Mae sbermidin yn Lliniaru Plant Newydd-anedig a Achosir gan Hypocsia Mewngroth i Ddifrod Mitocondriaidd Myocardaidd mewn Llygod Mawr Trwy Atal Straen Ocsidiol A Rheoleiddio Rheoli Ansawdd Mitocondriaidd Rhan 1

Haniaethol

Cefndir: Mae hypocsia mewngroth (IUH) yn cynyddu'r risg o glefydau cardiofasgwlaidd mewn epil. Fel sborionwr rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), mae polyamine spermidine (SPD) yn hanfodol ar gyfer goroesiad a thwf embryonig a ffetws. Fodd bynnag, mae angen astudiaethau pellach ar amddiffyn SPD a mecanweithiau ar gyfer niwed i'r galon a achosir gan IUH mewn epil.

Gall glycoside cistanche hefyd gynyddu gweithgaredd SOD ym meinweoedd y galon a'r afu, a lleihau'n sylweddol y cynnwys lipofuscin a MDA ym mhob meinwe, gan ysbeilio radicalau ocsigen adweithiol amrywiol (OH-, H₂O₂, ac ati) yn effeithiol a diogelu rhag difrod DNA a achosir. gan OH-radicaliaid. Mae gan glycosidau ffenylethanoid Cistanche allu sborionu radicalau rhydd, gallu lleihau uwch na fitamin C, gwella gweithgaredd SOD mewn ataliad sberm, lleihau cynnwys MDA, a chael effaith amddiffynnol benodol ar swyddogaeth pilen sberm. Gall polysacaridau cistanche wella gweithgaredd SOD a GSH-Px mewn erythrocytes a meinweoedd yr ysgyfaint llygod senescent arbrofol a achosir gan D-galactos, yn ogystal â lleihau cynnwys MDA a cholagen yn yr ysgyfaint a phlasma, a chynyddu cynnwys elastin, wedi effaith sborion dda ar DPPH, ymestyn amser hypocsia mewn llygod senescent, gwella gweithgaredd SOD mewn serwm, ac oedi dirywiad ffisiolegol yr ysgyfaint mewn llygod senescent arbrofol Gyda dirywiad morffolegol cellog, mae arbrofion wedi dangos bod gan Cistanche y gallu gwrthocsidiol da ac mae ganddo'r potensial i fod yn gyffur i atal a thrin clefydau heneiddio'r croen. Ar yr un pryd, mae gan echinacoside yn Cistanche allu sylweddol i ysbeilio radicalau rhydd DPPH ac mae ganddo'r gallu i ysbeilio rhywogaethau ocsigen adweithiol ac atal diraddio colagen a achosir gan radical rhad ac am ddim, ac mae hefyd yn cael effaith atgyweirio da ar ddifrod anion radical rhad ac am ddim thymin.

Cliciwch ar Cistanches Herba Ar gyfer Gwrth-heneiddio

【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Amcanion: Nod yr astudiaeth hon oedd ymchwilio i effeithiau ataliol triniaeth SPD cyn-geni ar niwed i'r galon a achosir gan IUH mewn llygod mawr epil newydd-anedig a'i fecanwaith sylfaenol cysylltiedig â mitocondriaidd.

Dulliau: Sefydlwyd model llygod mawr IUH trwy ddod i gysylltiad â 10 y cant O2 saith diwrnod cyn y tymor. Yn y cyfamser, am saith diwrnod, rhoddwyd SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip) i'r llygod mawr beichiog. Aberthwyd y llygod mawr epil undydd i asesu nifer o baramedrau, gan gynnwys datblygiad twf, niwed i'r galon, amlhau cardiomyocytes, straen ocsideiddiol myocardaidd, apoptosis celloedd, a swyddogaeth mitocondriaidd, ac mae ganddynt reolaeth ansawdd mitocondriaidd (MQC), gan gynnwys mitophagy, biogenesis mitocondriaidd, a ymasiad/ymholltiad mitocondriaidd. Mewn arbrofion in vitro, roedd cardiomyocytes cynradd yn destun hypocsia gyda neu heb SPD am 24 awr.

Canlyniadau: Gostyngodd IUH bwysau'r corff, pwysau'r galon, mynegiant cardiaidd Ki67, gweithgaredd SOD, a'r lefelau CAT ac adenosine 5'- triphosphate (ATP) a chynyddodd y mynegiant BAX/BCL2 a niferoedd niwclysau TUNEL-positif. Ymhellach, achosodd IUH annormaledd adeiledd mitocondriaidd, camweithrediad, a llai o mitoffagi (lleihad yn nifer y mitoffagosomau), llai o fiogenesis mitocondriaidd (llai o fynegiant SIRT-1, PGC-1, NRF-2), a TFAM), ac wedi arwain at anghydbwysedd ymholltiad/fusion (canran uwch o ddarnau mitocondriaidd, mwy o fynegiant DRP1, a llai o fynegiant MFN2) yn y myocardiwm. Yn syndod, roedd triniaeth SPD wedi normaleiddio'r amrywiadau yn y paramedrau a achosir gan IUH. At hynny, roedd SPD hefyd yn atal croniad ROS a achosir gan hypocsia, pydredd potensial pilen mitocondriaidd, a'r gostyngiad mitophagi mewn cardiomyocytes.

Casgliad: Achosodd triniaeth SPD mamol niwed i'r galon a achosir gan IUH mewn llygod mawr epil newydd-anedig trwy wella swyddogaeth mitocondriaidd myocardaidd trwy wrth-ocsidiad a gwrth-apoptosis, a rheoleiddio MQC.

1. Cefndir

Mae astudiaethau epidemiolegol ac anifeiliaid yn dangos bod amgylchedd mewngroth adv se yn gysylltiedig â risg uwch o glefydau cardiofasgwlaidd pan fyddant yn oedolion (1). Gall hypocsia cyn-geni, yr amgylchedd mewngroth anffafriol mwyaf cyffredin, wneud y ffetws yn methu â gwireddu ei botensial twf a bennir yn enetig, a amlygir fel arafu twf ac anaf i swyddogaeth organau yn y gwanwyn(2). Mae hypocsia ffetws cronig yn aml yn deillio o feichiogrwydd gyda mwy o ymwrthedd fasgwlaidd brych fel cyn-clampsia, rhyng-beichiogrwydd ar uchder uchel, neu glefydau anadlol mamol. Yn fwy arwyddocaol, mae un rhan o dair ohonynt yn cael eu heffeithio gan syndrom hypoventilation apnoea cwsg rhwystrol (OSAHS) ar ddiwedd beichiogrwydd, ac mae hefyd yn gysylltiedig â datblygiad syndrom gorbwysedd beichiogrwydd. Y mwyaf hanfodol pathoffisiolegol changechangeSAHS yw hypocsia ysbeidiol cronig (3, 4). Mewn sawl model anifeiliaid, mae hypocsig mewngroth (IUH) yn arwain at ostyngiad mewn effeithlonrwydd cardiaidd, camweithrediad diastolig a systolig, twf hypertroffig, llai o ymlediad cardiomyocyte, ac oedi wrth aeddfedu cardiomyocyte yn y ffetws a'r galon newyddenedigol, gan gynyddu'r risg o anhwylderau'r galon mewn plant sy'n oedolion ( 5). Gall effaith rhaglennu hypocsia cronig esbonio'r mecanwaith yn bennaf ar gamau hanfodol datblygiad y galon, sy'n arwain at wella straen ocsideiddiol cardiaidd a chynnydd apoptosis celloedd mewn epil (6-9). Mae con pt rhaglennu datblygiadol yn gwneud synnwyr oherwydd bod ein ffisioleg yn llawer mwy hydrin a phlastig yn ystod bywyd cynnar. Mae'r cyflwr mewngroth yn pennu ac yn rhaglennu cysyniadau ffisioleg a metabolaeth ein bywyd. Yn unol â hynny, mae ymateb addasol y ffetws i IUH yn arwain at ddatblygiad clefydau cardiofasgwlaidd oedolion (10). Mae mitocondria yn organynnau cymhleth sy'n chwarae rhan hanfodol mewn cynhyrchu ynni cellog a llu o ddigwyddiadau signalau seler. Mae cyfanrwydd strwythurol a swyddogaethol mitocondria yn hanfodol ar gyfer goroesiad cardiomyocytes, a phan gaiff ei beryglu, mae tarfu ar homeostasis mit-hondrial yn arwain at ddatblygiad clefydau carac. Yn ddiweddar, mae sawl astudiaeth wedi canolbwyntio ar rôl camweithrediad mitocondriaidd sy'n achosi hypocsia cyn-geni wrth gyfryngu niwed i'r galon i blant. Adroddwyd bod nam ar y swyddogaeth mitocondriaidd honno, a bod mynegiant sawl rheol mol mitocondriaidd wedi newid y galon amenedigol a oedd yn agored i IUH (11). Ar ben hynny, mae IUH yn arwain at lai o weithgaredd enz e cymhleth mitocondriaidd a chamweithrediad sleis y galon mewn epil eithaf yn dilyn isgemia myocardaidd (12). Yn unol â hynny, nod yr astudiaeth hon oedd darganfod y cyswllt moleciwlaidd amo hypocsia cyn-geni, straen ocsideiddiol, gweithredu dys mitocondriaidd, ac anaf i'r galon mewn plant newydd (13).

Mae datblygiad ac aeddfediad y system mitocondriaidd cyfaint uchel hon yn y myocardiwm yn digwydd yn bennaf yn y cyfnodau datblygu amenedigol ac ôl-enedigol, yn bennaf oherwydd y newid metabolaidd cardiaidd o ddefnyddio glwcos o asidau brasterog ar gyfer y genhedlaeth adenosine 5'-triffosffad (ATP) ar ôl genedigaeth. (14). Mae tystiolaeth sy'n dod i'r amlwg yn awgrymu bod mecanweithiau rheoli ansawdd mitocondriaidd (MQC) yn benderfynyddion hanfodol ar gyfer aeddfedu cardiomyocytes (15). Mae rheoli ansawdd mitocondriaidd, gan gynnwys biogenesis mitocondriaidd yn bennaf, mitochondrial ynghyd â deinameg, rhwydwaith rheoleiddio wedi'i diwnio'n fanwl, yn trefnu maint ac ansawdd mitocondria ac yn gwella swyddogaeth mitocondriaidd a goroesiad cardiomyocyte o dan amodau straen (16). Mae coactivator 1 (PGC-1) ​​derbynyddion amlhau-actifadu peroxisome (PPAR ) yn chwarae rhan hanfodol wrth yrru biogenesis mitocondriaidd a gweithrediad yn y galon (17). Peroxisome proliferators-activate derbynyddion coactivator 1 / (-/-) calonnau llygod arddangos y llofnodion f y diffyg aeddfedu ac annormaledd difrifol mewn swyddogaeth mitocondriaidd a dwysedd ( 18 ). Ar ben hynny, mae dileu'r cyfryngwr mitophagi Parkin yn atal aeddfedu mitocondria morffolegol a swyddogaethol yn y cyfnod newyddenedigol (19). Mae mitocondria yn organynnau deinamig iawn, sy'n mynd trwy ddigwyddiadau ymholltiad ac ymasiad cyson sy'n gysylltiedig â'u swyddogaeth. Ar ddiwedd y cyfnod embryonig, mae abladiad genetig car ac-benodol o ymasiad mitocondriaidd pro yn MFN1 a MFN2 mewn llygod yn arddangos camweithrediad mitocondriaidd difrifol ar ôl genedigaeth ac yn datblygu cardiomyopathi (20). Yn drawiadol, datgelodd astudiaeth ddiweddar fod hyp ia cronig yn amharu ar ddeinameg mitocondriaidd ym mlaenebrain gui a mochyn ffetws (21). Yn unol â hynny, gall MQC fod yn ganolbwynt yn natblygiad anafiadau myocardiwm yn epil newyddenedigol IUH. Fodd bynnag, ychydig a wyddom am effeithiau hypocsia cyn-geni ar y system cardiaidd MQC newyddenedigol ac effaith camweithrediad MQC ar iechyd y galon newyddenedigol. Cymerodd yr astudiaeth hon drosodd y genhadaeth hon i archwilio'r mecanwaith cysylltiedig â mitocondriaidd o niwed myocardaidd a achosir gan IUH mewn epil newydd ac archwilio ymhellach strategaethau ataliol i leihau anafiadau cardiaidd IUH.

Mae polyamines (PAs), gan gynnwys pydresgîn (PU), sbermidin (SPD), a sbermin (SP), yn bresennol ym mron pob organeb fyw ac maent yn hanfodol ar gyfer goroesiad embryonig a ffetws, twf a datblygiad (22-24). . Canfu astudiaethau y gall defaid sy'n agored i IUH wella dysplasia embryonig trwy ychwanegu at polyamines alldarddol (25, 26). Ar ben hynny, mae'r corff cynyddol o lenyddiaeth yn nodi rôl polyamines wrth chwilio am radicalau rhydd ac amddiffyn DNA, proteinau a lipidau rhag difrod niweidiol straen ocsideiddiol. Datgelir hefyd bod ychwanegiad polyamine yn cynyddu'r oes mewn organebau model trwy geisiau gwrthocsidiol, gwrthlidiol a mitoffagi (27-29). Mae astudiaethau diweddar wedi dogfennu bod rhoi hwb i SPD mewn diet yn cardioprotective ac yn ymestyn hyd oes llygod a bodau dynol trwy ysgogi meitoffagi a resbiradaeth mitocondriaidd a gwella gweithrediad y galon (30, 31). Yn bwysicach fyth, fe wnaethom adrodd yn flaenorol bod amlygiad hypocsig mamau yn ystod cyfnodau hwyr datblygiad y ffetws wedi arwain at restr ana wedi'i ddadio a mwy o gataboledd polyamines ym meinwe carac llygod mawr newydd-anedig. Fe wnaeth SPD atal anaf i'r galon mewn llygod mawr epil diwrnod gwenwynig a oedd yn agored i IUH trwy atal crybwylliad mitocondriaidd (32).

2. Amcanion

Yn yr astudiaeth hon, rhagdybir bod IUH yn achosi diffygion strwythur a swyddogaeth mitocondriaidd trwy gynyddu straen ocsideiddiol a dinistrio'r mecanwaith MQC yng nghalon yr epil newydd-anedig, a thybir bod triniaeth SPD mamol yn y groth yn lleihau anaf myocardaidd trwy leihau rhaglen ddatblygu mitocondria. Gall yr astudiaeth hon gyfrannu at ddatblygiad strategaethau ataliol neu therapiwtig ar gyfer epil IUH i atal clefydau cardiofasgwlaidd oedolion.

3. Dulliau

3.1. Anifeiliaid

Prynwyd llygod mawr Wistar gwrywaidd a benywaidd (3 mis oed) oddi wrth yr Adran Anifeiliaid Labordy ym Mhrifysgol Feddygol Harbin. Cymeradwywyd yr holl weithdrefnau gan Bwyllgor Adolygu Moeseg Prifysgol Feddygol Harbin (Tsieina), a chynhaliwyd yr holl arbrofion gan ganllawiau'r Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol. Cafodd y llygod mawr â chymhareb gwrywaidd-i-benywaidd o 2:1 eu gosod ar hap mewn cawell ar gyfer paru. Perfformiwyd profion ceg y groth y diwrnod canlynol i ganfod presenoldeb sberm mewn plygiau o'r wain neu i'r wain, a gadarnhawyd fel dim-diwrnod beichiogrwydd. Cadwyd y llygod mawr beichiog mewn ystafell gyda lleithder rheoledig (60 y cant ) a thymheredd rheoledig (21 gradd ), a'r cylch tywyll golau oedd 12: 12 awr.

3.2. Model Hypocsia Mewngroth

O'r 15fed i'r 21ain diwrnod o feichiogrwydd, rhoddwyd y llygod mawr yn y grŵp hypocsia (n=10) i mewn i siambr plexiglass caeedig, eu chwistrellu ag aer a nitrogen, a'u monitro gan ddadansoddwr ocsigen (Pro OX12{{13). }}; BioSpherix, Efrog Newydd, UDA), a'i fewnanadlu â chynnwys ocsigen o 10 y cant am bedair awr y dydd. Cymerwyd y samplau gwaed rhydwelïol o'r rhydweli femoral dde, mesurwyd y gwerthoedd nwy gwaed a pH i gynnal pwysedd rhannol ocsigen arterial o 50 - 55 mmHg, cynhaliwyd dirlawnder ocsigen gwaed ar 80 - 85 y cant, a perfformiwyd gweithdrefnau penodol fel y disgrifiwyd yn flaenorol (32). Rhannwyd y llygod mawr benywaidd arbrofol ar hap yn bedwar grŵp: grŵp rheoli (rheolaeth), grŵp hypocsia mewngroth (Hpx), hypocsia mewngroth ynghyd â grŵp spermidine (Hpx-Spd), a grŵp atalyddion hypocsia mewngroth ynghyd â spermidine plws (Hpx-Spd-DFMO). ). Cafodd chwe llygoden fawr i bob grŵp eu chwistrellu'n fewnberitoneol ar 15fed - 21diwrnod y beichiogrwydd. Rhoddwyd 0.9 y cant o halwynog (1 mL/kg/d) i’r llygod mawr yn y grwpiau rheoli a Hpx, SPD (5 mg/kg/d) yn y grŵp Hpx-Spd, a SPD (5 mg/kg/d) a difuoromethy -L-ornithine (DFMO, atalydd yr ensym allweddol o synthesis polyamine ODC) (5 mg / kg / d) yn y grŵp Hpx-Spd-DFMO, yn y drefn honno. Ar ôl genedigaeth, aberthwyd 1-newydd-anedig diwrnod oed, a chafodd eu calonnau eu tynnu ar gyfer astudiaethau arbrofol dilynol.

3.3. Dadansoddiad Histolegol

Torrwyd meinwe fentriglaidd chwith y llygod mawr i drwch o <1 cm, wedi'i osod â 4 y cant o baraformaldehyde, wedi'i ddadhydradu ag alcohol, a'i fewnosod mewn paraffin. Torrwyd y paraffin wedi'i fewnosod yn dafelli 5 mm o drwch, yna ei sychu ar dymheredd popty cyson o 60 gradd, ei wyro â sylene, a'i ddilyn gan staenio hematocsilin-eosin (AU). Arsylwyd ar y tafelli meinwe i asesu'r newidiadau mewn morffoleg cardiaidd a strwythurau gyda microsgop optegol (Eclipse E200; Nikon, Tokyo, Japan).

3.4. Dadansoddiad Immunofluorescence

Perfformiwyd staenio immunofluorescence Ki67 fel y disgrifiwyd yn flaenorol (33). Yn gryno, gosodwyd meinwe fentriglaidd chwith y llygod mawr yn fformalin 4 y cant, wedi'i fewnosod mewn paraffin; dewaxing, hydradu, ac atgyweirio antigen eu cwblhau gyntaf. Cafodd y meinweoedd hynny eu rhwystro â 0.5 y cant o albwmin serwm buchol am 2 awr ac yna eu deor â Ki67 Rabbit Monoclonal Antibody (1: 100, AF1738, Beyotime, China) ar 4 gradd dros nos. Ar ôl golchi â PBS, cafodd y meinwe ei deor â fflwor Alexa wedi'i labelu Goat gwrth-gwningen IgG (1: 500, A 0468, Beyotime, Tsieina) a'i wrth-staenio â DAPI ar gyfer niwclysau. Edrychwyd ar y delweddau a'u sganio o dan ficrosgopeg confocal laser (OLYMPUS, FV1000, Japan). Defnyddiwyd y feddalwedd i ddadansoddi cydleoli'r delweddau cyfun.

3.5. Meintioli Ffibrosis

Aseswyd ffibrosis cardiaidd gan staeniad trichrome Masson. Fel y disgrifiwyd uchod, cafodd yr adrannau meinwe cardiaidd o'r llygod mawr newydd-anedig eu gwyro a'u hydradu trwy ddulliau safonol ac yna eu staenio â thrichrome Masson yn unol â'r protocolau. Defnyddiwyd dau drawstoriad nad yw'n gyfagos ar gyfer pob calon. Dadansoddwyd canran yr ardal ffibrotig yng nghyfanswm yr ardal myocardaidd fentriglaidd chwith gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. TdT-Mediated dUTP Nick End Labelu a Mesuriadau Cell Apoptotig

Defnyddiwyd assay labelu ffug diwedd dUTP (TUNEL) wedi'i gyfryngu gan TdT i bennu nifer y celloedd apoptotig yng nghalonnau llygod mawr newyddenedigol undydd. Cafodd meinweoedd y galon eu trin yn dilyn ein gweithdrefn a ddisgrifiwyd yn flaenorol gan ddefnyddio Pecyn Canfod Marwolaeth Celloedd (Roche, yr Almaen) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Gwerthuswyd tair sleid o bob bloc ar gyfer canran y celloedd apoptotig. Archwiliwyd pedwar maes sleidiau ar hap gyda chwyddhad 200 ×. Cafodd cyfanswm o 100 o gelloedd eu cyfrif ym mhob maes.

3.7. Mesur Gweithgaredd Ensym Gwrthocsidiol

Mesurwyd gweithgaredd Superoxide dismutase (SOD) a catalase (CAT) gan ddefnyddio citiau masnachol (SOD: A001-3- 1 a CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, Tsieina) gyda sbectroffotomedr (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Unol Daleithiau America). Yn ôl cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, cwblhawyd y llawdriniaeth, a mesurwyd y crynodiad protein gan ddefnyddio'r dull asid bicinchoninic (Pierce, Rockford, Unol Daleithiau) gyda albwmin serwm buchol (BSA) fel safon (34).

3.8. Mesur Cynnwys Adenosine 5'-Triphosphate

Mesurwyd cynnwys ATP mewn meinwe cardiaidd gan ddefnyddio pecyn assay ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, Tsieina). Yn ôl cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, ychwanegwyd y lysate mewn cyfrannedd yn ôl pwysau'r meinwe, ei homogeneiddio â homogenizer gwydr, ac yna ei allgyrchu ar 4 gradd 12000 g. Cymerwyd y supernatant, a chanfuwyd cynnwys ATP ym mhob sampl gyda phecyn BCA luminometer (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, UDA) (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, Tsieina). Defnyddiwyd y dull asid bicinchoninic i bennu'r crynodiad protein ac yna trosi crynodiad ATP yn brotein nmol / g.

3.9. Microsgopeg Electron Trosglwyddo

Cafodd y meinwe apigol cardiaidd ei rannu'n ddarnau bach o tua 1 mm × 1 mm × 1 mm ac yna ei osod mewn byffer ffosffad glutaraldehyde ar 4 gradd. Ar ôl dadhydradu, socian, mewnosod a staenio arferol, gwnaed y rhannau ultrathin o 50 - 70 nm. Arsylwyd uwch-strwythur y meinwe cardiaidd o dan ficrosgop electron trawsyrru (TEM) a thynnwyd llun (H600 Hitachi, Tokyo, Japan). Mapiwyd mitocondria sengl a myofilamentau o dan gyflwr chwyddiad 10000 o weithiau gyda fersiwn meddalwedd Image J 1.80 (Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol), a mesurwyd eu hardaloedd o bob calon (35). Yn y cyfamser, nodwyd darnau mitocondriaidd < 1 µm3, nad oeddent wedi'u rhannu (crwn fel arfer), a chyfrifwyd canran gyfartalog y darnau mitocondriaidd yn y maes golygfa gan ddefnyddio'r Mynegai Darnio Mitocondriaidd (MFI).

3.10. Ynysu Mitocondriaidd

Cafodd Mitocondria eu hynysu ar 4 gradd gan ddefnyddio allgyrchu gwahaniaethol gyda Phecyn Ynysu Mitocondria (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Yn fyr, torrwyd meinwe calon ffres yn ddarnau meinwe a'i centrifugio â 10 cyfrol o PBS wedi'i oeri ymlaen llaw, cafodd y supernatant ei daflu, cafodd y gwaddod ei dreulio â trypsin am 20 munud, cafodd y byffer ynysu ychwanegol A ei allgyrchu, trosglwyddwyd y supernatant i un arall tiwb, wedi'i allgyrchu eto, a'r ffracsiwn gwaddod oedd y mitocondria ynysig. Cafodd y belen mitocondriaidd cardiaidd olaf ei hail-ddarparu mewn byffer homogeneiddio, ei storio ar rew, a'i ddefnyddio ar gyfer arbrofion ar swyddogaeth resbiradaeth mitocondriaidd o fewn 4h.

3.11. Mesur Defnydd Ocsigen Mitocondriaidd

Mesurwyd y defnydd o ocsigen mitocondriaidd gan electrod ocsigen tebyg i Clark (Hansatech Instruments, Norfolk, DU) mewn byffer resbiradaeth mitocondriaidd. Defnyddiwyd Pyruvate (5 mM) a malate (5 mM) fel swbstrad ar gyfer mitocondria cymhleth sy'n cynnwys I yn y crynodiad terfynol o 500 µg protein/mL. Mesurwyd y defnydd o ocsigen wedi'i ysgogi gan ADP (anadliad cyflwr 3) ym mhresenoldeb 200 µM ADP, a chafodd defnydd ocsigen annibynnol ADP (cyflwr anadliad 4) ei fonitro. Mae'r gymhareb rheoli anadlol (RCR, cyflwr 3 wedi'i rannu â chyflwr 4) yn adlewyrchu'r defnydd o ocsigen trwy ffosfforyleiddiad (cyplu). Parhaodd y gweithdrefnau, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (36).

3.12. Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol

Cynaeafwyd y sampl o feinweoedd cardiaidd a'i storio ar -80 gradd . Cafodd meinweoedd cardiaidd fentriglaidd chwith wedi'u rhewi eu homogeneiddio mewn byffer lysis RIPA oer-iâ (Beyotime Inc., Shanghai, China P0013B). Mesurwyd y crynodiadau protein gan ddefnyddio pecyn profi protein BCA (Beyotime Inc., Shanghai, China P0006C). Gwahanwyd y samplau sy'n cynnwys cyfanswm protein gan 10 y cant (w / v) SDS-PAGE a'u trosglwyddo i bilen PVDF (Millipore, Bedford, MA, Unol Daleithiau). Defnyddiwyd y gwrthgyrff canlynol: Gwrthgyrff ar gyfer GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,13161-1- }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP), a BAX (1.1000,509599-2-Ig) eu prynu oddi wrth Proteintech (WuHan, Tsieina), BCL2 (1: 2000, sc-7382) a DRP1 (1:1000, sc-271583) eu prynu gan Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) a PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Caergrawnt, MA, DU). Daeth yr gwrthgorff eilaidd (IgG gwrth-gwningen gafr wedi'i labelu gan farch-barch) o Beyotime Corporation (Shanghai, Tsieina). Mesurwyd dwyster y bandiau protein gan ddefnyddio system delweddu gel Fluor Chem Chemiluminescence (Protein Simple, USA). Dadansoddwyd dwysedd optegol y bandiau protein gyda fersiwn meddalwedd Image J l.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Model Cardiomyocyte Hypocsig

Roedd cardiomyocytes llygod mawr newyddenedigol (NRMCs) yn cael eu hynysu a'u meithrin trwy ddulliau safonol, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (32). Yn gryno, cafodd calonnau llygod mawr newyddenedigol tridiau eu hechdynnu, eu briwio, eu diwyllio, ac yna eu treulio yn 0.25 y cant trypsin a 0.02 y cant EDTA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Ar ôl centrifugation, trosglwyddwyd y gwaddodion i DMEM wedi'i ategu â serwm llo ffetws 10 y cant (Biolot, Rwsia) a'i ddeor mewn aer llaith yn cynnwys 5 y cant 2. Dri diwrnod ar ôl cael ei hadu, gosodwyd y celloedd mewn siambr hypocsig gwydr (Biospherix OxyCycler C42 , Redfield, NY), a'i lenwi â nitrogen am 8 munud i ollwng yr ocsigen gweddilliol. Rhannwyd y cardiomyocytes hyn ar hap i'r grwpiau canlynol: (1) Grŵp rheoli (rheolaeth), celloedd wedi'u meithrin o dan amodau deor arferol; (2) grŵp hypocsia (Hpx), celloedd wedi'u gosod yn y siambr hypocsig am 24 h ac yna'n cael eu meithrin fel arfer am 24 h; (3) Grŵp Hpx-Spd, celloedd wedi'u gosod yn y siambr hypocsig a'u deor â 10 µmol/L SPD am 24 h; (4) Grŵp Hpx-SpdDFMO, celloedd wedi'u gosod mewn siambr hypocsig a'u deor â 10 µmol/L SPD ynghyd â 2 mmol/L DFMO am 24 awr.

3.14. Mesur Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol

Mesurwyd y genhedlaeth ROS gan y assay staenio dihydroethidium (DHE) (Cat Rhif S0063, Beyotime, Tsieina). Yn gryno, cafodd cardiomyocytes cynradd eu deor â 5 µmol/L DHE ar 37 gradd am 30 munud, eu golchi â PBS, ac yna eu symud o dan y microsgop i arsylwi ar y newidiadau mewn dwyster fflworoleuedd. Cymerwyd delweddau gyda microsgop fflworoleuedd Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japan) ar donfedd cyffro o 535 nm, a'r donfedd allyriadau uchaf oedd 610 nm, n> 20 cell fesul grŵp.

3.15. Pennu Potensial Pilenni Mitocondriaidd

Mae'r llifyn tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) wedi'i wefru'n bositif a gellir ei leoli'n ddetholus mewn mitocondria. Fe'i defnyddir yn eang i bennu potensial pilen mitocondriaidd (∆Ψm). Yn fyr, ychwanegwyd hydoddiant gweithio staenio TMRE ar grynodiad o 200 µmol/L at y cardiomyocytes wedi'u trin wedi'u grwpio, wedi'u cymysgu'n drylwyr, a'u gosod mewn deorydd cell ar 37 gradd am 20 munud. Allsugnwyd y supernatant, a golchwyd y celloedd â PBS a'u symud i ficrosgop gwrthdro i arsylwi ar y newid mewn dwyster fflworoleuedd. Y donfedd excitation oedd 549 nm, a'r golau allyrru oedd 579 nm. Roedd dwyster fflworoleuedd coch yn dangos y newid o ∆Ψm, n > 20 cell fesul grŵp.

3.16. Arbrawf Lleoli Mitocondriaidd a Lysosomaidd

Yn ôl y cyfarwyddyd, defnyddiodd Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, China) a Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, China) y dadansoddiad colocalization mitochondrial a lysosomal. Llwythwyd NRCMs â 200 nM MitoTracker Green FM a 50 nM LysoTracker Red yn HBSS am 30 munud cyn arbrofion, golchwyd celloedd â PBS, ac yna cafwyd delweddau celloedd gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd Olympus FluoView FV1000. Defnyddiwyd y llinell laser 488 nm i gyffroi fflworoleuedd MitoTracker Green, wedi'i fesur rhwng 505 a 515 nm. Ar gyfer LysoTracker Red, defnyddiwyd y llinell laser 577 nm gyda mesuriad o 590 nm. Pennwyd troshaen dwysedd picsel coch a gwyrdd gan ddefnyddio meddalwedd meintioli ar Ficrosgop Nikon Eclipse, n > 20 cell fesul grŵp.

3.17. Dadansoddiad Ystadegol

Cymharwyd yr holl ddata o'r grwpiau arbrofol gan ddefnyddio ANOVA unffordd ac yna prawf post hoc Bonferroni gyda fersiwn meddalwedd GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) a fersiwn meddalwedd SPSS 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United). Gwladwriaethau). Mynegwyd data fel cymedr ± SEM, a gosodwyd y lefel arwyddocâd i P < 0.05.

4. Canlyniadau

4.1. Nodweddion Epil a Chalon

Mesurwyd pwysau'r corff (BW) a phwysau'r galon (HW), a chyfrifwyd y gymhareb HW i BW (HW/BW) (Ffigur 1). Dangosodd y canlyniadau fod BW a HW y llygod mawr newydd-anedig wedi gostwng, a bod eu HW/BW wedi cynyddu oherwydd hypocsia mewngroth. O'i gymharu â'r grŵp IUH, cynyddodd BW a HW llygod mawr newyddenedigol yn y grŵp SPD (P < 0.05), a gostyngodd yr HW/BW (P < 0). 05); O'i gymharu â'r grŵp SPD, gostyngodd BW a HW o'r grŵp triniaeth DFMO (P < 0.05), a chynyddodd HW/BW yn sylweddol (P < 0.05).

4.2. Effeithiau SPD ar Adeiledd Morffolegol Myocardaidd, Ymlediad Celloedd, a Ffibrosis mewn Plant Newydd-anedig sy'n Agored i

Dangosodd canlyniadau staen AU cardiaidd fod calonnau epil undydd a oedd yn agored i IUH yn dangos chwyddo a ffibrau myocardaidd wedi'u trefnu'n llac. Fodd bynnag, roedd y calonnau IUH a gafodd eu trin ag SPD yn cynnal strwythur meinwe myocardaidd derbyniol (Ffigur 2A). Nesaf, gwnaethom werthuso nifer y cardiomyocytes binuclear gyda'r sleisen meinwe AU-staen; roedd nifer y cardiomyocytes binuclear yn fwy yn y grŵp IUH nag yn y grŵp rheoli (P < 0.{5}}5). O'i gymharu â'r grŵp IUH, gostyngodd cyfran y cardiomyocytes binuclear yn y grŵp trin SPD yn sylweddol (P < 0.05); Gwanhaodd DFMO effaith SPD (P < 0.05) (Ffigur 2C). Fe wnaethom ganfod ymhellach fynegiad Ki67 (marcwr o amlhau celloedd) mewn myocardiwm llygod mawr gan ddefnyddio'r dull imiwnfflworoleuedd. Po uchaf yw mynegiant Ki67, y cryfaf yw'r fflworoleuedd pinc trwy uno coch a glas (Ffigur 2E). Dangosodd y canlyniadau, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, bod mynegiant Ki67 yn y grŵp IUH wedi gostwng yn sylweddol (P < 0.05), cynyddodd mynegiant Ki67 yn sylweddol yn dilyn y weinyddiaeth SPD (P < { { {28}}.05), a diddymwyd effaith SPD gan DFMO (P < 0.05) (Ffigur 2F). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall SPD atal tynnu'n gynnar cardiomyocytes o'r cylch celloedd a achosir gan IUH a hyrwyddo amlder cardiomyocytes yn yr epil newydd sy'n agored i IUH. Yna fe wnaethom ddefnyddio staenio Masson i ganfod y newidiadau yng nghynnwys colagen myocardaidd ac aseswyd ffibrosis myocardaidd trwy fesur arwynebedd colagen (Ffigur 2BandD). Gwelsom fod dyddodiad colagen myocardaidd yng nghalonnau'r llygod mawr newydd-anedig a oedd yn agored i IUH wedi cynyddu (P <0.05), ac roedd lefel y rhain yn uwch o gymharu â'r grŵp rheoli. I'r gwrthwyneb, gostyngodd ardal ffibrosis myocardaidd yn dilyn y driniaeth SPD yn sylweddol (P < 0.05). Fodd bynnag, o'i gymharu â'r grŵp triniaeth SPD, cynyddodd yr ardal ffibrosis yn sylweddol yn y grŵp HpxSpd-DFMO (P < 0.05).

4.3. Effeithiau sbermidin ar Adeiledd Mitocondriaidd Myocardaidd, Gweithrediad Anadlol, a Chynnwys Adenosine 5'-Triphosphate mewn Epil Newydd-anedig sy'n Agored i Hypocsia Mewngroth

Dadansoddwyd newidiadau strwythur uwch-strwythurol meinwe cardiaidd a nodweddion mitocondriaidd gan TEM (Ffigur 3A). Defnyddiwyd meddalwedd Image J i feintioli canran y cynnwys mitocondriaidd (ardal mitocondriaidd yn ardal y gell gyfan) a'r ardal mitocondriaidd (Ffigurau 3B ac C). Dangosodd y canlyniadau, yn y grŵp rheoli, fod y myofilamentau myocardaidd wedi'u trefnu'n drefnus, roedd y strwythur sarcomere yn glir, roedd y mitocondria yn gryno, roedd y matrics yn ddwysach, ac roedd y cristae mitocondrial wedi'u trefnu'n drefnus. Fodd bynnag, chwyddodd mitocondria, a gwelwyd y matrics llacio a dwysedd gostyngol mewn rhai cardiomyocytes o'r grŵp IUH. O gymharu â'r grŵp rheoli, gostyngwyd cyfran y mitocondria mewn cardiomyocytes ac ardal mitocondria (P < 0.05). Fodd bynnag, yng nghalonnau llygod mawr y driniaeth SPD, roedd y myofilamentau myocardaidd yn daclus, roedd y strwythur sarcomer yn glir, roedd y matrics mitocondriaidd yn gryno, a gostyngodd y chwydd mitocondriaidd. O'i gymharu â'r grŵp IUH, cynyddodd cyfran y mitocondria mewn cardiomyocytes (P < 0.05), a chynyddodd arwynebedd y mitocondria (P < 0.05). Ataliodd DFMO yr effeithiau hyn a achosir gan SPD (P < 0.05).

Fe wnaethom ddefnyddio pyruvate/malate fel y swbstrad i werthuso'r swyddogaeth resbiradol mitocondriaidd, gan gynnwys cyfraddau anadlol taleithiau 3 a 4 ac RCR (Ffigur 3D - F). Gwelsom, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, fod y gyfradd resbiradol yn nhaleithiau 3 a 4 ac RCR y grŵp IUH i gyd yn sylweddol is (P < 0.{{1{0}}5). Yn ddiddorol, adferodd RCR taleithiau 3 a 4 yn dilyn y driniaeth SPD (P < 0.05). Mewn cyferbyniad, cafodd yr effeithiau SPD hyn eu rhwystro'n sylweddol yn y grŵp triniaeth DFMO (P < 0.05). Yn yr un modd, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, gostyngodd y cynnwys ATP myocardaidd yn y grŵp IUH yn sylweddol (P <0.05). O'i gymharu â'r grŵp IUH, cynyddodd cynnwys ATP yn rhyfeddol yn y grŵp a driniwyd gan SPD (P < 0.05), a gwanhaodd DFMO effeithiau SPD (P < 0.05) (Ffigur 3G). Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gall SPD amddiffyn y strwythur mitocondriaidd myocardaidd a difrod swyddogaeth ac atal dirywiad y lefelau ATP mewn llygod mawr epil newyddenedigol sy'n agored i IUH.

【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】