Amseru Ac Effeithiau Isgemia Ar Ffibrosis Arennau Ar ôl Nephrectomi Cyfochrog

Rhagymadrodd

Yr achosion oanaf acíwt i'r arennau(AKI) wedi cynyddu'n aruthrol ledled y byd yn ystod y blynyddoedd diwethaf [1]. Gall AKI gael ei achosi gan drawsblannu organau, ar ôl llawdriniaeth o dan ddarlifiad, gwaedu, diffyg hylif, sioc a sepsis mewn ymarfer clinigol [2]. Mae astudiaethau epidemiolegol ac arbrofol diweddar wedi dangos bod cysylltiad agos rhwng difrifoldeb, amlder a hyd AKI a nifer yr achosion dilynol oclefyd cronig yn yr arennau(CKD). Gall ffibrosis yr arennau ar ôl AKI arwain at CKD neu hyd yn oedclefyd yr arennau cam olaf(ESKD) [3-5], sy'n awgrymu bod AKI a CKD yn syndromau cysylltiedig [6]. Fodd bynnag, mae'r mecanweithiau sy'n sail i'r trawsnewid o AKI i CKD yn parhau i fod yn anhysbys er gwaethaf nifer o astudiaethau arbrofol a chlinigol. Mae modelau anifeiliaid yn arfau pwysig ar gyfer ymchwilio i'r mecanweithiau y mae AKI yn eu defnyddio i arwain at CKD. Anafiad isgemia-atlifiad arennau (IRI) yw un o brif achosion AKI, ac mae sawl model anifail o AKI a achosir gan IRI wedi'u datblygu [7], gan gynnwys y model IRI dwyochrog (bIRI), y model IRI unochrog gydag aren cyfochrog cyfan. , y model uIRI gyda nephrectomi cyfochrog ar yr un pryd, a'r model uIRI gyda nephrectomi gwrthochrol gohiriedig.

Mae'r model bIRI yn llai cyson oherwydd pan fo anaf isgemig y ddwy aren yn rhy ysgafn, nid oes unrhyw newidiadau ffibrotig sylweddol yn y tymor hir. Pan fydd AKI yn rhy ddifrifol, gall llygod farw yn y cyfnod anaf acíwt. Ar ben hynny, gall gwahaniaethau bach yn anaf y ddwy aren arwain at wahaniaethau sylweddol yn eu patholeg arennau cronig ar ôl ychydig wythnosau [8,9]. Mae'r model uIRI gyda nephrotomi cyfochrog ar yr un pryd yn debyg i'r model bIRI gan mai dim ond yr aren anafedig sy'n weddill oherwydd nephrectomi ochr arall [10]. Yn y model IRI gydag aren cyfochrog cyfan, mae ffibrosis yr aren isgemig yn ddifrifol [11,12]. Mae'r model hwn yn gyson iawn ac yn ddibynadwy ar gyfer arsylwi hirdymor gan ymchwilwyr. Fodd bynnag, oherwydd presenoldeb aren cyfochrog heb ei difrodi, ni ellir ei ddefnyddio ar gyfer gwerthuso cyfradd hidlo glomerwlaidd amcangyfrifedig (eGFR), creatinin serwm (SCr), a nitrogen wrea gwaed (BUN) [11-14]. O'i gymharu â'r ddau fodel uIRI a grybwyllwyd uchod, mae'r model uIRI gyda nephrectomi cyfochrog gohiriedig yn goresgyn y problemau hyn a gellir ei ddefnyddio ar gyfer arsylwadau hirdymor ar ôl AKI a monitro gweithrediad yr arennau. Felly, mae'r model hwn yn addas ar gyfer astudio pontio AKI-CKD [15].

CLICIWCH YMA I GAEL DYFYNIAD CISTANCHE AR GYFERANAFIAD AWDUR AR YR AREN

Serch hynny, gall gwahanol gyflyrau isgemig a'r egwyl rhwng nephrectomi gwrthochrol ac uIRI gael effeithiau sylweddol ar ddilyniant a difrifoldeb CKD ar ôl AKI. Mae astudiaethau blaenorol wedi canolbwyntio ar effaith hyd yr isgemig ar ffibrosis yr arennau ôl-AKI ac nid ydynt wedi talu llawer o sylw i dymheredd craidd y corff yn ystod isgemia. Er enghraifft, mae Skrypnyk et al. Roedd [12] yn rheoli'r tymheredd isgemig ar 38 C gan system baddon dŵr, gyda hyd isgemig o 30 munud, a chafodd yr aren gyfan gyfochrog ei thynnu 8 diwrnod ar ôl uIRI. Dangosodd y canlyniad fod yr aren isgemig wedi cael newidiadau ffibrotig sylweddol 28 diwrnod ar ôl uIRI. Gyda'r un hyd isgemig, Xiao et al. [8] yn dangos bod newidiadau ffibrotig sylweddol wedi digwydd 11 diwrnod ar ôl uIRI pan oedd y tymheredd isgemig yn cael ei reoli ar 37 C 38 C a'r cyfnod amser rhwng uIRI a nephrectomi cyfochrog oedd 10 diwrnod. Mae rhai ymchwilwyr, fel Colombaro et al. [14] a Li et al. [16] ni soniodd am y tymheredd isgemig yn eu hastudiaethau.

Yn y cyfamser, ychydig o bobl a ymchwiliodd i effaith yr egwyl amser rhwng nephrectomi gwrthochrol ac uIRI yn y model hwn, gan arwain at ganlyniadau amrywiol iawn ymhlith gwahanol labordai, a effeithiodd ar arbrofion dilynol yn ddramatig hefyd. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymchwilio i effeithiau'r prif ffactorau sy'n effeithio ar ffibrosis yr arennau ar ôl AKI, gan gynnwys yr egwyl amser rhwng nephrectomi cyfochrog ac uIRI, tymheredd craidd y corff yn ystod isgemia, a hyd yr isgemia. Ein nod oedd darparu cyfeiriad i wneud model anifeiliaid priodol ar gyfer astudio trawsnewidiad AKI CKD

Defnyddiau a dulliau Modelau anifeiliaid

Cafodd llygod gwrywaidd C57BL/6J (8-10 wythnos oed, tua 22 g o bwysau; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Tsieina) fynediad am ddim i fwyd a dŵr yng Nghanolfan Arbrofi Anifeiliaid Prifysgol Feddygol Shanxi. Roedd yr amodau bridio fel a ganlyn: lleithder 40–70%, tymheredd 23 C, dosbarth glendid aer 7, cylch golau/tywyll a reolir o dan amodau di-batogenau, arbelydru Co60 porthiant, a dŵr wedi'i buro. Cymeradwywyd yr holl weithdrefnau ar gyfer yr astudiaeth hon gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Ail Ysbyty Prifysgol Feddygol Shanxi (rhif moeseg: DW2022028).

Protocolau

O ystyried y gallai cyfnodau isgemig, tymereddau craidd y corff yn ystod isgemia, ac amseriadau echdoriad yr aren anafedig cyfochrog i gyd gael effaith ar ddifrifoldeb AKI a ffibrosis yr arennau dilynol, gwnaethom ymchwilio i effeithiau'r tri ffactor uchod yn unigol, gyda'r ddau arall yn sefydlog. Cynhaliwyd tri arbrawf fel a ganlyn.

Protocol 1: Er mwyn arsylwi ar effaith yr egwyl rhwng nephrectomi cyfochrog ac uIRI ar swyddogaeth yr arennau a ffibrosis ôl-AKI, gosodwyd amser isgemig yr aren chwith ar 24 munud a gosodwyd tymheredd craidd y corff ar 37 C yn ystod yr aren. isgemia yn y cyfamser. Cynhaliwyd echdoriad yr arennau dde ar ddiwrnod 7, diwrnod 10, a diwrnod 14, yn y drefn honno (n ¼ 8 y grŵp) ar ôl yr IRI aren chwith. Fe wnaethom bennu hyd isgemia ac echdoriad arennau yn seiliedig ar ganlyniadau astudiaethau blaenorol [8,10,12,15] a'n canlyniadau cyn-arbrofol. Gweler Ffigur 1(AC-C) am brotocol yr astudiaeth.

Protocol 2: Er mwyn arsylwi effaith tymheredd craidd y corff yn ystod isgemia ar y trawsnewidiad AKI-CKD, gosodwyd amser isgemig yr aren chwith ar 24 munud, a chafodd yr aren dde ei dynnu 14 diwrnod ar ôl yr IRI aren chwith. Rheolwyd tymheredd craidd y corff ar 36 C, 36.5 C, 37 C, 37.5 C, a 38 C, yn y drefn honno (n ¼ 8 y grŵp). Gweler Ffigur 1(D) am brotocol yr astudiaeth.

Protocol 3: Er mwyn arsylwi effaith cyfnodau isgemia arennau ar y trawsnewid o AKI i CKD, gosodwyd tymheredd craidd y corff ar 37 C yn ystod isgemia, a chafodd yr aren dde ei thynnu 14 diwrnod ar ôl yr IRI aren chwith. Fe wnaethom ddewis y pwynt amser hwn oherwydd bod ffibrosis yr arennau, sef y newid nodweddiadol ar ôl AKI i CKD, yn amlwg iawn yn ôl yr adroddiadau [8,10,12,15] a'n canlyniadau cyn-arbrofol. Rheolwyd amser isgemig yr aren chwith ar 21 munud, 24 munud, 27 munud a 30 munud, yn y drefn honno (n ¼ 8 y grŵp). Gweler Ffigur 1(E) am brotocol yr astudiaeth.

Cafodd pob llygod eu ewthaneiddio 8 wythnos ar ôl IRI yr aren chwith. Storiwyd rhan o feinwe'r arennau chwith ar 70 C ar gyfer y dadansoddiad RT-PCR a blot gorllewinol dilynol, a gosodwyd y rhan arall mewn formalin niwtral ar gyfer dadansoddiad histopatholegol. Casglwyd samplau gwaed trwy'r sinws ôl-orbitol ar gyfer profion biocemegol.

Ffigur 1. Protocolau'r anaf isgemia-atlifiad unochrog (uIRI) gyda nephrectomi gwrthochrol gohiriedig. (A-C): Roedd yr aren chwith yn destun IRI ar ddiwrnod 0, a chynhaliwyd echdoriad yr arennau dde ar wahanol adegau (diwrnod 7, diwrnod 10, a diwrnod 14) gyda'r hyd isgemig sefydlog ar 24 munud gyda thymheredd craidd y corff yn sefydlog ar 37 C yn ystod isgemia'r arennau. (D): Roedd yr aren chwith yn destun IRI ar ddiwrnod 0, a chynhaliwyd echdoriad yr arennau dde o dan wahanol dymheredd craidd y corff (36 C, 36.5 C, 37 C, 37.5 C, a 38 C) gyda'r isgemia amser gosod yr aren chwith yn 24 munud, a chafodd yr aren dde ei thynnu 14 diwrnod ar ôl yr IRI aren chwith. (E): Roedd yr aren chwith yn destun IRI ar ddiwrnod 0, a chynhaliwyd echdoriad yr arennau dde ar wahanol gyfnodau isgemig (21 munud, 24 mun, 27 munud, a 30 munud) gyda thymheredd craidd y corff yn sefydlog ar 37 C yn ystod yr aren. isgemia, a chafodd yr aren dde ei thynnu 14 diwrnod ar ôl yr IRI aren chwith. Aseswyd pwysau'r arennau, gweithrediad yr arennau, anaf histolegol yr arennau, a ffibrosis yr arennau tan ddiwrnod 56.

Gweithdrefn lawfeddygol

Cyn llawdriniaeth, roedd yr holl lygod yn ymprydio am 12 awr gyda mynediad rhydd i ddŵr a chawsant eu chwistrellu â 3% sodiwm pentobarbital 50 mg/kg yn fewnberitoneol. Yn ystod anesthesia, cynhaliwyd y tymheredd rhefrol yn 36 C, 36.5 C, 37 C, 37.5 C, neu 38 C, yn y drefn honno, mewn gwahanol grwpiau arbrofol. Er mwyn cyflawni hyn, gosodwyd y llygoden gyda'i chefn ar bad gwresogi (CW{{1{0}}, BARBAROUS TWF, Zhejiang, Tsieina) mewn sefyllfa gyda'i phen a'i gwddf wedi'i hymestyn i sicrhau bod ei llwybr anadlu'n parhau. yn ddirwystr, ac roedd y llygaid wedi'u gorchuddio â rhwyllen halwynog cynnes i osgoi sychu yn ystod y driniaeth. Ar ôl anesthesia, cafodd y gwallt ar gefn chwith y llygoden ei eillio â'r clipiwr gwallt. Yna cafodd y croen yn yr ardal lawfeddygol ei sychu'n lân gyda swab alcohol 75%. Yn gyffredinol, mae tymheredd corff y llygoden yn disgyn ar ôl eillio gwallt. Cynhaliwyd y weithdrefn lawfeddygol pan ddaeth tymheredd craidd y corff yn gyson, a allai gymryd tua 15 munud. Gellid gweld yr aren chwith trwy dorri'r croen dorsal chwith 0.5 cm wrth ymyl y llinell ganol a 0.5 cm ar ymyl isaf cawell asennau'r llygoden. Yna fe wnaethom ni wasgu'r abdomen chwith gydag un llaw i wneud yr aren chwith allan o geudod y corff, codi'r aren gyda gefeiliau crwm di-fin (gan gymryd gofal i osgoi niweidio'r aren), datgymalu'r pedicle aren a'i glampio'n gyflym, a gosod y clampio. aren o dan y croen i'w gadw'n gynnes ac yn llaith. Nodweddwyd isgemia llwyddiannus gan newid lliw graddol yr aren o goch i borffor tywyll, a barhaodd am 21 munud, 24 munud, 27 munud a 30 munud yn y drefn honno, mewn gwahanol grwpiau arbrofol. Newidiodd lliw'r arennau yn ôl i goch o fewn 2-5 munud ar ôl rhyddhau'r clamp. Yna fe wnaethom gau ceudod yr abdomen gyda phwythau haenog. Torrwyd y croen dorsal cywir a'r cyhyr ar ddiwrnod 7, diwrnod 10, a diwrnod 14 ar ôl uIRI, yn y drefn honno, mewn gwahanol grwpiau arbrofol, ac echdorwyd yr aren dde. Yna caewch y clwyf gyda phwythau safonol. Ar ôl pob llawdriniaeth, chwistrellwyd 500 lL halwynog yn fewnperitoneol i wneud iawn am y golled hylif yn ystod llawdriniaeth. Ar yr un pryd, cadwyd y llygoden ar bad gwresogi am tua 2-3 h nes iddi ddod yn ymwybodol iawn cyn cael ei throsglwyddo i'r cawell tai. Ni chlampiodd y grŵp ffug pedicle yr aren, ac roedd gweddill y llawdriniaethau yr un fath â rhai'r grŵp uIRI. Perfformiwyd pob llawdriniaeth lawfeddygol gan yr un person â mwy na 2 flynedd o brofiad o weithredu'r model hwn.

Assay swyddogaeth yr arennau

Mesurwyd lefelau SCr gan y Creatinine Kit (Jaffe Method, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). Mesurwyd lefelau BUN gan y Wrea Kit (Dull Urease-Glutamate Dehydrogenase, Biosino Biotechnology and Science).

Assay pwysau arennau

Ar ôl troethi, mesurwyd pwysau corff llygod gan raddfa electronig fanwl gywir. Roedd arennau ffres yn cael eu rinsio deirgwaith mewn halwynog wedi'i oeri ymlaen llaw, yna cafodd gormod o ddŵr ar yr arennau ei ddileu â phapur hidlo. Cafodd y capsiwlau arennau eu plicio i ffwrdd ar yr iâ a chafodd yr arennau eu pwyso ar unwaith. Cyfrifwyd cymhareb pwysau'r arennau i bwysau'r corff i werthuso pwysau'r arennau wedi'u cywiro mewn mg/g.

Sgôr staenio hematoxylin-eosin (AU) ac anaf i'r arennau

Roedd meinweoedd arennau sefydlog â fformalin niwtral yn cael eu dadhydradu'n rheolaidd, eu hymgorffori mewn paraffin, eu torri (3 lm), a'u staenio ag AU i arsylwi difrod meinweoedd yr arennau. Cafodd deg maes a ddewiswyd ar hap o cortecs yr arennau ym mhob adran eu dal gyda microsgopeg golau ar 400 chwyddhad. Sgoriodd dau batholegydd yr anaf i'r glomerwlws a'r tiwbiau arennau ar wahân. Sgoriwyd yr anaf tiwbaidd ar raddfa o {{20}}-4 gan ddefnyddio'r meini prawf canlynol [17]: 0, dim anaf; 1, sy'n effeithio ar 1-25% o ardal yr arennau; 2, yn effeithio ar 26–50% o arwynebedd yr arennau; 3, sy'n effeithio ar 51-75% o ardal yr arennau; a 4, sy'n effeithio ar 75-100% o arwynebedd yr arennau. Gwerthuswyd graddau'r anaf tiwbaidd yn lled-feintiol trwy gyfrifo arwynebedd anaf tiwbaidd yr arennau. Gwerthuswyd yr anaf glomerwlaidd a'i sgorio ar raddfa o 0-4 yn ôl arwynebedd canrannol yr ehangiad mesangial neu sglerosis gan ddefnyddio'r meini prawf canlynol [17]: 0, glomeruli arferol; 1, 1-25% o'r ardal a anafwyd; 2, 26-50% o'r ardal a anafwyd; 3, 51-75% o'r ardal a anafwyd; a 4, 76-100% o'r ardal a anafwyd. Y sgôr difrod glomerwlaidd terfynol ¼ 0 (% gradd 0 glomeruli) þ 1 (% glomeruli gradd 1) þ 2 (% glomeruli gradd 2) þ 3 (% glomeruli gradd 3) þ 4 (% gradd 4 glomeruli). Sgoriwyd mwy na 50 glomeruli fesul llygoden.

Staeniad trichrome Masson

Roedd meinweoedd arennau sefydlog â fformalin niwtral yn cael eu dadhydradu'n rheolaidd, wedi'u hymgorffori mewn paraffin, eu torri (3 lm), a'u staenio â thrichrome Masson i arsylwi ffibrosis yr arennau. Yn sleisys trichrome-staen Masson, cafodd ugain maes o cortecs yr arennau nad oeddent yn gorgyffwrdd eu dal o dan 200 o chwyddhad. Defnyddiwyd Meddalwedd Dadansoddi Delwedd Image-Pro Plus ar gyfer mesur a dadansoddi awtomatig. Defnyddiwyd canran yr ardal ffibrotig i gyfrifo lefel ffibrosis interstitial arennau [8].

RT-PCR

Echdynnwyd cyfanswm mRNA o feinwe arennau pob grŵp gan Trizol a mesurwyd ei grynodiad, yna cafodd ei drawsnewid i cDNA (Taka Reverse Transcription Kit). Defnyddiwyd dull fflworoleuedd Taqman (TB Green Premix Ex Taq II RT-PCR amser real) i feintioli mynegiadau RNA ffibronectin (FN) a colagen I (COL-I) ym meinweoedd yr arennau. Defnyddiwyd paent preimio penodol ar gyfer FN (ymlaen: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 a chefn: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT{6}} ), a COL-I (ymlaen: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} a chefn: 50 -T CSSATTGTATGCAGC-30 ) [18] (darparwyd gan Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Mae'r amodau ymhelaethu fel a ganlyn: 95 C am 30 s, 95 C am 5 s, 60 C am 30 s, 40 cylch; 95 C am 10 s, 65 C am 5 s, a 95 C/5 C. Ar ôl dadansoddi cromliniau ymhelaethu a chromliniau hydoddedd y cynhyrchion, pennwyd y lefelau mRNA cymharol gan y dull CT cymharol (2-DDCt) gyda 18SrRNA (ymlaen: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 a chefn: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) fel y cyfeiriad mewnol.

Blot gorllewinol

Defnyddiwyd byffer lysis radio-immuno-precitation-assay (RIPA) i lyse meinweoedd yr arennau a phenderfynwyd crynodiad y protein gan y dull BCA. Defnyddiwyd electrofforesis gel graddiant i wahanu'r proteinau oddi wrth 50 lg o samplau. Yna trosglwyddwyd y proteinau i bilen nitrocellulose. Ar ôl blocio â llaeth nonfat 5% am 2 awr, cafodd y pilenni eu blotio dros nos ar 4 C gyda gwrthgorff monoclo nal gwrth-lygoden cwningen yn erbyn actin cyhyrau llyfn (a-SMA) (1: 1000, Rhif 19245, Technoleg Signalau Cell ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam), neu COL-I (1:1000, Rhif 72026, Technoleg Signalau Cell), yn y drefn honno. Y diwrnod wedyn, cafodd y pilenni eu hailgynhesu ar dymheredd yr ystafell am 0.5 h. Ar ôl cael eu golchi â TBST, deorwyd y pilenni ag IgG Gwrth-gwningen AffiniPure Gafr Cyfunedig HRP (H þ L)(1:1000, Rhif BA1054, HRP) am 2 awr. Ar ôl cael eu golchi â TBST eto, cawsant eu staenio ag adweithydd cemiluminescence ECL hynod sensitif i ddelweddu'r imiwnoblotiau. mesurwyd b-actin ar yr un bilen â'r cyfeirnod mewnol. Pennwyd mynegiadau protein trwy feintioli mynegiadau cymharol proteinau targed yn erbyn b-actin.

Data a dadansoddiad ystadegol

Mynegir yr holl ddata a archwiliwyd fel cymedrig ± gwyriad safonol. Cymharwyd y ddau grŵp trwy brawf-t annibynnol. Cyrchwyd cymariaethau rhwng grwpiau lluosog gan ANOVA unffordd pan fo'r dosbarthiad data yn normal, a'r amrywiant yn homogenaidd, defnyddiwyd Welch ANOVA i asesu arwyddocâd ystadegol pan oedd yr amrywiant yn heterogenaidd, ac yna prawf post hoc Tukey ar gyfer cymariaethau lluosog. Cynhaliwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol gan feddalwedd GraphPad Prism 8.0. p < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol.