Mae Sidt2 yn Brotein Allweddol yn y Llwybr Diraddio Autophagy-lysosomal Ac Mae'n Hanfodol Ar Gyfer Cynnal Strwythur Arennau A Swyddogaeth Hidlo Ⅱ
Nov 07, 2023
TRAFODAETH
Mae nifer fawr o astudiaethau wedi dangos bod LMPs yn ymwneud â swyddogaeth yr arennau neu homeostasis strwythurol [21-25]. Canfu ein hastudiaeth flaenorol fod yr LMP Sidt2 yn effeithio ar y llwybr signalau llidiol ac yn achosi difrod i gelloedd mesangial glomerwlaidd y llygoden [28]. Yn yr astudiaeth hon, am y tro cyntaf, fe wnaethom ymchwilio i'r effeithiau ar strwythur a swyddogaeth arennau llygoden a achosir gan y LMP Sidt2. Canfuwyd bod dileu Sidt2 yn arwain at ymasiad prosesau traed arennau'r llygoden, tewhau'r bilen islawr, oedema celloedd epithelial tiwbaidd arennol, difrod microvilli, a phroteinwria cynyddol ar 24 h, sy'n dangos bod colli Sidt2 yn arwain at nam ar y swyddogaeth hidlo. a strwythur aren y llygoden, ond nid yw ei fecanwaith manwl yn glir.
Oherwydd bod LMPs yn unedau swyddogaethol pwysig o'r lysosome [17] acamweithrediad lysosomaiddyn un o ffactorau pathogenig cyffredin llawer o glefydau cronig yn yr arennau (CDKs) (cyf. [4, 29]), rydym wedi cynnal ymchwiliadau cysylltiedig ar lysosomau ar ôl dileu Sidt2 a chanfod bod nifer y lysosomau asidig wedi gostwng a pH y cynyddodd lysosomau in vitro. Fodd bynnag, nid oedd unrhyw newidiadau amlwg yn nifer y lysosomau cynradd wedi'u rhwymo i awtoffagosomau a chyfanswm y lysosomau yn ôl dadansoddiad microsgopeg electron. Mae cathepsins yn cynrychioli'r grŵp mwyaf o ensymau proteolytig mewn lysosomau [30], ymhlith y mae CTSB yn un o'r proteasau lysosomaidd mwyaf niferus [31].
Gan fod angen asideiddio cathepsinau ar gyfer aeddfedu (actifadu), bydd newid mewn pH yn y pen draw yn arwain at ostyngiad sylweddol mewn diraddiad protein [32]. Dangosodd lefelau in vivo ac in vitro lai o weithgaredd a chynnwys hydrolase asid lysosomaidd, gan gadarnhau ymhellach bod Sidt2 yn atal swyddogaeth lysosomaidd trwy effeithio ar aeddfedu proteasau yn y lysosomau.
CLICIWCH YMA I GAEL FFURFI LYLYSYDDOL O CISTANCHE AR GYFER YR AREN
Yn y cyfamser, mae'r lysosome yn gweithredu fel canolfan ailgylchu ar gyfer metabolion cellog diraddiol a chynhyrchion gwastraff ar ddiwedd awtoffagy [1]. Mae swyddogaeth diraddio lysosomaidd arferol yn hanfodol ar gyfer awtoffagi, cynnal homeostasis celloedd, a galluogi celloedd i oroesi mewn cyflyrau ffisiolegol [33-36]. Profwyd bod achosion a datblygiad llawer o glefydau'r arennau'n gysylltiedig ag awtophag annormal [37-39]. Mae astudiaethau diweddar wedi canfod bod Sidt2 yn gludwr DNA/RNA lysosomaidd. Mae'r mathau anghonfensiynol o awtophagy trwy RNautophagy a DNautophagy (RDA) yn bwysig ar gyfer diraddio RNA / DNA dethol [40]. Rydym wedi canfod yn flaenorol bod dileu'r Sidt2 yn niweidio ymasiad awtoffagosomau a lysosomau, gan achosi i mitocondria sydd wedi'i ddifrodi fethu â chael ei ddiraddio, sy'n arwain at ddifrod i strwythur a swyddogaeth cyhyrau ysgerbydol [41]. Felly, yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom archwilio awtophagi pan achoswyd difrod i'r arennau gan ddileu Sidt2. Gwelsom fod autophagolysosomau wedi cronni yn arennau Sidt2 -/ - llygod trwy ficrosgopeg electron. Mae awtophagi yn broses ddeinamig, gan gynnwys ffurfio awtoffagosomau a ffurfio a diraddio awtoffagolysosomau. Mae ffurfio awtoffagosomau cynnar yn cael ei reoli gan y genyn Atg, ac mae ffurfio LC3-II yn arwydd o ffurfio awtoffagosom [42]. Canfuom fod mynegiadau proteinau cysylltiedig ag awtophagi Atg ac LC3-II ill dau wedi cynyddu ar ôl dileu Sidt2, sy'n dangos y gallai'r gweithgaredd awtophagi gael ei wella. Fodd bynnag, gall cronni LC3-II hefyd gael ei achosi gan rwystr yn y llwybr awtoffagolysosomau ar ddiwedd awtophagi.
Er mwyn archwilio ymhellach effaith Sidt2 ar gyflwr awtophagi arennol, mesurwyd mynegiant a ffurfiant protein cargo P62, a hefyd ymchwiliwyd i effeithiau cyffuriau sy'n targedu awtophagi (CQ a RAPA). Mae angen cyfuno P62 â LC3B ac yna ei ddiraddio yn y lysosom. Mae cynnydd yn lefel y protein P62 yn aml yn cynrychioli rhwystr yn y fflwcs autophagy [43]. Er mwyn dileu achos y cynnydd mewn cynhyrchu P62, fe wnaethom fesur lefel mRNA P62 a chanfod bod cynhyrchu P62 wedi'i leihau, felly mae'n debyg bod cronni LC3-II o ganlyniad i ddiraddiad rhwystredig. Er mwyn archwilio'r broses o awtoffagi ymhellach, fe wnaethom gynnal arbrawf fflip cloroquine. Gall cloroquine niwtraleiddio amgylchedd asidig y lysosome, ac wedi hynny, ddinistrio swyddogaeth y lysosom ac atal awtoffagi [44]. Mae'r cynnydd mewn protein LC3-II cyn ac ar ôl triniaeth CQ yn adlewyrchu nifer yr awtoffagosomau sydd wedi'u diraddio gan lysosomau, a all adlewyrchu gweithgaredd awtophagi. Gellir defnyddio'r un prawf fflip CQ hefyd i bennu faint o ddiraddiad P62 trwy'r llwybr autophagolysosome. Yn gyson â'n canlyniadau, arweiniodd dileu'r Sidt2 at leihad yn y llif awtophagi oherwydd bod diwedd yr awtophagi wedi'i rwystro. Ar yr un pryd, yn arbrawf RAPA, cynyddodd lefelau protein LC3-II a P62 yn sylweddol yn y grŵp Sidt2−/-, a all gefnogi ymhellach bod diffyg Sidt2 yn amharu ar gyfnod diwedd yr awtophagi.
Mae cam olaf awtoffagy yn cynnwys ffurfio a diraddio autophagolysosomes. Fe wnaethom ddefnyddio arbrofion cydleoli imiwnofflworoleuedd LAMP1 a LC3B i ganfod asio awtoffagosomau a lysosomau [45, 46], a dangosodd y canlyniadau fod ymasiad awtoffagosomau a lysosomau wedi'i rwystro ar ôl dileu Sidt2. Mae arbrawf labelu dwbl Ad-mCherry-GFP-LC3B yn canfod ffurfio a diraddio autophagolysosomes [27]. Cadarnhaodd ymhellach mai rhwystr ffurfio a diraddio autophagolysosomes yw'r prif reswm dros y difrod i strwythur a swyddogaeth yr arennau ar ôl dileu Sidt2.
O'r canlyniadau uchod, gallwn ddod i'r casgliad bod absenoldeb Sidt2 yn achosi gostyngiad yn nifer y lysosomau asidig a bod camweithrediad asideiddio'r lysosomau yn effeithio ar aeddfedu ensymau hydrolyzed. Efallai mai dyma'r achos pwysicaf o ddifrod i'r llwybr diraddio awtoffagy-lysosome yn ogystal ag anhwylderau ymasiad awtoffagosom a lysosom. Yn y cyfamser, efallai y bydd y broses awtoffagy â nam yn gysylltiedig yn agos â'r strwythur arennol sydd wedi'i ddifrodi a'r swyddogaeth hidlo ar ôl dileu Sidt2 (Ffig. 8). Nid yw ein hastudiaeth ond yn mynd i'r afael â rhan o effeithiau Sidt2 ar strwythur a swyddogaeth yr arennau, ond yr hyn sy'n ddiddorol yw bod y croniad o broteinau awtoffagi allweddol a nam ar strwythur a swyddogaeth yr arennau a achosir gan ddileu Sidt2 yn debyg i'r newidiadau mewn proteinau awtophag allweddol a cynnydd sylweddol mewn proteinwria a welwyd mewn neffropathi diabetig [37, 47]. Gall atgyweirio swyddogaeth lysosome fod yn strategaeth newydd bosibl ar gyfer trin neffropathi diabetig [37]. Disgwyliwn y bydd Sidt2 yn darparu ffordd o archwilio pathogenesis a thriniaeth clefydau'r arennau yn y dyfodol.
Profi protein wrin mewn llygod 12-roedd llygod WT wythnos oed a Sidt2−/− a ddewiswyd ar hap yn cael eu rhoi mewn cewyll metabolaidd ac yn ymprydio ond yn cael dŵr. Casglwyd samplau wrin 24 h, ac yna eu profi am brotein wrin (Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng, CHN, C035-2-1) (cyfeiriwch at y Deunyddiau Atodol am ddulliau manwl). Celloedd Prynwyd podocytau glomerwlaidd llygoden MPC5 o BeNa Culture Collection, a'u meithrin â 10% FBS (Excell Bio, De America, FSP500) a DMEM â glwcos isel (Sigma-Aldrich, 6046). Prynwyd celloedd mesangial glomerwlaidd llygoden SV40 MES 13 o fanc celloedd pwyllgor cadwraeth diwylliant nodweddiadol Academi Gwyddorau Tsieineaidd, a'u meithrin â 10% FBS (Excell Bio, De America, FSP500) a DMEM glwcos uchel (Sigma-Aldrich, 6429) . Cynhaliwyd crynodiad CO2 y blwch meithrin celloedd ar 5% a chynhaliwyd y tymheredd ar 37 gradd. Prynwyd cloroquine (CQ) a rapamycin (RAPA) gan Sigma-Aldrich (C6628, V900930). Diddymwyd 10 mM CQ a 25 mg/mL rapamycin mewn dŵr pur iawn. Ychwanegwyd CQ at y ddysgl petri fel bod y crynodiad terfynol yn 50 μM, a'i ddeor am 16 awr fel atalydd awtophagi. Ychwanegwyd Rapamycin at y ddysgl petri ar grynodiad terfynol o 15 μM a'i ddeor am 2 awr fel actifydd awtoffagy. Defnyddiwyd system fector golygu lentifeirws CRISPR/Cas9 i dynnu plasmidau genyn Sidt2 Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang), a defnyddiwyd offeryn dylunio ar-lein sgRNA (http://crispr.mit.edu/) i dylunio sgRNA targedu Sidt2.
Roedd y dilyniannau preimio fel a ganlyn: F: 5′-ACCACACCGTGACCC CAC-3′, R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGGTGT{5}}′, wedi'i syntheseiddio gan gwmni biotechnoleg (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Gan ddefnyddio system lentivirus CRISPR/Cas9, cafodd y plasmid Lenticrispr-v2 ei linellu a'i gysylltu â'r deublyg sgRNA a anelwyd i adeiladu'r plasmid ailgyfunol Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2. Defnyddiwyd adweithydd trawslifiad Vigofect (Biotechnoleg Egnïol, Beijing, CHN) i drawsnewid y plasmid Lenticrispr-v2 a Lenticrispr-v2-plasmid ailgyfunol Sidt2 er mwyn adeiladu'r lentivirus. Trosglwyddwyd y lentivirus a gafwyd i gelloedd MPC5 a chelloedd SV40 MES 13. Ar ôl 48 h, deorwyd y celloedd â purinomycin am 72 h i'r dewis. Y celloedd sydd wedi goroesi oedd y grŵp Sidt2+/+ a’r grŵp Sidt2−/− a gafodd eu trawsnewid yn llwyddiannus. Defnyddiwyd ynysu RNA ac assay PCR amser real Trizol (Invitrogen) i dynnu RNA o gelloedd arennau llygoden, ac roedd y dull RT-PCR penodol fel y disgrifiwyd yn flaenorol [21]. Roedd dilyniannau preimio RT-PCR fel a ganlyn: Actin (synnwyr: F: 5′- GGACTCC TATTGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62(synnwyr: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2(synnwyr: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′, R:5TG'-GGAT GGAT TAG {48}}′). Blotio gorllewinol Mae'r dull penodol fel y crybwyllwyd o'r blaen [28]. Yn yr astudiaeth hon, roedd gwrthgyrff cynradd yn cynnwys gwrth-LC3B cwningen (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), cwningen gwrth-P62 (1:1000; Abcam ab205719), gwrth-lygoden Actin (1:1000; Sigma Aldrich A5316), cwningen gwrth-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), cwningen gwrth-Atg5 (1:1000; Cell Signaling Technology 9980S), cwningen gwrth-Atg7 (1:1000; Cell Signaling Technology 8558S) , cwningen gwrth-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), llygoden gwrth-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnoleg H4A3), cwningen gwrth-cathepsin B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Cafodd y celloedd eu brechu ar ddysglau Petri gwaelod gwydr Nunc. Ar ôl tyfu i ddwysedd addas, ychwanegwyd Ad-mCherry-GFP-LC3B (amser Beyo, Shanghai, CHN, C3011-10 mL), gan arwain at grynodiad terfynol o 10 −11 vp/mL. Ar ôl ysgogi am 48 h, gwelwyd nifer y pwyntiau fflworoleuedd mCherry a GFP yn uniongyrchol o dan y microsgop confocal laser (Leica SP8, yr Almaen). Imiwnofflworoleuedd Cafodd y celloedd eu brechu ar ddysglau Petri gwaelod gwydr a'u gosod â pharaformaldehyd. Ar ôl blocio, deorwyd y celloedd dros nos gyda gwrthgorff cynradd, ac yna deorwyd y celloedd â gwrthgorff eilaidd am 90 munud yn y tywyllwch. Tynnwyd llun o'r celloedd gan ddefnyddio'r microsgop confocal sganio laser (Leica SP8, yr Almaen) ar ôl lliwio'r cnewyllyn â DAPI (1 ug/mL). Roedd gwrthgyrff cynradd yn cynnwys P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); roedd gwrthgyrff eilaidd yn cynnwys gwrth-lygoden gwrth-lygoden ail araidd Cy{3-cyfuniad Affinipure gafr gwrth-lygoden IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{133}}), CoraLite488-gafr Affinipure cyfun gwrth-lygoden IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- cyfun Affinipure gafr gwrth-gwningen IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144) }}). Ar gyfer LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046), fe wnaethom hefyd frechu'r celloedd ar ddysglau Petri â gwaelod gwydr. Ar ôl tyfu i ddwysedd addas, ychwanegwyd hylif meithrin celloedd sy'n cynnwys crynodiad terfynol LysoTracker o 75 nM at y celloedd, y tynnwyd llun ohonynt ar ôl 45 m o ysgogiad. Defnyddiwch ImageJ i gyfrif nifer y dotiau fflwroleuol a chyfernod cydberthynas Pearson. Arsylwadau microsgop electron trosglwyddo O bob grŵp, dewiswyd llygod gwrywaidd 3-wythnos oed Sidt2-/- a WT ar hap i baratoi samplau microsgopeg electron o feinwe'r arennau, ac mae'r dull penodol fel y disgrifiwyd yn gynharach [48] , tynnwch luniau ar hap o'r adrannau gan ddefnyddio microsgop electron, mae mwy na 10 llun wedi'u cymryd o adrannau arennau ar gyfer pob llygoden, dewis ar hap 3–5 llun o chwyddhad 8000 × o luniau microsgop electron pob llygoden, cyfrifwch nifer yr awtoffagolysosomau yn y llun, a chymharwch y grŵp Sidt2−/− gyda’r grŵp WT. O ran paratoi samplau microsgop electron cell, crafu dim llai na 105 o gelloedd gyda chrafwr celloedd a'u casglu mewn tiwb EP, yna allgyrchu ar 800 rpm/munud am 5 m, taflu'r uwchnatydd a'i lenwi â'r gosodiad microsgop electron. Ar ôl cael ei storio mewn oergell 4 gradd am fwy nag 1 h, gellir ei gyflwyno i'w archwilio. Cymerwyd yr ergyd microsgop electron gan KingMed Diagnostics (Guangzhou, Tsieina). LysoSensor Cafodd y celloedd eu brechu ar blât ffynnon. Ar ôl tyfu i ddwysedd addas, ychwanegwyd cyfrwng wedi'i gynhesu ymlaen llaw (37 gradd ) yn cynnwys 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545). Deorwyd y celloedd am 5 munud ar 37 gradd, ac yna tynnwyd y cyfrwng a'i ddisodli ar ôl golchi'r celloedd dair gwaith gyda PBS. Defnyddiwyd modd WellScan i ddarllen y plât yn BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, USA). Mesurwyd fflworoleuedd gan ddefnyddio tonfeddi excitation/allyriad Ex360nm/Em450nm ac Ex380nm/Em540nm, a phennwyd y pH lysosom o'r gymhareb Em540 i Em450. Dadansoddiad ystadegol Mynegwyd y canlyniadau fel y cymedr ± SEM. Perfformiwyd cymhariaeth ystadegol rhwng dau grŵp gan ddefnyddio profion t heb eu paru. Pan ddefnyddiwyd meddalwedd Graphics 8.0 ar gyfer dadansoddiad ystadegol, ystyriwyd bod P <0.05 yn arwyddocaol yn ystadegol. Ailadroddwyd pob grŵp o arbrofion yn yr astudiaeth hon o leiaf deirgwaith yn annibynnol. ARGAELEDD DATA Mae'r setiau data a gynhyrchwyd ac/neu a ddadansoddwyd yn ystod yr astudiaeth gyfredol ar gael gan yr awdur cyfatebol ar gais rhesymol.
CYFEIRIADAU
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Arwyddion o'r lysosome: canolfan reoli ar gyfer clirio cellog a metaboledd ynni. Nat Parch Mol Cell Biol. 2013; 14:283-96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lysosome: Y canolbwynt signalau metabolig. Traffig. 2019; 20:27-38.
3. Ballabio A. Y lysosom anhygoel. EMBO Mol Med. 2016; 8:73-76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J, et al. Mae camweithrediad lysosomaidd braster uchel a achosir gan ddeiet a fflwcs awtoffagig â nam yn cyfrannu at lipowenwyndra yn yr aren. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 1534-51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, et al. Anafiad tiwbaidd ac adfywiad yn yr aren llygod mawr ar ôl dod i gysylltiad acíwt â gentamicin: astudiaeth cwrs-amser. Ren Methu. 1992; 14:507-21.
Gwasanaeth Cefnogol Wecistanche - Yr allforiwr cistanche mwyaf yn Tsieina:
E-bost:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Ffôn:+86 15292862950
Siop Am Fwy o Fanylion:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
