arwyddocâd ystadegol yn t<>
3. Canlyniadau a Thrafodaeth
3.1.Cyfansoddiad Polyphenol yn Ffracsiynau Lingonberry ACN a PP
Canolbwyntiodd yr astudiaeth ar ddau baratoad polyphenolig wedi'u gwahanu oddi wrth ffrwythau lingonberry: y ffracsiwn ACN anthocyanin a'r ffracsiwn PP nad yw'n anthocyanin. Cyflwynir y proffiliau polyphenol mewn ffracsiynau ACN a PP a bennwyd yn seiliedig ar ddadansoddiad HPLC-DAD-ESI-MS yn Nhabl 1. Roedd ffracsiwn ACN yn cynnwys tri phrif gyfansoddyn anthocyanin, a gynhwysir yn echdyniad ffrwythau lingonberry [11], sy'n ddeilliadau seiliedig ar cyanidin, gan gynnwys 3-O-galactosid (82.5 y cant ), 3-O-arabinosid(13.0 y cant), a 3-O-glucoside (4.5 y cant))(Tabl 1A) .
Tabl 1. Cafwyd cyfansoddion a nodwyd yn ffracsiwn anthocyanin (ACN) (A) a ffracsiwn polyphenol (PP) nad yw'n anthocyanin (B) o ffrwythau lingonberry.
The purity of ACN preparation was evaluated at 97.3%; among the non-anthocyanin constituents, 1-O-Benzoyl-β-glucose was identified by HPLC-ESI-MS analysis in positive ion mode (precursor ion at m/z307.079, production at m/z 185.0432). The PP fraction contained polyphenolic compounds belonging to three predominant groups: Flavan-3-ols, hydroxycinnamic acid derivatives, and flavonols, which accounted for 40.4%, 22.8%, and 31.0%, respectively. In addition, the anthocyanin compounds' residue (5.8%)was detected in the PP fraction with cyanidin-3-O-galactoside as dominant anthocyanin, cyanidin-pentoxide, and cyanidin 3-O-(6"-acetyl)-glucoside (Table 1B), trace amounts of which have been identified previously in the original lingonberry fruit extract [11]. In the PP fraction, the following polyphenols were quantified in a significant amount (>5 y cant ): procyanidins math-A a B, catechin,3-asid O-caffeoylquinic, asid ferulic-hecsosid, quercetin a'i ddeilliadau(3-O-galactosid,3-O- arabinofuranoside,3-O-rhamnoside). Mae Tabl 1B yn dangos data sbectrol màs yr holl gyfansoddion polyphenolig a nodwyd yn betrus yn y ffracsiwn PP o ffrwythau lingonberry.
Mae'r erthygl hon wedi'i thynnu o Nutrients 2021, 13, 885 7