I Archwilio Effaith Awtoffagi a Achosir gan Atyniad Ar Senescence CBMSC

Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth

2.5.Awtophagy Inovoloes wrth Gyflawni Effaith Amddiffynnol Cur yn Senescence cBMSC

Er mwyn archwilio effaith awtophagi a achosir gan Cur-induced ar heneiddedd cBMSC, modiwleiddiwyd y lefel awtophagi trwy ddefnyddio RAP(200 nM) neu 3-MA(5 mM).{4}}Mae MA yn gweithredu gweithred ataliol sylweddol ar weithgaredd awtoffagic, a amlygir gan is-reoleiddio sylweddol mynegiant mRNA o brotein sy'n gysylltiedig â microtiwbyn 1 cadwyn ysgafn 3(LC3), genyn sy'n gysylltiedig ag awtophagi (ATG)7, ATG12, ac unc51-fel awtophagi-actifadu kinase51- {14}}(ULK1); y gymhareb mynegiant protein sy'n gysylltiedig â microtiwbwl 1 cadwyn ysgafn 3 math Ⅱ/I (LC3-I/I); a mynegiant cynyddol t62 o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffigur 5A, B). Yn unol â hynny, o'i gymharu â'r grŵp Cur, gwelwyd gostyngiad mewn gweithgaredd awtoffagig yn 3-grŵp MA plws Cur (Ffigur 5A, B). Mewn cyferbyniad, gwelwyd cynnydd mewn gweithgaredd awtoffagic yn y grŵp RAP, fel y dangosir gan fynegiant mRNA wedi'i uwchreoleiddio o LC3, ATG12, ac ATG7; y trosiad cynyddol o LC3-I i LC3-II; a diraddio t62 (Ffigur 5A, B).

Yn gyntaf, archwiliwyd y gweithgaredd awtoffagic yn systematig. Aseswyd ffurfiant gwagolau awtoffagic (a elwir hefyd yn awtopagosomau) trwy arsylwi morffolegol, a dangosodd y canlyniadau fod mwy o wagolau awtoffagic a dotiau LC3 yn y grŵp Cur a'r grŵp RAP o'u cymharu â'r grŵp rheoli, tra bod nifer llai o wagolau awtoffagic a arsylwyd llai o ddotiau LC3 yn y grwpiau 3-MA a 3-MA plus Cur (Ffigur 5C, E). Yn ogystal, dangosodd staenio LysoTracker fod asideiddio lysosomaidd wedi'i wella gan RAP a Cur mewn cBMSCs a'i fod yn gostwng mewn y 3-MA a 3-MA plws grwpiau Cur (Ffigur 5D). Mae'r canlyniadau'n dangos bod Cur a RAP yn cael effaith gadarnhaol debyg ar actifadu awtophagi a bod gweithgarwch awtoffagic yn cael ei atal gan 3-MA.maint pidyn cistanche,Fodd bynnag, gall effeithiau ataliad 3-MA ar awtophagi gael eu hachub yn rhannol trwy gyflogi Cur.

Cliciwch yma i wybod mwy

I gadarnhau a yw awtoffagi yn cymryd rhan yn y gwaith o reoleiddio heneiddedd CB MSc, fe wnaethom archwilio ffenoteipiau sy'n gysylltiedig â heneiddedd ymhellach ar ôl hyrwyddo neu atal awtoffagi trwy driniaeth ffarmacolegol. Dangosodd y canlyniadau fod nifer llai o gelloedd SA- -gal-positif yn bresennol yn y grwpiau Cur a RAP, tra bod nifer uwch o gelloedd SA- -gal-positif i'w gweld yn y {{5} }Grŵp MA o'i gymharu â'r grŵp rheoli. Mae'n werth nodi bod nifer y celloedd SA- -gal-positif wedi cynyddu'n sylweddol yn y grŵp 3-MA plus Cur o'i gymharu â'r grŵp Cur (Ffigur). Dangosodd canlyniadau dadansoddiad RT-qPCR fod triniaeth gyda RAP a Cur yn cynyddu lefel mynegiant SOX-2 a Nanog a gostwng lefel mynegiant IL-6, TNF-a, p21, a t16 o gymharu gyda'r grŵp rheoli. Fodd bynnag, roedd ataliad awtophagi gan 3-MA yn uwchreoleiddio mynegiant t16, t21, TNF- , ac IL-6(Ffigur 6C-E). Ymhellach, o gymharu â'r grŵp rheoli, cynyddwyd effeithlonrwydd ffurfio cytref cBMSCs yn y Grwpiau Cur a RAP, tra bod nifer a maint CFU-F wedi gostwng yn sylweddol yn y grŵp 3-MA. Yn ogystal, dangoswyd y gallai effaith well Cur ar y nifer o cBMSCs sy'n ffurfio cytrefi gael ei diddymu trwy ragamodi â 3-MA (Ffigur 6B).powdr cistancheMae'r dystiolaeth hon yn dangos y gall RAP a Cur wella heneiddedd cBMSC, tra bod 3-MA yn gwaethygu heneiddedd cBMSC ac yn gwanhau'r effeithiau buddiol a roddir gan Cur.

Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod atal awtophagi â 3-MA yn cyflymu heneiddedd cBMSCs, tra bod actifadu awtophag gyda Cur a RAP yn lleddfu heneiddedd cBMSC (Ffigur 6F). Yn nodedig, cafodd yr effeithiau amddiffynnol a roddwyd gan Cur eu gwanhau gan ragdriniaeth gyda 3-MA(Ffigur 6F), sy'n awgrymu bod awtoffagi a achosir gan Cur yn fecanwaith moleciwlaidd posibl ar gyfer gwella heneiddedd cBMSC.

3. Trafodaeth

Mae organebau'n atgyweirio meinweoedd anafedig yn barhaus ac yn arafu prosesau sy'n gysylltiedig â heneiddedd oherwydd nodweddion swyddogaethol nodedig yr MSCs sy'n byw'n helaeth o fewn meinweoedd ac organau amrywiol [15]. Yn anffodus, mae oedran a chlefydau yn ffactorau allweddol ar gyfer heneiddedd MSC in vivo, ac mae gwahaniaethau mewnol ac allanol mewn amgylcheddau cellog yn cyflymu diwylliant heneiddedd MSC in vitro, ac mae'r ddau ohonynt yn effeithio'n negyddol ar eu gallu ar gyfer gwrthimiwnedd, gwahaniaethu a mudo, gan leihau effeithiolrwydd yr hunan yn y pen draw. -atgyweirio a thrawsblannu mewn MSCs [7,14,49-51].dyfyniad salsa cistancheNododd Oja a chydweithwyr fod BMSCs dynol wedi rhoi'r gorau i amlhau ar y pumed i'r nawfed taith o ddiwylliannau gradd glinigol ac yn arddangos ffenoteipiau heneiddedd nodweddiadol, megis morffoleg hypertroffig a gwastad, actifadu atalyddion cylchred cell kinase t16 a p21, cyfradd amlhau is. , a gweithgarwch uwch SA- -gal [52]. Yn amlwg, mae ehangu in vitro yn anochel yn arwain at ymddangosiad cynamserol o heneiddedd mewn MSCs, a ystyrir yn system fodel bwysig ar gyfer ymchwil heneiddio cellog in vitro [42, A4, A5]. Canfu ein hastudiaeth bresennol fod cBMSCs cyn y 3ydd darn yn dangos morffoleg unffurf ond y gwelwyd eu bod yn mynd trwy gyfres o newidiadau o ran morffoleg cellog, ffisioleg, a mynegiant genynnau ar ôl y 6ed darn (Ffigurau 2 a 7), yn gyson â henebrwydd cynamserol. .

Gall Cistanche gwrth-heneiddio

Mae swm cynyddol o dystiolaeth yn dangos bod ysgogiad ffarmacolegol yn ddull addawol ar gyfer achub MSCs o heneiddedd [53,54]. Gyda hyn mewn golwg, mae nifer o gyfansoddion naturiol a synthetig wedi cael eu hymchwilio'n helaeth er mwyn pennu eu potensial gwrthlidiol, gwrthocsidiol a gwrth-senescence in vivo ac in vitro [15,55]. Fel cyfansoddyn ffenolig sy'n digwydd yn naturiol, mae Cur wedi ennyn sylw mawr oherwydd ei effeithiau buddiol ar fioleg MSC [36,37,56,57]. Fodd bynnag, dylid ystyried yn ofalus effeithiau cymhleth amlygiad Cur ar MSCs cyn gweithredu ymchwil biofeddygol wahanol. Adroddodd Yang a chydweithwyr y gallai crynodiadau uchel o Cur (50 a 100 uM) achosi effeithiau gwenwynig acíwt mewn BMSCs dynol in vitro, tra bod amlygiad parhaus (7 d) i 10uM o Cur yn atal ymlediad BMSC dynol ac yn achosi apoptosis celloedd [58]. Yn ddiddorol, nododd astudiaeth arall fod triniaeth gyda Cur (<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Yn ddiweddar, mae gweithgareddau biolegol Cur wedi cael eu hadrodd yn helaeth ar amrywiol fodelau in vitro neu in vivo, yn enwedig o ran modiwleiddio nodweddion biolegol MSCs. Mae gweithgaredd gwrth-heneiddio Cur wedi'i drafod yn aml, a chanfuwyd bod Cur yn arddangos effeithiau buddiol ar heneiddio a chlefydau sy'n gysylltiedig ag oedran ar y lefelau organeb a cellog. Fodd bynnag, mae'r mecanwaith sy'n sail i'w reoleiddio yn gymhleth oherwydd y dosau a'r ffurfiau gwahanol o Cur, yn ogystal â'r mecanwaith heneiddio [19]. Fel mecanwaith mewngellol mawr o ddiraddio moleciwlau a throsiant organelle, mae awtoffagy yn chwarae rhan fawr wrth amddiffyn MSCs rhag amodau straen a chynnal homeostasis cellog. Ystyrir bod modiwleiddio autophagy yn strategaeth newydd ar gyfer lleddfu swyddogaethau MSC [59]. Yn ôl data a gasglwyd o astudiaethau sylweddol, mae hyrwyddo neu atal awtoffagy gan Cur mewn modelau celloedd amrywiol yn cael effeithiau cytoprotective boddhaol [38-40].coesyn cistancheDangosodd ein data y gwelwyd mwy o weithgarwch awtoffagig ar ôl dod i gysylltiad â Cur, fel y nodwyd gan uwchreoleiddio genynnau sy'n gysylltiedig ag awtoffagi (LC3, ULK1, Atg7, ac Atg12), cynhyrchu LC{5}}II, cynnydd yn nifer y gwagolau awtoffagic ac organynnau pothellog asidig, a gostyngiad sylweddol yn lefel protein p62 (Ffigur 4). Yn ogystal, mae'r lysosom yn cael ei ystyried yn organelle anhepgor ar gyfer awtophagi, tra bod dadreoleiddio pH lysosomaidd a newid gweithgaredd gwagolar H plws -ATPase (v-ATPase) yn y broses o heneiddedd MSC, gan hyrwyddo asideiddio lysosomal ac awtophagi a chyfrannu. i ohirio henebrwydd MSC [60]. Nododd Yan a chydweithwyr y gall Cur actifadu swyddogaeth lysosome ffibroblastau embryonig llygoden (MEFs) a chymell awtoffagy, sy'n gweithredu fel signal goroesi hanfodol [38]. Yn yr un modd, gwelsom fod triniaeth Cur yn gwella asideiddio lysosomaidd mewn cBMSCs (Ffigur 4), gan awgrymu y gallai Cur fod yn rhan o actifadu swyddogaeth lysosom, sy'n anhepgor ar gyfer gwella gweithgaredd awtoffagig.

Mecanwaith cytoprotective yn bennaf yw awtoffagy, ac mae mwy a mwy o dystiolaeth wedi dangos bod cydberthynas rhwng priodweddau gwrth-heneiddio cyfansoddion naturiol a synthetig â modiwleiddio autophagy [29,54,61,62]. Fodd bynnag, nid yw effeithiau modiwleiddio awtophagi ar heneiddedd MSC a mecanweithiau cyfatebol wedi'u gwerthuso na'u harchwilio'n llawn eto. Mae adroddiadau cychwynnol wedi nodi bod awtoffagi yn fecanwaith sytoprotective yn bennaf ac y gall lefel uwch o awtoffagi oedi henaint cellog trwy leihau cronni metabolion gwenwynig ac adfer swyddogaeth organynnau [63]. Yn ddiddorol, mae ymchwiliadau diweddar hefyd wedi dangos bod niferoedd cynyddol o wagolau awtophagig a phroteinau sy'n gysylltiedig ag awtophagi (LC3-II, ATG7, ac ATG12) wedi'u harsylwi yn ystod heneiddedd MSC, tra bod ataliad awtophagig gyda bafilomycin A1 a {{11 }}Dangoswyd MA i leihau canran y celloedd SA- -gal-positif a mynegiant t16 a t21 [35]. I egluro ymhellach y berthynas rhwng awtophagi a achosir gan Cur a'i effeithiau ar cBMSCsenescence, awtoffagi ei fodiwleiddio gan pretreatment â rapamycin neu 3-MA. Yn amlwg, canfuwyd bod gweithgarwch awtoffagig yn cael ei wanhau gan 3-MA, tra dangoswyd bod RAP a Cur (1 uM) yn gwella awtoffagi yn sylweddol (Ffigur 5). Yn gyson ag adroddiadau blaenorol [5], mae ein canfyddiadau hefyd yn dangos bod ataliad awtophagy gan 3-MA wedi cyflymu heneiddedd cellog mewn cBMSCs.Cafodd effeithiau cyson bron ar actifadu awtophagi gan Cur(1uMand RAP tra bod effeithiau cytoprotective analogaidd mewn Yn unol â hynny, pan gafodd awtoffagi ei atal gan 3-MA, lleihawyd yr effeithiau amddiffynnol a roddwyd gan Cur (Ffigur ), sy'n awgrymu bod awtoffagi a achosir gan Cur yn fecanwaith moleciwlaidd posibl ar gyfer gwella heneiddedd cBMSC (Ffigur 7).

O dan amodau ffisiolegol, mae awtoffagi yn digwydd ar lefel waelodol ym mhob cell ewcaryotig i gynnal homeostasis cellog. Fodd bynnag, gall amodau straen amrywiol arwain at awtophagi annormal, sy'n cael dylanwad ar dynged celloedd oni bai bod awtophag yn cael ei adfer i'r lefel optimaidd [41,44,64]. Cadarnhaodd ein tystiolaeth fod awtophagi a achosir gan Cur-induced yn dangos effeithiau buddiol ar reoleiddio heneiddedd cBMSC. Yn y senario hwn, dylid ystyried ysgogiadau amrywiol sy'n cynhyrchu straen a gosodiadau allgellog yn ofalus cyn triniaeth Cur, a byddai'n ddiddorol ymchwilio i weld a all awtoffagy a achosir gan Cur wella swyddogaeth MSCs yn ddetholus ar ddogn a hyd a bennwyd ymlaen llaw. Yn ogystal, mae system cyflenwi curcumin sy'n seiliedig ar nanotechnoleg wedi dangos lefelau hydoddedd cyfnod dyfrllyd a bio-argaeledd gwell [65,66]; gallai fod yn arf addawol ar gyfer oedi a gwrthweithio heneiddedd MSC. Mae'r ateb i'r cwestiwn ai awtoffagi yw'r prif fecanwaith sylfaenol ar gyfer gohirio heneiddedd MSC yn dal i fod angen mwy o fanylion a fydd yn cael eu darparu gan ymchwil yn y dyfodol.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1.Anifeiliaid

Casglwyd samplau mêr esgyrn oddi wrth 6 chi sy'n oedolion iach o gefn gwlad Tsieineaidd (12-mis oed). Cymeradwywyd yr holl astudiaethau gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Cyfadran Prifysgol Amaethyddol Sichuan (rhif cymeradwyaeth2020-0608) a'u cynnal yn unol â safonau moesegol deddfau amddiffyn anifeiliaid Gweriniaeth Pobl Tsieina.

4.2. Paratoi Ateb Curcumin

Diddymwyd Cur (HPLC Yn fwy na neu'n hafal i 98 y cant, rhif CAS:458-37-7; Solar Science & Technology Co, Ltd., Beijing, China) yn DMSO i grynodiad stoc o 20 mmol/ L. wedi'i hidlo trwy bilen hidlo microfandyllog organig 0.22 μm a'i storio ar -80 gradd . Paratowyd gwahanol atebion Cur mewn cyfrwng ar gyfer astudiaeth in vitro.

4.3. Diwylliant Cell ac Ehangu

Cafwyd cBMSCs o fêr esgyrn. Cafodd y celloedd eu meithrin mewn cyfrwng cyflawn a oedd yn cynnwys Glucos Cyfrwng Eryr Addasedig Dulbecco (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, UDA), serwm buchol ffetws 10 y cant (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China). ), ac 1 y cant penisilin/streptomycin. Ar gydlifiad 80-90 y cant, rhyddhawyd y celloedd ymlynol gyda Trypsin Digestion Solution (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) a'u hehangu ymhellach ar gymhareb o 1:2-1:3 [67 ].

4.4. Twf Cell Curie

Er mwyn pennu gallu lluosogol cBMSCs mewn darnau (P)3,6, a 9, cafodd y celloedd eu hadu mewn tri 48-blat ffynnon (2500 o gelloedd/ffynnon). Ar ôl deoriad 48 h, rhyddhawyd y celloedd gyda Datrysiad Treulio Trypsin a'u cyfrif gyda hemocytomedr. Roedd y weithdrefn cyfrif celloedd yn cael ei hailadrodd bob 48 awr a'i chynnal am 14 d.

4.5.Canfod Imiwnoffenoteip cBMSCs yn ôl Cytometreg Llif

Yn y 3ydd darn, cafodd cBMSCs eu golchi â PBS a'u trypsineiddio. Ail-ataliwyd y celloedd (3 × 105 celloedd / mL) yn y byffer staenio, a deorwyd yr ataliadau celloedd （100 μL） gyda gwrthgyrff monoclonaidd FITC, PE, neu APC wedi'u labelu â fflwroleuol yn erbyn yr antigenau arwyneb CD45, CD34, a ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, UDA) a CD31, CD90, a CD105 (biotechnoleg Biosynthesis Co.Ltd. Beijing, Tsieina) wedi'u labelu heb fflworoleuol am 15 munud ar 4 gradd. Golchwyd y celloedd â PBS a'u deor ag IgG gwrth-gwningen gafr cyfun FITC am 15 munud ar 4 gradd . Canfuwyd yr antigenau arwyneb gan sytometreg llif (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, UDA). Cynhaliwyd dadansoddiad data gyda meddalwedd CytExpert.

4.6. Assay Gwahaniaethu In Vitro

Cafodd cBMSCs eu platio ar ddwysedd o 5×104 cell/mL mewn 6-platiau ffynnon. Ar gydlifiad 70-80 y cant, disodlwyd y cyfrwng cyflawn â chyfrwng sefydlu gwahaniaethu osteogenig neu adipogenig a'i newid bob 3 diwrnod (Cvagen, Suzhou, Tsieina). Canfuwyd dyddodiad calsiwm gan staenio Alizarin Red S (Solarbio, Beijing, China) ar ôl 3 wythnos o ymsefydlu osteogenig a gwelwyd cronni defnynnau lipid gan ddefnyddio staenio Olew Red O (Solarbio, Beijing, Tsieina) ar ôl 2 wythnos o anwythiad adipogenig.

4.7.Effaith Cur ar Hyfywedd Cellog

Pennwyd hyfywedd cellog cBMSCs gan ddefnyddio pecyn CCK-8(Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China).manteision a sgîl-effeithiau cistanche tubulosaCafodd cBMSCs eu meithrin ymlaen llaw mewn 96-plât ffynnon am 24 h.Cafodd cBMSCs eu trin â Cur ar grynodiadau gwahanol(0.1, 0.5, 1, 5, ac 1{ {14}} umol/L) am 12 awr, 24 awr, 48 awr a 72 awr. Cafodd celloedd eu trin â 0.1 y cant o DMSO, a ddefnyddiwyd fel rheolydd Ar ôl deori gyda 10 μL o doddiant CCK-8 y ffynnon am 2 h, mesurwyd y dwysedd optegol gan ddarllenydd microplate ar 450 nm (Thermo Scientific, Waltham, MA, UDA). Cyfrifwyd hyfywedd cell cymharol yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

4.8. Assay Ffurfio Trefedigaethau

Canfuwyd effeithlonrwydd hunan-adnewyddu cBMSCs gan ddefnyddio assay uned-fibroblast sy'n ffurfio cytref （CFU-F）. cBMSCs eu hadu （3 × 10² celloedd/ffynnon） mewn 6-blatiau ffynnon. Ar ôl pythefnos o ddiwylliant, gosodwyd y celloedd â 4 y cant o baraformaldehyd am 30 munud a'u harsylwi o dan ficrosgop gwrthdro (LX73, Olympus Corporation, Tokyo, Japan) ar ôl staenio â fioled grisial 1 y cant am 10 munud. Ar gyfer y CFU-F, cyfrifwyd mwy na 50 o gelloedd. Cyfrifwyd effeithlonrwydd CFU-F fel a ganlyn:

Effeithlonrwydd CFU-F=nifer CFU-F/nifer yr hadau (300 o gelloedd)[68].

4.9. Assay Staenio Beta-Galactosidase

Amcangyfrifwyd gweithgaredd -galactosidase sy'n gysylltiedig â heneiddedd (SA- -gal) mewn cBMSCs gan ddefnyddio pecyn staenio gal SA- - (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr . Ar ôl staenio, archwiliwyd y celloedd o dan ficrosgop gwrthdro. Cafodd celloedd wedi'u staenio'n gadarnhaol eu cyfrif i asesu'r heneiddedd cellog.

4.10.Trawsgrifio Gwrthdro PCR Meintiol Amser Real (RT-qPCR)

Echdynnwyd cyfanswm yr RNA o'r pelenni celloedd gan ddefnyddio dull adweithydd Trizol. Cafodd cDNA ei syntheseiddio gan ddefnyddio pecyn adweithydd PrimeScriptTM RT gyda'r Rhwbiwr gDNA (Takara, Shiga, Japan). Dyluniwyd paent preimio PCR (Tabl 2) ar wahân i GAPDH gan gyfeirio at astudiaethau blaenorol [67] gan ddefnyddio meddalwedd Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) yn seiliedig ar ddilyniannau cDNA. Perfformiwyd y qPCR gan ddefnyddio TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Japan) ar System Canfod PCR Amser Real CFX96 Touch (Bio-Rad, Richmond, CA, UDA). Roedd amodau'r adwaith fel a ganlyn: 95 gradd am 30 s ac yna 39 cylch o 95 gradd am 5s a 60 gradd am 30 s. Perfformiwyd dadansoddiad cromlin toddi gan ddechrau ar 95 gradd for10s, yna'n amrywio o 65 i 95 gradd, gan gynyddu 0.5 gradd bob cylch. Defnyddiwyd GAPDH fel rheolaeth fewnol i normaleiddio'r holl ddata a chyfrifwyd y mynegiant cymharol trwy'r dull Trothwy Beicio cymharol (Ct).

4.11. Olrhain UIsing Lusosomal LysoTracker

Defnyddiwyd Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co, Ltd., Shanghai, China) i olrhain lysosomau, a all arddangos dwyster fflworoleuedd cynyddol ar asideiddio lysosomaidd. Fe wnaethon ni hadu cBMSCs mewn 12-blatiau ffynnon a'u trin â Cur am 24 h, yna cafodd y celloedd eu trin â Lyso-Tracker (60 nM) a Hoechst 33,342 (2 ug/mL) am 20 munud. Gwelwyd y fflworoleuedd gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd gwrthdro ar ôl golchi â PBS.

4.12. Immunofluorescence

Cafodd y cBMSCs (2×104 cell/sleid) eu hadu ar sleidiau a'u gosod gyda 4 y cant o baraformaldehyd am 30 munud. Ar ôl deori ar y cyd â 0.5 y cant Triton X-100 am 5 munud (Solarbio, Beijing, Tsieina), cafodd yr adrannau eu trochi yn yr ateb blocio am 30 munud. Tynnwyd yr hylif caeedig, a deorwyd celloedd â gwrthgyrff gwrth-LC3B (1: 1000, Abcam, Caergrawnt, MA, UDA) dros nos ar 4 gradd, yna deorwyd â gwrthgyrff eilaidd cyfun fflworocrom (Abcam, Caergrawnt, MA, UDA) am 50 munud ar 37 gradd C. Yn olaf, cafodd y celloedd eu gwrth-staenio â DAPI (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) a'u monitro o dan ficrosgop confocal.

4.13.Dadansoddiad Blotio'r Gorllewin

Cafodd y samplau celloedd eu gorchuddio â'r meinwe a'r lysate cell (Solarbio, Beijing, China) yn cynnwys atalydd proteas ar ôl golchi â PBS oerfel iâ. Cafodd y lysates cell sy'n cynnwys 15 ugs o brotein y sampl eu llwytho i mewn i geliau sodiwm-dodecyl sylffad-polyacrylamid (SDS-PA)(Solarbio, Beijing, China) a'u gwahanu gan electrofforesis. Ar ôl trosglwyddo'r proteinau i'r bilen fflworid polyvinylidene (PVDF), cafodd yr olaf ei rwystro'n amhenodol gyda 5 y cant o laeth sych di-fraster (Solarbio, Beijing, Tsieina) am 1 h ar dymheredd yr ystafell. Deorwyd y pilenni dros nos gyda'r gwrthgyrff cynradd gwrth-LC3B (1:2{{000, Abcam, Cambridge, MA, USA), gwrth-p62/SQSTM1(1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, USA). ), a gwrth- -actin (1:1000, Abcam, Caergrawnt, MA, UDA) ar 4 gradd , a golchwyd y blots gyda TBST (Solarbio, Beijing, Tsieina) cyn eu deor â gwrthgorff eilaidd (1 :2000, Abcam, Caergrawnt, MA, UDA) ar 37 gradd am 1 h. Yn dilyn hynny, datblygwyd y pilenni trwy ddod i gysylltiad ag adweithyddion cemiluminescence (Millipore, Billerica, MA, UDA) a'u delweddu gyda ChemiDocTM Imaging Systems (Tanon-5200, Shanghai, China). Cafodd dwysedd y band ei feintioli gan ddefnyddio meddalwedd Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, UDA) ar gyfer pob grŵp a'i normaleiddio gyda -actin.

4.14. Microsgopeg Trawsyrru Electron (TEM)

Cafodd y belen gell ei dreulio a'i chasglu i mewn i diwb centrifuge 1.5ml, yna ei osod gyda 2.5 y cant o glutaraldehyde (Solarbio, Beijing, Tsieina) am 2 awr ar dymheredd yr ystafell. Cafodd y samplau eu hôl-sefydlu gydag 1 y cant o osmiwm tetroxide am 1 awr ar ôl golchi gyda PBS, yna fe wnaethom gynyddu'r dadhydradiad fesul cam mewn toddiannau o aseton a'u hymgorffori mewn resin epocsi 812 (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co, Ltd, Beijing, Tsieina). Yn dilyn hynny, cafwyd adrannau 50 nm o'r uwch-microtome (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, yr Almaen). Cafodd yr adrannau eu staenio ag asetad wranyl (Zhongjingkevi, Bejing, Tsieina) am 10-15 mun a sitrad plwm (Zhongjingkei, Beijing, Tsieina) am 2 funud. Edrychwyd ar yr holl sbesimenau ar TEM (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokyo, Japan).

4.15. Dadansoddiad Ystadegol

Cafwyd y canlyniadau o dri arbrawf annibynnol a dangoswyd yr holl ddata fel modd ± gwyriadau safonol (SD). Dadansoddwyd gwerthoedd ystadegol gan ddefnyddio Ystadegau SPSs IBM 25 a'u darlunio gan ddefnyddio GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, UDA). Canfuwyd gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol gan ddefnyddio perfformio gan ddefnyddio dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) a phrawf-t y Myfyriwr. gwerthoedd p<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Casgliadau

Mae ein canfyddiadau yn taflu goleuni ar y berthynas rhwng Cur, heneiddedd cBMSC, ac awtophagi. Mae'r data o'n hastudiaeth yn awgrymu y gall Cur liniaru cyflwr heneiddedd cBMSCs wrth actifadu awtophagi a hyrwyddo asideiddio lysosomaidd. At hynny, dangosodd tystiolaeth bellach fod awtophagi a achosir gan Cur-induced yn fecanwaith posibl ar gyfer gwella heneiddedd cBMSC. Gallai Cur fod yn ysgogydd a chadwraethwr addawol ar gyfer gwella swyddogaeth MSCs. Yn ein barn ni, ni ellir esgeuluso effeithiau cadarnhaol Cur ar heneiddio. Dylai astudiaethau yn y dyfodol ganolbwyntio ar effaith rheoleiddio Cur ar dynged MSC i wella potensial therapiwtig MSCs mewn amrywiol glefydau, megis difrod meinwe a chlefydau dirywiol a llidiol.

Mae'r erthygl hon wedi'i thynnu o Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms