Mae targedu Cathepsin B Gan Cycloastragenol yn Gwella Imiwnedd Antitumor Celloedd CD8 T Trwy Atal Diraddio MHC-I Rhan 1

ABSENOLDEB

CefndirMae colli antigenau tiwmor a disbyddu celloedd CD8 T a achosir gan y llwybr PD-1/PD-L1 yn ffactorau pwysig ar gyfer dianc imiwn tiwmor. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, bu ymchwil gynyddol ar feddyginiaeth draddodiadol Tsieineaidd mewn trin tiwmor. Canfuwyd bod Cycloastragenol (CAG), moleciwl gweithredol effeithiol yn Astragalus membranaceus, â swyddogaethau gwrthfeirysol, gwrth-heneiddio, gwrthlidiol a swyddogaethau eraill. Fodd bynnag, nid yw ei effaith antitumor a mecanwaith yn glir.

Gall glycoside cistanche hefyd gynyddu gweithgaredd SOD ym meinweoedd y galon a'r afu, a lleihau'n sylweddol y cynnwys lipofuscin a MDA ym mhob meinwe, gan ysbeilio radicalau ocsigen adweithiol amrywiol (OH-, H₂O₂, ac ati) yn effeithiol a diogelu rhag difrod DNA a achosir. gan OH-radicaliaid. Mae gan glycosidau ffenylethanoid Cistanche allu chwilota cryf o radicalau rhydd, gallu lleihau uwch na fitamin C, gwella gweithgaredd SOD mewn ataliad sberm, lleihau cynnwys MDA, a chael effaith amddiffynnol benodol ar swyddogaeth pilen sberm. Gall polysacaridau cistanche wella gweithgaredd SOD a GSH-Px mewn erythrocytes a meinweoedd yr ysgyfaint llygod senescent arbrofol a achosir gan D-galactos, yn ogystal â lleihau cynnwys MDA a cholagen yn yr ysgyfaint a phlasma, a chynyddu cynnwys elastin, wedi effaith sborion dda ar DPPH, ymestyn amser hypocsia mewn llygod senescent, gwella gweithgaredd SOD mewn serwm, ac oedi dirywiad ffisiolegol yr ysgyfaint mewn llygod senescent arbrofol Gyda dirywiad morffolegol cellog, mae arbrofion wedi dangos bod gan Cistanche y gallu gwrthocsidiol da ac mae ganddo'r potensial i fod yn gyffur i atal a thrin clefydau heneiddio'r croen. Ar yr un pryd, mae gan echinacoside yn Cistanche allu sylweddol i ysbeilio radicalau rhydd DPPH ac mae ganddo'r gallu i ysbeilio rhywogaethau ocsigen adweithiol ac atal diraddio colagen a achosir gan radical rhad ac am ddim, ac mae hefyd yn cael effaith atgyweirio da ar ddifrod anion radical rhad ac am ddim thymin.

Cliciwch ar cistanche manteision ac anfanteision

【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

DulliauYmchwiliwyd i effaith antitumor CAG mewn modelau tiwmor wedi'i drawsblannu â llygoden MC38 a CT26. Dadansoddwyd effaith gwrth-tiwmor CAG ymhellach trwy ddilyniannu aml-omeg ungell. Defnyddiwyd technoleg proffilio hygyrchedd sy'n ymateb i dargedau i ddod o hyd i brotein targed CAG. Yn dilyn hynny, archwiliwyd mecanwaith gwrth-tiwmor CAG gan ddefnyddio microsgopeg confocal, imiwnodiad, a thrawsnewidiad plasmidau mutant. Yn olaf, ymchwiliwyd i effaith gwrth-tiwmor cyfun gwrthgyrff CAG a PD{-1 mewn llygod neu organoidau.

CanlyniadauCanfuom fod CAG i bob pwrpas yn atal twf tiwmor mewn vivo. Dangosodd ein hatlas aml-omeg un-gell fod CAG yn hyrwyddo cyflwyniad antigenau arwyneb celloedd tiwmor a'i fod wedi'i nodweddu gan swyddogaeth lladd uwch celloedd CD8 ynghyd â T. Yn fecanyddol, rhwymodd CAG at ei darged protein catepsin B, a oedd wedyn yn atal diraddiad lysosomaidd cymhlyg histocompatibility mawr I (MHC-I) ac yn hyrwyddo agregiad MHC-I i'r gellbilen, gan roi hwb i rag-orsafiad yr antigen tiwmor. . Yn y cyfamser, fe wnaeth y cyfuniad o CAG a gwrthgorff PD-1 wella'n effeithiol y celloedd tiwmor lladd tiwmor CD8 ynghyd â T mewn llygod xenograft ac organoidau canser colorectol. Casgliad Adroddodd ein data am y tro cyntaf bod is-reoleiddio cathepsin B yn rhoi imiwnedd gwrth-tiwmor a dyddiadau exp ar fecanwaith gwrth-tiwmor naturiol y cynnyrch CAG.

RHAGARWEINIAD

Canser y colon a'r rhefr yw un o'r canserau mwyaf cyffredin ledled y byd. Mae ei gyfradd mynychder a chyfradd marwolaethau ymhlith y tri uchaf, gan fygwth bywyd dynol ac iechyd yn ddifrifol.1 Mae dulliau triniaeth cyffredin yn cynnwys cemotherapi a radiotherapi llawfeddygol, cyffuriau wedi'u targedu, ac imiwnotherapi.2–4 Fodd bynnag, mae celloedd canser fel arfer yn dangos colled o antigenau arwyneb a mynegiant lefelau uchel o foleciwlau atal i ddianc rhag gwyliadwriaeth celloedd imiwn. Felly, er mwyn datrys y broblem o ddianc rhag imiwn tiwmor, mae ymchwilwyr wedi datblygu atalyddion pwynt gwirio imiwnedd a therapi neoantigen i rwystro cuddio celloedd canser i gelloedd imiwn.5–8 Er y gall atalyddion pwynt gwirio imiwnedd adfer y celloedd imiwnedd sydd wedi'u disbyddu, antigen arwyneb canser celloedd heb eu gwella'n sylweddol. Felly, mae'n arbennig o bwysig dod o hyd i gyffuriau a all hyrwyddo e-gyflwyniad o antigenau arwyneb tiwmor. Mae TCR yn derbyn yr antigen sy'n bresennol gan y gell dendritig / protein cellbilen canser CI ac yn trosglwyddo'r signal i gysylltu CD3 yn dynn, sydd wedyn yn ymestyn yn ddyfnach i'r cytoplasm.9 10 Ar yr un pryd, gydag actifadu signal CD28/ B7 , gellir cydactifadu celloedd CD8 plws T i adnabod a lladd celloedd canser.11 Mae astudiaethau diweddar wedi canfod, yn y broses o ddilyniant tiwmor, bod lysosomau yn arwain at leihau agregiad MHC-I ar wyneb celloedd canser, nad yw'n effeithiol. antigenau presennol.12 13 Adroddodd Liu et al y gall atal PCSK9 atal diraddio MHC-I mewn lysosomau a galluogi MHC-I i ddychwelyd i'r gellbilen i gyflwyno antigenau.12 Felly, adfer y swyddogaeth cyflwyno antigenau o MHC-I yn arbennig o bwysig ar gyfer rhwystro dianc imiwn tiwmor.

Mae nifer cynyddol o astudiaethau wedi canfod bod y defnydd o foleciwlau gweithredol o feddyginiaeth Tsieineaidd draddodiadol n ymyrraeth gwrth-tiwmor yn cynnig rhagolygon gwych.14 15 Mae cycloastragenol (CAG) yn foleciwl gweithredol effeithiol n Astragalus membranaceus, sydd â gwrthfeirysol, gwrthfacterol, gwrth-diwmor ymfflamychol, ac effeithiau ffarmacolegol eraill, ond anaml yr adroddir ar ei effaith antitumor.16–19 Yn yr astudiaeth hon, canfuom fod CAG yn atal twf tiwmorau tra anted tiwmorau canser y colon Roedd y mecanwaith yn bennaf yn golygu atal diraddio MHC-I, wedi'i gyfryngu gan cathepsin B (CTSB), hyrwyddo cyflwyniad antigen celloedd canser, ac yna gwella gallu lladd celloedd CD8 ynghyd â T.

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Gwrthgyrff ac adweithyddion

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 y cant). Gwrthgyrff CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Actin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ), a Phecyn Canfod Imiwnohistocemeg Gwrth-lygoden/cwningen (Cat#PK10006) eu prynu oddi wrth Proteintech. Gwrthgyrff H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), a CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) eu prynu oddi wrth Santa Cruz Biotechnology. Prynwyd Antibody of Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142 ) gan Cell Signaling Technology. Prynwyd gwrthgorff Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) oddi wrth Abcam. Gwrthgyrff sytometreg llif o CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) a CD{ {31}}Prynwyd PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) gan BD Bioscience. Prynwyd gwrthgorff cytometreg llif Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575 ) gan BioLegend. gwrthgyrff sytometreg llif NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) ac IFN- -PE (Cat#12-7311-81), RRID :AB_466192) eu prynu oddi wrth Thermo Fisher Scientific. Prynwyd cyfrwng DMEM (Cat#{{01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122), a Serwm Buchol Ffetws (Cat#C04001-500) oddi wrth Biological Industries. Prynwyd serwm gafr (Cat#88RNG001) a Phecyn assay protein BCA Pierce (Cat#23225) gan Thermo Fisher Scientific. Gwrthgyrff PD gwrth-ddynol-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) a PD gwrth-lygoden-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) eu prynu o gell Bio X. Prynwyd Pecyn Daduniad Meinwe Tiwmor MACS (Cat#130-095-929) gan Miltenyi Biotec.

Diwylliant celloedd

Cafodd llinellau celloedd canser y colon y llygoden MC38 a CT26 eu cynnal yn ein labordy.20 Cafwyd llinellau l canser y colon dynol HCT-116 o Gasgliad Diwylliant Math yr Academi Gwyddorau Tsieineaidd (Shanghai, Tsieina). Cafodd y celloedd MC38, CT26, a HCT-116 eu meithrin mewn cyfrwng DMEM yn cynnwys 10 y cant o serwm buchol ffetws ac 1 y cant o benisilin/streptomycin ar 37 gradd mewn deorydd CO2 o 5 y cant.

Arbrawf tiwmor trawsblannu

Prynwyd llygod C57BL/6JGpt benywaidd chwe wyth wythnos oed, llygod BALB/c, a llygod noethlymun BALB/,c oddi wrth GemPharmatech (Nanjing, Tsieina). Cafodd celloedd canser MC38 neu CT26 (1 × 106) eu brechu yn isgroenol i bob llygoden. Ar y tiwmor yn tyfu i 100 mm3, rhannwyd y meic ar hap yn grŵp halwynog byffer ffosffad (PBS) (ee, unwaith y dydd) a'r grŵp CAG (ee, 50mg / kg unwaith y dydd). Pennwyd cyfeintiau tiwmor trwy fesur caliper gan ddefnyddio'r fformiwla V=hyd × lled2 /2. Pan gyrhaeddodd cyfaint tiwmor llygod y grŵp PBS 1000 mm3, tynnwyd tiwmor llygod allan, tynnwyd llun ohono a'i bwyso.

Daduniad cell sengl o'r llygoden ar gyfer RNA/ATACseq un gell

Cafodd tiwmorau solet o lygod eu treulio gan ddefnyddio Pecyn Daduniad Tiwmor i gael celloedd ungell sengl. Cell sengl s sengl gyda chrynodiad o 1000 o gelloedd/1000 o gelloedd wedi'u llwytho ar y rheolydd cromiwm 10 × genomeg celloedd sengl cell sengl yn dilyn protocol y gwneuthurwr genomeg 10 ×. Cymysgwyd adweithyddion trawsgrifio gwrthdro, gleiniau gel cod bar, ac olew rhaniad â'r celloedd ar gyfer gen i gynhyrchu gleiniau gel mewn emylsiynau (GEM) ar gyfer trawsgrifio gwrthdro. rhagbrosesu data scRNA-seq a rheoli cei.

Yn seiliedig ar y genom cyfeirnod llygoden GRCm38 (mm10), piblinell CellRanger V.4.0.0 (10×Genomeg) i brosesu RNA un gell data dilyniant ar gyfer pob arbrawf (GSE197229). Cafodd matricsau mynegiant genynnau digidol eu zed yn R (V.4.0.4) gan ddefnyddio'r pecyn Seurat (V.4.0.0).21 Cyn dadansoddiad dBeforem, roedd celloedd yn cael eu hidlo yn ôl rhif UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Rhagbrosesu data SeaTac-seq a rheoli ansawdd

Cafodd y data un gell ATAC-seq (GSE197229) eu rhagbrosesu gan geidwad cell-yn (V.2.0.{5}}) gyda'r llinell orchymyn cyfrif. Ar gyfer prosesu a dadansoddi data scATAC-seq dilynol, defnyddiwyd y pecyn ArchR (V.1.0.1). ffeil saeth gyda'r swyddogaeth cre ArrowFiles gyda'r paramedrau rhagosodedig. Nesaf, gwnaethom ddefnyddio'r swyddogaeth filterDoublets i ddileu'r dyblau posibl a chreu prosiect ArchR gan ddefnyddio'r swyddogaeth ArchRProject gyda pharamedrau rhagosodedig. Yna fe wnaethom ddefnyddio'r pecyn Harmony i gael gwared ar yr effaith swp gan y swyddogaeth addHarmony.25 Ar gyfer lleihau dimensiwn, rydym yn defnyddio'r swyddogaeth addIterativeLSI yn ArchR i redeg gyda'r paramedrau def t. Ar gyfer mewnosod un gell, fe wnaethom ddewis y gwrthrych llai Dims gyda harmoni a defnyddio'r swyddogaeth addTSNE gyda'r paramedr 'perplexity=30' ar gyfer delweddu.

Dadansoddiad integredig o ddata siRNA-seq a scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Er mwyn gwella cywirdeb y rhagfynegiadau i integreiddio'r ddwy set ddata yn well, fe wnaethom unwaith eto integreiddio'r data scATAC-seq a scRNA-seq gan ddefnyddio'r modd 'integreiddio cyfyngedig'. Yn gryno, fe wnaethom anodi data scATAC-seq gyda mathau o gelloedd yn seiliedig ar sgoriau genynnau scATAC-seq. Yna, fe wnaethon ni greu rhestr gyfyngedig fel bod tebygrwydd mynegiant genynnau yn cael ei gyfrifo yn yr un math o gell yn unig ar gyfer scATAC-seq a scRNA-seq. Datgelodd clystyru heb oruchwyliaeth gyda t-SNE 13 clwstwr o is-gelloedd, a gafodd eu hanodi gan farcwyr hysbys neu dybiedig yn Nhabl 1 atodol ar-lein.

Trywydd llinach ffug-amser

Tybiwyd trywydd llinach celloedd canser trwy ddefnyddio pecyn Monocle2 (V.2.18.0) R.26 Mae monocytes yn dysgu'r prif graff penodol o ddata genomeg un-gell trwy Mewnosod Graff Wedi'i Wrthdroi i ddidoli celloedd, a thrwy hynny ddatrys cymhleth prosesau biolegol yn gadarn ac yn gywir.27 Defnyddiwyd y swyddogaeth ''GeneTest gwahaniaethol'' i ddeillio DEG o bob clwstwr, ac ar ôl llunio'r taflwybr cell, canfuwyd y genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol yn yr amser ffug. Cafodd pob genyn ffug-ddibynnol ei ddelweddu gan y ffwythiant map gwres plot_ffug-amser_yn cymryd gwrthrych CellDataSet. Cynhyrchwyd plotiau taflwybr llinach a chromliniau mynegiant llyfn yn seiliedig ar CellDataSet gan blotio_cell_taflwybr a phlot_genynnau_yn_ffugamser, yn y drefn honno.28

Galwad amrywio rhif copi un gell

Er mwyn nodi celloedd malaen ag amrywiadau rhif copi cromosomaidd clonal ar raddfa fawr (CNV), defnyddiwyd y pecyn inferCNV R i gasglu proffiliau genetig pob cell yn seiliedig ar fynegiant cyfartalog setiau genynnau mawr ym mhob rhanbarth cromosomaidd o'r genom tiwmor o'i gymharu â celloedd normal.29 Ar sail sampl wrth sampl, defnyddiwyd y celloedd imiwn fel cyfeiriad i amcangyfrif CNVs yn y celloedd sy'n gysylltiedig â chanser.

Dadansoddiad cyfoethogi

Perfformiwyd dadansoddiadau anodi llwybr KEGG a GO gan ddefnyddio'r pecyn R clusterProfiler (V.3.11.1) gyda pharamedrau PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10, a MaxGSSize=500.20Cymhwyswyd dadansoddiad cyfoethogi set Genynnau (GSEA) gan ddefnyddio 50 set genynnau dilysnod (h.all.V.7.4.symbols. gmt) i nodi a gyfoethogwyd yn sylweddol llwybrau swyddogaethol trwy feddalwedd GSEA (V.4.1.0), gyda meini prawf sgrinio gwerth P enwol<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Dadansoddiad PCR meintiol amser real

Cafodd celloedd MC38 a HCT-116 eu hadu mewn platiau chwe ffynnon am 6 awr ac yna eu trin â CAG am 24 awr arall. Cafodd y celloedd eu golchi deirgwaith gyda PBS oer, a'u centrifugio ar 18{0g am 5 munud ar 4 gradd . Ar yr un pryd, ar ôl malu meinwe'r tiwmor. Echdynnwyd cyfanswm RNA o gelloedd MC38, HCT-116, a meinwe tiwmor gan ddefnyddio'r adweithydd TRIzol, yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cyfaint yr adwaith oedd 20µL yn cynnwys: 1µg RNA, 5µL 5×Hiscript III qRT SuperMix, a RNase Free dH2 O. Roedd y cDNA yn destun PCR meintiol, gyda chyfaint adwaith o 10µL gyda 1µL cDNA, 5µL qPCR cymysgedd, 5µL qPCR 0µ5M 0µM. (Ymlaen a Chwith), a 3.25µL dH2 di-RNase O. Cafodd y paent preimio eu syntheseiddio gan GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Tsieina) yn ôl y dilyniannau canlynol (tabl atodol ar-lein 2).

Darganfod targedau trwy ddull proffilio hygyrchedd sy'n ymateb i darged

Perfformiwyd sgrinio proteinau sy'n rhwymo CAG fel y disgrifiwyd yn flaenorol.31 32 Yn gryno, defnyddiwyd y dull proffilio hygyrchedd targed-ymatebol (TRAP) i ddarganfod y proteinau rhwymol ar gyfer CAG yn y milieu celloedd trwy fonitro lysin a achosir gan ymgysylltu ligand newidiadau hygyrchedd ar lefel proteome. Yn gryno, cafodd dwy ddysgl o gelloedd eu trin â 10µM CAG a dimethyl sulfoxide (DMSO), yn y drefn honno. Ar ôl deori 1-awr, cafodd celloedd eu treiddio trwy glustog M-PER (Thermo Scientific) a chafodd y lysadau canlyniadol eu labelu'n cofalent trwy ychwanegu fformaldehyd a chymhlyg pyridin borane sydd gyda'i gilydd yn labelu gweddillion lysin proteinaidd yn benodol ar dymheredd ystafell ar gyfer proffilio hygyrchedd. . Yna, cafodd y lysates eu gwaddodi gan doddydd organig, ac ail-hydoddwyd y pelenni a gasglwyd mewn wrea 8mol / L, wedi'i leihau gan dithiothreitol (DTT) ar 56 gradd am 30 munud, ac yna alkylation gan ddefnyddio iodoacetamide (IAA) mewn tywyllwch am 30 munud. Ychwanegwyd swm priodol o ddatrysiad DTT eto i adweithio ag IAA gormodol. Yn dilyn hynny, cafodd y proteome ei wanhau â hydoddiant amoniwm bicarbonad nes bod y crynodiad terfynol o wrea yn cyrraedd 1mol/L. Cafodd y crynhoadau protein a gasglwyd eu dihalwyno ar golofnau C18 HLB (Waters, Milford, Massachusetts, UDA), a chafodd y peptidau cyfoethog eu sychu a'u hailgyfansoddi mewn hydoddiant dyfrllyd asid fformig (FA) o 0.1 y cant. Defnyddiwyd system AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) i ddadansoddi'r samplau ar gyfer proffilio meintiol o'r newidiadau hygyrchedd lysin mewn ymateb i rwymo CAG ar gyfer darganfod targed. Defnyddiwyd caffael dibyniaeth data yn y modd cadarnhaol ar gyfer caffael data. Perfformiwyd dadansoddiad data gan ddefnyddio PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Canada). Yn benodol, dewiswyd alkylation cys fel addasiad sefydlog, a gosodwyd ocsidiad methionine a dimethylation lysin, a gyflawnwyd gan labelu TRAP, fel addasiadau amrywiol. Yn fyr, neilltuwyd peptidau sy'n cynnwys dimethylation a achosir gan TRAP ac a ddangosodd newidiadau helaethrwydd sylweddol gyda deoriad CAG a hebddo fel peptidau sy'n ymateb i darged. Mae cymhareb helaethrwydd pob peptid wedi'i labelu â TRAP yn nodi maint y newid hygyrchedd ac mae'n gysylltiedig yn agos ag affinedd sy'n rhwymo ligand. Cynhaliwyd prawf-t y myfyriwr i asesu a yw'r newidiadau hygyrchedd a ganfuwyd mewn peptidau wedi'u labelu yn ystadegol arwyddocaol. Gwerth-p rhwng grŵp (t<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Diwylliant organoid

Adeiladwyd a thyfu'r organoidau canser colorefrol dynol gan Chongqing Kingbiotech.33 Cafodd samplau meinwe cleifion a gafwyd gan y llawdriniaeth lawfeddygol eu briwio'n ddarnau cyn lleied â phosibl â siswrn di-haint. Cymysgwyd y darnau meinwe yn drylwyr gyda Matrigel (Corning, Cat # 356231) ar y gymhareb fras o 1:4 ar rew. Roedd y prosesu dilynol yn cyfeirio at brotocolau cyhoeddedig. Yn gryno, cafodd y darnau - ataliadau Matrigel eu hadu'n gyflym yn y plât multiwell i ffurfio defnynnau hemisfferig a'u trosglwyddo i 37 gradd am 15-20 munud, gan ganiatáu i'r defnynnau gael eu cadarnhau. Ychwanegu'r swm priodol o gyfrwng diwylliant (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​at bob ffynnon, a newid y cyfrwng bob 2–4 diwrnod.

Ynysu a diwylliant celloedd dynol CD8 T

Ychwanegwch yr un cyfaint o halwynog arferol i waed ymylol pobl iach sy'n cynnwys gwrthgeulyddion i wanhau'r gwaed cyfan. Ychwanegwch gyfaint penodol o doddiant gwahanu i diwb centrifuge 15mL, ychwanegwch y gwaed cyfan gwanedig yn araf ar hyd wal y tiwb i ben y toddiant gwahanu, a'r centrifuge ar 750g am 20 munud. Ar ôl allgyrchu, defnyddiwch bibed i sugno'r monocytes yn yr haen wen ganol yn ofalus i mewn i diwb centrifuge 15mL, ychwanegu cyfaint penodol o PBS i'w ail-ddarparu, centrifuge 250g am 5 munud, a thaflu'r supernatant. Ar ôl ychwanegu gleiniau magnetig CD8 dynol i'r gwaddodion cell, didolwyd celloedd T CD8 gan golofn didoli LS. Ychwanegwyd celloedd T CD8 at y plât tyllog wedi'i rag-orchuddio â gwrthgorff 5µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578), ac yna 10ng/mL IL{{15} Ychwanegwyd gwrthgyrff swyddogaethol } (Peprotech Cat# 212-12) a 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) am 24 awr.

Coddiwylliant

Ar ôl i'r organoidau gael eu deor â CAG am 24 awr, disodlwyd y cyfrwng diwylliant ffres, ac yna ataliwyd yr organoidau a'r celloedd CD8 T activated yn y gel matrics, yna ychwanegwyd yr ataliad at y plât chwe ffynnon a'i osod yn y 37 deorydd gradd am 15 munud, ac yna ychwanegwyd cyfrwng diwylliant cyflawn di-serwm 2mL am 24 awr.

Blot gorllewinol

Cafodd celloedd MC38 a HCT-116 eu hadu mewn platiau chwe ffynnon am 6 awr ac yna eu trin â CAG am 24 awr arall. Golchwyd y celloedd deirgwaith gyda PBS oer, a'u centrifugio ar 180g am 5 munud ar 4 gradd. Cafodd cyfanswm y protein ei lysed â lysis WB-IP yn cynnwys atalydd proteas 1 y cant am 30 munud ar rew. Aseswyd cyfanswm y protein gan ddefnyddio pecyn meintioli protein BCA. Gwahanwyd samplau protein gan electrofforesis gel polyacrylamid SDS 10 y cant -12 y cant a'u trosglwyddo i bilenni PVDF (fflworid polyvinylidene) ar 350 mA am 90 munud. Cafodd y pilenni PVDF eu rhwystro gyda 5 y cant BSA am 1 awr, y stribedi gyda'r gwrthgorff cynradd a nodwyd dros nos, a gyda'r gwrthgorff eilaidd yn cael ei ddeor am 90 munud ar dymheredd ystafell. Yn olaf, canfuwyd y stribedi gan ddefnyddio system swbstrad cemiluminescent LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, UDA).

Cytometreg llif

Ar ôl treulio meinwe tiwmor a pharatowyd yr ataliad un-gell. Perfformiwyd staenio arwyneb gyda gwrthgyrff antigen arwyneb yn y byffer FCM (Llif Cytometreg) (PBS sy'n cynnwys 1 y cant FBS) a'i staenio ar rew gyda gwrthgyrff priodol am 30 munud. Defnyddiwyd llifynnau adweithiol (eBioscience) i ddileu celloedd marw. Perfformiwyd staenio cytocin mewngellol gyda hydoddiant sefydlog celloedd BD / hydoddiant pilen allgellog, a chafodd y celloedd eu gosod a'u treiddio, ac yna eu staenio â gwrthgyrff yn erbyn cytocinau mewn byffer Perm / Wash (BD Biosciences).

Trawsnewidiwyd plasmidau mutant CTSB

Cafodd celloedd HCT{0}} eu hadu mewn 6-blatiau ffynnon am 12 awr ac yna eu trawsgyfeirio â phlasmidau mutant CTSB-WT-EGFP neu CTSB (Y75A, A77V, a G198A) am 36 awr.

Ymyrraeth trawsnewid neu plasmid gorfynegiant o CTSB i mewn i gelloedd MC38 neu gelloedd HCT-116

Cafodd celloedd MC38 (1 × 106 / ffynnon) eu brechu mewn 6-blatiau ffynnon am 6 awr, yna eu trawsosod â RNA ymyrryd CTSB (dilyniant: Ymlaen-GGACAUAGAUCUACCUGAATT a Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) am 48 awr, a'r mRNA neu lefelau mynegiant protein o Ctsb a H2-k1 wedi'u canfod. Cafodd celloedd HCT-116 (1 × 106 / ffynnon) eu brechu mewn 6-blatiau ffynnon am 6 awr, yna eu trawsosod ag ymyrraeth CTSB (dilyniant: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) neu plasmid gorfynegiant am 48 awr, a'r mRNA neu lefelau mynegiant protein o CTSB a HLA-A.

Technoleg tocio

Lawrlwythwyd strwythur 3D CTSB o'r Gronfa Ddata Protein (PDB ID: 2iPP), a lawrlwythwyd strwythurau CAG o PubChem. Perfformiwyd y broses docio yn Autodock 2 gyda thocio bras gan ddefnyddio algorithm anelio efelychiedig a mireinio dilynol gan ddefnyddio algorithm genetig.

Assay sifft thermol cellog

Cafodd y celloedd MC38 eu hadu mewn platiau 10cm dros nos ac yna eu trin â CAG neu 0.1 y cant DMSO am 2 awr arall. Casglwyd y celloedd, eu golchi â PBS oer, a'u centrifugio ar 180g am 5 munud. Yna rhannwyd y celloedd yn gyfartal yn diwbiau centrifugation (70µL pob tiwb) a'u gwresogi am 3 munud ar y tymheredd canlynol: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, a 67 gradd, cafodd y samplau eu hoeri am 3 munud ar dymheredd a yna cadw ar ia. Yna, rhoddwyd y samplau mewn oergell ar −80 gradd dros nos. Cafodd y samplau eu dadmer ar dymheredd ystafell am 30 munud ac yna eu rhoi yn yr oergell ar −80 gradd am 4 awr. Yn olaf, cafodd y samplau eu centrifugio ar 12, 000g am 25 munud, ychwanegwyd y supernatant at y byffer llwytho, a'i ddadansoddi gan Western blotting.

Staenio imiwnohistocemegol

Cafodd adrannau paraffin o feinwe tiwmor eu trochi mewn sylene am 20 munud i wyro, ac yna mewn 100 y cant, 75 y cant, a 50 y cant ethanol am 10 munud. Ar ôl i'r sleisys gael eu hatgyweirio antigen gyda thoddiant atgyweirio antigen citrad sodiwm, anactifwyd y hydrogen perocsid mewndarddol gyda 3 y cant o hydrogen perocsid. Ar ôl blocio gyda serwm gafr 5 y cant am 1 awr, ychwanegwyd y gwrthgorff gwrth-Ki67 (1:200) a'i ddeor dros nos ar 4 gradd . Ychwanegwyd y polymer HRP gwrth-lygoden/cwningen (100µL) wedi'i labelu a chafodd samplau eu deor ar 37 gradd am 30 munud, ac yna 100µL o hydoddiant gweithio DAB, a deor ar dymheredd ystafell am 5 munud. Ar ôl 1 munud o staenio â hematoxylin, golchwyd samplau mewn 50 y cant, 75 y cant, a 100 y cant ethanol a sylene am 5 munud, a defnyddiwyd gwm niwtral i selio'r ffilm. Arsylwyd y ffilm a thynnwyd llun ohono dan ficrosgop.

Ystadegoldadansoddi

Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism (V.8.0). Mynegir yr holl ganlyniadau fel cymedr ± SEM tri arbrawf annibynnol. Defnyddiwyd dadansoddiad un ffordd o amrywiant a ddilynwyd gan brawf post hoc Dunnett i werthuso'r gwahaniaethau pan oedd mwy na dau grŵp. Defnyddiwyd prawf-t y Myfyriwr i werthuso'r gwahaniaeth arwyddocaol rhwng y ddau grŵp. Gosodwyd arwyddocâd ystadegol yn t<0.05.

CANLYNIADAU

Dadansoddiad aml-omeg ungell o CAG yn atal twf canser y colon a drawsblannwyd mewn llygod

Er mwyn ymchwilio i weld a oes gan CAG effaith gwrth-tiwmor, fe wnaethom drawsblannu celloedd canser MC38 i lygod C57BL/6 yn gyntaf. Gwnaethom nodi bod CAG yn atal twf tiwmorau yn sylweddol (ffigur atodol ar-lein S1A, B). Yn dilyn hynny, fe wnaethom drawsblannu celloedd CT26 i lygod BALB / c a chanfod bod CAG hefyd yn atal twf tiwmorau (ffigur atodol ar-lein S1C, D).

Er mwyn datgelu ymhellach y mecanwaith penodol y mae CAG yn ei ddefnyddio i atal twf tiwmor, fe wnaethom ei ddadansoddi gan ddefnyddio'r technegau scRNA-seq a scATAC-seq (ffigur 1A). Rhannwyd y boblogaeth celloedd yn bedwar grŵp: celloedd canser, ffibroblastau, celloedd myeloid, a lymffocytau (ffigur 1B, ffigur atodol ar-lein S2A, B). Canfuom fod celloedd canser (52 y cant) a ffibroblastau (41 y cant) wedi'u treiddio'n bennaf mewn meinweoedd tiwmor, tra bod celloedd imiwn yn cyfrif am 7 y cant yn unig. Yna rhannwyd celloedd canser yn wyth is-set a ffibroblastau yn dri is-set (ffigur 1C–E). Yn dilyn hynny, dangosodd y dadansoddiad cyfoethogi o enynnau a fynegwyd yn uchel ym mhob poblogaeth cell fod llwybrau moleciwlaidd MHC-I mewn celloedd canser yn cael eu cyfoethogi, yn ogystal â signalau antitumor celloedd T a chelloedd NK (ffigur atodol ar-lein S2C). Yna, canfuwyd pedwar grŵp o gelloedd hefyd gan ddefnyddio dadansoddiad integreiddio scATAC-seq a scRNA-seq (ffigur 2D-G). Yn dilyn y gymhariaeth, canfuom fod celloedd canser (celloedd C01, C03), CD8 ynghyd â chelloedd T, Spp1 ynghyd â chelloedd TAM, a ffibroblastau (celloedd F01 a F02) yn ymddangos mewn dilyniant ATAC (ffigur 1F, G), ac ymhellach, wedi'i fynegi'n fawr. cyfoethogwyd ffactorau trawsgrifio yn y celloedd hyn (ffigur 1H). Trwy'r dadansoddiadau hyn, rydym yn dyfalu bod atal twf tiwmor gan CAG yn gysylltiedig yn agos â newidiadau yn y celloedd hyn.

Mae Cag yn hyrwyddo cyflwyniad antigen celloedd tiwmor

Er mwyn dadansoddi mecanwaith antitumor CAG, fe wnaethom ddadansoddi'r boblogaeth celloedd tiwmor yn gyntaf a rhannu'r celloedd canser yn wyth is-grŵp (ffigur 2A, B, ffigur atodol ar-lein S3A). Dangosodd y canlyniadau, o gymharu â'r grŵp PBS, bod celloedd grŵp C05 wedi gostwng yn sylweddol tra bod celloedd grŵp C07 wedi cynyddu (ffigur 2C). Yn y cyfamser, i wirio cywirdeb ein clystyru celloedd tiwmor, gwnaethom gymharu CNV lymffocytau a chelloedd myeloid fel celloedd cyfeirio. Dangosodd y canlyniadau fod CNV celloedd canser yn sylweddol uwch na'r hyn o gelloedd imiwn (ffigur atodol ar-lein S3B). Wrth ddadansoddi'r is-setiau o gelloedd canser, canfuom fod y genynnau ymateb interferon Isg15, Irf7, Ifit3, ac Ifi47 wedi'u mynegi'n uchel ym mhoblogaethau celloedd C07 a C08 y grŵp CAG o'u cymharu â'r grŵp PBS (ffigur atodol ar-lein S3C). Canfu'r dadansoddiad o'r boblogaeth celloedd tiwmor fod llwybrau cysylltiedig â chyflwyniad antigen wedi'u cyfoethogi'n sylweddol mewn poblogaethau celloedd lluosog. Felly, rydym yn dyfalu y gallai CAG hyrwyddo cyflwyniad antigen celloedd canser i chwarae rôl antitumor (ffigur 2D). Yna, gwnaethom ddewis y genynnau sy'n gysylltiedig â chyflwyniad antigen a chanfod bod y lefel mynegiant yn y grŵp CAG yn sylweddol uwch na'r lefel yn y grŵp PBS (ffigur 2E, ffigur atodol ar-lein S3D). Gwelsom hefyd fod CAG yn hyrwyddo cyflwyniad antigen mewn meinweoedd tiwmor (ffigur 2F, G).

Nesaf, defnyddiwyd scATAC-seq i ddadansoddi'r rhesymau penodol y tu ôl i gyflwyniad antigen celloedd tiwmor sy'n hyrwyddo CAG. Gwelsom fod y boblogaeth celloedd tiwmor yn mynegi'n fawr y ffactorau trawsgrifio Fos, Junb, Jund, Fosb, a Fosl1 (ffigur 2H, I). Yn dilyn hynny, gwnaethom adeiladu map o'r rhyngweithio rhwng ffactorau trawsgrifio a genynnau cyfatebol i egluro bod CAG yn hyrwyddo mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â chyflwyno antigen celloedd tiwmor (ffigur 2J). Mewn meinweoedd tiwmor, canfuom hefyd fod ffactorau trawsgrifio Junb, Fos, Jund, a Fosb wedi'u gorfynegi'n sylweddol yn y grŵp PBS o dan driniaeth CAG (ffigur 2K-N, ffigur atodol ar-lein S3E-I). Hyd yn hyn, rydym wedi canfod y gall CAG hyrwyddo mynegiant ffactorau trawsgrifio genynnau sy'n gysylltiedig â chyflwyno antigen, a thrwy hynny wella swyddogaeth cyflwyno antigen celloedd canser. Fodd bynnag, mae sut mae'r celloedd canser hyn yn ymateb i ymatebion celloedd imiwnedd yn parhau i fod yn aneglur.

I ddatgelu'r ffenomen y mae CAG yn ei defnyddio i hyrwyddo cyflwyniad antigen celloedd canser, gwnaethom ddadansoddiad taflwybr i ymchwilio i sut mae celloedd canser yn newid ei gilydd mewn ymateb i ymatebion celloedd imiwn. Canfuom, dros amser, fod celloedd canser C07 wedi trawsnewid yn gelloedd C05, C06, a C08, a dangosodd cyfoethogi genynnau hefyd y byddai celloedd canser yn trawsnewid i gyflwyniad antigen (ffigur 3A-E).

Mae CAG yn gwella swyddogaeth lladd celloedd imiwnedd

Mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall CAG gyflwyno antigenau celloedd tiwmor, felly a fydd gwella cyflwyniad antigen celloedd tiwmor yn arwain at wella swyddogaeth celloedd imiwnedd? I ddarganfod hyn, fe wnaethom ddadansoddi lymffocytau a chelloedd myeloid, yn y drefn honno. Dangosodd y canlyniadau fod CAG yn hyrwyddo ymdreiddiad celloedd CD8 ynghyd â T mewn meinweoedd tiwmor, a chynyddwyd ymdreiddiad celloedd CD8 plus T a chelloedd NK hefyd, a ganfuwyd gan cytometreg llif (ffigur atodol ar-lein S4A-F). Gwelsom hefyd fod CAG wedi gwella mynegiant genynnau Ifitm2, Cxcr6, a S100a6 mewn celloedd CD8 ynghyd â T,

Genynnau Fcer1g, Gzmb, AW112010, a Zfp36i2 mewn celloedd NK, a genynnau Nfkbia a Junb mewn celloedd CD4 ynghyd â T (ffigur atodol ar-lein S4G). Cafodd mynegiant Ifng a Gzmb mewn celloedd CD8 a T hefyd ei wella'n sylweddol, fel y'i canfuwyd gan sytometreg llif (ffigur atodol ar-lein S4H, I). Ar ben hynny, canfuom, ar ôl triniaeth CAG, fod mynegiant y derbynyddion ataliol Lag3, Tigit, a Havcr2 ar wyneb celloedd CD8 ynghyd â T wedi gostwng, a mynegiant y genynnau Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5, a Pdcd1, sy'n nodweddu'r actifadu celloedd CD8 ynghyd â T yn sylweddol (ffigur atodol ar-lein S4J). Er mwyn gwirio ymhellach bod CAG wedi gwella swyddogaeth ladd celloedd CD8 ynghyd â T trwy hyrwyddo cyflwyniad antigen tiwmor gwell, fe wnaethom drawsblannu celloedd CT26 i diwmorau wedi'u trawsblannu mewn llygod noethlymun a gwelsom na allai CAG atal twf tiwmorau yn effeithiol (ffigur atodol ar-lein S4K-M ).

Yn dilyn hyn, dadansoddwyd celloedd myeloid gennym a chanfod bod celloedd Spp1 ynghyd â TAM wedi cynyddu ar ôl triniaeth CAG, tra bod nifer y celloedd C1qc ynghyd â TAM wedi gostwng a chynyddodd nifer y Il1b ynghyd â monocytau (ffigur atodol ar-lein S5A-D). Ar ôl triniaeth CAG, roedd celloedd Spp1 ynghyd â TAM a C1qc ynghyd â TAM yn fwy agored i drawsnewid TAM pro-llidiol. Canfu dadansoddiad cyfoethogi ei fod yn canolbwyntio'n bennaf ar Tnf-, Ifn-g, a'r llwybr signalau ymateb llidiol (ffigur atodol ar-lein S5E-H). Yn seiliedig ar y canlyniadau uchod, rydym yn casglu bod CAG yn gwella swyddogaeth adnabod a lladd celloedd imiwnedd trwy hyrwyddo cyflwyniad antigen mewn celloedd canser. Fodd bynnag, nid yw'n glir sut y caiff CAG ei reoleiddio.

Darganfod y protein targed CAG CTSB trwy fagl

Nesaf, byddwn yn ymchwilio i'r protein targed CAG penodol sy'n chwarae rôl antitumor. Dewisasom gelloedd canser fel gwrthrych yr ymchwil oherwydd canfuom y gall CAG wella cyflwyniad antigen celloedd canser, a thrwy hynny wella swyddogaeth lladd celloedd imiwn. Yn gyntaf, fe wnaethom syntheseiddio deilliad biotin CAG a chanfod mai dim ond 3-OH allai adweithio (ffigur atodol ar-lein S6A). Yna fe wnaethom ymchwilio a yw CAG-biotin hefyd yn hyrwyddo mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â chyflwyniad antigen yn llinell gell tiwmor llygoden MC38. Dengys y canlyniadau nad oedd CAG-biotin yn effeithio ar fynegiant genynnau H2-K1, Cd74, ac Anxa1 (ffigur atodol ar-lein S6B-D).

Felly, gwnaethom ddefnyddio'r dull chwilio targed TRAP blaenorol yn y labordy.32 Cafodd CAG a DMSO ill dau eu deor â llinell gell MC38 (ffigur 4A). Dewiswyd y protein gyda FC Mwy na neu'n hafal i 2 ac ap Llai na neu'n hafal i 0.05 fel y protein targed ymgeisydd o CAG. Gan ddilyn yr egwyddor y bydd rhwymo moleciwlau bach i broteinau yn arwain at effeithlonrwydd labelu isel lysin, dewisom y CTSB ar gyfer yr astudiaeth (ffigur 4B). Nesaf, gwnaethom ddefnyddio assay sifft thermol cellog (ffigur 4C) a thermofforesis microscale (MST) (ffigur 4D) i wirio'r rhwymiad rhwng CAG a CTSB, a chanfuwyd mai'r affinedd rhwng CAG a CTSB oedd 26.6nM (ffigur 4D). Yn dilyn hynny, rhagwelwyd y safleoedd rhwymo rhwng CAG a CTSB yn ôl strwythur grisial protein CTSB yn y llyfrgell PDB. Canfuom fod y grwpiau hydrocsyl ar ddau ben CAG a safleoedd ALA77 a GLY198 CTSB wedi’u rhwymo gan fond hydrogen, tra bod safleoedd TYR75, PRO76, ac ALA173 CAG a CTSB wedi’u rhwymo gan rym van der Waals (ffigur 4E) . Er mwyn gwirio'r safle rhwymo rhwng CAG a CTSB, fe wnaethom drawsnewid y plasmid mutant o CTSB mewn celloedd HCT-116. Mae'r canlyniadau'n dangos bod yr affinedd rhwng y plasmid mutant yn A77V a G198A a CAG gannoedd o weithiau'n uwch na'r plasmid WT (ffigur 4F, G). Yn yr adran nesaf, rydym yn archwilio'r mecanwaith penodol y mae CAG yn ei ddefnyddio i chwarae rôl gwrth-tiwmor trwy CTSB.

【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】