Imiwnedd Synergaidd ac Amddiffyniad mewn Llygod Trwy Gyd-Imiwneiddio Gyda Brechlynnau DNA Yn Amgodio'r Protein Sbigyn A Phroteinau Strwythurol Eraill SARS-CoV-2

Crynodeb:Mae ymddangosiad amrywiadau newydd o coronafeirws syndrom anadlol acíwt difrifol 2 (SARS CoV-2) wedi arwain at achosion o heintiau sy'n digwydd dro ar ôl tro ledled y byd. Mae'r amrywiadau hynod dreigledig hyn yn lleihau effeithiolrwydd brechlynnau clefyd coronafeirws 2019 (COVID-19) cyfredol, sydd wedi'u cynllunio i dargedu protein pigyn (S) y firws gwreiddiol yn unig. Ac eithrio S o SARS-CoV-2, mae potensial imiwn-amddiffynnol proteinau adeileddol eraill (nucleocapsid, N; amlen, E; bilen, M) fel antigenau targed brechlyn yn dal yn aneglur ac yn haeddu ymchwiliad. Yn yr astudiaeth hon, datblygwyd brechlynnau DNA synthetig yn amgodio pedwar protein strwythurol SARS-CoV (pS, pN, pE, a pM), a chafodd llygod eu himiwneiddio â thri dos trwy chwistrelliad mewngyhyrol ac electroporation. Yn nodedig, fe wnaeth cyd-imiwneiddio â dau frechlyn DNA a fynegodd y proteinau S ac N achosi gwrthgyrff niwtraleiddio uwch ac roedd yn fwy effeithiol wrth leihau llwyth firaol SARS-CoV-2 na'r protein S yn unig mewn llygod. Yn ogystal, arweiniodd cyd-imiwneiddiad pS gyda naill ai pN neu pE + pM imiwnedd cellog uwch-benodol i brotein S ar ôl tri imiwneiddiad ac achosodd newidiadau histopatholegol mwynach na pS yn unig ar ôl yr her. Dylid ymchwilio ymhellach i rôl proteinau strwythurol gwarchodedig SARS-CoV-2, gan gynnwys y proteinau N/E/M, i’w cymhwyso wrth ddylunio brechlynnau, megis brechlynnau mRNA.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Geiriau allweddol: COVID{0}}; SARS-CoV-2}}; cyd-imiwneiddio; brechlyn DNA; protein pigyn; protein strwythurol

1. Rhagymadrodd

Coronafeirws syndrom anadlol acíwt difrifol 2 (SARS-CoV-2) yw achos clefyd coronafeirws 2019 (COVID-19), sydd wedi achosi miliynau o heintiau a marwolaethau ledled y byd ac sydd wedi peryglu iechyd pobl a'r economi fyd-eang . Er nad yw dulliau therapiwtig effeithiol ar gael o hyd, maent wedi datblygu'n gyflym, gan gynnwys cymhwyso therapi celloedd CAR-T a nanotechnoleg [1,2]. Mae brechu yn ffordd effeithiol o reoli'r pandemig, ac mae sawl brechlyn wedi'u cymeradwyo i'w defnyddio gan wahanol gyrff iechyd rheoleiddiol [3,4]. Mae'r genom coronafirws yn amgodio pedwar prif brotein strwythurol, sef y proteinau pigyn (S), niwcleocapsid (N), bilen (M), ac amlen (E), sy'n gyfrifol am gydosod firion ac atal ymateb imiwn y gwesteiwr [5 ]. Mae'r protein S yn cynnwys 1273 o weddillion asid amino sy'n cynnwys dwy is-uned, sef S1 a S2. Mae'n cyfryngu mynediad firaol ac mae'n darged mawr ar gyfer datblygu brechlynnau coronafirws [6-11]. Fodd bynnag, mae gan y protein SARS-CoV-2 S amledd treiglo uchel. Nid yw'n syndod, yn SARS-CoV-2, firws RNA, mae'r treiglad yn barhaus ac yn anochel. Mae pum amrywiad SARS-CoV-2 sy’n peri pryder (VOC) wedi dod i’r amlwg ers mis Medi 2020, gan gynnwys B.1.1.7 (DU, Alpha), B.1.351 (De Affrica, Beta), T.1 (Brasil, Gama), B.1.617.2 (India, Delta), a B.1.1.529 (De Affrica, Omicron) (Andreano a Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Mae ganddyn nhw i gyd sawl treiglad yn y protein pigyn [12]. Mae'r amrywiadau hyn yn bygwth effeithiolrwydd brechlynnau COVID-19 cyfredol, sydd wedi'u cynllunio i dargedu'r protein pigyn yn unig.

Mae protein N SARS-CoV-2 yn rhwymo i RNA firaol trwy barth rhwymo RNA-amino-asid-hir 140- yn eu craidd mewn modd "glain ar linyn". Mae'n cael ei warchod yn fawr ymhlith coronafirysau, gan rannu hunaniaeth dilyniant ~ 90% â hunaniaeth SARS-CoV, a hwn hefyd yw'r unig brotein strwythurol y tu mewn i'r virion [13]. Yn ogystal, mae'n chwarae rhan bwysig wrth becynnu RNA firaol i'r cymhleth capsid ribonucleo ac mae'n angenrheidiol ar gyfer dyblygu RNA firaol, cydosod virion, a rhyddhau o gelloedd cynnal [14]. Yn seiliedig ar debygrwydd dilyniant uchel y protein N mewn coronafirysau, gellir ei awgrymu fel targed brechlyn traws-amddiffyn. Gwelsom yn flaenorol fod cyd-imiwneiddio â dau frechlyn DNA sy'n mynegi proteinau E ac M yn darparu amddiffyniad rhannol rhag SARS-CoV-2, a dylid ystyried y dull hwn wrth ddatblygu brechlynnau [15]. Yn dibynnu ar y ddogfen dirwedd gan Sefydliad Iechyd y Byd, fel arfer mae saith strategaeth ar gyfer ymgeiswyr brechlyn SARS-CoV, y gellir eu rhannu ymhellach yn dri chategori: brechlynnau cyntaf, seiliedig ar brotein, gan gynnwys brechlynnau firws anweithredol, tebyg i firws gronynnau, a brechlynnau is-uned protein; yn ail, brechlynnau sy'n seiliedig ar genynnau, gan gynnwys brechlynnau fector firws, brechlynnau DNA, a brechlynnau mRNA; yn drydydd, cyfuniad o ddulliau seiliedig ar brotein a genynnau, megis brechlynnau firws a wanhawyd yn fyw. Gall technolegau DNA, fel strategaethau brechlyn newydd yn seiliedig ar genynnau, gymharu ymgeiswyr a strategaethau brechlyn lluosog yn gyflym yn ystod profion rhag-glinigol [16,17]. Yn ddamcaniaethol, mae bron pob protein firaol yn dargedau posibl imiwnogenau a brechlynnau. Fodd bynnag, hyd eithaf ein gwybodaeth, nid yw imiwnogenigrwydd a photensial amddiffynnol brechlynnau DNA synthetig wrth amgodio proteinau SARS-CoV-2 S a phroteinau strwythurol eraill wedi'u hadrodd yn systematig eto. Gwerthuswyd pedwar brechlyn DNA yn mynegi proteinau SARS-CoV-2 S, N, E, ac M l am eu imiwnogenedd a'u heffeithiolrwydd amddiffynnol mewn llygod i archwilio effeithiau imiwnolegol S ar y cyd â phroteinau strwythurol eraill.

2. Defnyddiau a Dulliau

2.1. Celloedd

Cafodd celloedd Huh7.5 a chelloedd 293T arennau embryonig dynol eu meithrin ar 37 ◦C mewn awyrgylch llaith ar 5% CO2 trwy gydol yr astudiaeth. Cafodd y celloedd eu meithrin mewn cyfrwng DMEM (HyClone, Logan, UT, UDA), ynghyd â 10% FBS (GEMINI Co., Shanghai, China) ac 1% penisilin-streptomycin (Gibco, Efrog Newydd, NY, UDA). Cadarnhawyd bod pob llinell gell yn negyddol ar gyfer halogiad mycoplasma.

2.2. Adeiladu Codio Brechlynnau DNA SARS-CoV-2 S/N/E/M

Cafodd y genyn amgodio protein SARS-CoV-2 S/N, sy'n cynnwys dilyniant Kozak N-terminal (GCCACC) ac yna codon cychwyn (ATG), ei syntheseiddio gan ddefnyddio codon wedi'i optimeiddio gan famaliaid (GenScript Co., Nanjing , Tsieina). Yna cafodd ei glonio i'r fector mynegiant pcDNA3.1 (+) trwy dreulio EcoRI a XbaI a'i enwi'n PS/pN (brechlynnau DNA) (Ffigur 1A). Cafodd y protein pE / PM ei adeiladu a'i nodi fel y disgrifiwyd yn flaenorol [15]. Paratowyd brechlynnau gan ddefnyddio citiau Maxiprep di-endocsin (Qiagen, Beijing, Tsieina), a chadarnhawyd dilyniannau gan ddefnyddio dilyniannu DNA Sanger. Cadarnhawyd mynegiant y protein S/N gan ddefnyddio blotio gorllewinol a gwrth-S (Sino Biological, Beijing, China)/gwrthgyrff gwrth-N wedi'u gwanhau am 1:1000. Cynhaliwyd yr arbrofion hyn fel y disgrifiwyd yn flaenorol [15,18].

Ffigur 1. Dyluniad a mynegiant lluniadau brechlyn protein S/N ailgyfunol SARS-CoV-2 S/N. (A) Diagram sgematig o'r brechlynnau ailgyfunol seiliedig ar DNA sy'n amgodio SARS-CoV-2 pigyn (PS), niwcleocapsid (pN), amlen (pE), a/neu broteinau pilen (PM). (B) Dilyswyd y mynegiant protein targed mewn brechlynnau DNA trwy ddadansoddiad blot gorllewinol o 293 o gelloedd T a drawsluniwyd â'r plasmidau PS/pN/PE/PM.

2.3. Imiwneiddio a Her

Roedd llygod BALB/c benywaidd (Charles River Laboratories, Ffrainc) yn 6 wythnos oed yn cael eu cartrefu yn y Sefydliad Cenedlaethol dros Iechyd Galwedigaethol a Rheoli Gwenwyn mewn amgylchedd 21 ◦C a lleithder a reolir gyda chylchoedd golau/tywyll 12 h. Yn y cyfamser, darparwyd bwyd a dŵr ad libitum, a chymeradwywyd yr holl arbrofion anifeiliaid gan Bwyllgor Moeseg Arbrofion Anifeiliaid y Ganolfan Tsieineaidd ar gyfer Rheoli ac Atal Clefydau (China CDC). Roedd yr ymchwil yn cydymffurfio â'r rheoliadau moesegol perthnasol.

Rhannwyd llygod ar hap yn bum grŵp a'u himiwneiddio â pS/pN yn unig neu eu cyd-imiwneiddio â pS + pN neu pS + pE + PM ar ddiwrnodau 0, 21, a 42 trwy chwistrelliad mewngyhyrol ynghyd ag electroporation (35 mg/50 mL) (Ffigur 2) [19,20]. Yn gryno, cafodd brechlynnau DNA eu chwistrellu i mewn i'r cyhyr tibialis anterior (TA) a'u curo'n syth â thrydan gan ddefnyddio electrod arae dwy nodwydd 5 mm ar wahân (ECM830; BTX) gyda nodwyddau. Casglwyd sera o'r llygod ar gyfer dadansoddiad ymateb imiwn humoral, a phroseswyd dueg y llygoden i fesur yr ymateb imiwn cellog (Ffigur 2).

Ffigur 2. Sgematig yr her imiwneiddio a SARS-CoV-2. Cwrs amser o frechu, herio, a samplu gwaed/meinwe. Rhannwyd llygod BALB/C ar hap yn grwpiau.

Cynhaliwyd arbrofion her SARS-CoV-2 fel y disgrifiwyd yn flaenorol [15,21]. Yn gryno, cafodd y llygod eu hanestheteiddio ac yna eu trawsgludo’n fewnnasol gyda 2.5 × 108 PFU o Ad5-hACE2 mewn cyfanswm cyfaint o 45 µL. Bum diwrnod ar ôl y trawsgludiad, cafodd y llygod eu hanestheteiddio ac yna eu herio'n fewnnasol gyda 1 × 105 TCID50 o SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) mewn cyfanswm cyfaint o 50 µL o halwynog byffer. Perfformiwyd yr holl waith gyda SARS-CoV-2 byw mewn modelau llygoden mewn labordai Bioddiogelwch Anifeiliaid Lefel 3 (ABSL-3).

2.4. Assay Imiwnosorbent Cysylltiedig ag Ensym

Cynhaliwyd profion imiwnosorbent sy'n gysylltiedig ag ensymau (ELISA) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [15]. Yn gryno, cafodd proteinau S (a brynwyd o Sino Biological)/N (rhodd gan Song) wedi'u gwanhau mewn byffer carbonad (0.1 M, pH 9.6) eu gorchuddio ar 96-blatiau EIA/RIA ffynnon (Thermo). Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) dros nos am 4 ◦C. Cafodd y platiau eu rhwystro gyda 200 µL o serwm gafr 10% mewn PBS ar 37 ◦C am 2 awr, ac yna golchi bum gwaith gyda PBST. Yna, ychwanegwyd samplau serwm wedi'u gwanhau'n gyfresol mewn serwm gafr 2% yn PBS a'u deor am 2 awr ar 37 ◦C, ac yna pum golchiad gyda PBST. Ychwanegwyd gwrth-lygoden gafr cyfun HRP IgG Ab (1:5000) ar 37 ◦C am 1 h. Ychwanegwyd cyfanswm o 100 µL o swbstrad TMB at bob ffynnon a'i ddiffodd gyda 50 µL o 2M H2SO4. Darllenwyd yr amsugnedd ar donfedd o 450 nm gan ddefnyddio SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, China).

system imiwnedd sy'n cynyddu planhigion cistanche

Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche

【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Arbrofion Heintiau a Niwtraleiddio Pseudofeirws

Perfformiwyd yr assay niwtraliad ffug-firws fel y disgrifiwyd yn flaenorol [21,22]. Adeiladwyd plasmid sy'n mynegi protein firws S hynafol yn flaenorol [22]. Cafodd yr amrywiad Omicron SARS-CoV-2 genyn pigyn protein (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) ei syntheseiddio (rhodd gan Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) gan ddefnyddio codon wedi'i optimeiddio gan famaliaid a'i glonio i'r fector pcDNA3.1, fel y disgrifiwyd yn flaenorol [22]. Yn gryno, cafodd plasmidau a oedd yn mynegi gohebydd luciferase a phlasmidau yn mynegi'r protein S eu cyd-drawsgludo i gelloedd HEK 293T gan ddefnyddio Adweithydd Trawsnewid DNA X-treme GENE HP. Adnewyddwyd meithriniad y gell 6 awr ar ôl ei drawsnewid, a chynaeafwyd y supernatant sy'n cynnwys ffug-firws ar ôl 48 h a'i storio ar -70 ◦C. Yn yr assay niwtraliad ffug-feirws, deorwyd cymysgedd serwm-firws cyfartal ar 37 cyfrol o'r uwchnatant a oedd yn cynnwys ffug-feirws ac yna fe'i ychwanegwyd at y serwm gwanedig. ◦C am 1 h. Yna disodlwyd cyfryngau diwylliant celloedd Huh7.5 â 100 µL o'r gymysgedd serwm-firws a chawsant eu deor ar 37 ◦C am 12 h. Roedd celloedd wedi'u meithrin gyda dim ond ffugfeirysau SARS-CoV-2 yn cael eu rhedeg ochr yn ochr. Yna disodlwyd y cyfryngau gan DMEM (2% FBS), a deorwyd y deor ar 37 ◦C am 48 h. Yna, mesurwyd y signal luciferase gan ddefnyddio pecyn luciferase pryfed tân Bright-Glo (Promega).

2.6. SARS-CoV-2 Assay Niwtraleiddio

Defnyddiwyd SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019) yn yr arbrawf hwn. Yn fyr, cafodd y sera eu gwanhau'n ddeublyg o wanhad cychwynnol o 1:10, wedi'i gymysgu â chyfaint cyfartal (10-15 pfu/wel) o SARS-CoV byw-2, a'u deor am 1 h ar 37 ◦C, ar ôl hynny cawsant eu hychwanegu at y celloedd Vero wedi'u hadu. Ar ôl deoriad ar 37 ◦C am 48 h, gwelwyd effaith cytopathig (CPE), a chynaeafwyd 100 µL o'r uwchnatant meithrin ar gyfer echdynnu asid niwclëig a thrawsgrifio gwrthdro fflworoleuedd amser real PCR (RT-PCR). Cyfrifwyd y dos niwtraliad canolrifol (ND50) gan ddefnyddio'r dull Reed-Munch [15].

2.7. IFN- ELISpot Assay

Syntheseiddiwyd y pyllau peptid sy'n rhychwantu'r protein S/N/E/M cyfan fel 15-mers olynol sy'n gorgyffwrdd â 10 asid amino gan Scilight Biotechnology, LLC. Roedd tua 2.5 mg o bob peptid wedi'i buro yn y pwll peptid yn bresennol fesul ffiol. Cynhaliwyd yr arbrawf fel y disgrifiwyd yn flaenorol [18]. Yn gryno, cafodd 96-blatiau ffynnon (BD ELISPOT Set, UDA) eu gorchuddio â gwrth-IFN- dal Ab a'u deor dros nos ar 4 ◦C. Cafodd y platiau eu rhwystro gyda'r cyfrwng diwylliant cyflawn ar ôl eu golchi dair gwaith. Cynaeafwyd splenocytes ar ôl i'r llygod gael eu ewthanized ar ddiwrnodau 35 a 120 Cafodd ataliadau un-gell ffres o bob grŵp eu platio ar 5 × 106 y ffynnon, ac ychwanegwyd peptidau. Yna cafodd y platiau eu deor ar 37 ◦C mewn 5% CO2 am 22 h a'u canfod gan ddefnyddio darllenydd plât ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, UDA). Mae uned ffurfio sbot (SFU) yn cynrychioli IFN- .

2.8. Gwerthusiad o Ddiogelwch mewn Llygod ar ôl Her SARS-CoV-2

Cynhaliwyd yr arbrofion fel y disgrifiwyd yn flaenorol [15,21]. Yn fyr, cynaeafwyd yr ysgyfaint ar ôl i'r llygod gael eu ewthaneiddio. Defnyddiwyd hanner y meinweoedd ar gyfer echdynnu asid niwclëig, fflworoleuedd amser real RT-PCR, a TCID50. Anfonwyd yr hanner arall i Goleg Meddygaeth Filfeddygol, Prifysgol Amaethyddol Tsieina ar gyfer gwerthusiad patholegol.

2.9. Dadansoddiad Ystadegol

Perfformiwyd profion-t heb eu paru, profion ANOVA dwy ffordd, a phrawf cymariaethau lluosog Dunnett gan ddefnyddio GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p-gwerthoedd < 0.05 yn cael eu hystyried yn ystadegol arwyddocaol (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0.001; **** p < 0.0001).

3. Canlyniadau

3.1. Nodweddu Brechlynnau DNA

Canfuwyd lefelau protein E ac M gan ddefnyddio blotio gorllewinol. Fe wnaethom fesur mynegiant y proteinau S/N/E/M wedi'u hamgodio o SARS-CoV-2 mewn celloedd HEK-293T a drawslifwyd â phlasmidau pS/pN/pE/pM drwy ddadansoddi blotiau gorllewinol, gan ddefnyddio gwrth -S/gwrthgyrff gwrth-N a gwrth-6 x Ei wrthgorff, yn y lysates cell. Roedd y bandiau'n brasamcanu pwysau moleciwlaidd rhagweledig y proteinau S (140-142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa), ac M (22-25 kDa) (Ffigur 1B).

3.2. Cynhyrchu IgG Gwrth-S a/neu gwrth-N Cadarn a Chynal wedi'i achosi gan DNA pS a/neu pN

Brechlynnau Serwm ei gasglu o BALB/c llygod ar 35, 56, 96, a 120 diwrnod (Ffigur 2). Canfuwyd lefelau IgG gwrth-S/gwrth-N gan ddefnyddio ELISA. Cynyddwyd maint yr ymateb IgG penodol i S- neu N a achosir gan pS neu pN yn y serwm yn dilyn yr hwb cyntaf a'r ail hwb. Roedd y titers gwrth-S a gwrth-N IgG yn uwch yn y grŵp pS + pN nag yn y grwpiau eraill; fodd bynnag, nid oedd y gwahaniaeth yn ystadegol arwyddocaol (Ffigur 3A, B). Ni chanfuwyd unrhyw ymatebion gwrthgyrff protein-benodol E/M cadarn, sy'n gyson â chanlyniadau astudiaeth flaenorol (data heb ei ddangos) [15].

Ffigur 3. Ymatebion celloedd B i SARS-CoV-2 mewn llygod BALB/c. (A) Teitrau terfynbwynt rhwymol Serum IgG ar gyfer y proteinau SARS-CoV-2 S (A) ac N (B). (C) Pennwyd teitrau niwtraleiddio yn seiliedig ar system firws ffug-deipio SARS-CoV. (D) Penderfynwyd ar deitlau niwtraliad gwrth-SARS-CoV gan ddefnyddio firws SARS-CoV{-2. (E) Assay niwtraleiddio yn seiliedig ar system firws ffug-deipio SARS-CoV-2 Omicron. Dangosir y cymarebau ataliad ar gyfer y sera o'r grwpiau ffug (glas), pS (coch), pS + pN (gwyrdd), pS + pE + pM (pinc), a pN (oren). Mae barrau gwall yn cynrychioli'r SEM, a chyfrifwyd gwerthoedd-p gan ddefnyddio dadansoddiad post hoc ANOVA dwy ffordd a Sidak, lle * p < 0.05

3.3. Lefelau Uchel o Wrthgyrff Niwtraleiddio a Achosir gan Gyd-Imiwneiddio â Brechlynnau PS a pN

Penderfynwyd ar deitlau niwtraleiddio samplau serwm wedi'u gwanhau'n gyfresol gan ddefnyddio'r firws SARS-CoV-2 ffug-deipio. Gwelwyd y lefelau uchaf o wrthgyrff niwtraleiddio (nAbs) yn y grŵp pS + pN, gyda'r titerau cymedrig geometrig EC50 dwyochrog yn cyrraedd 2988 (ar ddiwrnod 35) a 3578 (ar ddiwrnod 56) (Ffigur 3C). Gwelwyd canlyniadau tebyg gan ddefnyddio'r assay microniwtraleiddio firws byw (MN), lle'r oedd lefelau NAbs yn y grŵp pS + pN yn uwch na'r rhai yn y grŵp S ar ddiwrnodau 56 a 96 (p < 0.05; Ffigur; 3D). At hynny, roedd lefelau NAbs yn y grŵp pS + pN ar ddiwrnod 56 (ail hwb) yn sylweddol uwch na'r rhai ar ddiwrnod 35 (p < 0.05; Ffigur 3D).

Penderfynwyd ymhellach ar weithgaredd niwtraleiddio pob regimen brechlyn yn erbyn yr amrywiad SARS-CoV-2 Omicron gan ddefnyddio'r llwyfan ffug-deipio a samplau serwm. Roedd y proffil niwtraliad yn erbyn firws Omicron ar ddiwrnodau 35 a 56 yn debyg i'r un yn erbyn firws yr hynafiaid (Ffigur 3E), gan awgrymu bod gan y driniaeth PS + pN nerth traws niwtraleiddio.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

3.4. Ymatebion T-Celloedd a Achosir gan Frechu DNA

Fel y disgrifiwyd yn flaenorol, amcangyfrifwyd yr ymatebion cell T yn erbyn yr antigenau SARS-CoV-2 S/N/E/M gan ddefnyddio IFN-ELISpot, fel y disgrifiwyd yn flaenorol [15]. Yn ôl y disgwyl, ysgogodd y cyfundrefnau PS + pN a pS + pE + pM lefelau sylweddol uwch o gelloedd IFN + T yn benodol ar gyfer y protein S ar ddiwrnod 120 nag ar ddiwrnod 35 (p < 0. 05; Ffigur 4A). Ar ben hynny, roedd nifer y celloedd IFN + T penodol ar gyfer y protein N ar ddiwrnod 120 (ail hwb) yn sylweddol uwch na'r un ar ddiwrnod 35 yn y grŵp pS + pN (p <0.05; Ffigur 4B). Yn olaf, roedd nifer y celloedd IFN + T penodol ar gyfer y protein M ar ddiwrnod 120 (ail hwb) yn sylweddol uwch na'r un ar ddiwrnod 35 yn y ddau grŵp (p <0.05; Ffigur 4D).

Ffigur 4. Ymatebion celloedd T i SARS-CoV-2 proteinau adeileddol unigol mewn llygod BALB/c. (A) Mesurwyd ymatebion celloedd T gan ddefnyddio IFN- ELISpot mewn splenocytes a ysgogwyd am 20 h gyda phyllau peptid gorgyffwrdd yn rhychwantu'r SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, a (D) proteinau M. Mae barrau'n cynrychioli'r cymedr ± SD. Perfformiwyd dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio prawf post hoc dwy ffordd ANOVA a Sidak, lle * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.01, a **** p < 0.0001.

3.5. Amddiffyniad Synergaidd a Achosir gan Gyd-Imiwneiddio â PS/pN neu PS/PE/pM

Yna fe wnaethom werthuso effeithiolrwydd amddiffynnol brechlynnau DNA gan ddefnyddio llygod hACE2 wedi'u himiwneiddio ar ôl yr her gyda'r firws hynafol SARS-CoV-2. Yn dilyn yr her, dangosodd y llygod yn y grŵp ffug golli pwysau yn raddol. Mewn cyferbyniad, dangosodd y llygod a gafodd eu himiwneiddio â naill ai pS neu pS+ golli pwysau ysgafn yn syth ar ôl haint, ac yna adferiad (Ffigur 5A). Ni chanfuwyd unrhyw firws byw yn y llygod a gafodd eu brechu â pS, pS + pN, neu pS + pE + pM. Ymhellach, fe wnaeth y brechiad pS + pN leihau'n sylweddol y niferoedd copi RNA firaol o'i gymharu â'r rhai a gafwyd gyda brechiad pS yn unig (p=0.0228; Ffigur 5B). Ar ben hynny, dangosodd histopatholeg yr ysgyfaint fod llygod yn y grwpiau ffug a pN yn dangos clytiau ffocal o lid, invagination plewrol, cwymp alfeolaidd, lefelau uchel o ymdreiddiad celloedd llidiol, ac ardaloedd hemorrhagic. Mewn cymhariaeth, dangosodd llygod a gafodd eu trin â naill ai pS + pN neu pS + pE + pM newidiadau histopatholegol mwynach a sgoriau INHAND yn is ar ôl yr her na'r grŵp arall (Ffigur 5C).

Ffigur 5. Effeithiolrwydd amddiffynnol imiwneiddio ar ôl yr her gyda firws SARS-CoV-2 byw. (A) Roedd llygod yn cael eu pwyso bob dydd (cymedr ± gwall safonol y cymedr (SEM), n=4) am dri diwrnod ar ôl yr her. (B) Titer SARS-CoV-2 heintus mewn homogenadau ysgyfaint ar y trydydd diwrnod ar ôl yr her, fel y pennir gan rif copi assay TCID5{{1{{{-}}} a RNA. Canfuwyd gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol rhwng grwpiau gan ddefnyddio ANOVA un ffordd ac yna cywiriad cymhariaeth luosog Dunnett (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, a **** p < 0.0001). (C) Dadansoddiad histopatholegol yr ysgyfaint gan ddefnyddio staenio H&E.

4. Trafodaeth

Yn yr astudiaeth hon, roedd cyd-imiwneiddio â dau frechlyn DNA yn mynegi'r proteinau S ac N yn achosi lefelau uchel o NAbs ac roedd yn hynod effeithiol wrth leihau llwyth firaol SARS-CoV-2 mewn llygod. Fe wnaeth brechlynnau DNA a oedd yn mynegi’r protein S gynyddu lefelau imiwnedd cellog protein-benodol S ar ôl tri imiwneiddiad pan gafodd llygod eu cyd-imiwneiddio â phroteinau N/E ac M a lleddfu’r newidiadau histopatholegol ar ôl yr her. Hyd eithaf ein gwybodaeth, dyma'r adroddiad cyntaf sy'n datgelu gwelliant synergyddol imiwnedd ac amddiffyniad mewn llygod gan ddefnyddio brechlyn DNA sy'n amgodio'r protein S pan fyddant yn cael eu cyd-imiwneiddio â brechlynnau DNA sy'n amgodio proteinau strwythurol eraill SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Mae epitopau imiwno-gelloedd B mewn rhanbarthau antigen N wedi'u harsylwi mewn sawl astudiaeth. Fel arfer ni all brechlynnau sy'n seiliedig ar N gymell NAbs, yn debygol oherwydd nad yw'r protein N yn cael ei arddangos ar yr wyneb firaol. Yn nodedig, ysgogodd cyd-imiwneiddio â phroteinau S ac N lefelau uwch o NAbs yn erbyn y firws hynafol ac Omicron SARS-CoV-2 na'r grwpiau eraill. Mae mwy o ymatebion NAb yn gysylltiedig â chlirio firaol gwell ac effeithiolrwydd amddiffynnol. Dangosodd ein canlyniadau fod y driniaeth pS + pN yn fwy effeithiol na'r driniaeth pS yn unig o ran lleihau llwyth firaol SARS-CoV ar ôl yr her. Nododd astudiaeth flaenorol fod bochdewion sydd wedi'u himiwneiddio â brechlyn sy'n cyd-fynegi'r proteinau M ac N wedi'u hamddiffyn rhag colli pwysau difrifol a phatholeg yr ysgyfaint a'u bod wedi lleihau'n sylweddol titerau firaol yn yr oroffaryncs a'r ysgyfaint ar ôl her SARS-CoV{-2, sy'n gyson â'n canlyniadau [23]. Yn anffodus, ni ellir priodoli'r gostyngiad mewn titerau firws yn benodol i'r protein M neu N, ac ni werthuswyd lefelau NAb yn yr astudiaeth hon. Nododd un astudiaeth brechlyn SARS-CoV-2 mRNA fod cyd-imiwneiddio S + N wedi arwain at ymateb cell-T CD-benodol estynedig a niwtraleiddio gweithgarwch gwrthgyrff, gan ddarparu gwell amddiffyniad yn yr ysgyfaint rhag y Delta. amrywiad o'i gymharu ag S yn unig, sy'n gyson â chanlyniadau'r astudiaeth hon [24]. Nododd astudiaeth arall fod y protein N o coronafirws gastroenteritis trosglwyddadwy yn hyrwyddo synthesis gwrthgyrff niwtraleiddio pan ysgogwyd celloedd TGEV-IMMUNE mochyn gyda chyfuniad o broteinau S ac N in vitro, a gallai'r effaith hon gael ei hesbonio gan ymateb T-lymffosyt y cynorthwyydd i y protein N [25].

Mae epitopau cell-T CD{0}}/CD8+ imwnodominant mewn rhanbarthau N-antigen wedi'u nodi'n flaenorol. Mae sawl astudiaeth wedi nodi bod brechlynnau sy'n seiliedig ar brotein SARS-CoV-2 N i bob pwrpas yn ysgogi ymatebion imiwn cellog. Dangosodd y grŵp S + N lefelau uwch o imiwnedd cellog protein-benodol ar ôl tri imiwneiddiad. Nododd un astudiaeth brechlyn SARS-CoV-2 mRNA fod cyfuniadol S + N wedi achosi ymateb cell-T estynedig sy'n benodol i S o'i gymharu ag S yn unig, sy'n gyson â'n canlyniadau [24]. Nododd astudiaeth arall fod ymatebion celloedd T i antigenau S ac N ar ôl brechiad cysefin dau-antigen HAd5 S + N yn unig yn cyfateb i'r rheini gan gleifion a oedd wedi'u heintio â SARS-CoV yn flaenorol, ac mewn modelau rhagfynegi silico o gelloedd T Awgrymodd rhwymiad HLA epitope y bydd ymatebion celloedd T i'r brechlyn HAd5 S + N yn cadw eu heffeithiolrwydd yn erbyn yr amrywiad B.1.351. Ar ben hynny, dangosodd plasma gan gleifion a heintiwyd yn flaenorol SARS-CoV-2- gysylltiad rhwymol uwch â chelloedd gan fynegi'r lluniad antigen deuol S-Fusion + N-ETSD nag i'r HAd5 S-Fusion yn unig, gan awgrymu ymhellach fod imiwnogenedd y Mae brechlyn antigen dwbl S + N yn well na brechlyn antigen sengl S [26].

Ni chanfuwyd y firws byw yn yr ysgyfaint, a lliniarwyd colli pwysau ar ôl her yn y grwpiau pS, pS + pN, a pS + pE + pM, tra nad oedd y driniaeth pN yn lleihau'r titer firws yn effeithiol. Mae'r canfyddiadau hyn yn pwysleisio anhepgor ac effeithiolrwydd y protein S fel targed brechlyn. Yn nodedig, cafodd cyd-imiwneiddio â pS a pN effeithiau gwell na pS neu pN ar glirio firaol. Nododd y grŵp pS + pE + pM lai o newidiadau histopatholegol yn yr ysgyfaint, sy'n gyson â chanlyniadau ein hastudiaeth flaenorol [15]. Roedd gan y grŵp S + N gopïau RNA firaol isel yn yr ysgyfaint, llai o golli pwysau, a her amser adfer cyflym ar ôl her SARS-CoV-2 o'i gymharu â'r grŵp a imiwneiddiwyd â S/N yn unig, a oedd yn gyson â'r her. canlyniadau'r astudiaeth hon. Fodd bynnag, ni chanfu unrhyw un o'r grwpiau y titers gwrthgyrff niwtraleiddio, a allai gael eu hesbonio gan wahaniaethau mewn amrywiaeth brechlynnau ac anifeiliaid arbrofol [26]. Nododd un astudiaeth brechlyn fector adenofirws SARS-CoV{-2 fod y brechlyn S ond yn darparu amddiffyniad acíwt i’r ymennydd pan gaiff ei gyd-imiwneiddio â brechlyn N [27]. Datblygodd astudiaeth arall frechlynnau Tri: ChAd, Bi: ChAd, a Mono: ChAd yn mynegi'r proteinau S1/N/RdRp, N/RdRp, ac S1, yn y drefn honno, a'u profi mewn model anifail B.1.351. Arsylwyd patholeg gros helaeth yn y Mono: ChAdlungs, tra bod ysgyfaint Bi: ChAd a Tri: ChAd yn ymddangos bron yn rhydd o'r patholeg hon [28].

At hynny, roedd gan anifeiliaid heb eu brechu lwythi firaol uchel ar yr ysgyfaint, tra bod y driniaeth Tri:ChAd wedi lleihau llwythi firaol yn sylweddol 3.5 boncyff. Mewn cymhariaeth, roedd brechlynnau Bi:ChAd a Mono:ChAd ond yn lleihau'r llwyth firaol yn gymedrol. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai effaith amddiffynnol y brechlyn antigen dwbl S/N yn erbyn amrywiadau fod yn well nag un y brechlyn antigen sengl S, sy'n gyson â'n canlyniadau [28]. Mae rhai astudiaethau wedi nodi bod llygod sydd wedi'u himiwneiddio â phrotein N yn datblygu llid difrifol ar yr ysgyfaint ar ôl haint SARS-CoV [29-31]. Mae astudiaethau blaenorol hefyd wedi nodi bod imiwneiddio â brechlyn fector adenofirws sy'n mynegi'r protein Llygoden Hepatitis Virus N yn amddiffyn llygod rhag haint angheuol, sy'n dangos y gallai'r protein N gynhyrchu effaith amddiffynnol [32]. Ar ben hynny, roedd gan y grŵp a gafodd ei imiwneiddio â'r brechlyn DNA CRT/N ostyngiad sylweddol yn y nifer o feirws ar ôl yr her, gyda firws vaccinia yn mynegi'r protein SARS-CoV N [33].

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Dangosodd un astudiaeth ar y protein S fod y brechlyn DNA/protein cyfun wedi ysgogi imiwnedd digrif a cellog yn well na'r brechlyn DNA/protein yn unig [8]. Mae brechlynnau sy'n targedu'r protein S yn unig wedi dangos llai o effeithiolrwydd wrth amddiffyn rhag COVID ysgafn-i-gymedrol-19 a achosir gan amrywiadau sy'n dod i'r amlwg. Mae rolau proteinau adeileddol SARS-CoV-2 sydd wedi'u cadw, gan gynnwys y proteinau N/E/M, yn haeddu sylw wrth ddylunio a chymwysiadau brechlyn, gan nad yw treigladau'n effeithio ar ymatebion celloedd T a achosir gan frechlyn yn erbyn epitopau cadwraeth yn gyffredinol. . Nododd un astudiaeth fod cleifion a gafodd eu hadfer gan SARS (n=23) yn dal i fod â chelloedd cof hirhoedlog T adweithiol i'r protein SARS-CoV N 17 mlynedd ar ôl yr achosion yn 2003, a oedd yn dangos traws-adweithedd cadarn i'r SARS CoV{ {15}} N protein, gan ddilysu ymhellach y defnydd o'r protein N fel targed brechlyn traws-amddiffynnol [34]. Dangosodd yr astudiaeth hon fod y cyd-imiwneiddio pS/pN yn gysylltiedig ag ymatebion NAb uwch, gwell clirio firaol, a gwell ymatebion imiwn cellog a gallai ddarparu gwell amddiffyniad ar ôl her SARS-CoV-2 o gymharu â pS yn unig. Ar ben hynny, dangoswyd bod amrywiadau SARS-CoV-2 yn heintio llawer o rywogaethau anifeiliaid, a gwelwyd trosglwyddiad dynol-i-anifail mewn rhai anifeiliaid gwyllt ac anifeiliaid anwes [7]. Felly, mae angen mwy o sylw ar y brechlyn SARS-CoV-2 milfeddygol. Yn ogystal, gall nanotechnoleg fod yn arf pwerus wrth optimeiddio brechlynnau ac mae'n haeddu mwy o sylw [2].

Mae gan yr astudiaeth hon nifer o gyfyngiadau. Yn gyntaf, dim ond mewn llygod BALB/c y gwnaethom arsylwi ar y strategaeth brechlyn DNA, a dylai astudiaethau yn y dyfodol asesu effeithiau imiwnogenig y regimensau brechlyn hyn mewn modelau anifeiliaid eraill. Yn ail, mae angen ymchwil ychwanegol i ddeall yn llawn y mecanweithiau moleciwlaidd sy'n sail i'r ymatebion celloedd-T CD8 uwch-benodol NAb a S a achosir gan gyd-imiwneiddio gan ddefnyddio'r proteinau S ac N ac i harneisio'r wybodaeth hon i wneud y gorau o COVID-19 dylunio brechlyn. Yn olaf, mae swyddogaeth gwrthgyrff N protein-benodol yn haeddu astudiaeth bellach.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

I gloi, gwerthusodd yr astudiaeth hon botensial imiwnedd-amddiffynnol cyd-imiwneiddio â phroteinau SARS-CoV-2 S, N, E, ac M. Mae sawl brechlyn sy'n targedu'r protein S yn unig yn cael effaith amddiffynnol lai ar y mathau amrywiol sy'n dod i'r amlwg. Bydd ein canlyniadau yn gosod sylfaen ar gyfer datblygu brechlyn COVID-19 traws-adweithiol i reoli amrywiadau SARS-CoV-2 cyfredol a rhai sy'n dod i'r amlwg ac atal pandemigau -coronafeirws posibl.

Cyfeiriadau

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I. ; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. Cymhwyso Therapi Cell CAR-T y tu hwnt i Oncoleg: Clefydau Awtoimiwn a Heintiau Feirysol. Biofeddygaeth 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.A.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, A.S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Nanotechnoleg yn erbyn y coronafirws newydd (coronafeirws syndrom anadlol acíwt difrifol 2): ​​Diagnosis, triniaeth, therapi a safbwyntiau yn y dyfodol. Nanomeddygaeth 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Fontanet, A. ; Cauchemez, S. Imiwnedd buches -19 COVID: Ble ydyn ni? Nat. Parch Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkami, S.; Smaill, F. ; Miller, Llsgr; Lichtey, BD; Xing, Z. Ystyriaethau imiwnolegol ar gyfer strategaethau brechlyn COVID{1}}. Nat. Parch Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A. ; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A. ; Rupert, J. ; Zacco, E.; Bechara, E. ; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG Dadansoddiad strwythurol o genom SARS-CoV-2 a rhagfynegiadau o'r rhyngweithiad dynol. Asidau Niwcleig Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.A.; Chen, B. ; Choe, H. Mecanweithiau mynediad SARS-CoV-2 i gelloedd. Nat. Parch Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Conforti, A. ; Sanchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L. ; Compagnone, M. ; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscili, G.; et al. Mae ymgeisydd brechlyn DNA llinol sy'n amgodio Parth Rhwymo Derbynnydd SARS-CoV-2 yn ennyn ymateb imiwn cryf ac yn niwtraleiddio gwrthgyrff mewn cathod domestig. Mol. Mae yna. Dulliau Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Shcherbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. Imiwnogenigrwydd y brechlyn DNA/Protein Cyfunol yn erbyn COVID-19. Tarw. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Qu, L. ; Yi, Z. ; Shen, Y.; Lin, L. ; Chen, F.; Xu, Y. ; Wu, Z. ; Tang, H. ; Zhang, X. ; Tian, ​​F. ; et al. Brechlynnau RNA cylchol yn erbyn SARS-CoV-2 ac amrywiadau sy'n dod i'r amlwg. Cell 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, A.S.; Schäfer, A. ; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. SARS-CoV-2 cynllun brechlyn mRNA wedi'i alluogi gan barodrwydd pathogenau prototeip. Natur 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R. ; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J. ; Portnoff, A. ; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.A.; et al. SARS-CoV-2 pigyn ymgeisydd brechlyn glycoprotein NVX-CoV2373 imiwnogenigrwydd mewn babŵns ac amddiffyniad mewn llygod. Nat. Cymmun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I. ; Piccini, G. ; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I. ; Leonardi, M.A.; Pantano, E.; Abiento, V. ; Benincasa, L.; et al. Mae imiwnedd hybrid yn gwella celloedd B a gwrthgyrff yn erbyn amrywiadau SARS-CoV-2. Natur 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A. ; Atif, SM; Hariprasad, G. ; Hasan, GM; Hassan, MI Mewnwelediadau i SARS-CoV-2 genom, strwythur, esblygiad, pathogenesis a therapïau: Ymagwedd genomeg strwythurol. Biochim. Bioffys. Acta Mol. Sail. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. India's New COVID-19 Brechlyn DNA ar gyfer Glasoed ac Oedolion Yn Gyntaf. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J. ; Deng, Y. ; Huang, B. ; Han, D.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et al. Mae Brechlynnau DNA sy'n Mynegi'r Proteinau Amlen a Pilenni yn Darparu Amddiffyniad Rhannol yn Erbyn SARS-CoV-2 mewn Llygod. Blaen. Imiwnol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, P. ; Kraynyak, KA; Patel, A. ; Maslow, JN; Morrow, AS; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T. ; et al. Mae Brechlyn DNA Meddyg Teulu Intradermal SynCon®Ebola yn Sefydlog Tymheredd ac Yn Dangos yn Ddiogel Manteision Imiwnogenigrwydd Cellog a Humoral mewn Gwirfoddolwyr Iach. J. Heintio. Dis. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Smith, TRF; Patel, A. ; Ramos, A.S.; Elwood, D.; Zhu, X. ; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schulteis, K.; Purwar, M.; et al. Imiwnogenigrwydd ymgeisydd brechlyn DNA ar gyfer COVID-19. Nat. Cymmun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z. ; Deng, Y. ; Niu, P.; Cân, J.; Wang, W.; Du, Y. ; Huang, B. ; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et al. Mae Cyd-Imiwneiddio Gyda CHIKV VLP a Brechlynnau DNA yn Ysgogi Ymateb Doniol Addawol mewn Llygod. Immunol blaen. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J. ; Deng, Y. ; Chen, H.; Yin, X. ; Yang, Y.; Tan, W. Preimio gyda dau frechlyn DNA yn mynegi firws hepatitis C Mae protein NS3 sy'n targedu celloedd dendritig yn ennyn potensial heterologaidd amddiffynnol uwch mewn llygod. Arch. Firol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Chen, H.; Wen, B. ; Deng, Y. ; Wang, W.; Yin, X. ; Guan, J. ; Ruan, L.; Tan, W. Effaith imiwneiddio DNA yn ogystal ag electroporation in vivo gyda chyfuniad o firws hepatitis B craidd-PreS1 a plasmidau S-PreS1. Clin. Imiwnol Brechlyn. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Yang, R. ; Deng, Y. ; Huang, B. ; Huang, L.; Lin, A. ; Li, Y. ; Wang, W.; Liu, J. ; Lu, S.; Zhan, Z. ; et al. Brechlyn mRNA COVID-19 strwythuredig craidd-cragen gyda phatrwm bio-ddosbarthu ffafriol ac imiwnedd addawol. Trawsgludiad Signal. Targed Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B. ; A, R. ; Li, W. ; Wang, W.; Deng, Y. ; Tan, W. Datblygiad ac effeithiolrwydd system SARS-CoV-2 ffug-deipio fel y'i pennir gan effeithlonrwydd niwtraleiddio a phrawf atal mynediad in vitro. Biosaf. Iechyd 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q. ; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali’c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Mae atgynhyrchu brechlyn bacteriwmfectoraidd sy'n mynegi proteinau bilen a Niwcleocapsid SARS-CoV yn amddiffyn rhag clefyd difrifol tebyg i COVID mewn bochdewion. Brechlynnau NPJ 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y. ; Alameh, M.-G.; Tang, J. ; Zhong, C.; Adda, A. ; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et al. Mae brechiad mRNA cyfunol yn gwella amddiffyniad rhag yr amrywiad SARS-CoV-2 delta. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antón, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsin, M.; Risco, C. ; Langeveld, YH; Enjuanes, L. Cydweithrediad rhwng proteinau adeileddol coronafeirws gastroenteritis trosglwyddadwy (TGEV) yn y cyfnod sefydlu in vitro o wrthgyrff firws-benodol. Firws Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y. ; Lynch, J.; Warner, B. ; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Teiliwr, N. ; Frost, K. ; Booth, S.; Sajesh, B. ; et al. Mae imiwneiddiad sengl gyda firysau vaccinia ailgyfunol ACAM2000 sy'n mynegi'r pigyn a'r proteinau niwcleocapsid yn amddiffyn bochdewion rhag clefyd clinigol a achosir gan SARS-CoV. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Dosbarth, J. ; Dangi, T.; Richner, JM Mae brechlyn nucleocapsid SARS CoV-2 yn amddiffyn rhag lledaeniad firaol distal. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A. ; Kang, A. ; Singh, R. ; Bavananthasivam, J.; Ie, G.; Luo, X. ; et al. Mae cyflenwad mwcosaidd anadlol o frechlyn COVID-19 cenhedlaeth nesaf yn darparu amddiffyniad cadarn rhag mathau hynafol ac amrywiol o SARS-CoV-2. Cell 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, N.; Xia, R. ; Yang, C.; Yin, B. ; Li, Y. ; Duan, C. ; Liang, L. ; Guo, H.; Xie, Q. Mynegiant hwb o'r protein niwcleocapsid SARS-CoV mewn tybaco a'i imiwnogenigrwydd mewn llygod. Brechlyn 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. Mae imiwneiddio blaenorol â phrotein niwcleocapsid sy'n gysylltiedig â syndrom anadlol acíwt difrifol (SARS) (SARS-CoV) yn achosi niwmonia difrifol mewn llygod sydd wedi'u heintio â SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Young, B. ; Davies, N.; Sims, A. ; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Pickles, R.; et al. Effeithiolrwydd brechlyn mewn llygod senescent wedi'i herio gydag amrywiadau ailgyfunol SARS-CoV sy'n dwyn epidemig a phigyn milheintiol. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L. ; Graham, F.; Horzinek, MC; Mae Rottier, pigyn firws hepatitis PJ Llygoden a phroteinau nucleocapsid a fynegir gan fectorau adenofirws yn amddiffyn llygod rhag haint angheuol. J. Gen. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Hung, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Efe, L. ; Chen, PJ; et al. Cynhyrchu a nodweddu brechlynnau DNA sy'n targedu'r protein nucleocapsid o coronafirws syndrom anadlol acíwt difrifol. J. Firol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K. ; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M. ; Tan, N. ; Linster, M.; et al. SARS-CoV-2-Imiwnedd cell T penodol mewn achosion o COVID-19 a SARS, a rheolyddion heb eu heintio. Natur 2020, 584, 457–462. [CrossRef]