Nodweddiad strwythurol polysacarid cistanche deserticola a'i effaith amddiffynnol ar HK -2 anaf a ysgogwyd gan glwcos

Haniaethol:

 

Amcan: Astudio strwythur polysacaridau cistanche deserticola (Cdps) ac effaith amddiffynnol a mecanwaith celloedd epithelial tiwbaidd proximal dynol (hk {{{0}}) anaf. Dulliau: Canfuwyd cyfansoddiad cemegol, pwysau moleciwlaidd, cyfansoddiad monosacarid a strwythur posibl CDPau trwy ddull ffenol asid sylffwrig, dull biphenyl hydrocsyl, dull glas gwych Coomassie, dull cromatograff ïon, cromatograffeg athreiddedd gel uchel perfformiad uchel a chromatograffeg ymyrraeth. Gwerthuswyd effaith amddiffynnol CDPau ar anaf HK -2 a'i fecanwaith trwy sefydlu model difrod o gelloedd HK -2 a achoswyd gan glwcos uchel.Results: pwysau moleciwlaidd cyfartalog CDPau oedd 8 0 31,41111111111 mannose ac arabinose, ac efallai y bydd bond -glycosidig. Gall leihau difrod ocsideiddiol celloedd HK -2 a achosir gan glwcos uchel a difrod potensial pilen mitochondrial celloedd HK -2 a achosir gan glwcos uchel. Gostyngwyd y mynegiant cymharol o brotein derbynnydd tebyg i doll 4 (TLR4) a chymhareb ffactor p -niwclear (NF) -κB p65 / -actin a p -iκB / -actin mewn celloedd HK -2 yn sylweddol ar ôl ymyrraeth gyda chrynodiadau gwahanol o Cdps1). Casgliad: Gall CDPau leihau'n uchelcell epithelial tiwbaidd arennol a achosir gan glwcosanaf trwy atal TLR4 / NF-κB i hyrwyddo amlhau celloedd ac atal straen ocsideiddiol ac apoptosis.

 

Geiriau allweddol: Cistanche deserticola polysacarid; Celloedd epithelial tiwbaidd arennol dynol; Straen ocsideiddiol; Llwybr TLR4/NF-κB

 

 

 

Cistanche ar gyfer nephropathi diabetes (dn)

 

Nephropathi Diabetes (DN)yw prif achos clefyd arennol cam olaf ac mae'n bygwth bywyd ac iechyd cleifion yn ddifrifol [1]. Mae anaf tiwbaidd arennol yn chwarae rhan allweddol wrth ddigwydd a datblygu DN. Gall annormaleddau hemodynamig, straen ocsideiddiol, ymateb llidiol, ac annormaleddau metabolaidd a achosir gan amgylchedd siwgr uchel gymell apoptosis a necrosis celloedd epithelial tiwbaidd arennol, gan arwain at ddifrod tiwbaidd arennol [2,3]. Mae TLR4 yn yr aren yn aelod o deulu TLRS, ac mae ei drosglwyddiad signal cysylltiedig yn chwarae rhan bwysig yn nigwyddiad a datblygiad DN [4]. O dan amodau glwcos uchel, gall mynegiant uchel o TLR4 yn yr aren actifadu'r llwybr NF-κB, gwaethygu difrod ocsideiddiol cellog ac achosi apoptosis celloedd HK -2 [5, 6].
Cistanches Herba yw'r coesyn cigog sych gyda dail ffosfforws o cistanche deserticola ycma a (neu) cistanche tubulosa (Schenk) Wight, planhigyn meddyginiaethol a bwytadwy traddodiadol. Yn blasu'n felys, hallt,

Mae'n cynhesu ac yn mynd i mewn i'rMeridiaid yr Aren a Choluddyn Mawr. Mae'n cael effeithiau tynhau aren yang, gwella hanfod a gwaed, a moistening y coluddion a lleddfu rhwymedd. [7] Polysacaridau yw un o brif gynhwysion gweithredol Cistanche deserticola. Mae cynnwys polysacaridau yn y darn dŵr o Cistanche deserticola yn gymharol uchel, gyda llenyddiaeth yn adrodd bod y cynnwys yn 29.598 i 39.609 mg/g [8]. Mae'n cynnwys glwcos yn bennaf, galactos, rhamnose, arabinose, ffrwctos, ac ati. Mae'n cynnwys monosacaridau ac mae ganddo lawer o effeithiau ffarmacolegol, gan gynnwys rheoleiddio gweithgaredd imiwnedd, gwrth-heneiddio, gwella dysgu a chof, amddiffyn nerfau, gwrthsefyll niwed i'r afu, gwrth-feirws, a gwrth-lwch, a 9]. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae nifer fawr o astudiaethau wedi dangos y gall polysacaridau mewn meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol wella neffropathi diabetig. Mae'r nodweddion aml-darged, aml-lwybr ac effeithiau sylweddol polysacaridau llysieuol Tsieineaidd yn dangos potensial mawr wrth ymyrryd mewn neffropathi diabetig [10]. Yn yr astudiaeth gan Wang et al. [11], dangosodd polysacaridau Banyan effeithiau sylweddol wrth wella metaboledd glwcos a lipid, lleihau ymatebion llidiol, a rheoleiddio microbiota berfeddol llygod diabetig math 2 trwy'r echel iau perfedd. Mae astudiaethau blaenorol gan y tîm ymchwil wedi dangos y gall dyfyniad dŵr cistanche deserticola gynyddu cyfradd goroesi celloedd HK -2 mewn amgylchedd siwgr uchel a braster uchel, rheoleiddio apoptosis celloedd, straen ocsideiddiol a lefelau llid, ac mae ganddo effaith therapiwtig bosibl ar nephropathy diabetig [12]. Dangosodd canlyniadau arbrofol anifeiliaid y gall CDPau wella neffropathi diabetig mewn llygod yn effeithiol, a dangosodd canlyniadau patholegol fod ffibrosis tiwbaidd arennol wedi'i wella'n sylweddol [13]. Fodd bynnag, prin yw'r astudiaethau ar rôl polysacaridau cistanche deserticola wrth amddiffyn y model celloedd HK -2 a ysgogwyd gan glwcos. Yn wyneb y gweithgaredd ffarmacolegol posibl a mecanwaith polysacaridau, nod yr astudiaeth hon yw canfod cyfansoddiad cemegol, strwythur moleciwlaidd a strwythur moleciwlaidd CDPau trwy ddefnyddio dull ffenol asid sylffwrig, dull hydroxybiphenyl, dull glas gwych Coomassie, cromatograffeg ïon a chromatograffeg infreed uchel. Dadansoddwyd y màs, cyfansoddiad monosacarid a strwythur posibl, a sefydlwyd model difrod o gelloedd HK -2 a achoswyd gan glwcos uchel i werthuso effaith amddiffynnol CDPau ar ddifrod HK -2 a'i fecanwaith gweithredu. Darparu sylfaen ddamcaniaethol a thystiolaeth arbrofol ar gyfer cymhwyso CDP posibl wrth drin DN.

1 deunydd a dulliau
1.1 deunyddiau ac offerynnau

CDPS (Cynnwys Polysacarid> 8 0%, Rhif Swp: 2306019, Cwmni Shaanxi Xintianyu); dapagliflozin (dapa, rhif swp: bms -512148, astraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); celloedd epithelial tiwbaidd arennol dynol hk -2 (rhif swp: 20231014, ACTT Company, UDA); Canolig Diwylliant MEM, serwm buchol y ffetws (rhif lot: 20231014, 20231014, Gibco Company, UDA); Byffer PBS (rhif lot: 20230906, Hyclone Company, UDA); Datrysiad treuliad trypsin sy'n cynnwys EDTA 0.25% (rhif lot: 20240411, Anhui Biosharp Company); Cck -8 Pecyn Canfod hyfywedd celloedd (rhif swp: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (mda), glutathione peroxidase
Pecyn Canfod Peroxidase, GSH-PX) (rhif swp: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Yoxuan Biotechnology Co., Ltd.); Hoechst33258 Pecyn Apoptosis Staenio (rhif swp: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); Jc -1 staenio
Pecyn canfod potensial pilen mitochondrial (rhif swp: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); DICHLOROFLUORESCEIN Diacetate (DCF-DA) Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol Cell (ROS) Adweithydd Canfod
cit (rhif lot.: 20231225, Beijing Solebow Technology Co., Ltd.); Gwrthgorff monoclonaidd TLR4, ffactor niwclear ffosfforyleiddiedig-κB p65 (ffosffo-NF-κB p65, p-NF-κB p65) gwrthgorff monoclonaidd (lot rhif: 10032512, 00128965, wuhan sany., Ltd., Ltd., Ltd., wuhan.

Cromatograff ïon ICS5000, darllenydd microplate mul-tigo (Thermo Fisher, UDA); Offeryn Electrofforesis Protein PowerPAC HC+Mini (Biorad, UDA); Microsgop gwrthdro TS2 (Nikon, Japan); Lc -10 cromatograff hylif perfformiad uchel, ri -20 synhwyrydd gwahaniaethol (Shimadzu Technology Co., Ltd., Japan); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) colofn gel tandem (cwmni BRT, y DU); Cydbwysedd electronig CPA225D, Eppendorf5424 centrifuge (Sartorius, yr Almaen).

 

1.2 Dulliau Arbrofol
1.2.1 Pennu cyfanswm siwgr, asid wronig a chynnwys protein CDPau

Dilynwyd y dull yn unol â chyfeirnod [14]. Penderfynwyd ar gyfanswm cynnwys siwgr CDPau gan y dull asid ffenol-sylffwrig; Penderfynwyd ar gynnwys asid wronig CDPau gan y dull lliwimetrig M-hydroxybiphenyl; a phennwyd cynnwys protein CDPau gan ddull glas gwych Coomassie.

 

1.2.2 Penderfyniad Màs Moleciwlaidd

Canfuwyd dosbarthiad pwysau moleciwlaidd polysacaridau gan golofnau tandem cromatograffeg athreiddedd gel perfformiad uchel. Cyfres o dextran safonol (dextran p {{{0}}, p -10, p -20, p -50, p {-100, p {-200, p} a p} a p} a p} a p} 0. 0 5 mol/l cyn ei ddefnyddio. Y crynodiad terfynol oedd 5 mg/ml, wedi'i fortecsio i doddi, a'i centrifugio ar 12 0 00 r/min am 10 munud. Cafodd yr uwchnatur ei amsugno a'i hidlo â philen microporous dŵr 0.22 μm. Ar ôl centrifugio cyflym, defnyddiwyd 0.05 mol/L NaCl fel y cyfnod symudol. Y golofn cromatograffig oedd BRT 105-103-101 (8 mm × 300 mm); Y gyfradd llif oedd 0.7 ml /min; Tymheredd y golofn: 40 gradd; Cyfrol Chwistrellu: 25 μl; Synhwyrydd: Synhwyrydd Gwahaniaethol Rid -20 a; Amser dadansoddi: 62 mun. Dewiswch y dull cromatograffig uchod i'w ddadansoddi, cael yr amser cadw, a phlotio logarithm y pwysau moleciwlaidd brig (AS) ar yr ordeiniad (LGMP) a'r amser cadw (RT) ar yr Abscissa (LGMP-RT). Cromlin Safonol: Yn ôl y dull uchod, gwnaed cromlin safonol Pwysau Moleciwlaidd Cyfartalog Pwysau (MW) LGMW-RT a'r Pwysau Moleciwlaidd Rhif Moleciwlaidd (MN) Cromlin Safonol LGMN-RT safonol i gael y pwysau moleciwlaidd. Fformiwla gyfrifo. Gan amnewid yr amser cadw sampl yn y fformiwla, gellir cael y pwysau moleciwlaidd (AS, MW, MN).

1.2.3 Cyfansoddiad monosacarid

Penderfynwyd ar y cyfansoddiad monosacarid gan ddefnyddio cromatograffeg ïon. Cymerwch symiau priodol o 16 o safonau monosacarid (fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glwcos, xylose, mannose, ffrwctos, ribose, asid galacturonig, asid glucuronig, asidau aminoglactose aminoglactose, glecosamin, glwcosamin, glwcos ychwanegwyd asid) gyda 2 ml o 3 mol/L asid trifluoroacetig (TFA), wedi'i hydroli ar 120 gradd am 3 h, ei sychu â nitrogen, a'i ychwanegu i gael gwared ar fortecs y dŵr wedi'i ddad -ddyneiddio i gymysgu'n dda a pharatoi'r toddiant stoc safonol. Cymerwch bob toddiant safonol monosacarid a pharatowch y safon crynodiad yn gywir fel y safon gymysg. Yn ôl y dull meintioli absoliwt, pennwyd masau gwahanol monosacaridau, a chyfrifwyd y gymhareb molar yn seiliedig ar fàs molar y monosacaridau.
Ychwanegwch 2 ml o 3 mol/L TFA i'r polysacarid ac ymateb ar radd 12 0 am 3 h. Yn ystod yr adwaith, defnyddiwyd N2 ar gyfer amddiffyn. Hydoddi ar ôl anweddu o dan bwysau llai. Ychwanegwch 5 ml o ddŵr a fortecs i'w gymysgu. Cymerwch 5 0 µl ac ychwanegwch 950 µl o ddŵr wedi'i ddad -ddyneiddio. Centrifuge yn RPM am 5 munud. Cafodd yr uwchnatur ei hidlo trwy bilen microfiltration 0.22 µm a'i ddadansoddi gan gromatograffaeth ïon. Y golofn oedd Dionex carbopactm PA20 (3 mm × 150 mm); Y cam symudol oedd: H2O; B: 15 mol/lnaOH; C: 15 mol/ l NaOH & 100 mol/ l NaAC; Cyfradd Llif: 0.3 ml/min; Cyfaint y pigiad: 25 µl; Tymheredd y golofn: 30 gradd ;. Synhwyrydd: synhwyrydd electrocemegol; graddiant elution gweler Tabl 1.

 

Tabl 1 Tabl Elution Graddiant Cyfnod Symudol

 

 

1.2.4 Canfod Sbectrwm Is -goch

Pwyswch 1 mg o polysacarid sych a phowdr KBR, eu malu a'u cymysgu mewn morter, a'u pwyso i mewn i gynfasau tenau gan ddefnyddio gwasg llechen. Gwnaed y dadansoddiad gan ddefnyddio sbectromedr is -goch trawsnewid Fourier yn yr ystod rhif tonnau o 4500 ~ 400cm -1.

 

1.2.5 Effaith amddiffynnol CDPS ar gelloedd HK -2 a achosir gan glwcos mewn neffropathi diabetig

1.2.5.1 hk -2 diwylliant celloedd

Ar ôl i gelloedd HK {{0}} gael eu hadfywio, fe'u diwylliwyd mewn cyfrwng cyflawn MEM yn cynnwys serwm buchol y ffetws 10% ac 1% gwrthgorff dwbl, a gosodwyd y celloedd mewn deorydd diwylliant celloedd ar 37 gradd, 5% CO2 a lleithder dirlawn i lynu wrth y wal. . Pan fydd y celloedd yn tyfu i 80% i 90%, cânt eu treulio gyda 0.25% trypsin ac isddiwylliant. Defnyddiwyd celloedd HK -2 yn y cyfnod twf logarithmig ar gyfer arbrofion dilynol.

 

1.2.5.2 Paratoi toddiant stoc CDPS a chrynodiad dosio.

Pwyso'n gywir 3 0 mg o CDPS, ychwanegwch 6 ml o gyfrwng cyflawn MEM uchel-glwcos i baratoi datrysiad stoc 5 mg/ml CDPS, a'i storio mewn oergell 4 gradd. Wrth ddefnyddio, mesurwch gyfaint benodol o doddiant mam CDP, ychwanegwch gyfrwng diwylliant, cymysgu'n dda, sterileiddio â hidlydd di -haint 0.22 µm, a pharatoi toddiant sampl o grynodiad priodol.

 

1.2.5.3 Effeithiau Cdps ar gelloedd HK -2 arferol

Hk -2 Cafodd celloedd yn y cyfnod twf logarithmig eu hadu mewn platiau 96- ffynnon ar ddwysedd o 3000 o gelloedd/ffynnon. Yn ôl y canlyniadau arbrofol rhagarweiniol, rhannwyd y celloedd yn grŵp rheoli arferol (grŵp rheoli, CON), crynodiadau màs gwahanol (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/mL)
Sefydlwyd grŵp gwag yn cynnwys dim ond cyfrwng diwylliant; Ar ôl diwyllio â diwylliant cyfrwng neu gyffuriau am 24 h a 48 h, ychwanegwyd 100 μl o gyfrwng diwylliant sy'n cynnwys 10% cck -8 at bob ffynnon a deorwyd y celloedd ar 37 gradd er mwyn osgoi caniatâd yn y golau am 1.5 h. Mesurwyd dwysedd optegol (OD) pob ffynnon ar donfedd o 450 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate, a chyfrifwyd hyfywedd celloedd (%) yn ôl y fformiwla "hyfywedd celloedd (%)=[(OD o gyffur ffynnon - OD o grwpiau gwag yn dda) (OD o reoli a gwerthuso" Od o wallt " cyffuriau i gelloedd arferol.

1.2.5.4 hk -2 amser modelu glwcos uchel celloedd a sgrinio crynodiad
Paratowch doddiant stoc glwcos (glwcos, GLC) (10 mg/mL) a'i wanhau â chrynodiadau diwylliant cyflawn i fodelu o 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, ac 80 mmol/L yn y drefn honno i'w ddefnyddio. Cafodd hk -2 celloedd yng nghyfnod twf logarithmig eu hadu mewn platiau ffynnon 96- ar 3000/ffynnon, ac roedd con, grŵp model (model, mod), a grŵp addasu gwag yn cael eu sefydlu ac yn cael cyfrwng diwylliant diwylliant cyflawn cyfrwng diwylliant glwcos uchel o wahanol grynodiadau gwahanol, yn y drefn honno. , yr un faint o gyfrwng diwylliant cyflawn, diwylliant ar gyfer 24 h a 48 h, a chanfod hyfywedd celloedd yn ôl y dull o dan "1.2.5.3".

 

1.2.5.5 Effaith CDPS ar gyfradd goroesi celloedd model

Yn ôl canlyniadau arbrofol "1.2.5.4", cafodd hk -2 celloedd yn y cyfnod twf logarithmig eu hadu mewn platiau ffynnon 96- ar ddwysedd o 3000 o gelloedd y ffynnon. Rhannwyd y celloedd yn con, mod, a chrynodiadau màs gwahanol o 50, 100, a 200 diwylliwyd y celloedd ar 400 ug/mL, 400 ug/mL, ac 800 ug/ml CDP. Sefydlwyd grŵp addasu gwag heb gelloedd. Ychwanegwyd y grwpiau addasu con a gwag gyda swm cyfartal o gyfrwng cyflawn. Ychwanegwyd MOD a phob grŵp wedi'u trin â chyffuriau gyda 60 mmol/L GLC a'u diwyllio am 24 h. , taflu'r cyfrwng diwylliant, ychwanegu cyffuriau a diwylliant cyfrwng diwylliant neu gyfatebol am 24 h a 48 h, a chanfod y gyfradd goroesi celloedd yn unol â'r dull o dan "1.2.5.3".

 

1.2.5.6 Effeithiau CDPau ar ddangosyddion straen ocsideiddiol mewn celloedd model

Yn ôl canlyniadau'r arbrawf yn "1.2.5.5", rhannwyd y celloedd yn grŵp CON, MOD, DOSE CDPS UCHEL (CDPS-H, 400 mg/kg), grŵp CDPau dos canol (CDPS- M, 200 mg/kg), grŵp Cdps dos isel (CDPS-l, 100 mg/kg) a dapagin a dapagin, a dapagin, a dapagin, a dapagin, a dapaglozin, a dapagin, a dapaglozin, a dapagin, 10 μ) I fyny yn y grŵp addasu sero, ar ôl modelu, ychwanegwyd a diwylliwyd cyffuriau cyfrwng neu gyfatebol am 24 h. Casglwyd proteinau a normaleiddiwyd y lysates i'r un lefel gan gywiro crynodiad protein. Yn ôl cyfarwyddiadau pob pecyn dangosydd, canfuwyd yr MDA, cynnwys GSH-PX a gweithgaredd SOD ym mhob grŵp o gelloedd.

 

1.2.5.7 Canfod ROS mewn celloedd hk -2

Ychwanegwch yr ataliad cell i blât 6- yn dda a'i roi mewn deorydd diwylliant celloedd nes bod y celloedd yn tyfu i fod yn monolayer ac yn derbyn ysgogiad cyfatebol. Golchwch y celloedd 3 gwaith gyda PBS wedi'i oeri ymlaen llaw a'i wanhau â chyfrwng MEM heb serwm. Gwanhawyd llifyn fflwroleuol DCF-DA i grynodiad terfynol o 10 µmol/L. Ychwanegwyd y llifyn at blât 6- yn dda, golchwyd y celloedd 3 gwaith gyda PBS wedi'i oeri ymlaen llaw, a gwanhawyd y llifyn fflwroleuol DCFH-DA i grynodiad terfynol o 10 µmol/L gyda chyfrwng MEM heb serwm. µmol/L, ychwanegwyd y llifyn at blât 6- yn dda, cafodd y llifyn ei daflu, golchwyd y celloedd dair gwaith gyda chyfrwng mem heb serwm, ac yna casglwyd delweddau o dan ficrosgop fflwroleuedd.