Abstract

Cefndir: Yn gynyddol mae astudiaethau wedi adrodd am effaith therapiwtig ecsosomau bôn-gelloedd mesenchymal (MSC) y mae protein a miRNA yn cael eu nodweddu ganddynt. Fodd bynnag, mae proffiliau proteomeg a miRNA o ecsosomau sy'n deillio o fôn-gelloedd embryonig dynol (hESCs) a bôn-gelloedd plwripotent a achosir gan ddynol (hiPSCs) yn aneglur o hyd.

Gall glycoside cistanche hefyd gynyddu gweithgaredd SOD ym meinweoedd y galon a'r afu, a lleihau'n sylweddol y cynnwys lipofuscin a MDA ym mhob meinwe, gan ysbeilio radicalau ocsigen adweithiol amrywiol (OH-, H₂O₂, ac ati) yn effeithiol a diogelu rhag difrod DNA a achosir. gan OH-radicaliaid. Mae gan glycosidau ffenylethanoid Cistanche allu chwilota cryf o radicalau rhydd, gallu lleihau uwch na fitamin C, gwella gweithgaredd SOD mewn ataliad sberm, lleihau cynnwys MDA, a chael effaith amddiffynnol benodol ar swyddogaeth pilen sberm. Gall polysacaridau cistanche wella gweithgaredd SOD a GSH-Px mewn erythrocytes a meinweoedd yr ysgyfaint llygod senescent arbrofol a achosir gan D-galactos, yn ogystal â lleihau cynnwys MDA a cholagen yn yr ysgyfaint a phlasma, a chynyddu cynnwys elastin, wedi effaith sborion dda ar DPPH, ymestyn amser hypocsia mewn llygod senescent, gwella gweithgaredd SOD mewn serwm, ac oedi dirywiad ffisiolegol yr ysgyfaint mewn llygod senescent arbrofol Gyda dirywiad morffolegol cellog, mae arbrofion wedi dangos bod gan Cistanche y gallu gwrthocsidiol da ac mae ganddo'r potensial i fod yn gyffur i atal a thrin clefydau heneiddio'r croen. Ar yr un pryd, mae gan echinacoside yn Cistanche allu sylweddol i ysbeilio radicalau rhydd DPPH a gallant ysbeilio rhywogaethau ocsigen adweithiol, atal diraddio colagen a achosir gan radical rhad ac am ddim, ac mae hefyd yn cael effaith atgyweirio da ar ddifrod anion radical rhydd thymin.

Cliciwch ar Swmp Powdwr Cistanche Gwrth-heneiddio

【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Dulliau: Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ynysu ecsosomau o hESCs, hiPSCs, a bôn-gelloedd mesenchymal llinyn bogail dynol (hUC-MSCs) trwy uwch-ganrifiad clasurol a hidlydd 0.22-μm, wedi'i ddilyn gan adnabod ceidwadol. Roedd labelu tagiau màs tandem a meintioli peptidau cymharol di-label gyda'i gilydd yn diffinio eu proteomeg. Perfformiwyd dilyniannu trwybwn uchel i bennu proffiliau miRNA. Yna, fe wnaethom gynnal dadansoddiad biowybodeg i nodi'r prosesau a'r llwybrau biolegol amlycaf sydd wedi'u modiwleiddio gan gargoau ecsosomaidd. Yn olaf, perfformiwyd y blot gorllewinol a RT-qPCR i ganfod y llwythi gwirioneddol o broteinau a miRNAs mewn tri math o exosomau.

Canlyniadau: Yn seiliedig ar ein hastudiaeth, mae'r cargoau o dri math o exosomau yn cyfrannu at brosesau biolegol soffistigedig. Mewn cymhariaeth, roedd exosomau hESC (hESC-Exos) yn well o ran rheoleiddio datblygiad, metaboledd, a gwrth-heneiddio, ac roedd gan exosomau hiPSC (hiPSC-Exos) swyddogaethau biolegol tebyg i hESC-Exos, tra bod ecsosomau hUC-MSCs (huC-MSC-Exos) cyfrannu mwy at reoleiddio imiwnedd.

Casgliadau: Mae'r data a gyflwynir yn ein hastudiaeth yn helpu i ddiffinio tirweddau protein a miRNA tri ecsosom, rhagfynegi eu swyddogaethau biolegol trwy ddadansoddiad rhwydwaith systematig a chynhwysfawr ar lefel y system, a datgelu eu cymwysiadau posibl mewn gwahanol feysydd i wneud y gorau o ddethol exosome mewn preclinical a chlinigol. treialon.

Geiriau allweddol: bôn-gelloedd embryonig dynol, bôn-gelloedd lluosog a achosir gan ddyn, bôn-gelloedd mesenchymal llinyn bogail dynol, Ecsosomau, Proteomeg, miRNA

Rhagymadrodd

Mae fesiglau allgellog (EVs) yn fesiglau bach sy'n cael eu secretu'n weithredol gan gelloedd, sy'n cynnwys yn bennaf ecsosomau, microfesiglau (MVs), a chyrff apoptotig [40, 56, 57]. Maent yn cael eu dosbarthu'n eang mewn hylifau corff lluosog, megis poer, llaeth y fron, gwaed, hylif serebro-sbinol, bustl, ac wrin [57]. Yn eu plith, mae gan ecsosomau haen ddeulipid â diamedr o 40–200 nm, dwysedd bywiog o 1.13–1.18 g/ml yn y graddiant swcros, ac ymddangosiad siâp cwpan o dan ficrosgop electron [21, 53]. Mae cyfansoddion bioactif amrywiol, gan gynnwys proteinau, asidau niwclëig, a lipidau, yn gwaddoli swyddogaeth gyfathrebu rhynggellog ecsosomau rhwng celloedd [16, 17]. Mae'r haen ddeulip yn rhwystr cain sy'n amddiffyn cynnwys exosomau rhag dirywiad ensymatig hylif y corff [49]. Gall exosomau sefydlog gyfryngu prosesau ffisiolegol a phatholegol cymhleth trwy weithgaredd paracrine, gan gynnwys datblygiad organau ac atgenhedlu, cyflwyniad antigen, cyfathrebu niwronau, ymateb imiwn, rheoleiddio heneiddio, ac amlhau celloedd [57, 62].

Mae ffurfio a rhyddhau ecsosomaidd yn broses a reoleiddir yn llawn, ac mae didoli cynnwys wedi'i amgáu ecsosom yn digwydd trwy symud proteinau amrywiol [22, 47]. Mae proteinau lluosog yn hanfodol i ffurfiad ecsosomaidd, sy'n cynnwys y cymhleth didoli endosomaidd sydd ei angen ar gyfer cludiant (ESCRT), tetraspaninau (CD9, CD63, a CD81), genyn sy'n gysylltiedig ag apoptosis 2-protein rhyngweithiol X (Alix), a thueddiad tiwmor genyn 101 (TSG101) [38, 55]. Mae masnachu mewngellol ecsosomau yn cael ei yrru gan weithgaredd cyfunol cyfres o broteinau, gan gynnwys GTPasau RAB switsh moleciwlaidd a phroteinau sytosgerbydol, fel actin a thiwbwlin [24]. Yn dilyn hynny, mae secretion exosome yn cael ei ategu gan y teulu cymhleth SNARE a synaptotagmin [22]. Mae ymchwil wedi pennu bod egin a gollwng ecsosomau yn dibynnu ar weithgarwch calsiwm a recriwtio ESCRT [15]. Fel negesydd, mae rhyddhau exosome yn ymwneud â crosstalk cell mewn ymateb i ffisioleg cellog a newidiadau patholegol, megis activation, newid pH, hypocsia, difrod ymbelydredd, neu straen celloedd [61].

Er mwyn dadorchuddio cydrannau exosomes a'u swyddogaethau ffisiolegol a phatholegol posibl, defnyddir technegau proteomig, trawsgrifomig a thechnegau eraill yn aml i astudio RNAS exosome a phroteinau o wahanol rywogaethau, meinweoedd a chelloedd [44]. Mae dadansoddiad proteomeg exosome fel arfer yn cynnwys tri cham: ynysu, puro a nodweddu ecsosomau, adnabod cydrannau protein gan ddefnyddio sbectrometreg màs, a dadansoddi data crai [14]. Mae cyflwr cellog yn effeithio'n sylweddol ar gyfansoddiad protein a digonedd o exosomau. Ar hyn o bryd, defnyddir technegau proteomig meintiol ar gyfer dadansoddi nodweddion a digonedd protein i egluro'r mecanwaith sy'n sail i gynhyrchu ecsosom a dyfnhau ein dealltwriaeth o rolau ffisiolegol a phatholegol ecsosomau mewn celloedd [39]. Yn eu plith, mae technolegau proteomeg meintiol sy'n seiliedig ar sbectrometreg màs yn cael eu defnyddio'n eang, yn bennaf gan gynnwys dulliau sefydlog heb label a labelu isotopau [13, 42]. Mae miRNAs yn foleciwlau bioactif bach sydd â chysylltiad agos â gweithgareddau bywyd amrywiol. Nodweddir y dechneg dilyniannu trwybwn uchel gan sensitifrwydd a manwl gywirdeb uchel ac mae'n cael ei chymhwyso'n eang mewn dilyniannu miRNA (18-30 nt) [6]. O ystyried datblygiad y dechnoleg gyfredol, nid oes unrhyw rwystr i ddyrannu proffiliau protein a miRNA ecsosomau.

Mae gan yr hESCs a hiPSCs botensial gwahaniaethu uchel [36]. Fodd bynnag, mae eu cymhwysiad uniongyrchol mewn triniaeth yn gyfyngedig oherwydd y risg o falaenedd a materion moesegol [31]. Mewn cyferbyniad, mae gan fôn-gelloedd mesenchymal (MSCs) gymhwysiad ehangach ar gyfer ymyrraeth mewn clefydau lluosog mewn lleoliadau clinigol [8]. Fodd bynnag, mae eu defnydd uniongyrchol yn dal i wynebu sawl cyfyngiad, gan gynnwys cyfradd goroesi isel, gwrthodiad imiwnolegol, a materion diogelwch [8, 43]. Ar hyn o bryd, mae llawer o sylw wedi'i roi i ecsosomau oherwydd eu bioddiogelwch, eu sefydlogrwydd, nad ydynt yn aneuploidy, ac imiwnogenedd isel [51]. Mae astudiaethau blaenorol wedi dogfennu cymhariaeth gydran MSCs sy'n deillio o wahanol feinweoedd a'u exosomau sy'n cynnwys proffiliau proteomig a miRNA [59]. Roedd Gong et al. hefyd yn darlunio'r rhwydwaith rheoleiddiol o fesiglau allgellog hESC (EVs) o ran y proteome, ond dim ond mewn llwybrau sy'n gysylltiedig â heneiddio heb ganolbwyntio ar eraill [19]. Mae Questa et al. gwehyddu atlas proteomig EV o hiPSCs sy'n deillio o ffibroblastau blaengroen dynol (HFFs) [45]. Er bod yr astudiaethau hyn wedi adrodd yn rhannol am gydrannau protein EVs, nid oeddent yn canolbwyntio ar exosomau yn unig, ac nid yw eu dadansoddiad proteomig cynhwysfawr wedi'i fynegi'n glir. Yn benodol, nid yw'r proffiliau miRNA wedi'u disgrifio eto. Er mwyn mynd i'r afael â hyn, dewiswyd ecsosomau wedi'u hynysu o hESCs, hiPSCs, a hUC-MSCs yn yr astudiaeth bresennol i'w hymchwilio ymhellach gan dargedu eu proffiliau proteome a miRNA i gael mewnwelediadau newydd ar gyfer eu hymchwil a'u cymhwysiad clinigol.

Dulliau

Paratoi a nodweddu ecsosomau

Cafodd hESCs a hiPSCs eu meithrin mewn cyfrwng ncTarget (cat. rhif. RP01020; Nuwacell. Ltd, Tsieina), tra bod y 3edd genhedlaeth o hUC-MSCs wedi'u meithrin mewn cyfrwng hMSC cenhadaeth di-serwm (cat. no. RP02010; Nuwacell. Ltd, Tsieina). Nesaf, casglwyd 350 ml o'r supernatant o gelloedd yn y cyfnod twf logarithmig (~ cydlifedd 80 y cant) ar gyfer puro ecsosomaidd. Echdynnwyd yr ecsosomau gan gyfres o allgyrchiant cydnabyddedig ac uwch-allgyrchiant, fel y disgrifiwyd yn flaenorol [34, 52]. Yn gryno, casglwyd y cyfrwng cyflyredig (CM) a bu'n destun centrifugio graddiant (300 × g am 10 munud, 2000 × g am 15 munud, 10, 000 × g am 30 munud) i wahanu malurion cell. Cafodd ecsosomau eu peledu o'r uwchnatyddion a gasglwyd ar 100, 000 × g am 70 munud gan ddefnyddio rotor Ti45 (Beckman Coulter, UDA). Yna cawsant eu hailddarparu yn PBS ar gyfer y hidliad nesaf gan ddefnyddio hidlydd Bilen 0.{{21}μm MF-Millipore™ (Sigma, UDA). Bu'r hidlydd yn destun uwch-allgyrchiant ar 100, 000 × g am 70 munud. Cafodd y belen exosome terfynol ei hailddarlledu yn PBS ar gyfer y dadansoddiad nesaf. Defnyddiwyd system gwasgaru golau deinamig (DLS) (Wyatt Technology, UDA) i fesur crynodiad a maint yr ecsosomau ynysig.

Microsgopeg trosglwyddo electron (TEM)

Perfformiwyd sganio TEM i ddisgrifio morffoleg exosomau ynysig, fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Plannwyd yr ecsosomau wedi'u hailddarlledu (1 ug mewn 10 ul o PBS) ar grid copr wedi'i orchuddio â charbon (200-rhwyll) a'i ganiatáu i arsugniad arno am 2 funud, ac yna dwy olchi gyda dŵr distyll dwbl. Yna, cafodd y gridiau eu staenio'n negyddol gyda 8 μL o hydoddiant asetad uranyl 2 y cant am 1 munud. Ar ôl sychu'n naturiol, archwiliwyd y samplau gan ddefnyddio system Tecnai Spirit (Thermo Fisher, UDA) ar 120 kV.

Gwasgariad golau deinamig

Disgrifiwyd dosbarthiad maint ecsosomau trwy ddadansoddiad olrhain nanoronynnau gan ddefnyddio gwasgariad golau deinamig (Wyatt Technology, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (271-DPN), fel yr adroddwyd yn flaenorol[23]. Yn gryno, cafodd y belen exosome ei hail-ddarparu mewn 100 μL o PBS. Ychwanegwyd deg, 50 μL o'r ecsosomau uchod at 1450 μL o PBS a'u vortexed am 30 s. Trosglwyddwyd ecsosomau (1.5 mL) i cuvette tafladwy ar gyfer cydbwysedd ar 25 gradd am 30 s. Gwerth mynegai plygiant y gwasgarwr oedd 1.37, a phenderfynodd cyfartaledd Z ac aml-dispersity (PDI) faint y gronynnau exosome. Cymerwyd mesuriadau coed-annibynnol ar gyfer pob sampl.

Labelu tag màs tandem (TMT) a dadansoddiad meintioli peptid cymharol di-label (LFQ).

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100, a P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 a P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), yn ogystal ag arwyddocâd ystadegol (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

dadansoddiad proffil miRNA

Echdynnwyd cyfanswm RNA o exosomau ynysig gan ddefnyddio Pecyn Ynysu mirVana™ miRNA (cat. rhif. AM1560; Thermo Fisher, UDA). Bu'r samplau RNA yn destun arolygiad ansawdd ar gyfer assay microarray miRNA a berfformiwyd gan LC-Bio Technology Co, Ltd. Perfformiwyd dadansoddiad te o ddata crai fel yr adroddwyd yn flaenorol [9]. Dewiswyd miRNAs a fynegwyd yn wahaniaethol fel ymgeiswyr miRNAs ar werth-p<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) ac uchafswm ynni rhad ac am ddim<−10 (miRanda).

Dadansoddiad biowybodeg

Cafodd data crai eu dadansoddi gan ddefnyddio pecyn meddalwedd Maxquant (v1.6.0), a gosodwyd y Swiss-Prot_data dynol fel cyfeirnod (20,600 o broteinau) (Proteome ID: UP000005640) . Mapiwyd proteinau a nodwyd i Gene Ontology (GO) a Gwyddoniadur Genynnau a Genomau Kyoto (KEGG) yn seiliedig ar dermau dadansoddiad KOBAS [60] i bennu eu priodweddau biolegol a swyddogaethol. Defnyddiwyd meddalwedd Cytoscape a phecyn igraff mewn meddalwedd R (fersiwn 3.6.1) i dynnu'r rhwydwaith cydgysylltiedig o broteinau ecsosomaidd neu miRNAs rhwng llwybrau signalau.

Dadansoddiad ystadegol

Perfformiwyd yr holl arbrofion yn driphlyg. Cafodd ailadroddadwyedd meintiol proteinau a miRNAs ei ddyrchafu trwy ddadansoddiad prif gydrannau (PCA), gwyriad safonol cymharol, a chyfernod cydberthynas Pearson. Dadansoddwyd y canlyniadau gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr heb ei baru. Mynegir data fel cyfeiliornad safonol cymedrig y cymedr (SEM). Ystyriwyd bod gwerthoedd-P yn ystadegol arwyddocaol yn *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Canlyniadau

Ynysu ac adnabod exosome

Disgrifiwyd diwylliant ac adnabod tri bôn-gelloedd lluosog dynol yn Ffeil Ychwanegol 1. Cafodd exosomes eu hynysu o'r cyfryngau cyflyru o dri math o fôn-gelloedd (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S1) a'u nodi ar sail morffoleg, maint gronynnau, crynodiad, a marcwyr arwyneb [19]. Datgelodd TEM fod gan yr ecsosomau hyn forffoleg siâp cwpan (Ffig. 1 A), a datgelodd DLS fod eu dosbarthiad maint o fewn 50-200 nm (Ffig. 1 B). Nododd blotio gorllewinol fod yr ecsosomau ynysig yn cario'r marcwyr positif CD63, TSG101, a HSP70 ond nid y marciwr negyddol calnexin (Ffig. 1C). Roedd gan bob hESC gynnyrch exosome tebyg i'r hiPSCs, ac roedd y ddau yn uwch nag un HUC-MSCs (Ffig. 1D). Mae canlyniadau TSE yn dangos bod ecsosomau cynrychioliadol wedi'u harestio, heb unrhyw wahaniaethau o ran siâp; fodd bynnag, canfuwyd gwahaniaethau ymhlith y crynodiadau o ecsosomau wedi'u hynysu o'r tri math o fôn-gelloedd.

Biowybodeg proteinau a rennir a phroteinau wedi'u llwytho i'r brig

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (profiad di-label). Yn olaf, dewiswyd hadau 554, 437, a 911 ar gyfer dadansoddi proffiliau protein hESC-Exos, hiPSC-Exos, a hUC-MSC-Exos, yn y drefn honno (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S3A). Yna bu'r ymgeiswyr hyn yn destun assay diagram Venn i ddewis proteinau a rennir (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S3B). Datgelodd dadansoddiad biowybodeg fod y 303 o broteinau a rennir yn dominyddu'r rheoliad yn y llwybrau signalau hyn gan gynnwys rheoleiddio cytoskeleton actin, adlyniad ffocal, PI3K-AKT, metaboledd carbon, ac ati (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S3C). Dangosodd dadansoddiad GO hefyd fod y proteinau a rennir wedi'u cyfoethogi mewn ecsosom allgellog, bilen, rhwymo protein, a rhanbarth allgellog, (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (profiad di-label) (Ffig. 2A). Yn seiliedig ar y canlyniadau hyn, sgriniwyd 163, 187, a phroteinau 451 yn yr hESC-Exos, hiPSC-Exos, a hUC-MSC-Exos, yn y drefn honno (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S3E). Yna fe wnaethom ddisgrifio cromlin helaethrwydd mynegiant y tri math o ecsosomau a nodi'r deg symbol genyn uchaf o broteinau wedi'u llwytho mewn ecsosomau (Ffig. 2 B). The Roedd proteinau llwyth iawn yn destun biowybodeg yn seiliedig ar algorithm KOBAS. Roedd proteomes y tri math o ecsosomau i gyd yn ymwneud â rhwydwaith rheoleiddio llwybr signalau cymhleth, ac yna cafodd yr 20 llwybr uchaf eu didoli yn seiliedig ar werth -log10 (P-value) (Ffig. 2C-E). Cyfoethogwyd yr holl broteomau yn y rhyngweithio matrics allgellog (ECM)-derbynnydd a llwybrau signalau PI3K-AKT. Datgelodd y dadansoddiad rhyngweithio protein-protein (PPI) fod y proteinau â'r llwyth uchaf yn hESC-Exos a hiPSC-Exos yncyfoethogi yn y cylchred gell a llwybr metabolig, tra bod y proteinau uchaf-lwytho yn HUC-MSC-Exos eu cyfoethogi mewn imiwnedd rheoleiddio sy'n gysylltiedig â llwybrau (Ffig. 2 F-H).

Cymhariaeth pâr o broteomeg ecsosomaidd

Er mwyn gwerthuso'r gwahaniaeth rhwng pob dau broteom ecsosom, gwnaethom lunio diagram Venn i gydnabod y clystyrau genynnau codio protein unigryw sy'n gorgyffwrdd. Yna bu'r genynnau codio protein a rennir yn destun dadansoddiad llosgfynydd a map gwres ac i GSEA, a chafodd proteinau a fynegwyd yn wahaniaethol eu hidlo yn P<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Datgelodd y gymhariaeth rhwng hESC-Exos a hUC-MSC- 1: Ffig. S4 D) fod clystyrau genynnau codio protein unigryw o hESC-Exos yn ymwneud yn bennaf ag EGFR, TGF- , cylchred celloedd, rheoleiddio lluosogrwydd, ac Wnt signalau (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S4E). Mewn cyferbyniad, cyfoethogwyd clystyrau unigryw hUC-MSC-Exos mewn llawer o lwybrau signalau cysylltiedig â immunoregulation megis system ategu, rheoleiddio llid, a haint microbaidd (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S4F). Roedd clystyrau gorgyffwrdd wedi'u cyfoethogi'n fawr mewn rhyngweithiad ECM-derbynnydd, rhaeadrau cyd-fynd a cheulo, a signalau PI3K-AKT (Ffig. 3 D). Mae plot y llosgfynydd yn darlunio'r gwahaniaethau rhwng hESC-Exos a hUC-MSC-Exos (Ffig. 3E). Roedd y proteinau uwch-reoledig yn hUC-MSC-Exos (Clwstwr 1) yn ymwneud yn bennaf â'r ymateb cyflenwad, gweithgaredd celloedd lladd naturiol, a signalau Rap1 a PPAR. Mewn cyferbyniad, roedd proteinau uwch-reoledig hESC-Exos yn ymwneud yn bennaf â signalau PI3K-AKT, MAPK, a AMPK (Ffig. 3F). Cadarnhaodd GSEA allu rheoleiddio uwch hiPSC-Exos mewn lluosogrwydd (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S6A a D) a hESC-Exos mewn imiwnreoleiddiad, gan gynnwys cytotoxicity cell-mediated lladdwr naturiol (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S6B ac E) a rheoleiddio COVID19-SARS-CoV2 (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S6C ac F).

Datgelodd y gymhariaeth hiPSC-Exos a hUC-MSC-Exos (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S4G) fod y set genynnau codio protein unigryw hiPSCExos yn sylweddol gysylltiedig ag uniad terfynol nad yw'n homologaidd, TGF-, a metaboledd fitamin B6 (Ychwanegol ffeil 1: Ffig. S4H), tra bod hUC-MSC-Exos yn ymwneud yn bennaf â llwybrau cysylltiedig â imiwn-reoleiddio (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S4I). Mae eu proteinau gorgyffwrdd hefyd yn cymryd rhan yn y rheoleiddio ECM-derbynnydd rhyngweithiadau, ategu a rhaeadrau ceulo, a PI3K-AKT signalau (Ffig. 3 G). Mae'r plot llosgfynydd yn cyflwyno'r proteinau a fynegir yn wahaniaethol (Ffig. 3H). Roedd proteinau clwstwr 1 yn y map gwres yn nodi bod hUCMSC-Exos yn rheoleiddio'r ymateb imiwn a'r llwybr signalau AMPK yn bennaf tra bod hiPSC-Exos yn bennaf yn rheoleiddio'r cylchred celloedd a llwybrau signalau inswlin, Hippo, a mTOR (Ffig. 3 I). Roedd GSEA yn cefnogi ymhellach rôl ddominyddol hiPSC-Exos wrth reoleiddio prosesau datblygiadol (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S7A a D) a chynnal lluosogrwydd (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S7B ac E), tra bod hUC-MSC-Exos yn yn ymwneud yn bennaf â'r broses immunoregulation (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S7C ac F).

Biowybodeg proteomau sy'n gorgyffwrdd

Nesaf, buom yn ymchwilio i broteomau a rennir y tri math exosome. At ei gilydd, roedd 309 o enynnau codio protein (Ffig. 4A) yn destun dadansoddiadau GO a KEGG. Nododd y canlyniadau fod setiau genynnau codio protein a rennir ymhlith y tri math exosome yn ymwneud yn bennaf â gweithgareddau allgellog a phrosesau biolegol gan gynnwys prosesau metabolaidd protein cellog, rhwymo derbynyddion signalau, rhwymo ATP, rhwymo NAD, iachau clwyfo, a phrosesau metabolaidd lipid (Ffig. 4B). Fe wnaethant hefyd gyfrannu at adeiladu rhwydweithiau rheoleiddio cymhleth o lwybrau signalau fel PI3K-AKT, glycolysis / gluconeogenesis, Hippo, Oxytocin, HIF-1, cylchred celloedd, a llwybrau AMPK (Ffig. 4C). Roedd perthnasoedd rheoleiddio cymhleth rhwng y llwybrau signalau proteomig a chanonaidd hyn (Ffig. 4D). Mae'r plot swigen yn dangos digonedd gwahanol pob clwstwr protein yn y llwybr signalau canonaidd. Er y gallai fod gan hESC-Exos a hiPSC-Exos alluoedd rheoleiddio cryfach na hUC-MSC-Exos o ran cylchred celloedd a llwybrau signalau AMPK, gallai hUC-MSC-Exos gael effeithiau rheoleiddiol amlwg ar lwybrau signalau VEGF a NF-κB (Ychwanegol ffeil 1: Ffig. S8).

Datgelodd y dadansoddiad map gwres ymhellach wahaniaethau yn y mynegiant o broteinau a rennir (Ffig. 4E). Yng Nghlwstwr A, cyfoethogwyd proteinau sy'n ymwneud â llwybrau signalau derbynyddion PI3K-AKT, Hippo, VEGF, a B-cell yn hUC-MSCExos a hESC-Exos. Roedd proteinau yng Nghlwstwr B yn cymryd rhan yn bennaf yn y gwaith o reoleiddio signalau PPAR, metaboledd colesterol, a chynhyrchu IgA a chawsant eu disbyddu yn hESC-Exos. Roedd yr hUC-MSC-Exos yn cynnwys proteinau Clwstwr C yn bennaf, a oedd yn rheoleiddio'r ymateb cyflenwad, haint microbaidd, signalau HIF-1, signalau MAPK, llwybrau metabolaidd, a llwybr NF-κB. Cymerodd proteinau yng Nghlwstwr d, a gyfoethogwyd yn hiPSC-Exos, ran mewn rheoleiddio signalau Ras, ffosfforyleiddiad ocsideiddiol, a signalau mTOR. Roedd proteinau yng Nghlwstwr e yn fwy niferus yn hiPSC-Exos a hESC-Exos nag yn hUC-MSCExos, ac roeddent yn ymwneud â phrosesau metabolaidd lluosog, megis y cylch sitrad, cylchred celloedd, signalau inswlin, metaboledd asid brasterog, a signalau AMPK. . Cymerodd proteinau mewn Clwstwr f ran mewn rheoleiddio adamsugniad calsiwm, glycolysis/gluconeogenesis, signalau adrenergig, a metaboledd pyrwfad ac fe'u disbyddwyd yn hUC-MSCExos a hiPSC-Exos. Rhestrir proteinau yn y gwahanol glystyrau yn Ffeil Ychwanegol 4.

proffiliau miRNA o'r tri math exosome

Er mwyn ymchwilio i broffiliau miRNA y tri math ecsosomaidd, cafodd cyfanswm yr RNA ei ynysu o ecsosomau i gyplu'r pennau 5' a 3' ar gyfer trawsgrifio gwrthdro dilynol. Defnyddiwyd y cDNA a gafwyd ar gyfer adeiladu llyfrgelloedd a phrofion eang. Rhif uniondeb RNA (RIN) oedd 2.7, 2.6, a 2.6 yn hESC-Exos, hiPSC-Exos, a hUC-MSC-Exos, yn y drefn honno (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S9A). Datgelodd penderfyniad crynodiad RNA fod hESC-Exos yn dominyddu'r llwyth RNA, ac yna hiPSC-Exos a hUC-MSCExos (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S9B). Defnyddiwyd cyfernod cydberthynas Pearson (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S9C) a PCA (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S9D) i werthuso ailadroddadwyedd miRNAs yn feintiol. Defnyddiwyd mapiau gwres i gynrychioli'r miRNAs a fynegwyd yn wahaniaethol yn y tri math exosome (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S9E), a nifer y miRNAs a fynegwyd yn wahaniaethol yn P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Er mwyn ymchwilio i'r miRNAs sy'n ymwneud â phrosesau biolegol, cafodd y miRNAs uchaf eu hidlo yn P<0.05 and read count>1000 ar gyfer rhagfynegiad genynnau targed pellach. Roedd genynnau cyfoethog wedyn yn destun dadansoddiadau GO a KEGG. Dangosodd y canlyniadau fod miRNAs hESC-Exos wedi effeithio'n sylweddol ar y prosesau canlynol: Rap1, PI3K-AKT, calsiwm, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, cylchred celloedd, llwybr signalau AMPK, ac ati (dadansoddiad KEGG) (Ffig. 5D), a y gylchred gell, datblygiad organeb lluosog, trawsgludiad signal mewngellol, gwahaniaethu celloedd, heneiddio, signalau Wnt, a metaboledd asid brasterog. (proses fiolegol) (Ffig. 5G). Nododd cyfoethogi genynnau targed o hiPSC-Exos miRNAs fod y prosesau canlynol wedi'u rheoleiddio'n sylweddol: PI3K-AKT, Rap1, Ras, Calsiwm, Hippo, cAMP, a llwybr signalau cGMP-PKG, ac ati (dadansoddiad KEGG), a'r cylchred celloedd, datblygiad organebau lluosog, ffosfforyleiddiad, gwahaniaethu celloedd, mudo celloedd, ac ymateb i hypocsia. (proses fiolegol) (Ffig. 5H). Yn y rhwydwaith rheoleiddiol o hUC-MSC-Exos miRNAs, y prosesau biolegol mwyaf credadwy oedd: Rap1, Ras, PI3K-AKT, calsiwm, cAMP, Hippo, y cylchred celloedd, JAK-STAT, a llwybr signalau HIF-1 . (Dadansoddiad KEGG) (Ffig. 5F), a ffosfforyleiddiad, trawsgludiad signal mewngellol, rhwymo ATP, rhaniad celloedd, metaboledd lipid, cyd-symbyliad cell T, gwella clwyfau, rhwymo NF-κB, ac ymateb llidiol. (proses fiolegol) (Ffig. 5 I). Darluniwyd rhwydwaith y pum miRNA uchaf a'u llwybrau rheoleiddiol hefyd (Ffeil ychwanegol 1: Ffig. S10).

【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】