Mae Datrysiad PC wedi'i ychwanegu at Sodiwm Thiosylffad yn Amddiffyn impiadau Arennol Rhag Anafiad Isgemia-Atgiliad Hirfaith Oer Mewn Model Murine o Drawsblannu Arennau Syngeneig

Cyswllt: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang et al

Mae Cistanche tubulosa yn atalarenclefyd, cliciwch yma i gael ycynhyrchion a Cistanche Nz

ABSENOLDEB

Cyflwyniad:Mae anaf isgemia-atlifiad oer (IRI) yn ddigwyddiad anochel sy'n cynyddu cymhlethdodau ar ôl trawsblannu. Rydym wedi dangos o'r blaen bod ychwanegu moleciwlau rhoddwr hydrogen sylffid (H2S) at ateb Prifysgol Wisconsin (UW) heb eu cymeradwyo gan FDA yn lleihau IRI oerfel ac yn gwella swyddogaeth impiad arennol ar ôl trawsblannu. Mae'r astudiaeth bresennol yn ymchwilio i weld a fydd moleciwl rhoddwr H2S a gymeradwywyd gan FDA, sodiwm thiosylffad (STS), yn cael yr un effaith neu effaith uwch mewn model llygod mawr sy'n berthnasol yn glinigol o orthotopig syngeneig.arentrawsblaniad.

Dull:Cafodd tri deg o lygod mawr Lewis neffrectomi dwyochrog ac yna trawsblaniad orthotopig syngeneig o'r chwitharenar ôl 24-awr cadw yn naill ai PC neu PC ynghyd â datrysiad STS ar 4 ◦C. Cafodd llygod mawr eu monitro i ddiwrnod ôl-drawsblaniad 14 a'u haberthu i asesu swyddogaeth arennol (allbwn wrin, creatinin serwm, a nitrogen wrea gwaed).Arennaucafodd adrannau eu staenio â H&E, TUNEL, CD68, a myeloperoxidase (MPO) i ganfod necrosis tiwbaidd acíwt (ATN), apoptosis, ymdreiddiad macrophage, ac ymdreiddiad neutrophil.

Canlyniad:Dangosodd grafftiadau PC a STS gryn dipyn yn well yn union ar ôl trawsblannu, gyda goroesiad derbynwyr yn well o gymharu â impiadau PC (p < {{0}}.05).="" datgelodd="" archwiliad="" histopatholegol="" ostyngiad="" sylweddol="" mewn="" ymdreiddiad="" atn,="" apoptosis,="" macrophage,="" a="" neutrophil="" a="" is-reoleiddio="" genynnau="" pro-llidiol="" a="" pro-apoptotig="" yn="" pc="" ynghyd="" â="" impiadau="" sts="" o="" gymharu="" â="" impiadau="" pc="" (p=""><>

Casgliad:Rydym yn dangos am y tro cyntaf bod cadw impiadau arennol mewn hydoddiant PC wedi'i ychwanegu at STS yn amddiffyn rhag IRI oer hir trwy atal llwybrau apoptotig ac ymfflamychol, a thrwy hynny wella swyddogaeth impiad ac ymestyn goroesiad derbynwyr. Gallai hyn gynrychioli strategaeth therapiwtig newydd sy’n gymwys yn glinigol i leihau canlyniad clinigol niweidiol IRI oer hir mewnarentrawsblaniad.

Geiriau allweddol:Sodiwm thiosylffad (STS) Anaf isgemia-atlifiad (IRI) Storio oer statig (SCS)Arennautrawsblannu Graft a goroesiad derbynnydd

1. Rhagymadrodd

Arennautrawsblannu yw'r driniaeth optimaidd ar gyfer y cam olafarenarennolclefyd (ESRD). O'i gymharu â dialysis,arenmae trawsblannu yn well, gan ei fod yn darparu gwell ansawdd bywyd ac yn rhoi mantais goroesi sylweddol ynghyd â'i gost-effeithiolrwydd [1–3]. Fodd bynnag, mae caffael arennau rhoddwr yn gysylltiedig yn gynhenid ​​ag anaf isgemia-atlifiad (IRI), canlyniad anochel rhoi'r gorau i lif y gwaed a'i adfer wedyn yn ystod trawsblanhigfa [4]. Y strategaeth bresennol i liniaru IRI a achosir gan drawsblaniad yw storfa oer statig (SCS) o impiadau arennol mewn datrysiadau cadwraeth safonol fel datrysiad Prifysgol Wisconsin (UW) ar yr iâ ar 4 ◦C yn ystod y cyfnod cyn trawsblannu [5]. Fodd bynnag, dangoswyd bod SCS hirfaith yn gysylltiedig â mwy o farwolaethau celloedd, llid, a digwyddiadau cellog a moleciwlaidd niweidiol eraill, sydd yn y pen draw yn arwain at fwy o achosion o oedi wrth weithredu impiad (DGF), necrosis tiwbaidd acíwt (ATN), a llai o impiad. goroesi [6–10]. Yn ogystal, i gadw i fyny â'r nifer cynyddol o achosion ESRD yn fyd-eang a nifer gynyddol o gleifion ar restrau aros am drawsblaniad, mae llawer o ganolfannau trawsblannu yn derbyn impiadau arennol gyda chyfnodau hir o isgemia oer, sy'n cyfrannu ymhellach at niwed cyffredinol i feinwe. Yn dilyn SCS mae atlifiad, pan fydd gwaed ocsigenedig cynnes yn cael ei adfer i'r impiad isgemig oer. Nodweddir reperfusion, sef cam effeithydd anaf isgemig, gan fwy o anaf i feinwe [11-13].

Strategaeth therapiwtig bosibl i gyfyngu ar IRI oer yn ystodarenmae trawsblannu yn cynnwys ychwanegu hydrogen sylffid (H2S) at hydoddiant cadwraeth safonol, sef trosglwyddydd nwy a gynhyrchir yn fewndarddol y dangoswyd ei fod yn chwarae rhan ffisiolegol pwysig mewn fasodilediad a signalau cellog [14-16]. Rydym wedi dangos yn flaenorol bod SCS hirfaith mewn hydoddiant PC wedi'i ychwanegu at H2S yn lleihau IRI oer a achosir gan drawsblaniad ac yn gwella goroesiad impiad mewn modelau murine o drawsblannu aren syngeneig ac allogeneig [17-19,41, 42]. Fodd bynnag, nid yw'r moleciwlau rhoddwr H2S a ddefnyddir yn yr astudiaethau hyn yn glinigol hyfyw. Mae hyn wedi arwain at ystyried defnyddio sodiwm thiosylffad (STS), cyffur rhoddwr H2S a gymeradwyir gan y Weinyddiaeth Bwyd a Chyffuriau (FDA) i drin calciffylacsis mewn cleifion ESRD, gwenwyndra a achosir gan cisplatin mewn therapi canser, ac fel gwrthwenwyn i gwenwyn cyanid [20–23]. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod STS yn arddangos effeithiau amddiffynnol mewn modelau anifeiliaid o IRI [24-26]. Fodd bynnag, nid yw ei effaith ar IRI arennol oer a achosir gan drawsblaniad yn hysbys. Felly, mae'r astudiaeth bresennol yn ymchwilio i effeithiau ad-amddiffynnol STS mewn model in vitro o IRI arennol a model llygod mawr o drawsblannu aren orthotopig syngeneig.

2. Deunyddiau a dulliau

2.1. Protocol in vitro arbrofol

Defnyddiwyd model in vitro o hypocsia oer ac anafiad ad-ocsigeniad cynnes sy'n dynwared cyflyrau cellog yn ystod IRI oer in vivo i asesu effeithiau amddiffynnol STS yn ystod IRI arennol. Defnyddiwyd celloedd epithelial arennau llygod mawr (NRK{{{{{{0}} llinell gell E; ATCC, UDA)) yn yr arbrofion in vitro oherwydd bod y celloedd hyn yn agored i anaf isgemig [27], ac mae eu defnydd yn gyson â'r llygoden fawr model trawsblannu a ddefnyddiwyd ar gyfer ail nod yr astudiaeth hon. Cafodd y celloedd eu meithrin yng Nghyfrwng Eryr Addasedig Dulbecco (DMEM) sy'n cynnwys 10 y cant o serwm buchol ffetws (FBS) wedi'i anactifadu gan wres ar 60 ◦C am 20 munud ac 1 y cant o benisilin/streptomycin (P/S). Deorwyd celloedd ar amodau twf arferol o 37◦C, 21 y cant O2, a 5 y cant CO2. Roedd celloedd rheoli mewn amodau union yr un fath â'r rhai ar gyfer celloedd cyn-arbrofol. Cafodd celloedd arbrofol eu trin â naill ai cyfryngau di-serwm (SF), SF ynghyd â 200 nM AP39, neu SF gyda chrynodiadau amrywiol (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) o sodiwm thiosylffad pentahydrad (STS), a gafwyd o toddiant chwistrelladwy 250 mg/mL o STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]). Defnyddiwyd crynodiad o 200 nM AP39 oherwydd i ni ddangos yn flaenorol bod AP39 yn y crynodiad hwn yn sytoprotective yn erbyn yr un llinell gell mewn model tebyg o IRI oer [20]. Yna deorwyd celloedd ar 10 ◦C am 24 h o dan amodau hypocsig (5 y cant CO2, 0.5 y cant O2, 95 y cant N2) yn siambr hypocsia HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, UDA) i achosi anaf isgemig oer. Defnyddiwyd tymheredd hypothermig o 10 ◦C oherwydd dyma'r tymheredd isaf y gellid ei gyflawni'n dechnolegol tra'n cynnal lefel O2 o 0.5 y cant o hypocsia. Yn dilyn hypocsia, disodlwyd y cyfryngau sy'n cynnwys celloedd arbrofol gan gyfryngau rheoli, a chafodd y celloedd eu hail-ocsigenu trwy ddeor o dan amodau twf arferol (37 ◦C, 21 y cant O2, a 5 y cant CO2) am 24 awr i efelychu atlifiad a'i anaf cysylltiedig. Yn dilyn ail-ocsigeniad 24 h, aseswyd hyfywedd cellog trwy staenio celloedd ag Annexin-V wedi'i gyfuno â FITC (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) ac 7-Aminoactinomycin D (7-AAD; BioLegend, USA) ), sy'n mesur apoptosis cellog a necrosis yn y drefn honno. Dadansoddwyd celloedd trwy sytometreg llif gan ddefnyddio'r CytoFLEX S (Beckman Coulter, UDA). Defnyddiwyd fersiwn FlowJo 11 (FlowJo LLC, UDA) i borthi'r data'n briodol ar gyfer dadansoddiad ystadegol.

2.2. Anifeiliaid arbrofol

Cafodd tri deg o lygod mawr Lewis gwrywaidd yn pwyso 275-300 g ac a brynwyd gan Charles River (St. Constant, QC, Canada) eu cartrefu yn y cyfleuster Gofal Anifeiliaid a Gwasanaethau Milfeddygol ym Mhrifysgol y Gorllewin (Llundain, ON) o dan amodau safonol. Cymeradwywyd astudiaethau anifeiliaid gan Gyngor Prifysgol y Gorllewin ar Ofal Anifeiliaid a Defnydd Anifeiliaid gyda phrotocol ID 2018-155.

2.3. Model trawsblannu arennau

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 y cant o golli pwysau) neu farwolaeth. Gwiriwyd pwyntiau terfyn trugarog ddwywaith y dydd a chafodd yr holl lygod mawr eu lladd trwy ddatguddiad CO2 mewn siambr ar gyfradd llif o 40 y cant. Ar adeg ewthanasia, nid oedd unrhyw gymhlethdodau llawfeddygol a allai fod wedi arwain at amrywiadau yn y canlyniadau.

2.4. Dadansoddiad o swyddogaeth arennol

Yn dilyn trawsblannu aren, cafodd llygod mawr eu monitro mewn cewyll metabolig am 14 diwrnod ac yna eu haberthu. Casglwyd samplau gwaed ac wrin ar POD 3, 5, 7, 10, a 14 i bennu paramedrau swyddogaeth arennol (creatinin serwm, nitrogen wrea gwaed [BUN], osmolality wrin, ac allbwn wrin). Daeth BUN a creatinin serwm gan dderbynwyr trawsblaniad aren a mesurwyd llygod mawr a weithredir â Sham gan ddefnyddio peiriant Dadansoddwr Cemeg IDEXX Catalyst One (Markham, ON). Pennwyd lefelau osmolality wrin gan osmometreg pwynt rhewi gan ddefnyddio'r peiriant Osmomedr 3320 (Advanced Instruments, Norwood, MA) a'u cymharu â safonau a ddarperir gan y cwmni.

2.5. Dadansoddiad histopatholegol a morffometrig

Cafodd meinweoedd arennau wedi'u mewnblannu â pharaffin eu torri'n adrannau 4 µm o drwch a'u gosod ar sleidiau microsgopig ar gyfer histoleg. Cafodd yr adrannau eu staenio â Hematoxylin ac Eosin (H&E), Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end label (TUNEL) i bennu gradd ATN ac apoptosis yn y drefn honno. Rhoddwyd sgôr i adrannau H&E ar gyfer ATN gan batholegydd arennol dall yn unol â'r cynllun canlynol: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 y cant impiad ATN. Cafodd adrannau'r arennau eu staenio hefyd â'r gwrthgyrff sylfaenol canlynol: marciwr anaf i'r arennau (KIM-1), marciwr wyneb macrophage CD68, ac ensym penodol neutrophil myeloperoxidase (MPO; Abcam®, Toronto, Canada) a delweddu gyda gwrthgyrff eilaidd a Cromogen swbstrad DAB gan ddefnyddio System Dako Envision (Dako, Glostrup, Denmarc) yn ôl protocol y gwneuthurwr a ddilynir gan ddadansoddiad o dan ficrosgop golau digidol Eclipse 90i (Nikon® Instruments, Efrog Newydd) ar chwyddhad 10x a'i feintioli gan feddalwedd ImageJ v. 1.8 (Cenedlaethol Sefydliadau Iechyd, Bethesda, MD).

2.6. Dadansoddiad PCR meintiol

Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu o feinweoedd impiad arennol a gafwyd yn POD 3 gan ddefnyddio RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Canada) a thrawsgrifiwyd y cefn yn cDNA gan ddefnyddio Pecyn synthesis cDNA OneScript® Plus (ABM, Canada) ar y cyd ag oligo (dT) 12 - 18 paent preimio yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Dadansoddwyd RNA ynysig a cDNA trwy nanodrop (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, Canada) cyn eu defnyddio, gyda graddfeydd A260/280 yn gyson > 1.95 a > 1.8 yn y drefn honno. Roedd gan gymysgedd adwaith pob sampl qPCR gyfaint o 20 µL ac fe'i gwnaed yn unol â phrotocol Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Canada) a'i ddadansoddi gan ddefnyddio peiriant System Canfod PCR Amser Real CFX Connect (Bio-Rad, Canada). . Dyluniwyd dilyniannau premer gan ddefnyddio meddalwedd Primer-BLAST (NCBI) yn erbyn beta-actin, poly (ADP-ribose) polymeras (PARP), interferon-gamma (IFN- ), ffactor necrosis tiwmor-alffa (TNF- ), interleukin 6 (IL -6), lymffoma B-cell 2 (Bcl-2), Bcl-2- protein X cysylltiedig (BAX), caspase 3, gweithydd marwolaeth parth rhyngweithio BH3 (BID), c-Mehefin N-terminal kinase 1/2 (JNK1/2), Pparg coactivator 1 alpha (PGC -1 ), mitocondria cymhleth I (NDUFB8), mitocondria cymhleth II (SDHB), kinase protein-activated mitogen 1/2 (ERK1) /2), neutrophil gelatinase lipocalin (NGAL), a genynnau moleciwl anaf i'r arennau-1 (KIM-1). Cafodd pob genyn o ddiddordeb ei normaleiddio yn erbyn beta-actin. Cymharwyd newidiadau plyg mewn mynegiant genynnau â llygod mawr a weithredir gan Sham ac fe'u cyfrifwyd gan ddefnyddio'r dull ΔΔCt.

2.7. Dadansoddiad ystadegol

Cynhaliwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio pecyn meddalwedd ystadegol Prism, fersiwn 9.0, GraphPad (La Jolla, CA). Dadansoddwyd data goroesi gan ddefnyddio dadansoddiad goroesi Kaplan-Meier a phrawf rheng log tra dadansoddwyd data mynegiant genynnau qPCR gan ddefnyddio prawf-t unffordd heb ei baru. Dadansoddwyd yr holl ddata arall gan ddefnyddio dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) ac yna prawf ôl-hoc Tukey i bennu gwahaniaethau ystadegol rhwng grwpiau. Derbyniwyd arwyddocâd ystadegol yn t<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Canlyniadau

3.1. Mae cyfryngau di-serwm sydd wedi'u hatodi â STS yn gwella goroesiad celloedd epithelial tiwbaidd arennol yn ystod hypocsia oer / ail-ocsiageneiddio

Dangosodd dadansoddiad cytometreg llif ar ôl staenio ar gyfer apoptosis a necrosis fod celloedd NRK{{{0}} E celloedd a gafodd eu trin â SF yn ystod IRI oer in vitro yn arddangos hyfywedd celloedd wedi gostwng yn sylweddol o gymharu â chelloedd rheoli (normoxig) (Ffig. 1 A; p < 0.05).="" er="" bod="" yr="" holl="" samplau="" arbrofol="" yn="" dangos="" hyfywedd="" celloedd="" epithelial="" tiwbaidd="" arennol="" sylweddol="" is="" na="" chelloedd="" a="" dyfwyd="" o="" dan="" amodau="" normocsig="" (p="">< 0.05),="" dangosodd="" celloedd="" a="" gafodd="" eu="" trin="" ag="" sf="" wedi'u="" hategu="" â="" 150="" µm="" a="" 500="" µm="" sts="" hyfywedd="" sylweddol="" uwch="" na'r="" rhai="" a="" driniwyd="" gyda="" chyfryngau="" sf="" yn="" unig="" (ffig.="" 1a;="" p=""><0.05), a="" oedd="" yn="" cyfateb="" i="" apoptosis="" sylweddol="" is="" o'i="" gymharu="" â="" chelloedd="" a="" gafodd="" eu="" trin="" â="" chyfryngau="" sf="" yn="" unig="" (ffig.="" 1b;="" p=""><0.05). yn="" ogystal,="" mae'n="" ymddangos="" bod="" y="" cynnydd="" mewn="" hyfywedd="" celloedd="" a="" gostyngiad="" mewn="" apoptosis="" yn="" cyrraedd="" y="" lefelau="" gorau="" posibl="" gyda="" 150="" µm="" a="" 500="" µm="" sts,="" gan="" fod="" dos="" uwch="" yn="" gwrthdroi'r="" tueddiadau="" hyn="" (ffig.="" 1a="" a="">

3.2. Mae ychwanegu hydoddiant PC gyda STS yn gwella goroesiad a gweithrediad impiad arennol cynnar

Fe wnaeth cadw impiadau arennol mewn datrysiad PC wedi'i ychwanegu at STS wella goroesiad derbynwyr yn sylweddol gyda goroesiad o 83 y cant tan POD 14 (diwrnod yr aberth) o'i gymharu â'r grŵp rheoli heb ychwanegiad STS, a ddangosodd oroesiad 12.5 y cant, yn enwedig yn y 3 diwrnod cyntaf (Ffig. 2A; p < 0.05).="" yn="" ogystal,="" mae="" ychwanegiad="" sts="" wedi="" gwella="" swyddogaeth="" impiad="" yn="" sylweddol="" yn="" ystod="" y="" cyfnod="" cynnar="" ar="" ôl="" trawsblannu="" o'i="" gymharu="" â="" thriniaeth="" pc="" yn="" unig.="" cynyddwyd="" lefelau="" creatinin="" serwm="" a="" bun="" yn="" sylweddol="" mewn="" grwpiau="" pc="" a="" pc="" ynghyd="" â="" sts="" ar="" pod="" 3,="" a="" oedd="" yn="" cyfateb="" i="" osmolality="" wrin="" gostyngol="" o'i="" gymharu="" â="" sham="" (ffig.="" 2b,="" c,="" a="" 3a;="" p="">< 0.{{25)="" }}5).="" fodd="" bynnag,="" gostyngodd="" lefelau="" creatinin="" serwm="" a="" bun="" yn="" y="" grŵp="" pc="" a="" sts="" yn="" sylweddol="" ar="" pod="" 3="" gyda="" chynnydd="" cyfatebol="" mewn="" osmolality="" wrin="" o'i="" gymharu="" â="" grŵp="" pc="" (ffig.="" 2b,="" c="" a="" 3a;="" p=""><0.05). yn="" ddiddorol,="" gostyngodd="" lefelau="" creatinin="" serwm="" a="" bun="" yn="" y="" grŵp="" pc="" a="" sts="" yn="" raddol="" o="" pod="" 3="" i="" pod="" 14="" gyda="" mwy="" o="" osmolality="" wrin="" ac="" roeddent="" yn="" debyg="" i="" rai="" sham="" (ffig.="" 2b,="" c,="" a="" 3a).="" hefyd,="" roedd="" allbwn="" wrin="" yn="" y="" grŵp="" pc="" a="" sts="" yn="" sylweddol="" uwch="" yn="" ystod="" y="" pedwar="" diwrnod="" cyntaf="" ar="" ôl="" llawdriniaeth="" o'i="" gymharu="" â="" grwpiau="" pc="" a="" sham="" (ffig.="" 3b;="" p="">< 0.05).="" fodd="" bynnag,="" gostyngodd="" yn="" raddol="" tuag="" at="" werth="" gwaelodlin="" (sham)="" ac="" roedd="" yn="" debyg="" i="" un="" sham="" ar="" pod="" 14="" tra="" bod="" allbwn="" wrin="" yn="" y="" llygoden="" fawr="" sydd="" wedi="" goroesi="" yn="" y="" grŵp="" pc="" yn="" parhau="" i="" fod="" yn="" uwch="" na="" gwerth="" gwaelodlin="" ar="" pod="" 14="" (ffig.="">

3.3. Mae ychwanegu STS at doddiant PC yn lliniaru marwolaeth celloedd a achosir gan drawsblaniad ar ôl trawsblannu aren

Cafodd adrannau arennau a gafwyd ar POD 3 a 14 eu staenio â TUNEL fel mesur o farwolaeth celloedd apoptotig a'u sgorio gan batholegydd arennol dallu (Ffig. 4 A). Roedd impiadau arennol o'r grŵp PC yn dangos llawer uwch o farwolaethau celloedd apoptotig ar POD 3 fel y dangosir gan sgôr TUNNEL uwch o gymharu ag arennau o PC ynghyd â grwpiau STS a Sham (Ffig. 5A a b; p < 0.{{11}="" }5).="" nid="" oedd="" impiadau="" o="" grŵp="" pc="" a="" sts="" yn="" sylweddol="" wahanol="" o="" gymharu="" â="" rhai="" sham="" ar="" yr="" un="" pwynt="" amser="" ac="" yn="" pod="" 14="" (ffig.="" 4="" b).="" yn="" ogystal,="" er="" bod="" impiadau="" o="" grwpiau="" pc="" a="" pc="" ynghyd="" â="" sts="" wedi="" cynyddu'n="" sylweddol="" sgorau="" atn="" ar="" pod="" 3="" o'i="" gymharu="" â'r="" grŵp="" sham="" (ffig.="" 5;="" p="">< 0.05),="" pc="" ynghyd="" â="" impiadau="" sts="" dangosodd="" sgorau="" atn="" is="" ar="" pod="" 3="" o="" gymharu="" â="" pc="" (ffig.="" 5;="" p="">< 0.05).="" hefyd,="" er="" na="" oroesodd="" derbynwyr="" impiadau="" pc="" i="" pod="" 14,="" ac="" felly="" ni="" ellid="" pennu="" eu="" sgorau="" atn="" ar="" pod="" 14,="" goroesodd="" rhai="" pc="" a="" impiadau="" sts="" i="" pod="" 14="" ond="" dangosodd="" sgoriau="" atn="" sylweddol="" uwch="" o="" gymharu="" â'r="" grŵp="" sham="" (ffig.="" .5;p=""><>

3.4. Roedd impiadau arennol a gadwyd mewn hydoddiant PC wedi'i ychwanegu at STS yn dangos llai o farcwyr anafiadau ac ymdreiddiad llidiol ar ôl trawsblannu aren

Cafodd adrannau arennau a gafwyd ar POD 3 a 14 eu staenio â KIM-1 i ganfod anaf tiwbaidd procsimol yn ogystal â CD68 (marciwr macrophage) a MPO (marciwr niwtroffil) a'u sgorio gan batholegydd arennol dall (Ffig. 6A, 7A, ac C). Roedd mynegiant meinwe arennol KIM-1, CD68, ac MPO yn sylweddol uwch yn y grŵp PC ar POD 3 o gymharu â rhai grwpiau PC a STS a Sham (Ffig. 6B, 7B a D; p < {{11}="" }.05)="" er="" nad="" oedd="" mynegiant="" y="" marcwyr="" hyn="" ym="" mhrifysgol="" cymru="" ynghyd="" â="" impiadau="" sts="" yn="" sylweddol="" wahanol="" o="" gymharu="" â="" sham="" ar="" pod="" 14="" (ffig.="" 6b,="" 7b="" a="" d;="" p=""> 0.05).

3.5. Roedd atodiad STS i doddiant PC yn atal mynegiant arennol o enynnau pro-llidiol, pro-apoptotig a mitocondriaidd

Pennwyd mynegiant genynnau o farcwyr pro-inflammatory, pro-apoptotic, mitocondria-targedu, ac anaf i'r arennau trwy qRT-PCR mewn arennau wedi'u trawsblannu a gafwyd ar POD 3. Mynegiad o'r genynnau pro-llidiol IFN-, TNF- ac IL{{8 }} wedi cynyddu'n sylweddol mewn impiadau PC o gymharu â PC ynghyd â impiadau STS ar POD 3 (Ffig. 8A; p < 0.05)="" a="" dilynwyd="" yr="" un="" patrwm="" â="" genynnau="" pro-apoptotig="" parp,="" bax="" ,="" caspases-3,="" bid,="" jnk1="" a="" jnk2="" (ffig.="" 8a;="" p="">< 0.05)="" tra="" bod="" mynegiant="" gwrth-apoptotig="" bcl-2="" wedi="" cynyddu="" ychydig="" yn="" pc="" ynghyd="" â="" grŵp="" sts="" o'i="" gymharu="" â="" grŵp="" pc,="" er="" na="" chyrhaeddodd="" y="" cynnydd="" hwn="" arwyddocâd="" ystadegol="" (ffig.="" 8a).="" yn="" ogystal,="" roedd="" mynegiant="" genynnau="" mitocondriaidd="" pgc-1="" ,="" ndufb8="" (cymhleth="" i),="" a="" sdhb="" (ii="" cymhleth)="" mewn="" impiadau="" pc="" wedi="" gostwng="" yn="" sylweddol="" o="" gymharu="" â="" pc="" ynghyd="" â="" impiadau="" sts="" (ffig.="" 8b;="" p="">< 0="" .05)="" tra="" arsylwyd="" ar="" y="" cefn="" gydag="" ymadroddion="" erk1="" ac="" erk2="" (ffig.="" 8b;="" p="">< 0.05).="" ymhellach,="" cynyddwyd="" mynegiant="" genynnau="" kim-1="" mewn="" impiadau="" pc="" yn="" sylweddol="" o'i="" gymharu="" â="" grafftiau="" pc="" a="" sts="" (ffig.="" 8c;="" p="">< 0.05)="" tra="" na="" chyrhaeddodd="" mynegiant="" ngal="" gostyngol="" mewn="" pc="" ac="" impiadau="" sts="" arwyddocâd="" ystadegol="" o'i="" gymharu="" â'r="" un="" yn="" impiadau="" pc="" (ffig.="" 8c;="" p=""> 0.05).

4. Trafodaeth

Mae'r astudiaeth hon yn sefydlu ychwanegiad o hydoddiant cadw safonol gyda STS, rhoddwr H2S sy'n glinigol hyfyw a gymeradwyir gan FDA, i liniaru IRI arennol oer a achosir gan drawsblaniad, gwella ansawdd impiad ac ymestyn goroesiad derbynwyr. Gan ddefnyddio model in vitro o IRI arennol a model llygod mawr o drawsblannu aren orthotopig syngeneig, rydym yn dangos am y tro cyntaf bod ychwanegu hydoddiant PC gyda STS yn ystod SCS hirfaith yn amddiffynnol i organau ac i organau.

Y prif ganfyddiad yn ein model in vitro yw bod ychwanegiad STS i gyfryngau di-serwm yn amddiffyn celloedd epithelial arennol rhag hypocsia oer ac apoptosis cynnes a achosir gan ail-ocsigenedd ac yn cynyddu hyfywedd, sy'n gyson â'n hastudiaeth flaenorol lle dangosom effeithiau amddiffynnol y mitocondria. -cyffur rhoddwr H2S targedig, AP39, mewn model in vitro o IRI arennol oer [20]. Yn ddiddorol, roedd crynodiad STS uwch o 1 mM wedi gwrthdroi'r effeithiau buddiol, gan awgrymu bod STS yn arddangos ffenomen ymateb dos deuffasig y cyfeirir ato fel hormesis, lle mae crynodiad is yn sytoprotective tra bod crynodiad uwch yn sytotocsig. Mae difrod mitocondriaidd yn ganlyniad mawr i IRI arennol, gan y gall athreiddedd mitocondriaidd atal cynhyrchu adenosine triphosphate (ATP) a chynyddu ffurfiant rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), cyfryngwr dinistriol anaf i feinwe [13]. Awgrymwyd yn ddiweddar mai mitocondria yw un o brif safleoedd gweithgaredd STS. Nid yn unig y gwyddys bod STS yn cynhyrchu H2S yn y mitocondria trwy ostyngiad sy'n ddibynnol ar glutathione ac i'r gwrthwyneb trwy lwybr ocsideiddio sylffid, ond mae hefyd yn cadw synthesis ATP mitocondriaidd, yn lleihau cynhyrchiad ROS, ac yn gwella gweithgareddau ensymau cymhleth yn y gadwyn cludo electronau (ETC) [24 ,28–30]. Yn ogystal, dangosodd astudiaethau diweddar fod STS wedi cynyddu mynegiant PGC yn sylweddol, rheolydd cadarnhaol biogenesis mitocondriaidd a chynhyrchu ATP [26], sy'n cyd-fynd â'n harsylwad in vivo. Gallai'r mecanweithiau moleciwlaidd hyn gyfrif am fynegiant sylweddol uwch o gyfadeiladau ETC mitocondriaidd I a II (NDUFB8 a SDHB yn y drefn honno) yn ein model trawsblaniad aren gyda mwy o oroesiad a swyddogaeth fel y gwelwyd mewn impiadau arennol a gedwir mewn hydoddiant PC wedi'i ychwanegu at STS.

Yn seiliedig ar ein canlyniadau in vitro, penderfynasom ymchwilio i weld a yw effaith amddiffynnol STS yn berthnasol in vivo gan ddefnyddio model trawsblannu lle mae IRI oer yn cyfrannu'n fawr at gamweithrediad impiad a chymhlethdodau cynyddol ar ôl trawsblannu. Mae ein canfyddiadau'n dangos bod SCS hirfaith (24 h) o impiadau arennol mewn hydoddiant PC wedi'i atodi â STS yn gwella'n sylweddol ansawdd a swyddogaeth impiad a nodweddir gan ostyngiad mewn lefelau creatinin serwm a BUN, allbwn wrin uwch, a goroesiad derbynnydd hir o'i gymharu â impiadau a gedwir mewn datrysiad PC yn unig. . Mae'n bwysig nodi bod uniongyrchedd allbwn wrin hyd yn oed ar ôl trawsblaniad aren clinigol yn ganlyniad hanfodol sy'n penderfynu a oes angen dialysis i fynd i'r afael â gweithrediad impiad gohiriedig (DGF). Felly, mae ein harsylwad bod STS yn cynyddu allbwn wrin yn syth ar ôl trawsblannu a'i fod yn debyg i'r grŵp Sham ar POD 14 yn ganfyddiad addawol. Roedd y gwelliant a welwyd mewn swyddogaeth arennol ar ôl trawsblannu impiadau a gadwyd mewn hydoddiant PC wedi'i ychwanegu at STS hefyd yn rhoi mantais goroesi sylweddol. Yn feintiol, estynnodd ychwanegiad STS oes yr impiad fel bod 83 y cant (5/6) o lygod mawr a dderbyniodd PC ynghyd â impiadau STS wedi goroesi tan POD 14 (diwrnod yr aberth) o gymharu â dim ond 12.5 y cant (1/8) o lygod mawr a dderbyniodd grafftiau wedi'u cadw mewn hydoddiant PC heb ychwanegiad STS. Mae'r canfyddiad hwn o'r astudiaeth bresennol hefyd yn cyd-fynd â'n hastudiaeth flaenorol, lle mai dim ond 14 y cant (1 allan o 7) o lygod mawr derbyniol impiadau a gadwyd mewn toddiant PC am 24 h heb ychwanegiad H2S (GYY4137), a oroesodd tan POD 14 [20] .

Yn ogystal â dangos gwelliant mewn paramedrau swyddogaeth arennol, roedd ychwanegiad STS hefyd yn atal apoptosis impiad arennol a llid trwy is-reoleiddio mynegiant meinwe genynnau pro-apoptotig a pro-llidiol tra ar yr un pryd yn uwch-reoleiddio genynnau gwrth-apoptotig a lleihau CD68- macroffagau positif a Niwtroffiliau MPO-positif, a arweiniodd yn gyfan gwbl at lai o fynegiant KIM-1 ac ATN ac yn y pen draw cadw morffoleg arennol. Mae'n hysbys bod y cytocinau llidiol hyn yn gyfryngwyr marwolaeth celloedd yn ystod IRI oer [31], ac mae eu gostyngiad mewn impiadau PC a STS yn debygol oherwydd nodweddion adnabyddus STS i leihau athreiddedd endothelaidd mewn monolayer endothelaidd fasgwlaidd, cynhyrchu cytocin gwanhau. , ac yn ysgogi cynhyrchu cytocinau gwrthlidiol [32]. Hefyd, mae ein canfyddiad bod atodiad STS i ddatrysiad PC yn is-reoleiddio mynegiant genynnau pro-llidiol yn cyfateb i astudiaeth flaenorol ar weithgaredd gwrthlidiol STS trwy leihau lefelau TNF- ac IL-6 mewn clefydau niwrolegol [33] ,34]. Yn fecanyddol, mae STS yn anactifadu caspase-3 trwy gysylltu â'i safle gweithredol trwy fondiau hydrogen cryf a thrwy hynny atal mynediad i swbstrad naturiol i'r safle actif, gan atal apoptosis yn y pen draw [35]. Mae STS hefyd yn rhwystro actifadu JNK, protein sy'n chwarae rhan hanfodol mewn signalau apoptotig [35], sy'n cefnogi ein canfyddiad ar effaith is-reoleiddio STS ar caspase3 a JNK. Fodd bynnag, ni allwn benderfynu a yw mecanweithiau o'r fath yn weithredol yn yr astudiaeth bresennol gan na wnaethom gynnal arbrofion ychwanegol i archwilio'r mecanweithiau moleciwlaidd hyn.

Cyfyngiad mawr ar ein harbrawf in vitro yw ein her dechnegol o ddefnyddio'r tymheredd cadw safonol presennol 4 ◦C [36], gan mai'r 10 ◦C a ddefnyddiwyd gennym oedd y tymheredd isaf y gellid ei gyflawni'n dechnolegol heb beryglu'r amgylchedd hypocsig. Mae hyn yn wahaniaeth gwirioneddol o ran prosesau ffisiolegol cellog a hefyd mewn technegau cadw. Ateb posibl yw defnyddio hypocsia a achosir yn gemegol mewn bag plastig a'i roi mewn oergell 4 ◦C er mwyn adlewyrchu gosodiadau clinigol SCS. Fodd bynnag, dyluniwyd y bagiau cynhyrchu atmosffer anaerobig hyn i'w defnyddio ar dymheredd cynnes (21-37 ◦C) gan fod y cyfansoddion cemegol sy'n ysgogi'r amgylchedd hypocsig yn gweithredu o dan yr amod hwnnw. Dylai astudiaethau yn y dyfodol anelu at optimeiddio'r tymheredd yn y siambr hypocsia i ddynwared gosodiadau SCS clinigol. Bydd cyrraedd tymheredd cyson o 4 ◦C heb beryglu amgylchedd hypocsig yn ein galluogi i benderfynu a yw'r ffenoteipiau a arsylwyd yn y model IRI oer in vitro arbrofol yn cael eu mynegi'n gyson. Ar wahân i'r arbrawf in vitro, nid yw ein model trawsblannu llygod mawr hefyd heb unrhyw anfantais. Gwnaethom gyflawni trawsblaniad aren syngeneig (rhoddwyr a derbynwyr sy'n union yr un fath yn enetig â chydnawsedd imiwnolegol), sydd ond yn berthnasol i efeilliaid union yr un fath mewn trawsblaniadau aren clinigol, tra bod y rhan fwyaf o drawsblaniadau arennau clinigol yn alugenig (rhoddwyr a derbynwyr genetig gwahanol). Mae'r trawsblaniad allogeneig yn gorfodi derbynwyr trawsblaniadau i gael profion imiwnolegol cyn trawsblannu i nodi antigenau leukocyte dynol y rhoddwr (HLA; moleciwlau sy'n ysgogi a rheoleiddio ymateb imiwn), pennu cydnawsedd imiwnolegol rhwng rhoddwyr a derbynwyr, ac osgoi gwrthod organau [37,38]. Dylai astudiaethau yn y dyfodol sy'n defnyddio STS ystyried trawsblannu allogeneig. Model trawsblannu aren cyfyngu arall yw'r ffaith ein bod yn canolbwyntio ar roddwyr byw, mae impiadau is-optimaidd o roddwyr ar ôl marwolaeth cardiaidd (DCD) yn dod yn fwyfwy cyffredin fel ffynhonnell arennau rhoddwyr mewn llawer o ganolfannau trawsblannu ledled y byd [39]. Mae DCD yn datgelu organau rhoddwr i wahanol gyfnodau o isgemia cynnes yn ogystal ag amseroedd isgemia oer yn ystod SCS, ac mae'n gysylltiedig â chyfraddau uwch o DGF a llai o gyfraddau goroesi impiad o'i gymharu â rhoddwyr byw [40]. Felly, dylai astudiaethau yn y dyfodol ystyried model trawsblannu aren DCD i asesu effaith STS yn erbyn IRI yn y model hwn.

I gloi, mae ein hastudiaeth yn dangos bod ychwanegu at ateb cadw safonol gyda chyffur rhoddwr H2S sy'n glinigol hyfyw yn ystod SCS hir o impiadau arennol yn amddiffyn rhag IRI arennol oer a achosir gan drawsblaniad, yn gwella ansawdd impiad cyffredinol a swyddogaeth impiad, ac yn ymestyn goroesiad derbynwyr trawsblaniad. O ystyried bod y risg o DGF yn cynyddu gydag amser isgemia oer hir mewn trawsblaniad aren clinigol, sy'n codi pryder clinigol mawr, mae'r sylw bod STS yn amddiffyn impiadau arennol yn ystod SCS hir ac yn atal DGF ar ôl trawsblannu yn darparu addewid clinigol gwych a allai leihau neu atal y clefyd. nifer yr achosion o DGF mewn trawsblaniadau arennau clinigol yn y dyfodol agos. Felly, gallai budd ychwanegu STS at atebion cadwraeth yn y dyfodol fod yn ateb posibl i'r mater parhaus hwn. Yn gyffredinol, mae'r astudiaeth hon yn ychwanegu at y corff cynyddol o lenyddiaeth sy'n cefnogi effeithiau cytoprotective STS a rhoddwyr H2S eraill yn erbyn IRI organau, yn enwedig gwella canlyniadau impiad mewn IRI arennol oer a achosir gan drawsblaniad. Gallai'r strategaethau hyn hwyluso'r defnydd o fwy o impiadau sy'n agored i gyfnodau hir o isgemia oer, a allai gynyddu'r gronfa o organau trawsblannu.

Datganiad cyfraniad awduraeth CRediT

Mae pob awdur wedi cytuno i gyflwyno'r llawysgrif hon. Nid oes unrhyw wrthdaro buddiannau.

Cyfeiriadau

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., Cymhariaeth o farwolaethau ym mhob claf ar ddialysis, cleifion ar ddialysis sy'n aros am drawsblaniad, a derbynwyr trawsblaniad cadaverig cyntaf, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, et al., Adolygiad systematig: trawsblannu aren o'i gymharu â dialysis mewn canlyniadau clinigol berthnasol, Am. J. Trawspl. 11(10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Cost-effeithiolrwydd trawsblannu aren o DCD yn yr Eidal, Trawsblannu. Proc. 46(10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Isgemia- anaf atdlifiad, Eur. J. Trawma Emerg. Surg. 33(6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Cadw organau: cysyniadau cyfredol a strategaethau newydd ar gyfer y degawd nesaf, Transfus. Med. Hemor. 38(2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Isgemia oer a llai o oroesiad hirdymor o alografftiau arennol cadaverig, Kidney Int. 65(2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Effeithiau mawr o oedi wrth swyddogaeth impiad ac amser isgemia oer ar oroesiad alograft arennol, Nephrol. Deialwch. Trawsblannu. 21(6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Effaith amser isgemia oer ar oroesiad impiad ymhlith derbynwyr trawsblaniad ECD: dadansoddiad arennau pâr, Am. J. Trawsblaniad. 11(12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Ffactorau risg derbynnydd sy'n gysylltiedig â swyddogaeth impiad oedi: dadansoddiad arennau pâr, Trawsblannu 91 (6) (2011) 666-671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr’ebern-Launay, et al., Mae pob awr ychwanegol o amser isgemia oer yn cynyddu’n sylweddol y risg o fethiant impiad a marwolaethau ar ôl trawsblannu arennau, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, gwrthocsidyddion wedi'u targedu Mitochondria: persbectifau yn y dyfodol mewn anaf arennau isgemia-atlif, Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Straen ocsideiddiol a achosir gan orlwytho calsiwm mitocondriaidd, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Rôl mitocondria mewn anaf isgemia/atlifiad, Trawsblannu 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Rôl sy'n dod i'r amlwg o drosglwyddyddion nwy mewn trawsblannu arennau, Am. J. Trawsblaniad. 13(12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Hydrogen sylffid a signalau cell: chwaraewr tîm neu ganolwr? Physiol Planhigion. Biocemeg. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, Effaith vasorelaxant H(2)S fel agorwr sianel K(ATP) nwyol mewndarddol newydd, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., Triniaeth sylffid hydrogen yn lliniaru anaf allograft arennol isgemia-atlifiad yn ystod storio oer ac yn gwella swyddogaeth trawsblaniad cynnar yr arennau a goroesiad yn dilyn trawsblaniad arennol allogeneig, J. Urol. 194(6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, sylffid hydrogen atodol yn amddiffyn swyddogaeth trawsblaniad arennau ac yn ymestyn goroesiad derbynnydd ar ôl anaf hirfaith isgemia-atlifiad oer trwy liniaru apoptosis impiad arennol a llid, BJU Int. 110 (11 Rhan C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Mae Hydrogen Sulfide yn amddiffyn impiadau arennol rhag anaf hirfaith oer isgemia-atlifiad trwy weithredoedd mitocondriaidd penodol, Am. J. Trawsblaniad. 17(2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Sodiwm thiosylffad ar gyfer gwenwyno cyanid acíwt: astudiaeth mewn model llygod mawr, Ann. Pharm. Mae Tad. 63(2) (2005) 154–161. [21] Mae N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, et al., Sodiwm thiosylffad yn amddiffyn rhag nam arennol yn dilyn cemotherapi intraperitoneol hyperthermig (HIPEC) gyda Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37(1) (2020) 897–902.