Effeithiolrwydd Sensitif i Oedran Cyfyngiad Calorïau Ar Fiogenesis Mitocondriaidd A Difrod MtDNA mewn Afu Llygoden Fawr 2
Jul 14, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
2.4.Effaith Oedran a CR ar Gynnwys a Difrod mtDNA
Gan fod cysylltiad agos rhwng dynameg mitocondriaidd a chynnal mtDNA [16,18], fe wnaethom bennu'r cynnwys mtDNA yn yr holl lygod mawr gan yr adwaith cadwynol polymeras meintiol (qPCR) (Ffigur 8).
Canfuwyd gostyngiad cysylltiedig ag oedran yng nghynnwys mtDNA yn y llygod mawr AL-28(-27 y cant ) a’r AL-32 (-23 y cant ) o gymharu â’r AL{{ 5}} anifail, ond nid oedd unrhyw wahaniaeth ystadegol rhwng y grwpiau AL-28 ac AL-32. Roedd CR yn effeithiol iawn o ran atal y gostyngiad cysylltiedig ag oedran yn y cynnwys mtDNA yn unig ar ôl 28 mis gan arwain at gynnydd (ynghyd â 19 y cant ) mewn gwerth yn y grŵp CR-28 o gymharu â'r grŵp cyfatebol sy'n cael ei fwydo ag oedran AL. Ymhellach, nid oedd unrhyw wahaniaeth ystadegol rhwng y gwerth AL-18 a gwerth y grŵp CR-28. Fel y gwelwyd ar gyfer marcwyr eraill yn y gwaith presennol, nid oedd CR mor effeithiol ar 32 mis gan nad oedd gwahaniaeth rhwng gwerth AL-32 a gwerth y cyfatebol CR-32. Er mwyn dyfnhau'r dadansoddiad ar lefel difrod mtDNA, fe wnaethom fesur cynnwys cymharol y "dileu cyffredin" 4.8 Kb gan qPCR (Ffigur 9).
Ni chanfuwyd unrhyw newidiadau arwyddocaol gydag oedran na CR yng nghynnwys cymharol y dileu 4.8 Kb yn yr holl grwpiau a brofwyd.
Yn olaf, fe wnaethom sgrinio tri rhanbarth penodol o mtDNA ar gyfer nifer yr achosion o purinau ocsidiedig, yn bennaf 8-oxo-deoxyguanosine (8- ocsid), gan ddefnyddio'r ensym purinau ocsidiedig-sensitif formamidopyrimidine DNA glycosylase (Fpg). Roedd y tri rhanbarth yn cwmpasu, yn y drefn honno, y ddolen ddadleoli (D-dolen), tarddiad y dyblygu llinyn Golau (Ori-L), a rhannau o'r NADH dehydrogenase (ND) is-uned 1 a 2 (ND1 / ND2) Ffigur 10).
Fel y dangosir yn Ffigur 10, roedd canran yr achosion o 8-ocsid yn sylweddol wahanol rhwng y grwpiau llygod mawr ym mhob rhanbarth a ddadansoddwyd, er bod patrwm tebyg. Datgelodd y prawf post-doc arwyddocâd y gostyngiad mewn presenoldeb 8-ocsid mewn llygod mawr CR-28 o gymharu â grwpiau AL-18 ac AL-28({{7}) } y cant CR-28 vs.AL-18 a-43 y cant CR-28 vs.AL-28 ar y ddolen D;-48 y cant CR -28 vs.AL-18a-49 y cant CR-28yn erbyn.Detholiad Cistanche Gwrth YmbelydreddAL-28 yn yr Ori-L;-54 y cant CR-28 vs.AL-18 a-56 y cant CR-28 vs.AL{{ 7}} yn ND1/ND2). Dangosodd CR ei fod yn effeithiol o ran atal y difrod ocsideiddiol mtDNA am hyd at 28 mis, tra nad oedd nifer yr un difrod yn wahanol rhwng AL-32 a CR-32 llygod mawr. Canfuwyd purinau ocsidiedig eisoes mewn llygod mawr AL heb ddangos cynnydd cysylltiedig ag oedran yn yr anifeiliaid AL{-28. Nid oedd y gymhariaeth rhwng y grŵp AL{-32 a’r grŵp CR{-32 yn dangos gwahaniaeth arwyddocaol. O ystyried gwerthoedd y rhanbarth penodol mae'n ddiddorol tynnu sylw at y ffaith mai nifer yr achosion dolen D oedd yr uchaf ymhlith y gwerthoedd o'r rhanbarthau a brofwyd ym mhob grŵp, gan gefnogi canfyddiadau blaenorol sy'n nodi'r rhanbarth hwn fel man cychwyn ar gyfer difrod ocsideiddiol [17,{{ 20}}].
Ffigur 10.Amlder difrod purinau ocsidiedig yn y rhanbarthau mtDNA D-loop, Ori-L, a ND1/ND2 yn yr afu o AL-18, AL-28, CR-28, AL -32, a CR-32-llygod mawr mis oed. (A). Roedd bariau'n cynrychioli data a gafwyd o ddau arbrawf annibynnol a gynhaliwyd mewn triphlyg ac a ddadansoddwyd gan ddefnyddio'r prawf ANOVA Unffordd a phrawf cymharu lluosog Tukey. Yn y cynrychioliad graffigol, mae data wedi'u normaleiddio yn erbyn gwerth y llygod mawr AL{{-, wedi'u gosod fel 1, ac wedi'u dangos fel y gwerth cymedrig a SD.*p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">cistanche herbaLlwythwyd swm o bob ymhelaethiad PCR ar gel agarose wedi'i staenio â bromid ethidium a'i ddadansoddi ar gyfer dwyster bandiau.
Crynhowyd yr holl ganfyddiadau a adroddwyd ar effeithiolrwydd CR yn y grwpiau oedran cyfatebol yn Nhabl 1.
3. Trafodaeth
Yn y chwiliad parhaol am ddulliau sy'n gallu gwrthweithio dirywiad cynyddol heneiddio, mae CR wedi dod yn hollbwysig oherwydd ei effeithiau cadarnhaol, a adroddwyd mewn cyfres eang o organebau yn amrywio o furum i ddyn [22]. Dangoswyd bod CR yn effeithio ar nifer fawr o lwybrau moleciwlaidd. Ymhlith y rhain, mae rhai yn arbennig o effeithiol wrth fodiwleiddio biogenesis a gweithgaredd mitocondriaidd, fel y rhai sy'n synhwyro maetholion a / neu lefelau egni fel y kinase sy'n ddibynnol ar AMP (AMPK) a sirtuins, lle mae pob un yn cydweithredu ag ailraglennu mitocondriaidd a achosir gan CR. metaboledd [23]. Trwy wella'r metaboledd ocsideiddiol, mae CR yn lleihau cynhyrchiad mitocondriaidd ROS a'r iawndal moleciwlaidd a achosir gan gynnydd cysylltiedig ag oedran y rhywogaethau adweithiol hyn [8-10]. Er bod sawl astudiaeth wedi ymchwilio i effeithiau CR ar y lefel mitocondriaidd [3,13-15,24], mae gwaith cynhwysfawr ar effeithiau'r ymyriad maethol hwn ar organynnau yn dal ar goll. Felly, ceisiodd yr astudiaeth hon brofi bodolaeth ffiniau i effeithiolrwydd CRs mewn set fawr o farcwyr mitocondriaidd. Yn benodol, fe wnaethom ganolbwyntio ar y gymhariaeth rhwng yr effeithiau a achosir gan y regimen deietegol hwn ar lygod mawr oed (28-mis oed) a hynod o oed (32-mis oed) i wirio a oes cydadwaith yn bodoli rhwng CR. a dilyniant heneiddio. Datgelodd dadansoddiad y canlyniadau ddarlun cymhleth o effeithiolrwydd CR ar fiogenesis mitocondriaidd a difrod mtDNA, sydd wedi'i grynhoi yn Nhabl 1.
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
3.1.Marcwyr Mitochondrial mewn 28-Mis-Old Rats
Cafodd nifer fawr o farcwyr mitocondriaidd eu heffeithio'n gadarnhaol gan CR mewn 28-llygod mawr mis oed. Sef, adroddwyd am ostyngiadau cysylltiedig ag oedran yn y gweithgaredd citrate synthase, mewn symiau protein o TFAM, MFN2, a DRP1, ac yng nghynnwys mtDNA yn cymharu'r grŵp rheoli AL-18 â'r AL-28 un . Cafodd newidiadau o'r fath i gyd eu hatal gan CR mewn 28-llygod mawr mis oed(CR-28). Mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi effaith gwrth-heneiddio CR hyd at yr oedran hwn mewn afu llygod mawr. Yn yr un modd, mae'r gostyngiad yn nifer yr achosion o purinau ocsidiedig ym mhob un o'r tri rhanbarth mtDNA assayed, a achosir gan CR, yn atgyfnerthu'r farn hon ymhellach. O bwys, roedd y difrod ocsideiddiol hwn eisoes yn bresennol yn yr anifeiliaid AL-18 heb unrhyw gynnydd cysylltiedig ag oedran yn y llygod mawr AL-28 sy'n awgrymu y gallai ei ymddangosiad gael ei nodi fel arwydd cynnar o heneiddio. Mae angen rhoi sylw arbennig i'r pum marciwr mitocondriaidd na chafodd eu heffeithio gan CR mewn 28-llygod mawr mis oed sef y symiau protein o LonP1. Cvt c, OGGl, ac APE1 a'r cynnwys dileu 4.8 Kb. Mewn gwirionedd, yn yr un modd â LonP1 a Cyt c, ni wnaeth CR atal y gostyngiad cysylltiedig ag oedran a ganfuwyd yn yr anifeiliaid AL-28, tra nad oedd y symiau protein o OGG1 ac APE1, yn ogystal â'r cynnwys dileu 4.8 Kb, yn yr effeithir arnynt gan oedran na CR. Mae LonP1 yn gyfrifol am ddiraddio TFAM sydd wedi blino'n lân [{25-27] ac adroddwyd ei fod yn lleihau wrth heneiddio [28] mewn afu llygod mawr [29] hyd at 27 mis oed. Awgrymwyd gennym yn flaenorol y gallai mynegiant o'r fath sy'n heneiddio o LonP1 [16] fod yn gysylltiedig â'i weithgaredd wrth gael gwared ar TFAM heb ei rwymo i mtDNA [26]. Fel esboniad posibl am aneffeithiolrwydd CR i atal y gostyngiad sy'n gysylltiedig ag oedran mewn mynegiant LonP1, er gwaethaf y mynegiant TFAM wedi'i adfer a rhwymo TFAM i ranbarthau penodol mtDNA (data presennol a Picca et al. [15]), yw'r CR. -ysgogiad cyfryngol o Sirt3 [30] a allai fod wedi dylanwadu hefyd ar faint o brotein LonP1 trwy'r dad-asetyleiddiad anwythol. Gellir cynnig rhagdybiaeth wahanol ar gyfer egluro aneffeithiolrwydd CR i atal y gostyngiad cysylltiedig ag oedran yn swm Cyt c. Y protein hwn yw prif sbardun y llwybr apoptotig mitocondriaidd trwy ei ryddhau i'r cytosol, ac felly roedd ei swm is o fewn y mitocondriaidd yn y llygod mawr AL mewn perthynas â'r gwerth AL{-18 yn dangos cynnydd yn y proses apoptotig gynhenid gyda heneiddio [16,31]. Ymhellach, fel ar gyfer LonP1, roedd swm Cyt c yn y llygod mawr CR-28 yn dal yn sylweddol is na’r gwerth yn yr anifeiliaid AL-18, gan ddangos nad oedd CR yn effeithio’n sylweddol ar reoliad terfynol mynegiant Cyt c /rhyddhau i'r sytosol ac, yn ôl pob tebyg, na'r cynnydd cysylltiedig ag oedran yn y llwybr apoptotig mitocondriaidd. Mae hyn yn cyd-fynd â'r hyrwyddo apoptosis a adroddwyd yn flaenorol a gyfryngwyd gan CR [23].twf pidyn cistancheGan y gall y llwybr apoptotig gael ei sbarduno hefyd gan groniad difrod DNA [32,33], fe wnaethom bennu mynegiant protein dau ensym BER mitocondriaidd mawr sef OGG1 ac APE1. Nid oedd heneiddio a CR yn pasio o 18 i 28 mis oed yn effeithio ar symiau protein y ddau. Eglurhad posibl yw bod mynegiant y ddau ensym BER eisoes wedi cynyddu ac yn ddigonol yn y llygod mawr AL{-18 i wrthweithio'r niwed cynyddol sy'n gysylltiedig ag oedran i mtDNA. Yn wir, mae cynnydd cysylltiedig ag oedran yng ngweithgaredd mitocondriaidd OGG1 [34,35] ac APE mitocondriaidd1[36] wedi'i adrodd yn iau cnofilod sy'n symud o 3-6-anifeiliaid mis oed i 20-23-mis). -rhai hen, yn debygol o gael eu hysgogi i wrthweithio'n effeithlon y cynnydd cysylltiedig ag oedran mewn difrod mtDNA. Mae hyn i gyd yn cefnogi ymhellach ein rhagdybiaeth bod yr iawndal mtDNA, a atgyweiriwyd gan OGG1 ac APE1, wedi ymddangos yn gynnar iawn yn oes cnofilod (roeddent eisoes yn bresennol yn llygod mawr AL{-18) a'u bod wedi'u hysgogi, trwy gyfathrebu ôl-raddol niwclews mitocondrion, cynnydd cynnar mewn mynegiant yr ensymau BER. O ran absenoldeb effaith CR ar OGG1 ac APE1, rydym yn awgrymu bod presenoldeb ROS wedi'i leihau gan CR ac iawndal ocsideiddiol cysylltiedig wedi'i wrthweithio'n effeithiol gan fynegiant o'r ddau ensym nad oedd yn wahanol i fynegiant yr anifeiliaid AL sy'n cyfateb i oedran. O ran y cynnwys dileu 4.8 Kb, nid oedd unrhyw gynnydd cysylltiedig ag oedran yn mynd o'r anifeiliaid AL i'r rhai AL-28 fel petai'r difrod mtDNA hwn hefyd yn ymddangos yn eithaf cynnar yn oes llygod mawr a'i oedran - dim ond o gymharu ag anifeiliaid ifanc y gellid bod wedi gwirio cynnydd cysylltiedig, fel yr adroddwyd mewn astudiaethau eraill [19,37-39]. Mae aneffeithiolrwydd CR i leihau'n sylweddol y cynnwys dileu 4.8 Kb yn y llygod mawr CR o gymharu â'r anifeiliaid AL{-28 ac AL-18 yn dangos ymhellach bod y CR hirdymor wedi achosi a gostyngiad amlwg ym mhresenoldeb ROS yn yr afu. Gallai hyn fod wedi arwain at ryw fath o lefel sefydlog o ddileu 4.8 Kb, nad yw'n wahanol i lefel y gwrthran AL{-18 ac sy'n gydnaws â'r cynnwys mtDNA priodol. Er na leihawyd yr atgyweiriad mtDNA gan heneiddio, roedd y gostyngiad cysylltiedig ag oedran yn y cynnwys mtDNA yn dal i fod yn bresennol wrth drosglwyddo o'r llygod mawr AL{{-18 i'r rhai AL{{-28), fel y disgrifiwyd yn flaenorol mewn meinweoedd gwahanol o cnofilod oed [3,15,19,39-42]. Gellir esbonio hyn gan y rhwymiad cynyddol sy'n gysylltiedig ag oedran o TFAM mewn rhanbarthau mtDNA penodol a oedd hefyd yn fannau problemus a ddifrodwyd [19]. Byddai'r ddamcaniaeth hon felly'n cysoni'r golled mtDNA sy'n gysylltiedig ag oedran â mynegiant a gweithgaredd digyfnewid yr ensymau atgyweirio. I gefnogi'r ddamcaniaeth hon ymhellach mae absenoldeb colled mtDNA yn y llygod mawr CR-28. Yn wir, gwnaethom ddangos yn flaenorol bod CR yn atal y cynnydd sy'n gysylltiedig ag oedran mewn rhwymo TFAM mewn rhanbarthau mtDNA penodol [15]. Felly, yn ôl y presennol a'n data blaenorol, gall modiwleiddio rhwymo TFAM fod ymhlith y mecanweithiau moleciwlaidd sy'n ymwneud â rheoleiddio biogenesis mitocondriaidd sy'n heneiddio ac wedi'i gyfryngu gan CR. Dangoswyd bod y rheoliad hwn gan heneiddio a CR hefyd yn cael ei ddilyn trwy gydbwysedd dynameg mitocondriaidd y mae heneiddio yn effeithio arno [43] ac mae'n arwain at nifer yr achosion o ymasiad dros ymholltiad [44,45]. Felly, fe wnaethom gyfrifo'r mynegai ymasiad (FI) ym mhob anifail a assayed (Ffigur 6) a chanfod gwerthoedd a oedd yn cadarnhau ac yn ehangu ein canlyniadau blaenorol [16].manteision cistanche salsaGellir casglu rhai arwyddion newydd gan yr astudiaeth bresennol, sef, yn y llygod mawr AL-18roedd gwerthoedd FI yn cwmpasu amrediad bychan, tra yn y rhai AL-28 roedd yr amrediad FI yn llawer mwy, gyda nod wedi ei farcio. cynnydd cysylltiedig ag oedran yn y gwerthoedd unigol, yn y llygod mawr CR-28 roedd yr ystod fach o werthoedd yn dangos effaith gadarnhaol CR wrth sefydlu ymholltiad, gyda chynnydd cyffredinol yn symiau unigol DRP1 o gymharu â'r rhai o'r AL-28 grŵp. Er y gallai ymholltiad effeithlon gael gwared ar yr organynnau sydd wedi'u difrodi, gallai ymasiad endid tebyg sicrhau bod macromoleciwlau wedi'u difrodi yn ymledu yn y rhwydwaith mitocondriaidd, gan wanhau eu heffeithiau negyddol [46]. Felly, gallai adferiad trwy gyfrwng CR o'r cydbwysedd manwl gywir o ddeinameg mitocondriaidd arwain at ganlyniadau cadarnhaol ar fodiwleiddio biogenesis mitocondriaidd, gan weithredu'n synergyddol â chyfathrebu difrod mtDNA yn ôl. Mae hyn yn unol â'r llenyddiaeth bresennol sy'n adrodd y gall y statws maetholion a'r newidiadau metabolaidd fodiwleiddio cydbwysedd dynameg mitocondriaidd [47] ac, felly, effeithio hefyd ar fiogenesis yr organelle. Yn benodol, dim ond cynnydd cyfyngedig o ROS y gall y rheoliad ROS-sensitif o fiogenesis mitocondriaidd ei wynebu trwy'r cynnydd yn nifer yr organynnau [48] a gallai presenoldeb llai CR o ROS [15] atal goresgyn lefel tebyg i drothwy a allai arwain. i golled mitocondriaidd. Profwyd effeithiolrwydd CR wrth leihau presenoldeb ROS yn yr astudiaeth bresennol gan y croniad llai o purinau ocsidiedig yn y rhanbarthau a ddadansoddwyd mtDNA yn y llygod mawr CR-28 sy'n cefnogi gwelliant cyffredinol mewn metaboledd mitocondriaidd, sy'n gallu gwrthweithio'r oedran - dirywiad cysylltiedig. Yn wir, mae presenoldeb llai CR o ROS wedi'i ddangos yn eang hefyd ar lefel proteinau a lipidau mitocondriaidd. Yn benodol, dangoswyd bod CR yn lleihau addasiadau ocsideiddiol o broteinau mitocondriaidd mewn calonnau llygod mawr|49] ac i addasu'r mynegai dirlawnder / annirlawnder mewn pilenni mitocondriaidd gan atal difrod ocsideiddiol a chynnal hylifedd pilen [8]. Ar ben hynny, dangoswyd bod CR yn lleihau cynhyrchiad ROS gan gyfadeiladau anadlol mitocondriaidd yn y cyhyrau ysgerbydol murine a'r afu [8]. Mae effeithiau buddiol CR ar lefel ROS hefyd yn cynnwys niwtraliad gwell o ROS a thrwsio cynyddol moleciwlau a ddifrodwyd gan ROS [10]. Yn ogystal â'r effaith hon, mae newidiadau mewn ymarferoldeb mitocondriaidd yn cael eu modiwleiddio trwy actifadu AMPK sy'n sensitif i CR a sirtuins sy'n rheoleiddio gweithgaredd y ffactorau trawsgrifio cydweithredydd gama derbynnydd perocsisome-proliferator-activated 1-alpha (PGC-1). ), a blwch blaen fforch (FoxO), gyda'r olaf yn ymwneud â biogenesis, metaboledd ocsideiddiol, a throsiant y mitocondria [23]. Felly, dylai dylanwad cadarnhaol CR-gyfryngol ar fetaboledd mitocondriaidd ryngweithio â llwybrau eraill i fodiwleiddio sbardun terfynol biogenesis mitocondriaidd, yn ôl model o gyfathrebu ôl-radd i'r cnewyllyn [50].
3.2.Marcwyr Mitochondrial mewn 32-Mis-Old Rats
O ran y gymhariaeth rhwng llygod mawr AL-32 a CR-32, mae ein data yn dangos absenoldeb cyffredinol o wahaniaethau arwyddocaol. Gall hyn awgrymu cyfyngiad oedran i effeithiolrwydd CR wrth fynd i'r afael â'r dirywiad sy'n gysylltiedig ag oedran wrth basio o 28 i 32 mis. O ran yr effaith oedran, fodd bynnag, gellir gyrru casgliadau gwahanol yn dibynnu ar y marciwr a ddadansoddwyd. Mewn gwirionedd, yn y ddau grŵp 32-mis oed, cadwyd y gostyngiad cysylltiedig ag oedran yn y gweithgaredd citrate synthase, symiau TFAM, LonP1, OGG1, APE1, cynnwys mtDNA, a dileu 4.8 Kb ar lefel roedd hynny'n debyg i'r hyn a welwyd yn llygod mawr AL-28 neu fe'i rhwystrwyd yn rhannol/hollol fel mewn symiau o Cyt c, MFN2, DRP1, a nifer yr achosion o purinau ocsidiedig mewn rhanbarthau mtDNA penodol. Gallai'r ymddygiadau gwahanol hyn fod yn debygol o fod oherwydd y cydadwaith rhwng y gwahanol lwybrau sy'n cynnwys y marcwyr a ddadansoddwyd. Gellir tynnu sylw at gasgliad arall trwy gymharu 32-grwpiau mis oed â'r rhai AL{-18 a'r rhai AL{-28 ar gyfer y symiau MFN2 a DRP1. Mewn gwirionedd, nid oedd y gostyngiad cysylltiedig ag oedran yn bresennol yn mynd o'r grŵp AL{-18 i'r ddau grŵp AL{-32 a CR{-32 ar gyfer y ddau brotein dynameg. O ystyried, yn y gymhariaeth rhwng y grŵp AL-18 a'r ddau 32-mis oed ag ar gyfer y marcwyr eraill, roedd gostyngiad cysylltiedig ag oedran yn debyg neu'n llai o ran maint na'r un rhwng yr AL{{ 30}} ac AL-28 grwpiau, gallwn ysgogi rhai canlyniadau. Gall hyn ddangos y gallai'r newidiadau cysylltiedig ag oedran i farcwyr fod wedi dechrau neu wedi bod eisoes yn bresennol ers 18 mis, ac yna wedi cyrraedd eu gwerth isaf/uchaf yn yr anifeiliaid mis oed,28-gyda "cyflymder" sef nodweddiadol o'r broses heneiddio. I'r gwrthwyneb, yn yr anifeiliaid hynod oedrannus ({32-mis oed), roedd yn ymddangos bod "cyflymder" y broses yn arafu gan fod y gwerthoedd yn is na neu'n hafal i rai'r cymheiriaid AL{-18, ond nid yn is /uwch na'r rhai o'r rhai AL-28, er gwaethaf y rhychwant amser hwy a aeth heibio. Mae rhagdybiaeth dau gyflymder gwahanol yn y broses heneiddio [16] yn awgrymu bod difrod, oherwydd gwahanol achosion, yn dechrau effeithio ar weithgareddau corfforol a metabolaidd yn ystod oedolaeth ym mhob llygoden fawr. Mae iawndal o'r fath yn cael ei wrthweithio'n effeithiol gan fecanweithiau cydadferol ac nid yw'r iawndal yn ymddangos yn agored, gan gyd-fynd ag oedran "canol" sefydlog a nodweddir gan homeostasis llwyddiannus. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom nodi fel llygod mawr sy'n heneiddio'n "gyflym" y rhai lle mae'r cydbwysedd rhwng iawndal yn y cyfamser a mecanweithiau cydadferol yn dechrau pylu yn ddiweddarach mewn bywyd.dos cistanche tubulosa redditYn yr anifeiliaid hyn, sef y ffracsiwn mwyaf o'r grŵp AL-28, mae iawndal yn fwy na'r trothwy sy'n gydnaws â gweithgareddau arferol ac mae cyflwr wedi'i newid yn ymddangos. I'r gwrthwyneb, mae'r rhan lai sy'n weddill o'r boblogaeth heneiddio a archwiliwyd yn cynnal y cydbwysedd homeostatig rhwng yr iawndal a'r atgyweiriad am amser hirach ac yn ffurfio'r grŵp o anifeiliaid sy'n heneiddio'n "araf", gan gynnwys AL-32 a CR{{2} } llygod mawr. Mae rhagdybiaeth debyg am wahanol gyflymder heneiddio wedi'i gynnig yn ddiweddar hefyd ar gyfer bodau dynol [51]. O'u cymryd yn eu cyfanrwydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gallai'r anifeiliaid hynod o oedran fod wedi cyrraedd hirhoedledd heb gael eu heffeithio'n sylweddol gan CR ac yn debygol oherwydd rhagdueddiad genetig i ymdopi'n well â'r camweithrediad mitocondriaidd sy'n gysylltiedig ag oedran, ond mae rhagdybiaeth o'r fath yn haeddu ymchwil yn y dyfodol. Gall y canfyddiadau newydd hyn roi ateb i'r cwestiwn gwreiddiol a hanfodol ar fodolaeth cyfyngiadau ar effeithiolrwydd CR, a godwyd gan Ingram a de Cabo yn eu hastudiaeth ddwfn iawn ar y mater hwn l52l, gan ganiatáu nodi terfynau o'r fath gydag oedran 28 mis ar gyfer afu llygod mawr. Serch hynny, ni ddylai'r casgliad nad oedd CR neu unrhyw ddiet yn achosi canlyniadau buddiol yn y llygod mawr hynny a oedd yn naturiol dueddol i hirhoedledd effeithio ar yr hyder cyffredinol yn effeithiolrwydd yr ymyriad maethol hwn. Mewn gwirionedd, roedd CR yn dal i allu cyfleu effeithiau buddiol gan ei fod yn gallu atal y rhan fwyaf o'r newidiadau sy'n gysylltiedig ag oedran mewn biogenesis mitocondriaidd a niwed mtDNA yn iau 28-llygod mawr mis oed. Mae hyn yn cadarnhau CR ymhellach fel strategaeth â sail gadarn i wrthweithio'n effeithlon y dirywiad sy'n heneiddio yn y boblogaeth gyffredinol.
4. Defnyddiau a Dulliau
4.1.Anifeiliaid
Cymeradwywyd yr astudiaeth gan y Pwyllgor Gofal a Defnydd Sefydliadol Anifeiliaid ym Mhrifysgol Florida. Perfformiwyd yr holl driniaethau yn unol â chanllawiau'r Sefydliad Cenedlaethol dros Iechyd (NIH) ar gyfer gofalu am anifeiliaid labordy a'u defnyddio. Daeth samplau afu o lygod mawr gwrywaidd Fischer 344 × Brown Norwy (F344BNF1) a gafwyd gan y Sefydliad Cenedlaethol dros Heneiddio (Indianapolis, IN, USA) ac a gedwir yn unigol mewn tymheredd-(20 + /{5}} gradd ) a golau- amgylchedd rheoledig (12-h cylch golau/tywyll) gyda chow llygod mawr rheolaidd a dŵr ar gael ad libitum yn yr Adran Heneiddio ac Ymchwil Geriatrig, Is-adran Bioleg Heneiddio, Coleg Meddygaeth, Prifysgol Florida, Gainesville, FL( UDA). Roedd cyfyngiad calorïau wedi'i gychwyn yn 3.5 mis oed (cyfyngiad 10 y cant), wedi'i godi i gyfyngiad o 25 y cant ar 3.75 mis, ac wedi'i gadw ar gyfyngiad o 40 y cant o 4 mis hyd ddiwedd oes pob anifail, sef 28 mis (CR{ {17}}) neu 32 mis (CR-32) oed. Roedd anifeiliaid â chyfyngiad calorïau yn cael eu bwydo â diet cyfnerthedig yr NIH{31-NIA i sicrhau nad oeddent yn dioddef o ddiffyg maeth, tra bod anifeiliaid sy'n cael eu bwydo â chyfyngiadau calorïau yn cael diet llygod mawr NIH31. Roedd yr anifeiliaid yn cynnwys y grwpiau canlynol: 18-bwyd ad libitum mis oed (AL-18, n=6),28-mis oed ad libitum-bwyd(AL -28, n=6),28-mis oed cyfyngedig o galorïau(CR-28, n{38}}), 32-hysbyseb mis oed libitum-bwyd(AL-32, n=6), a 32-mis oed-cyfyngedig calorïau (CR-32, n =6)llygod mawr. Cafodd anifeiliaid eu hanestheteiddio cyn eu haberthu a chafodd samplau o'r afu eu tynnu ar unwaith, eu rhewi mewn isopentane wedi'u hoeri gan nitrogen hylifol, a'u storio mewn nitrogen hylifol hyd nes y gwneir dadansoddiad pellach.
4.2. Pennu Gweithgaredd Synthase Citrate
Perfformiwyd penderfyniad gweithgaredd citrate synthase fel yn [17]. Yn gryno, cafodd 80 ug o gyfanswm y proteinau wedi'u puro o samplau afu eu deor yn y byffer adwaith (0.31 mM acetyl-CoA, 100 mM Tris byffer ( pH 8.1), 0.25 y cant Triton X-100, 0.1 mM 550-dithiol-bis-2-asid nitrobenzoig, a 0.5 mM ocsaloacetate (1 mL) ar 30 gradd .
Pennwyd gweithgaredd synthase citrad (meinwe umol × min-I × g-) yn sbectroffotometrig trwy fesur cyfradd cynhyrchu asid thionitrobenzoic (TNB) ar 412 nm.
4.3. Immunoblotting Gorllewinol
Cafodd mitocondria'r afu eu hynysu mewn cyfrwng sy'n cynnwys mannitol 220 mM, swcros 70 mM, 20 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, a 5 mM EGTA, pH 7.4, ar 4 gradd yn ôl 【16】. Yn ogystal, defnyddiwyd 10 ug o broteinau mitocondriaidd ar gyfer dadansoddiad imiwnoblotio'r Gorllewin. Gwrth-TFAM(1:50,000), gwrth-VDAC(1:50,000, Abcam, Caergrawnt, DU), gwrth-OGG1(1:2500, Abcam, Caergrawnt, DU) , gwrth-APE1(1:5{000, Abcam, Caergrawnt, DU), gwrth-MFN2(1:5000, Abnova, Taipei, Taiwan), gwrth-DRP1(1:2500, Abnova, Taipei, Taiwan) , gwrth-Cyt c(1:500, Pharmingen, San Diego, CA, UDA), a gwrth-Lon Protease (1:10,000) fel gwrthgyrff cynradd. Cafodd yr gwrthgyrff yn erbyn TFAM a Lon eu gwneud yn arbennig a'u rhoi yn garedig, yn y drefn honno, gan Dr. H. Hinagaki (Adran Cemeg, Sefydliad Ymchwil Diwydiannol Cenedlaethol Nagoya, Nagoya-shi, Aichi, Japan) a Dr. C. Suzuki (Adran). Biocemeg a Bioleg Foleciwlaidd, Ysgol Feddygol New Jersey, Prifysgol Meddygaeth a Deintyddiaeth New Jersey, Newark, NJ, UDA). Canfuwyd y proteinau gan gemioleuedd a mesurwyd bandiau imiwn-adweithiol gan ddefnyddio'r Image Lab Software (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, UDA) a'u normaleiddio yn erbyn mynegiant VDAC.
4.4.Penderfynu mtDNA a mtDNA 4.8 Kb"Dileu Cyffredin"Cynnwys
Defnyddiwyd yr adwaith cadwyn polymeras amser real meintiol (qPCR) i bennu cynnwys cymharol mtDNA a mtDNA 4.8 Kb "dileu cyffredin". Perfformiwyd adweithiau trwy SYBR Green chemistry gan ddefnyddio 3 ng o gyfanswm DNA fel templed a'r preimwyr canlynol: MtDNA ar gyfer 5-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3'(nt 15.785-15.806), mtDNA rev 5'-TGATTAGACCCGTTACCATCGA-3'(nt 15,868-15,847); -actin ar gyfer 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA-3'(nt 2181-2200), -actinrev5'-CGTCTCCGGAGTCCATC AC-3'(nt 2266-2248);4.8 del ar gyfer {{26} }AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA-3'(nt8109-8131), 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA-3'(nt 13,020-12,996).Y cynnwys mtDNA mewn perthynas â'r niwclear Penderfynwyd ar gynnwys DNA a 4.8 Kb "dileu cyffredin" o'i gymharu â mtDNA, fel yr adroddwyd yn [19].
4.5. Dadansoddiad o Purinau Ocsidedig
Defnyddiwyd ffurfamidopyrimidine DNA glycosylase (Fpg) (New England Biolabs, Beverly, MA, UDA) o gyfanswm DNA i ganfod purinau ocsidiedig [53].
Cynhaliwyd ymhelaethiad PCR o ranbarthau mtDNA D-loop, Ori-L, a ND1/ND2 gan ddefnyddio'r pâr preimwyr priodol:
Dolen D For5'-TCTGGTCTTGTAAACCAAAAATGA-3'(nt 15,302-15,325),D-loop Rev 5'-TGGAATTTTCTGAGGGTAGGC-3'(nt 16,302-16, 282) ; Ori-L Ar gyfer 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA-3' (nt 4414-4433), Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGCTCCA-3'(nt 5407-5388);ND1 Ar gyfer 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT-3'(nt3390-3409),ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3'(nt 4399-4380) ar 5 ng o gyfanswm DNA wedi'i drin a heb ei drin gan Fpg. Yr amodau beicio oedd: Rhag-deoriad o 10 munud ar 95 gradd, ac yna 18 cylch o 15s95 gradd, 15s 58 gradd C, ac 1 munud 72 gradd. Llwythwyd aliquot pob ymhelaethiad PCR ar gel agarose 1.3 y cant. Dadansoddwyd dwyster bandiau bandiau lliw bromid ethidium gan y Image Lab Software (BioRad Laboratories Inc., CA, UDA). Er mwyn gwella delweddu graffigol, mynegwyd y gymhareb rhwng dwyster bandiau wedi'u trin â Fpg a bandiau heb eu trin fel canran o'r cyflenwad i 100.
4.6. ystadegau
Mynegir data fel y gwyriad cymedrig a safonol (SD). Defnyddiwyd yr ANOVA Unffordd gyda phrawf cymhariaeth lluosog Tukey. Ar gyfer pob prawf, gosodwyd yr arwyddocâd ystadegol ar lefel 5 y cant. Cynhaliwyd dadansoddiadau gan ddefnyddio pecyn ystadegol penodol (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software: Release. College Station, TX, USA).
Mae'r erthygl hon wedi'i thynnu o Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms
