Astudio ar effaith acteoside (cynhwysyn gweithredol yn Cistanche deserticola) ar NAFLD trwy gymell autophagy

Haniaethol:

 

Amcan:Archwilio swyddogaeth ysgogi autophagy acteoside cynhwysyn actif (ACT) yn Cistanche deserticola a'i effaith ar glefyd yr afu brasterog di-alcohol (NAFLD).

DdulliauI gymryd echinacoside a gweithredu fel gwrthrychau ymchwil, cyfunwyd 1 {0 0 μmol/L ac echinacoside (ECH) ag atalydd awtophagy-lysosom bleomycin A1 ar gyfer triniaeth ymyrraeth. Defnyddiwyd immunoblotting protein i ganfod lefel mynegiant cymharol marc autophagy protein protein microtubule cysylltiedig â phrotein 1 cadwyn ysgafn 3 (lc 3- ii). Ymyrrwyd celloedd HepG2 â chrynodiadau gwahanol o ACT in vitro, a chanfuwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio'r dull halen tetrazolium. Ymyrraeth vitro celloedd HepG2 gyda chrynodiadau gwahanol o ACT wedi'u cyfuno â balofloxacin A1, a chanfod technoleg protein LC {{9} II. Defnyddiwyd model NAFLD a adeiladwyd yn vitro gydag ymyrraeth cyffuriau i staenio defnynnau lipid gan ddefnyddio dull staenio olew O olew a chanfod lefelau triglyserid mewngellol. Arsylwch leoleiddio protein LC3 a defnynnau lipid trwy dechnoleg immunofluorescence. Gall Deddf Canlyniadau gymell autophagy yn sylweddol mewn celloedd HepG2, ac mae lefel mynegiant protein LC 3- II yn cael ei gynyddu'n sylweddol o'i gymharu â'r grŵp rheoli (wedi'i drin â ACT yn unig) (1.36 ± 0. 11, 0 2, 28}}}}}. yn y drefn honno), gydag arwyddocâd ystadegol (P0.05). Mae Deddf 50 μmol/L yn ysgogi autophagy yn sylweddol mewn celloedd HepG2, a chynyddwyd lefel mynegiant protein LC 3- II yn sylweddol (1.83 ± 0.53, 0.35 ± 0.18, yn y drefn honno). Roedd lefel TG celloedd HepG2 yn y grŵp ymyrraeth ACT (19.11 ± 1.68) yn sylweddol is na'r lefel yn y grŵp model celloedd in vitro NAFLD (34.15 ± 1.90), ac roedd y gwahaniaethau'n ystadegol arwyddocaol (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Geiriau allweddol:Clefyd yr afu brasterog di -alcohol;Cistanche Deserticola;Acteosid; Autophagy

 

Tcm perlysiau cistanche ar gyfer trin clefyd yr afu brasterog di-alcohol (NAFLD)

Cliciwch y llun i gael mwy o fanylion

 

Yn ystod yr ychydig ddegawdau diwethaf, brasterog di-alcoholclefyd yr afu(NAFLD) wedi dod y mwyaf cyffredinClefyd cronig yr afu, gyda mynychder byd -eang o oddeutu 25% o'r boblogaeth oedolion, ac fe'i hystyrir yn gysylltiedig yn agos â syndrom metabolig [1]. Er bod y tebygolrwydd o gymhlethdodau sy'n gysylltiedig â'r afu mewn cleifion NAFLD yn llai na 10%, mae NAFLD yn ffactor risg ar gyfer afiechydon sy'n gysylltiedig â'r afu fel sirosis a chanser cynradd yr afu, sy'n gosod baich economaidd enfawr ar gleifion [{2-5]. Er gwaethaf y sylw cynyddol a roddwyd i NAFLD, nid yw NAFLD fel clefyd cronig pwysig wedi cael digon o sylw. Felly, mae dealltwriaeth fanwl bellach o bathogenesis NAFLD a chwilio am strategaethau triniaeth effeithiol wedi dod yn broblemau brys i'w datrys [6-7].

Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod autophagy cellog yn chwarae rhan bwysig mewn ffisioleg afu a phatholeg [8]. Mae camweithrediad autophagy neu ddysregulation yn gysylltiedig ag amrywiaeth o afiechydon yr afu felClefyd yr afu sy'n gysylltiedig ag alcohol[9], NAFLD [10], steatohepatitis di-alcohol [11], a charsinoma hepatocellular [12]. Nodweddion patholegol NAFLD yw dyddodiad gormodol o driglyseridau (TG) a defnynnau lipid niwtral eraill (LD) mewn hepatocytes o dan ysgogiad di-alcohol. Ar gyfer yr afu, y ddau brif lwybr sy'n rheoleiddio cataboliaeth yr LDs hyn yw lipolysis ac autophagy.
Mae'r llwybr lipolysis yn cael ei reoleiddio gan lipasau niwtral cytoplasmig, megis lipas sy'n sensitif i hormonau a lipas TG adipose. Yn y llwybr lipoautophagy cyfatebol, gellir cymryd LDS yn ddetholus trwy recriwtio proteinau sy'n gysylltiedig ag autophagy yn uniongyrchol i ffurfio autophagosomau, ac yna mae'r LDS sydd wedi'u crynhoi gan autophagosomau yn cael eu danfon ymhellach i lysosomau a'u dadelfennu gan lipas asid mewn lysosomau. Felly, mae actifadu lipoautophagy mewn hepatocytes wedi dod yn strategaeth effeithiol ar gyfer atal a thrin NAFLD.
Mae Cistanche Deserticola yn feddyginiaeth lysieuol Tsieineaidd gwerthfawr sydd wedi'i defnyddio'n helaeth mewn ymarfer clinigol mewn fformwlâu meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol. Ar yr un pryd, mae wedi cael ei ddefnyddio ers amser maith fel ychwanegiad bwyd iechyd. Mae Cistanche Deserticola yn cynnwys amrywiaeth o gynhwysion bioactif, a'r pwysicaf ohonynt yw glycosidau phenylethanol cistanche deserticola. Fel cynrychiolwyr glycosidau phenylethanoid, adroddwyd bod gan echinacoside (ECH) a verbascoside (ACT) lawer o weithgareddau biolegol pwysig, megis gwrthocsidydd, niwroprotective, imiwnomodulatory, ac amddiffyn yr afu [13]. O ran amddiffyn yr afu, mae astudiaethau wedi canfod y gall ECH amddiffyn yr afu trwy leihau cyfryngwyr llidiol, atal trawsnewid ffactor twf-, a lleihau lefel mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â ffibrosis yr afu. Mae ACT yn cael effaith amddiffynnol sylweddol ar ddifrod cemegol a chyffuriau a achosir gan yr afu, fel alcohol, tetrachlorid carbon, a lipopolysacarid. Mae ACT yn lleihau straen ocsideiddiol a achosir gan gemegau gwenwynig, yn cael gwared ar ocsigen adweithiol a gronnwyd yn yr afu, ac yn lleihau crynodiad malondialdehyde. Ar yr un pryd, mae'n cynyddu gweithgaredd dismutase superoxide yr afu yn sylweddol ac yn lleihau cynnwys glutathione, ac yn gwella difrod histopatholegol yr afu ac apoptosis yn sylweddol. Fodd bynnag, nid oes adroddiad llenyddiaeth berthnasol ynghylch a yw glycosidau phenylethanoid Cistanche deserticola yn rhan o'r broses o autophagy wrth weithredu amddiffyn yr afu. Yn seiliedig ar hyn, defnyddiodd yr astudiaeth hon ddulliau bioleg celloedd confensiynol a model celloedd in vitro i archwilio effaith ysgogol autophagy yn rhagarweiniol glycosidau phenylethanoid cistanche deserticola ac archwilio ei swyddogaethau ffarmacolegol posibl, gan anelu at ddarparu sylfaen wyddonol ar gyfer datblygu cyffuriau yn y dyfodol.

 

1 deunydd a dulliau

1.1 deunyddiau

1.1.1 Pynciau Ymchwil Defnyddiwyd ECH ac ACT fel pynciau ymchwil.

1.1.2 Deunyddiau Prynwyd celloedd HepG2 gan Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (rhif swp: B21209) a Deddf (rhif swp: B20715, purdeb HPLC sy'n fwy na neu'n hafal i 98%). Prynwyd byffer, a thrypsin gan Hyclone Company, UDA, prynwyd serwm buchol y ffetws (rhif swp: 04-002-1 a) gan gwmni BI, Israel, Penicillin/Streptomycin (rhif swp: Sv30010.01) Prynwyd gan y Cwmni Sole, MeChated (MECTCHED METCH: MATTATH CWMNI, MATTATCH. Prynwyd Beijing, China, TG (rhif swp: BC0625) Pecyn Canfod gan Gwmni Solebao, Beijing, China, Olew Coch O (rhif lot: o 0625-100 g), dimethyl sulfoxide (rhif lot: BCBZ1685). Prynwyd yr atalydd autophagy-lysosome bafilomycin A1 (BAFA1, rhif lot: TLRL-BAF1) gan Invitrogen, UDA; Prynwyd yr ysgogydd autophagy rapamycin (rhif lot: S17098) gan Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., China; Protein Cysylltiedig â Microtubule 1 Cadwyn Ysgafn 3 (LC3, Rhif Lot: L7543, Rhywogaethau: Cwningen, Cymhareb Gwanhau: 1: {1 000) a -actin (rhif lot: zrb1312, rhywogaethau: rabbit, usa o sigma: 1:}}}}}}}}}} gwrthgorff eilaidd wedi'i labelu gan berocsidase (rhif lot: {4010-05, rhywogaethau: gafr gwrth-gwningen, cymhareb gwanhau: 1: {1 000) Prynwyd Prynwyd 1: 1000) gan Sigma-Aldrich Company, UDA, a Bodipy 493/501 (rhif lot: D3922) Prynwyd gan Invitrogen Company, UDA.

 

1.2 Dulliau

1.2.1 Diwylliant Cell

Tyfwyd celloedd HepG2 yng nghanolig glwcos uchel eryr wedi'i addasu Dulbecco sy'n cynnwys serwm buchol y ffetws 10%, penisilin 100 U/mL a 100 ug/ml streptomycin mewn deorydd 37 gradd, 5% carbon deuocsid. Pan gyrhaeddodd cydlifiad y gell 85%, perfformiwyd isddiwylliant, platio, ymyrraeth a gweithrediadau eraill.

 

1.2.2 Canfod Immunoblotting Protein

1.2.2.1 Triniaeth Deddf ac ECH

LC 3- ⅱ Gall lefel mynegiant protein mewn celloedd HepG2 BAFA1, fel atalydd pwmp proton, achosi protein LC 3- ⅱ i agregu mewn meintiau mawr mewn celloedd, a thrwy hynny ymhelaethu ar y gallu ymsefydlu awtophagy. Felly, gellir defnyddio'r defnydd cyfun o BAFA1 fel system monitro autophagy i werthuso'r gallu sefydlu autophagy. Trosglwyddwyd celloedd HepG2 yn y cyfnod twf logarithmig i seigiau diwylliant celloedd 3.5 cm ar gyfer diwylliant dros nos. Defnyddiwyd Deddf 100 μmol/L, ECH a BAFA1 ar gyfer ymyrraeth am 12 h. Golchwyd y celloedd gyda hydoddiant byffer ffosffad wedi'i oeri ymlaen llaw (PBS) a'u gorchuddio ar unwaith mewn byffer lysis protein RIPA am 10 munud. Cafodd yr uwchnatur ei centrifugio a phennwyd cyfanswm y crynodiad protein gan ddefnyddio pecyn assay crynodiad protein asid bicinchoninig. Ar ôl meintioli gyda byffer sylffad sodiwm dodecyl, cynheswyd y sampl ar 95 gradd am 10 munud i ddadnatureiddio'r protein. Yna cymerwyd 30 μl o'r sampl gyda micropipette a'i electrofforestio ar gel polyacrylamid.
Ar ôl yr electrofforesis, trosglwyddwyd y protein o'r gel i bilen nitrocellwlos, ei rwystro ag 1 0% llaeth dros nos, ei ddeor â gwrthgorff sylfaenol penodol ar dymheredd yr ystafell am 1 h, wedi'i olchi â byffer ffosffad sy'n cynnwys 0.5% triton, a thymheredd penodol. Defnyddiwyd y dull ECL ar gyfer datblygu lliw. Fe'u gosodwyd fel Blank Control Group, Rapamycin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamycin+BAFA1 Group, ECH+BAFA1 Group a Grŵp ACT+BAFA1.

 

1.2.2.2 Roedd crynodiadau gwahanol o ACT yn ymyrryd â lefel mynegiant protein lc 3- ⅱ mewn celloedd Hepg2

Trosglwyddwyd y celloedd cyfnod twf logarithmig HepG2 i seigiau diwylliant celloedd 3.5 cm ar gyfer diwylliant dros nos, a defnyddiwyd Deddf 25, 50, a 100 μmol/L wedi'u cyfuno â BAFA1 ar gyfer triniaeth ymyrraeth am 12 h, a chanfuwyd lefel mynegiant protein LC 3- ⅱ gan brotein gan protein. Sefydlwyd y grŵp con grŵp, rheolaeth wag), grŵp newyn (grŵp STA, celloedd Hepg2 triniaeth newyn), 25, 50, a grŵp Deddf 100 μmol/L, a BAFA1 ynghyd â grŵp ACT 25, 50, a 100 μmol/L ACT.

1.2.3 Dull MTT i ganfod cyfradd goroesi celloedd HepG2 sy'n cael eu trin â chrynodiadau gwahanol o ACT ar gyfer 24 a 48 h
Cafodd celloedd HepG2 yn y cyfnod twf logarithmig eu brechu mewn plât 96- yn dda gyda dwysedd brechiad cymedrol a'u diwyllio mewn deorydd am 12 h. Ychwanegwyd 2 0, 40, 60, 80, a 100 μmol/L am 24 a 48 h. Ychwanegwyd toddiant 0.5 mg/ml MTT mewn amgylchedd tywyll a'i ddeor mewn deorydd. Ar ôl 4 h, cafodd yr uwchnatur ei daflu, ychwanegwyd 100 μl o sylffocsid dimethyl at bob ffynnon, a chafodd y celloedd eu hysgwyd mewn ysgydwr tymheredd cyson ar 37 gradd am 10 munud. Canfuwyd y gwerth dwysedd optegol (OD) ar donfedd o 490 nm gan farciwr ensym, a chyfrifwyd cyfradd goroesi celloedd.

 

1.2.4 Adeiladu in vitro o fodel celloedd NAFLD

Roedd pwysau penodol o asid palmitig (PA) yn cael ei bwyso a'i doddi'n llawn mewn cyfaint penodol o isopropanol i baratoi toddiant stoc 100 mmol/L PA, a rannwyd a storiwyd wedyn mewn oergell gradd -20 i'w defnyddio'n ddiweddarach. Gwanhawyd yr hydoddiant stoc PA i 100 μmol/L gan ddefnyddio cyfrwng diwylliant cyflawn, ac ychwanegwyd 1% albwmin serwm buchol heb asid brasterog. Deorwyd y celloedd ar 37 gradd am 3 h i baratoi'r toddiant sefydlu. Trosglwyddwyd celloedd HepG2 yn y cyfnod twf logarithmig i ddysgl diwylliant celloedd 3.5 cm ar ddwysedd priodol ar gyfer diwylliant dros nos, ac yna defnyddiwyd yr ateb ymsefydlu a baratowyd ar gyfer ymyrraeth.

 

1.2.5 Ymyrraeth ACT NAFLD Model Cell in vitro Canfod TG a staenio olew O olew

 

1.2.5.1 Canfod TG

Trosglwyddwyd celloedd HepG2 yn y cyfnod twf logarithmig i ddysgl diwylliant celloedd 3.5 cm ar gyfer diwylliant yn ôl y grŵp rheoli gwag, grŵp model a grŵp ymyrraeth ACT. Cafodd y grŵp model ei gymell gyda datrysiad ymsefydlu 100 μmol/L PA, ac achoswyd grŵp ymyrraeth ACT gyda datrysiad ymsefydlu 100 μmol/L PA ac ychwanegwyd Deddf 50 μmol/L ar yr un pryd. Yr amser ymyrraeth oedd 24 h. Tynnwch yr hen gyfrwng diwylliant yn ysgafn, golchwch wyneb y gell yn araf gyda PBS wedi'i oeri ymlaen llaw unwaith, ychwanegwch 100 μl/dysgl o doddiant lysis ripa wedi'i oeri ymlaen llaw, lyse llawn ar rew am 15 munud, centrifuge ar 4 gradd a 12 000 r/min am 10 mun, casglwch y supernation, cymryd 10 μl, cymryd am enzymatic ar gyfer enzymatig ar gyfer enzymatict I'r cyfarwyddiadau cit TG, ac yn olaf cywiro'r lefel TG fesul mg o brotein.

1.2.5.2 Olew Coch O Staenio

Trosglwyddwyd celloedd HepG2 yn y cyfnod twf logarithmig i ddysgl ddiwylliant 3.5 cm wedi'i gorchuddio â slip gorchudd di -haint ar gyfer diwylliant dros nos. Fe wnaeth 100 μmol/L PA ysgogi'r celloedd i ffurfio defnynnau lipid. Ar yr un pryd, ychwanegwyd Deddf 50 μmol/L ar gyfer ymyrraeth am 24 h.
Casglwyd y sleidiau celloedd, eu golchi 3 gwaith gyda PBS wedi'u hoeri ymlaen llaw, wedi'u gosod â fformaldehyd 4% ar dymheredd yr ystafell am 10 munud, golchi wyneb y gell gyda PBS, ychwanegu'r toddiant gweithio olew wedi'i baratoi o staenio o staenio, wedi'i staenio ar dymheredd yr ystafell yn y tywyllwch yn y tywyllwch am 15 munud, alltudio toddiant dwbl, rannu â 60% gyda gormodedd, golchi toddiant yn cael ei ddistyllu, ei olchi. dŵr distyll, a'i selio, a thynnu llun o dan ficrosgop.

 

1.2.6 Arsylwi armunofluorescence ar autophagosomau a defnynnau lipid ar ôl triniaeth ACT

Trosglwyddwyd celloedd HepG2 yn y cyfnod twf logarithmig i ddysgl ddiwylliant 3.5 cm wedi'i gorchuddio â slip gorchudd di -haint ar gyfer diwylliant dros nos. Defnyddiwyd 1 0 0 μmol/L PA i gymell ffurfio defnynnau lipid yn y celloedd. Ar yr un pryd, ychwanegwyd ACT ar gyfer triniaeth ymyrraeth am 24 h. Casglwyd y sleidiau celloedd, eu golchi 3 gwaith gyda PBS wedi'u hoeri ymlaen llaw, wedi'u gosod ar dymheredd yr ystafell am 10 munud gyda fformaldehyd 4%, wedi'i athreiddio ar dymheredd yr ystafell am 15 munud gyda byffer athreiddiad sy'n cynnwys 0.1% saponin, wedi'i rwystro ar dymheredd yr ystafell am 1 h gyda serwm gafr, golchi casu ar dymheredd. PBS, a'i ychwanegu gyda gwrthgorff eilaidd penodol wedi'i labelu â fflwroleuol, wedi'i ddeor ar dymheredd yr ystafell ac i ffwrdd o olau am 1 h. Ar ôl y deori gwrthgorff, golchwyd y sleidiau 3 gwaith gyda PBS, eu gwrth-ddal â stiliwr lipid defnyn-benodol corff 493/503 ar dymheredd yr ystafell am 10 munud, ei olchi â PBS, a'i selio â chyfrwng selio gwrth-pylu, wedi'i sychu'n aer yn y tywyllwch, a welwyd gyda chyfaddawd laser, a chofnodi microsgop, a chofnodi. Gosodwyd y grŵp rheoli gwag, grŵp triniaeth rapamycin a grŵp ymyrraeth ACT.

 

1.3 Dadansoddiad Ystadegol

SPSS25. 0 Defnyddiwyd meddalwedd ystadegol ar gyfer dadansoddi data. Mynegwyd y data meintiol fel x ± s. Defnyddiwyd dadansoddiad unffordd o amrywiant a phrawf LSD-T. P<0.05 was considered statistically significant.