Mae'r RNA M6 A Darllenydd YTHDF2 yn Rheoli Antitumor Cell NK Ac Imiwnedd Gwrthfeirysol Rhan 2

Mae angen YTHDF2 ar gyfer swyddogaeth gwrthfeirysol celloedd NK

Er mwyn penderfynu a yw diffyg Ythdf2 yn effeithio ar weithgaredd gwrthfeirysol celloedd NK, fe wnaethom chwistrellu 2.5 × 104 PFU o MCMV intoYthdf2WT llygod a llygod Ythdf2ΔNK.

Dangosodd y canlyniadau fod llygod Ythdf2ΔNK yn fwy agored i haint MCMV, fel y dangosir gan golli pwysau sylweddol a chynnydd mewn titerau firaol yn y gwaed, y ddueg, a'r afu o'u cymharu â llygod Ythdf2WT (Ffig. 3, A a B; a Ffig. S2, A a B) .

Gwelsom hefyd ostyngiad sylweddol yng nghanran a nifer absoliwt cyfanswm NKcells yn y ddueg a gwaed llygod Ythdf2ΔNK o gymharu â'r rhai mewn llygod Ythdf2WT ar ôl haint (Ffig. 3, C a D; a Ffig.S2, C a D). Dangosodd dadansoddiad pellach fod gan lygod NK oYthdf2ΔNK fynegiant sylweddol is o lygod Ki67 nagYthdf2WT (Ffig. 3, E-G).

Fodd bynnag, roedd hyfywedd celloedd NK yn debyg rhwng llygod Ythdf2WT a llygod Ythdf2ΔNK, fel y dangosir gan staen V annexin (Ffig. S2 E). Mae'r data hyn yn dangos bod diffyg YTHDF2 mewn celloedd NK yn arwain at ddiffyg ymlediad celloedd yn hytrach na goroesiad celloedd yn ystod haint firaol. Mae NKcells yn atal haint MCMV trwy'r derbynyddion actifaduLy49H a Ly49D, a nodweddir y broses gan ymateb gwrthfeirysol perforin- neu IFN--ganolog (Arase et al., 2002; Lee et al., 2009; Loh et al., 2005; Orr et al., 2010; Sumaria et al., 2009).

Canfuom fod llygod Ythdf2ΔNK wedi lleihau celloedd NK Ly49H+ a Ly49D+ yn sylweddol yn y ddueg a'r gwaed o'u cymharu â llygod Ythdf2WT ar ôl haint (Ffig. 3, H–J; a Ffig. S2, F–K).

Dangosodd dadansoddiad pellach, er y canran, dim ond celloedd Ly49D + Ly49H + a ddangosodd wahaniaeth mewn llygod Ythdf2ΔNK o'i gymharu â llygod Ythdf2WT, niferoedd celloedd absoliwt celloedd Ly49D - Ly49H + NK, Ly49D + Ly49H - celloedd NK, a Ly49D yng nghelloedd N+L dueg a gwaed i gyd yn gostwng yn sylweddol mewn llygod Ythdf2ΔNK o gymharu â Ythdf2WTmice ar ôl haint (Ffig. S2, L-W).

Mae ein data yn awgrymu ei bod yn ymddangos bod rheoli haint MCMV gan YTHDF2 yn cael ei gyfryngu'n bennaf gan gelloedd Ly49D + Ly49H + NK. Roedd y cynhyrchiad gransym B ac IFN gan gelloedd NK mewn llygod Ythdf2ΔNK yn debyg i lygod Ythdf2WT (Ffig. S2, X ac Y).

Canfuom fod cynhyrchu perforin wedi'i leihau'n sylweddol gan lygod Ythdf2ΔNK o'i gymharu â llygod Ythdf2WT yn y ddueg a'r gwaed 7 d ar ôl haint (Ffig. 3, K-M), sy'n dangos bod YTHDF2 yn effeithio'n bennaf ar weithgaredd gwrthfeirysol wedi'i gyfryngu gan berforin yn erbyn MCMV mewn celloedd NK. yn awgrymu bod YTHDF2 yn hanfodol ar gyfer ehangu celloedd NK a swyddogaeth effeithydd yn ystod haint MCMV.

Mae YTHDF2 yn rheoli cartrefostasis celloedd NK ac aeddfedu terfynol mewn cyflwr cyson

Roedd y canfyddiadau uchod bod diffyg Ythdf2 mewn celloedd NK wedi gwella metastasisau tiwmor ac wedi amharu ar allu celloedd NK i reoli haintMCMV yn ein hannog i ymchwilio i weld a oes angen YTHDF2 ar gyfer cynnal a chadw celloedd NK mewn cyflwr cyson.

Fel y dangosir yn Ffig. 4 A, gostyngwyd amlder a nifer absoliwt celloedd NK yn sylweddol yn y gwaed ymylol, y ddueg, yr afu, a'r ysgyfaint ond nid ym mêr esgyrn (BM) llygod Ythdf2ΔNK o gymharu â llygod Ythdf2WT.

Fodd bynnag, nid oedd unrhyw newidiadau sylweddol ymhlith epilydd lymffoid cyffredin, epilydd cell cyn-NK, ac epilydd celloedd NK wedi'i fireinio (NKP) yn y BM (Fathman et al., 2011) rhwng llygod Ythdf2WT a Ythdf2ΔNK (Ffig. S3 A), gan nodi hynny Efallai na fydd YTHDF2 yn effeithio ar ddatblygiad cynnar celloedd NK yn eich model.

Er mwyn archwilio'r mecanweithiau posibl sy'n gyfrifol am ostyngiad mewn celloedd NK mewn llygod Ythdf2ΔNK, fe wnaethom ymchwilio i amlhau celloedd, hyfywedd, a gallu masnachu celloedd NK ar ôl dileu Ythdf2 mewn cyflwr cyson. Roedd canran y celloedd NK amlhau yn debyg rhwng llygod Ythdf2WT a Ythdf2ΔNK, fel y dangosir gan staenio Ki67 (Ffig. S3 B).

Roedd hyfywedd NKcells hefyd yn cyfateb rhwng llygod Ythdf2WT a Ythdf2ΔNK, fel y dangosir gan staenio atodiad V (Ffig. S3 C). Er mwyn gwirio a ywYTHDF2 yn effeithio ar allfa celloedd NK o BM i'r cyrion, chwistrellwyd llygod Ythdf2WT ac Ythdf2ΔNK iv gyda gwrthgorff gwrthCD45 i nodi celloedd imiwnedd a'u haberthu ar ôl 2 funud, a dadansoddwyd eu celloedd BM.

Roedd hyn yn ein galluogi i feintioli nifer y celloedd NK yn rhanbarthau sinwsoidal yn erbyn parenchymal y BM, dangosydd o fasnachu celloedd NK o BM i waed ymylol o dan gyflwr cyson (Leong et al., 2015). Dangosodd y canlyniadau leihad sylweddol yn amlder celloedd CD45+ NK mewn llygod Ythdf2ΔNK o gymharu â llygod Ythdf2WT yn y sinwsoidau (Ffig. 4 B), sy'n dangos bod diffyg Ythdf2 yn amharu ar allfa celloedd NK o BM i'r system gylchrediad in vivo .

Mae celloedd imiwnedd yn mynd trwy amlhau homeostatig yn ystod lymffopenia a achosir gan rai heintiau firaol neu a achosir gan gemotherapi (Sun et al., 2011). Er ein bod wedi canfod bod YTHDF2 yn anhepgor ar gyfer amlhau celloedd NK ar gyflwr cyson, gwelsom ostyngiad sylweddol mewn amlhau celloedd yn ystod haint MCMV (Ffig. 3, E-G). Felly, fe wnaethom ymchwilio i rôl YTHDF2 wrth reoleiddio amlhau cartrefostatig celloedd NK mewn lleoliad lymffopenig in vivo.

Rydym yn cyddrosglwyddo nifer cyfartal o gelloedd NK splenig fromCD45.2 Ythdf2ΔNK llygod neu CD45.1 llygod congenig intolymphocyte-ddiffygiol Rag2 - / -Il2rg - / - llygod. Dangosodd y canlyniadau fod cyfran fwy o gelloedd NK yn deillio o lygod rheoli CD45.1WT nag o lygod CD45.2 Ythdf2ΔNK ar ddiwrnod 3 ar ôl trosglwyddo celloedd (Ffig. S3 D).

Dangosodd dadansoddiad pellach fod y gostyngiad mewn celloedd NK o lygod Ythdf2ΔNK yn ganlyniad i amlhau celloedd nam (Ffig. S3 E) ond nid apoptosis celloedd (Ffig.S3 F), gan awgrymu bod YTHDF2 yn gyrru amlhad cartrefostatig celloedd NK in vivo o dan amodau lymffopenig.

Gellir dosbarthu gwahaniaethu pellach o gelloedd NK murine i gamau anaeddfed (CD11b−CD27+), aeddfed canolraddol (CD11b+CD{4}}), ac aeddfed terfynol (CD11b+CD27−) yn seiliedig ar lefelau CD11b a CD27 ( Chiossone et al., 2009; Geiger a Sun, 2016).

Gwelsom fod mynegiant Ythdf2 yn cynyddu wrth aeddfedu a bod CD11b−CD27+, CD11b+CD{5}}, CD11b+CD27− yn dangos lefelau mynegiant isaf, canolradd, ac uchaf Ythdf2, yn y drefn honno (Ffig. S3 G), sy'n nodi y gall YTHDF2 fod yn rhan o aeddfedu celloedd NK. Felly, fe wnaethom ymchwilio i rôl YTHDF2 mewn aeddfedu celloedd NK a ddiffinnir gan y marcwyr arwyneb celloedd CD11b a CD27.

Canfuom fod colli Ythdf2 mewn NKcells wedi arwain at ostyngiad sylweddol yn amlder celloedd NK aeddfed terfynol a/neu gynnydd mewn celloedd NK aeddfed anaeddfed a chanolradd yn y ddueg, yr afu, yr ysgyfaint, a'r gwaed ond nid yn BM (Ffig. 4 C a Ffig. S3 H), sy'n dangos bod YTHDF2 yn rheoleiddio aeddfedu celloedd NK terfynol yn gadarnhaol. bod llygod Ythdf2WT yn yr organau cyfatebol neu adrannau meinwe (Ffig. 4 D).

Er mwyn penderfynu a oedd y nifer gostyngol o gelloedd NK aeddfed yn ôl diffyg Ythdf2 yn gell gynhenid, fe wnaethom greu chimeras mewn llygod Rag2 - / - Il2rg - / - trwy chwistrellu celloedd BM o CD45.1 WT a CD45.2 Ythdf2ΔNK llygod, wedi'u cymysgu ar 1: cymhareb. Fel y dangosir gan cytometreg llif yn ôl-drawsblaniad 8 wk, roedd cyfran lai o gelloedd NK aeddfed terfynol yn deillio o gelloedd BM CD45.2 Ythdf2ΔNK na'r rhai o gelloedd rheoli CD45.1 WT (Ffig. 4 E), gan awgrymu bod aeddfedu cellterminal NK a reolir gan YTHDF2 yn gell gynhenid.

Ffactorau trawsgrifio blwch-T Mae Eome a Tbet yn hanfodol ar gyfer aeddfedu NKcell (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012). Datgelodd staenio mewngellol ostyngiad sylweddol yn lefelau protein Eomau mewn celloedd NK o lygod Ythdf2ΔNK o'i gymharu â llygod Ythdf2WT (Ffig. S3 I). Yn ogystal, canfuom fod y gostyngiad mewn lefelau protein a mRNA o Eomau yn digwydd yn benodol mewn celloedd NK aeddfed terfynol (CD11b + CD27 -) (Ffig. S3, J-L).

Fodd bynnag, yn wahanol i Eomes, roedd mynegiant Tbet yn gyfwerth mewn celloedd NK rhwng llygod Ythdf2ΔNK ac Ythdf2WT (Ffig. S3, I a K), gan nodi bod YTHDF2 o bosibl yn rheoleiddio aeddfedu terfynell NKcell trwy dargedu Eomes.