Amrywiad mewn Mynegiant Genynnau Rhwng Dwy Linell Sorghum Bicolor Yn Wahanol mewn Ymateb Imiwnedd Cynhenid

Crynodeb:

Mae imiwnedd wedi'i ysgogi gan batrwm moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â microbau (MAMPs) yn elfen allweddol o ymateb imiwn cynhenid ​​​​y planhigyn i adnabyddiaeth ficrobaidd. Fodd bynnag, mae'r rhan fwyaf o'n gwybodaeth gyfredol am MTI yn dod o blanhigion model (hy, Arabidopsis thaliana) gyda llai o waith yn cael ei wneud gan ddefnyddio planhigion cnydau. Yn y gwaith hwn, buom yn astudio’r byrst ocsideiddiol a sbardunwyd gan MAMP (ROS) a’r ymateb trawsgrifio mewn dau genoteip deuliw Sorghum, BTx623 a SC155-14E. Mae SC{4}}E yn llinell sy'n dangos ymwrthedd anthracnose uchel ac mae'r llinell BTx623 yn agored i anthracnose. Datgelodd ein canlyniadau amrywiad clir mewn mynegiant genynnau a ROS mewn ymateb i naill ai flagellin (flg22) neu ennyn chitin rhwng y ddwy linell. Er bod yr ymateb trawsgrifiadol i bob MAMP ac ym mhob llinell yn unigryw, roedd cryn orgyffwrdd, ac roeddem yn gallu diffinio set graidd o enynnau sy'n gysylltiedig ag ymateb trawsgrifiadol sorghum MAMP. Darganfu dadansoddiad cyfoethogi llwybr tymor GO a KEGG fod mwy o DEGs sy'n gysylltiedig ag ymwrthedd i imiwnedd a phathogenau mewn samplau SC155-14E wedi'u trin â MAMP nag yn BTx623 gyda'r un driniaeth. Mae'r canlyniadau'n darparu llinell sylfaen ar gyfer astudiaethau yn y dyfodol i ymchwilio i lwybrau imiwnedd cynhenid ​​​​sorghum, gan gynnwys ymdrechion i wella ymwrthedd i glefydau.

Cliciwch i brynu acynnyrch imiwnedd gwell

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Geiriau allweddol:

Sorghum deuliw; ROS; imiwnedd cynhenid; MAMPs; RNA-seq; mynegiant genynnau

1. Rhagymadrodd

Mae planhigion yn naturiol yn agored i amrywiaeth o straen, gan gynnwys nifer o bathogenau bacteriol, ffwngaidd a firaol [1]. Mae planhigion yn amddiffyn eu hunain rhag pathogenau gan ddefnyddio strwythurau a chemegau a ffurfiwyd ymlaen llaw, ac ymatebion y system imiwnedd a achosir gan haint. Mae'r system imiwnedd planhigion yn defnyddio system canfyddiad dwy haen gyda dwy haen ryng-gysylltiedig o dderbynyddion.

Mae'r haen gyntaf yn cael ei actifadu gan dderbynyddion adnabod patrwm wedi'u lleoli ar yr wyneb (PRRs), sy'n synhwyro moleciwlau y tu allan i'r gell trwy adnabod y pathogen goresgynnol trwy ganfod motiffau adeileddol wedi'u cadw, a elwir yn Patrymau Moleciwlaidd Cysylltiedig â Microbau (MAMPs), sy'n sbarduno, cymedrol. ond eang, ymateb amddiffyn [2]. Mae fflagellin, chitin, lipopolysaccharides, peptidoglycans (PGNs), a ffactor elongation Tu yn enghreifftiau o MAMPs sydd wedi'u hastudio'n dda [3-5]. Gelwir yr ymateb amddiffyn hwn yn imiwnedd MAMPtrigged (MTI) [6]. Mae'r ail haen o amddiffyniad a elwir yn Imiwnedd Sbardun Effeithiol (ETI) yn digwydd mewn ymateb i broteinau effeithydd penodol sy'n deillio o bathogenau a gydnabyddir gan y planhigyn trwy weithrediad proteinau ymwrthedd, gan arwain at ymateb imiwn cryf, ond hynod benodol. Yn aml, gall ETI gael ei gydnabod trwy sefydlu marwolaeth celloedd lleol a elwir yn ymateb gorsensitif (HR) [7]. Mae systemau MTI ac ETI yn synhwyro'r pathogenau ac yn ymateb trwy actifadu amddiffynfeydd gwrthficrobaidd yn y gell heintiedig a chelloedd cyfagos [3,8]. Mae planhigion hefyd yn cario derbynyddion imiwnedd sy'n adnabod effeithwyr pathogen amrywiol iawn, mae'r rhain yn cynnwys dosbarth proteinau NBS-LRR [9].

Yn ogystal, mae ymwrthedd caffael systemig (SAR) yn ymateb gwrthiant "planhigyn cyfan" sy'n digwydd yn dilyn datguddiad lleol cynharach i bathogen. Mae SAR yn gysylltiedig ag ymsefydlu ystod eang o enynnau (genynnau sy'n gysylltiedig â pathogenesis), ac mae actifadu SAR yn gofyn am gronni asid salicylic mewndarddol (SA) [10].

Mae astudiaethau a wnaed yn bennaf gan ddefnyddio Arabidopsis wedi dangos y gall MTI achosi amrywiaeth o ymatebion gan gynnwys newidiadau mewn cynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), cynhyrchu rhywogaethau nitrogen adweithiol fel ocsid nitrig (NO), dyddodiad calos, lefelau calsiwm mewngellol, fflwcs ïon ar draws y plasma pilen, anwythiad neu ormes mynegiant nifer o enynnau sy'n gysylltiedig ag amddiffyn planhigion, newidiadau yn y cellfur planhigion, anwythiad cyfansoddion gwrthficrobaidd a synthesis proteinau sy'n gysylltiedig â pathogenesis (PR) [3,11].

Er y gellir ystyried nifer o'r ymatebion MTI hyn yn ymatebion planhigion cyffredinol, gall eu maint fod yn benodol i rywogaethau planhigion a hyd yn oed yn benodol i gyltifar [12-17]. Mae dulliau wedi'u datblygu i fesur ymateb MTI y planhigyn. Mae'r dulliau hyn yn cynnwys mesur cynhyrchiad ROS neu NO, ffosfforyleiddiad protein kinase wedi'i actifadu gan mitogen, mynegiant genynnau penodol a achosir gan MAMP, ataliad twf eginblanhigion, ffenolau lignin a wal gell, ac ymwrthedd a achosir gan MAMP i bathogenau bacteriol a ffwngaidd [18-20].

Sorghum bicolor (L.) Mae Moench yn gnwd grawnfwydydd byd-eang allweddol sydd wedi'i addasu i ystod o gynefinoedd a'i fridio at ddibenion amrywiol [21]. Disgwylir i dyfu sorghum gynyddu'n sylweddol ledled y byd fel un o'r prif gnydau ar gyfer cynhyrchu bwyd a biomas [22].

Wrth i'r arferion a'r ardaloedd daearyddol sy'n cael eu tyfu sorghum gynyddu, mae'n anochel y bydd pwysau'r clefyd yn cynyddu. Mae Sorghum yn cael ei wahaniaethu ymhlith grawnfwydydd eraill gan ei ystod anarferol o eang o afiechydon, sef un o'r cyfyngiadau pwysicaf ar ei gynhyrchiad. Yn fyd-eang, afiechydon ffwngaidd eang yw'r clefydau sorghum mwyaf dinistriol sy'n arwain at golledion enfawr mewn cynnyrch, o ran maint ac ansawdd y grawn [23]. Anthracnose yw un o'r clefydau ffwngaidd mwyaf difrifol sy'n effeithio ar gynnyrch grawn sorghum a chynhyrchu biomas. Gall colledion cynnyrch oherwydd y pathogen hwn fod rhwng 50 a 70 y cant mewn cyltifarau sy'n agored i niwed [24,25]. Mae planhigion wedi datblygu strategaethau amddiffyn amrywiol i frwydro yn erbyn goresgyniad pathogenau. Mewn sorghum, mae'r strategaethau hyn yn cynnwys actifadu proteinau PR [26], cronni hydrogen perocsid [27], a biosynthesis o ffytoalecsinau flavonoid [28]. Defnyddiwyd gwahanol ddulliau i astudio ymatebion ymwrthedd sorghum, nodi cyfansoddion amddiffyn, a nodi rhwystrau ffisegol yn erbyn anthracnose (gweler y cyfeiriad [29,30] ar gyfer adolygiad). Defnyddiwyd astudiaethau mynegiant genynnau yn eang i nodi genynnau ymwrthedd ymgeisiol mewn planhigion yn seiliedig ar y mynegiant gwahaniaethol rhwng cyltifarau gwrthsefyll a thueddol neu blanhigion heb eu brechu a phlanhigion â phathogenau (ee, cyfeiriadau [31-37]). Perfformiodd Wang et al., [37] ddadansoddiad trawsgrifomig i astudio ymateb cyltifar sorghum BTx623 i C. subline-ola. Dywedasant fod genynnau sy'n ymwneud â metaboledd ffenylpropanoid, a biosynthesis metabolion eilaidd wedi'u nodi'n wahanol mewn ymateb i haint gyda'r pathogen o'i gymharu â phlanhigion rheoli heb eu brechu.

Fodd bynnag, cynhaliwyd yr arbrofion hyn gydag eginblanhigion o'r cyltifar sy'n agored i niwed BTx623. Byddai astudiaethau trawsgrifomig ychwanegol i gymharu ymateb mynegiant genynnau i bathogen yn y cyltifarau sorgwm sy'n dueddol ac yn ymwrthol o werth. Felly, mae'n bwysig deall y bensaernïaeth enetig sy'n rheoli ymwrthedd i glefydau sorghum gwaelodol a'i gysylltiad ag ymwrthedd i glefydau meintiol.

Fel cam cychwynnol i'r cyfeiriad hwn, yn ddiweddar, fe wnaethom sgrinio set o germplasm sorghum amrywiol ar gyfer amrywiad yn eu hymateb i fflg22 a chodiad chitin, yn ogystal ag ymwrthedd i glefydau ffwngaidd [38]. Yn yr achos hwn, cafodd MTI ei feintioli trwy fesur cynhyrchiad ROS ar ôl i MAMP ddod i'r amlwg. Ymhlith canlyniadau'r astudiaeth gynharach hon, roedd nodi genoteipiau sorghum a oedd yn dangos naill ai ymateb cryf neu wan i ennyn MAMP.

Gall dilyniannu trwybwn uchel cenhedlaeth nesaf ac astudio trawsgrifiadau helpu i egluro ymatebion heintiad ffwngaidd mewn planhigion a chynyddu dealltwriaeth o ymatebion gwesteiwr. Defnyddiwyd dadansoddiadau trawsgrifiadol yn eang i astudio ymatebion planhigion i haint ffwngaidd mewn llawer o rywogaethau planhigion gan gynnwys cnydau grawn (ee, cyfeiriadau [31-37]).

Fodd bynnag, mae data cyhoeddedig ar ddadansoddiad trawsgrifiad cymharol o gnydau grawn wedi canolbwyntio'n bennaf ar yr ymateb i bathogenau amrywiol. Mewn sorghum, canolbwyntiodd nifer o gyhoeddiadau ar gymariaethau trawsgrifiad o blanhigion a gafodd eu trin â phathogenau amrywiol, gan gynnwys anthracnose [35,37]. Awgrymodd rhai cyhoeddiadau blaenorol nad oes unrhyw gydberthynas arwyddocaol rhwng yr ymateb i MAMPs a chlefyd ffwngaidd. Er enghraifft, mae Zhang et al. [17] adroddodd gydberthynas gref rhwng ymateb i ddau MAMP flg22 a chitin mewn poblogaeth mapio indrawn ond dim gohebiaeth i ymateb i glefyd ffwngaidd. Mae Kimball et al. [38] hefyd yn adrodd am gydberthynas isel rhwng sgorau ymateb ROS a achosir gan flg a sgorau atal dail targed mewn dwy boblogaeth RIL sorghum gan gynnwys poblogaeth BTx623/SC155-14E. Felly, o ystyried y prinder data, roeddem yn teimlo ei bod yn bwysig proffilio'r ymateb sorghum i driniaethau MAMP yn drawsgrifiadol.

Yn yr adroddiad cyfredol hwn, rydym yn ymestyn ein dadansoddiad cynharach drwy fesur yr ymateb trawsgrifio byd-eang i ennyn MAMP. Defnyddiasom ddadansoddiad dilyniannu RNA yn seiliedig ar Illumina i arolygu newidiadau trawsgrifiadol mewn ymateb i driniaeth flg22 neu chitin yn y genoteipiau sorghum BTx623 a SC155-14E, a nodweddwyd gennym yn flaenorol fel ymatebwyr MTI gwan a chryf, yn y drefn honno. BTx623 yw llinell gyfeirio genom Sorghum bicolor [22] ac mae SC155-14E yn llinell sy'n dangos ymwrthedd anthracnose uchel [39]. Roedd Patil et al. [39] adroddodd SC155-14E lefel uchel o wrthwynebiad sefydlog (bron yn rhydd o afiechyd) i glefyd anthracnose ym mhob amgylchedd a brofwyd tra bod BTx623 yn agored i'r clefyd ffwngaidd hwn. Nododd ein dadansoddiad RNA-seq 5252 a 8085 o Genynnau a Fynegwyd yn Wahanol (DEGs) mewn BTx623 wedi'u trin â flg22 a chitin, yn y drefn honno, a 3849 a 5786 DEG yn flg22 a SC155-14E wedi'u trin â chitin, yn y drefn honno, o gymharu â rheolyddion ffug heb eu trin. o'r ddau genoteip hyn.

At hynny, dangosodd cymhariaeth o DEGs a ddewiswyd gan ddefnyddio dwy biblinell biowybodeg wahanol ganlyniadau tebyg iawn. Dangosodd proffiliau mynegiant o'r genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol, dadansoddiad cyfoethogi ontoleg genynnau (GO), a dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG amrywiad clir yn seiliedig ar genoteip mewn mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â MTI. Datgelodd canlyniadau cyfoethogi tymor GO a llwybr KEGG fwy o DEGs sy'n gysylltiedig ag ymwrthedd i imiwnedd a phathogenau (genynnau PR, ymateb genynnau i chitin, ymateb genynnau i asid salicylic, ymateb genynnau i straen, ac ati) a gyflwynwyd yn SC{{4} a driniwyd gan MAMP. }E samplau o'u cymharu â BTx623 wedi'i drin â MAMP. Mae'r canlyniadau'n darparu llinell sylfaen ar gyfer nodi gwahanol gydrannau'r ymateb MTI sorghum.

2. Canlyniadau a Thrafodaeth

2.1. Amrywiad o'r Byrstio Ocsidiol mewn Gwahanol Dail Sorgwm

Datgelodd ein dadansoddiad blaenorol o ymateb MTI o genoteipiau sorghum amrywiol amrywiad sylweddol yn y byrst ocsideiddiol a sbardunwyd gan MAMP rhwng y genoteipiau BTx623 a SC155-14E [38]. At hynny, mae SC155-14E yn llinell sy'n dangos ymwrthedd anthracnose uchel, tra bod llinell BTx623 yn agored i anthracnose [39]. Am y rhesymau hyn y dewiswyd y ddau genoteip hyn i'w cymharu gan ddefnyddio RNA-seq.

Wrth gynnal y mesuriadau ROS cynharach, canfuom amrywiad sylweddol hyd yn oed o fewn yr un planhigyn, a arweiniodd at ymchwilio i ffynhonnell yr amrywiad hwn yn fwy gofalus. Yn benodol, gwnaethom brofi cynhyrchiant ROS gan ddefnyddio tair set o ddail, gan fynd o waelod i frig planhigion BTx623 a SC155-14E pymtheg diwrnod oed. Cafodd y dail eu marcio fel #1, #2, a #3, o'r gwaelod i'r brig fel y dangosir yn Ffigur 1A. Datgelodd canlyniadau assay ROS (Ffigur 1B) fod: (1) lefel cynhyrchu ROS yn is yn y dail hŷn (deilen #1), tra bod y lefelau uchaf o gynhyrchu ROS mewn ymateb i naill ai flg22 neu chitin o'r dail ieuengaf ( deilen #3). (2) Cynhyrchodd BTx623 2nd dail ieuengaf (deilen #2) wedi'i drin â MAMP a heb ei drin lefelau cymharol isel o gynhyrchu ROS.

Mewn cyferbyniad, cynhyrchodd 2il ddail ieuengaf SC155-14E a gafodd driniaeth MAMP lefelau sylweddol uwch (ar lefel 0.01) o gynhyrchu ROS na'r ffug heb ei drin, yn ogystal â'r BTx wedi'i drin neu ffug{ {5}}il ddail ieuengaf. (3) Canfuwyd y byrst ocsideiddiol a ysgogwyd gan gymwysiadau o flg22, neu chitin mewn disgiau dail o'r dail ieuengaf (dail #3) o'r ddau genoteip, er, fel y sylwyd yn flaenorol, roedd lefelau cynhyrchu ROS yn uwch yn SC a driniwyd gan MAMP. 155-14E mewn perthynas â BTx623. Datgelodd cwrs amser cynhyrchu ROS flg22-wedi'i sbarduno a chitin yn SC155-14E 2il ddeilen ieuengaf fod cynhyrchu ROS wedi'i sbarduno gan chitin wedi digwydd yn gynharach na fflg22- wedi'i sbarduno i gynhyrchu ROS (Ffigur 1C ). Adroddwyd canlyniadau tebyg gan Zhang et al. [17] lle'r ymddangosodd y cynhyrchiad ROS a sbardunwyd gan chitin yn gynharach na chynhyrchiad ROS wedi'i sbarduno gan flg yn flg22 ac eginblanhigion india-corn wedi'u trin â chitin. Adroddwyd [40] bod cynhyrchiad ROS mewn ymateb i flg22 yn dangos y cynhyrchiad uchaf o ROS o gwmpas 12 min, a dyma'r isaf ar 30 min yn Arabidopsis. Dangosodd ein canlyniadau assay ROS mewn sorghum y cynhyrchiad ROS uchaf o gwmpas 13 munud, a'r isaf ar 30 munud ar ôl triniaeth flg22, sy'n debyg iawn i'r canlyniadau mewn Arabidopsis. Gan mai ein nod oedd dod o hyd i'r amodau gorau posibl ar gyfer cymharu ymateb MTI y ddau genoteip, fe wnaethom ddewis yr 2il ddail ieuengaf o 15-blanhigion diwrnod oed ar gyfer echdynnu RNA a dadansoddiad trawsgrifomig dilynol. Mae'r amrywiad rhwng dail planhigion sorghum sengl yn ein hatgoffa y gall canlyniadau amrywio rhwng arbrofion yn dibynnu ar ffynhonnell, amseriad, a nodweddion eraill arbrawf penodol ac, felly, bod angen rheoli paramedrau arbrofol yn ofalus.

Mae'r byrstio ocsideiddiol, cynhyrchiad cyflym, dros dro, o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), yn un o'r agweddau cynharaf y gellir ei arsylwi ar ymateb amddiffyn planhigyn [41]. O ystyried bod y byrstio ROS yn ymateb ar unwaith, disgwylir ymateb trawsgrifio ychydig yn ddiweddarach o enynnau sy'n gysylltiedig â MTI. Fe wnaethon ni gynaeafu samplau 60 munud ar ôl triniaeth MAMPs ar gyfer dadansoddiad RNA-Seq.

2.2. Genynnau a Fynegwyd yn Wahanol (DEGs) o BTx623 a SC155-14E mewn Ymateb i Driniaethau MAMP

I werthuso lefel mynegiant genynnau codio protein Sorghum bicolor anodedig ar gyfer pob sampl, cyfrifwyd nifer y darlleniadau glân o RNA-seq a fapiodd i bob genyn ac yna eu normaleiddio i FPKM (darnau fesul model exon kb fesul miliwn o ddarnau wedi'u mapio). Ymchwiliwyd i newidiadau mynegiant pob genyn mewn disgiau dail wedi'u trin â MAMP o BTx623 a SC155-14E o gymharu â thriniaethau ffug (dŵr). Roedd cyfanswm y genynnau a fynegwyd yn debyg ym mhob triniaeth o'r ddau genoteip: 27,171, 27,283, 27,161, 27,182, 27,512, a 27,175 o enynnau wedi'u mynegi mewn ffug BTx623, flg22-wedi'u trin â BTx623, wedi'u trin â BTx623 ffug {22}}E, flg22-trin SC155-14E, a SC155-14E wedi'i drin â chitin, yn y drefn honno. Defnyddiwyd genom cyfeirnod BTx623 ar gyfer mapio darllen yn y ddwy linell gan nad yw'r cyfeiriad penodol ar gyfer SC155-14E ar gael. Datgelodd y niferoedd genynnau a fynegwyd o BTx623 a SC{{3{0}E gyda'r holl amodau uchod fod y ddwy linell yn rhannu niferoedd tebyg o enynnau wedi'u mynegi. Cyfraddau mapio darllen cyffredinol samplau o SC155- 14E ffug (3 atgynhyrchiad), SC155-14E wedi'i drin â flg22 (3 atgynhyrchiad), SC155-14E wedi'i drin â chitin (3 atgynhyrchiad) , BTx623 mock (3 replicates), BTx623 treated with flg22 (3 replicates), BTx623 treated with chitin (3 replicates) were: 93.6 percent , 93.9 percent , 93.9 percent , 93.8 percent , 93.9 percent , 93.6 percent , 93.5 percent , 93.5 percent , 93.1 y cant , 96.9 y cant , 97. { {68}} y cant , 97. { {74}} y cant , 97.2 y cant , 96.8 y cant , 97. { { 78}} y cant , 96.9 y cant , 97. y cant , 97.0 y cant , yn y drefn honno . Roedd y canlyniadau hyn yn awgrymu nad oedd effeithiau gwahanol triniaeth MAMPs ar drawsgrifiadau o BTx623 a SC155-14E oherwydd y gwahaniaethau dilyniant genomig rhwng y ddau genoteip.

Mae plot mynegiant genynnau PCA yn rhoi cipolwg ar y cysylltiad rhwng samplau. Er mwyn archwilio tebygrwydd ein samplau, gwnaethom ddadansoddiad PCA. Roedd plotio sampl ar y PC1 a PC2 (Ffigur 2) yn dangos bod pedwar cyflwr arbrofol (BTX623_flg22; SC155-14E{6}}flg22 flg22; BTX623_chitin a SC{ Roedd {10}E_chitin) wedi'u gwahanu'n eang. Mewn cyferbyniad, roedd y tri atgynhyrchiad biolegol o bob llinell sorghum a phob triniaeth MAMP, yn ogystal â'r driniaeth ffug, wedi'u clystyru'n agos gyda'i gilydd, yn y drefn honno, gan nodi atgynhyrchedd da rhwng atgynhyrchiadau biolegol (Ffigur 2).

Mae plotiau llosgfynydd yn Ffigur 3 yn dangos mynegiant genynnau yn y ddwy linell sorghum sy'n cael eu trin â flg22 neu chitin. Math o blot gwasgariad yw plot llosgfynydd sy'n dangos arwyddocâd ystadegol (gwerth-p) yn erbyn maint y newid (plyg newid). Mae'n galluogi adnabyddiaeth weledol gyflym o enynnau gyda newidiadau mawr sydd hefyd yn ystadegol arwyddocaol. Efallai mai'r rhain yw'r genynnau mwyaf arwyddocaol yn fiolegol. Yn Ffigur 3, mae genynnau â −log10 (gwerth-p) sy'n hafal i neu'n fwy na 3 yn cael eu hystyried yn DEG. Mae'r dotiau lliw coch yn cynrychioli DEGs ac mae'r dotiau lliw du yn cynrychioli'r rhai nad ydynt yn DEGs. Ym mhob plot, mae genynnau â log2 (plyg_newid) sy'n fwy na 0 yn enynnau wedi'u rheoleiddio i fyny, fel arall, yn enynnau wedi'u rheoleiddio i lawr. Mae'r genynnau sydd wedi'u rheoleiddio fwyaf tua'r dde, mae'r genynnau sydd wedi'u rheoleiddio fwyaf tua'r chwith, ac mae'r genynnau mwyaf arwyddocaol yn ystadegol tuag at y brig.

Dewiswyd genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol (DEGs) o bob triniaeth yn ôl eu harwyddocâd mynegiant (gwerth-p 0.001). Dylid nodi ein bod wedi defnyddio gwerth-p o 0.001 fel ein trothwy ond nid FDR (q-values) i ddewis DEGs yn yr adroddiad hwn. Roedd y FDR (gwerthoedd q) hefyd yn arwyddocaol ar y lefel hon (Tablau S2-S5). Ar werth p o 0.001, roedd y FDRs yn 0.0039, 0.0051, 0.0025, a 0.0035 ar gyfer BTx623 gyda thriniaeth flg22, SC{155-14E gyda thriniaeth flg22, BTx623 gyda thriniaeth chitin a SC{ 26}}E gyda thriniaeth chitin, yn y drefn honno. Mae gwerthoedd-p a gwerthoedd q genynnau BTx623 a SC155-14E ym mhob cyflwr wedi'u rhestru yn Nhablau S2–S5. Trwy ddadansoddi patrymau mynegiant y genynnau hyn mewn dail BTx623 a SC155-14E a gafodd eu trin â MAMP, gwelsom nifer fawr o enynnau (14-30 y cant o gyfanswm y genynnau a fynegwyd) a ddangosodd wahaniaethau mawr ar ôl flg22 neu chitin triniaeth yn y ddwy linell sorghum. Roedd nifer y DEGs cyfan o BTx623 (8085) a driniwyd â chitin yn agos iawn at yr hyn a adroddwyd mewn astudiaeth trawsgrifio flaenorol yn BTx623 a heintiwyd gan y pathogen anthracnose C. subline-ola (8078) [37]. Roedd nifer y DEGs yn uwch mewn dail flg22 (19 y cant) neu chitin (30 y cant) a gafodd eu trin â BTx623 o gymharu â SC155-14E (14 y cant a 21 y cant, yn y drefn honno).

Er bod y nifer uwch o DEGs yn y BTx623 a driniwyd gan MAMP o gymharu â SC155-14E yn groes i ymateb ROS y ddau genoteip hyn, efallai nad yw hyn yn syndod gan fod ymateb ROS ac ymateb mynegiant genynnau i driniaeth MAMP yn digwydd yn amseroedd gwahanol, yn annibynnol i raddau helaeth, ac yn cael eu cyfryngu gan wahanol fecanweithiau [42,43]. Datgelodd term GO a chyfoethogi llwybr KEGG fod mwy o DEGs yn ymwneud ag ymwrthedd i imiwnedd a phathogenau wedi’u cyflwyno mewn samplau SC155-14E wedi’u trin â MAMP. At hynny, roedd y ffaith bod niferoedd DEG yn uwch yn y samplau a driniwyd â chitin o gymharu â'r rhai a gafodd eu trin â flg22 yn cyfateb yn dda â phrofion ymateb ROS (Ffigur 1B) lle gwelsom ymateb ROS cryfach ar driniaeth chitin.

Er mwyn ymchwilio i ba raddau y rhennir genynnau a phrosesau biolegol rhwng y triniaethau flg22 a chitin yn BTx623 a SC155-14E, gwnaethom gymharu eu DEGs yn fanylach. Mae diagramau Venn yn Ffigur 4A yn dangos y gorgyffwrdd mewn DEGs yn y cyfanswm, mae'r genyn wedi'i reoleiddio i fyny ac i lawr yn gosod ar werth p o 0.001. Allan o'r cyfanswm o 10,535 DEG, ymatebodd set graidd o 2272 o enynnau i driniaeth flg22 a chitin yn y ddwy linell sorghum. Yn yr un modd, o'r cyfanswm o 5410 o enynnau wedi'u huwchreoleiddio, cafodd set graidd o 1778 o enynnau eu huwchreoleiddio yn y ddau genoteip, tra, allan o gyfanswm o 5125 o enynnau wedi'u rheoleiddio i lawr, roedd set graidd o 474 wedi'u his-reoleiddio yn y ddau. genoteipiau.

Dadansoddwyd y data RNA seq a gyflwynir yma gan ddefnyddio'r biblinell biowybodeg gydag offer Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1, a Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) gyda pharamedrau rhagosodedig (piblinell #1). I gadarnhau'r canlyniadau assay ymhellach, fe wnaethom ddefnyddio piblinell arall (piblinell #2) gyda HiSat2, HTSeq, ac edgeR i berfformio'r dadansoddiad. HiSat2 yw datblygiad nesaf TopHat2. Cymharwyd DEG pob cyflwr (hy, dau genoteip wedi'u trin â flg22 neu chitin, pob un, DEG wedi'i reoleiddio i fyny neu i lawr) a ddewiswyd gan ddefnyddio'r ddwy biblinell. Dangosodd y canlyniadau (Ffigur 5) fod y niferoedd DEG a ddewiswyd gan ddefnyddio'r ddwy bibell yn agos iawn.

Cyfanswm y DEGs a ddewiswyd gyda phiblinell #1 yn erbyn piblinell #2 oedd BTx623_flg22: 5241 vs. 5413; SC155-14E_flg22: 3849 yn erbyn 3476; BTx623_chitin: 8085 yn erbyn 8320; SC155-14E_chitin: 5786 vs. 5383. Y DEGs uwch-reoledig a ddewiswyd gyda phiblinell #1 yn erbyn piblinell #2 oedd BTx{623_flg22:3074 vs. 3076; SC155-14E_flg22: 2591 yn erbyn 2483; BTx623_chitin: 4156 yn erbyn 4583; SC155-14E_chitin: 3486 vs. 3346. Y DEGs is-reoleiddiedig a ddewiswyd gyda phiblinell #1 yn erbyn piblinell #2 oedd BTx{623_flg22: 2152 vs. 2237; SC155-14E_flg22: 1257 yn erbyn 993; BTx623_chitin: 3919 vs. 3757; SC155-14E_chitin: 2296 vs. 2037. Yn ogystal, datgelodd y canlyniadau yn Ffigur 5 hefyd fod canran uchel o DEGs a ddewiswyd gan ddefnyddio'r ddwy biblinell yn gorgyffwrdd ym mhob cyflwr. Canran y niferoedd DEG/rhifau DEG gorgyffwrdd a ddewiswyd gan ddefnyddio piblinell #1 oedd 79.6 y cant a 73.7 y cant . 80.8 y cant a 74.4 y cant o gyfanswm DEGs o BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitin a SC155-14E{{73}) }chitin, yn y drefn honno; 83 y cant , 80.6 y cant , 85.3 y cant ac 81.1 y cant o DEGs uwch-reoledig BTx{ {82}}flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitin a SC{{). 88}E{{_chitin), yn y drefn honno; 75.1 y cant , 59.5 y cant , 75.8 y cant a 67.4 y cant o DEGs is-reoledig BTx 623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitin a SC{{ 105}E{_chitin, yn y drefn honno. Felly, profodd y canlyniadau cymharol hyn fod y data RNA seq a gyflwynwyd yn gywir waeth pa un o'r ddau ddull a ddefnyddir ar gyfer y dadansoddiad.

Dangosir y map gwres o broffiliau mynegiant clystyrog y DEGs o BTx623 a SC155-14E a gafodd eu trin â flg22 neu chitin ar gyfer y tri atgynhyrchiad biolegol yn Ffigur 6. Cafodd gwerthoedd mynegiant genynnau eu normaleiddio fel sgorau z. Mae'r lliw yn troi o borffor i goch wrth i'r gwerth gynyddu, gan ddangos mynegiant y genyn o isel i uchel. Mae'r map gwres hwn yn dangos yn glir y rheoliad gwahaniaethol o enynnau yn BTx623 a SC155-14E mewn ymateb i flg22 neu driniaeth chitin. Yn ogystal, mae'r canlyniadau hefyd yn dangos bod y mapiau gwres o dri atgynhyrchiad biolegol ym mhob cyflwr yn agos iawn, sy'n dangos bod atgynhyrchu da rhwng atgynhyrchiadau biolegol.

Yn ogystal, dangosodd cymariaethau pâr (Ffigur 7A) rhwng DEGs wedi'u rheoleiddio i fyny ac i lawr o'r triniaethau flg22 a chitin fod gorgyffwrdd mawr rhwng BTx623 a SC155-14E. Ymhlith y 3074 o enynnau a ysgogwyd gan fflg yn BTx623, roedd 83.8 y cant hefyd wedi'u hysgogi yn BTx623 mewn ymateb i driniaeth chitin, tra o'r genynnau a ysgogwyd gan flg 2591 yn SC155-14E, {{ Ymatebodd 16}}.6 y cant hefyd i SC155-14E wedi'i drin â chitin. Efallai nad yw hyn yn syndod gan fod gwaith blaenorol yn Arabidopsis thaliana wedi dangos gorgyffwrdd sylweddol mewn genynnau yn ymateb i amrywiaeth o MAMPs gwahanol, sy'n diffinio'r llwybrau MTI cyffredinol [44-46].

Ar ben hynny, Zhang et al. [17] hefyd yn adrodd am gydberthynas sylweddol rhwng ymateb flg22 ac ymateb chitin mewn indrawn. Gwelwyd llai o orgyffwrdd rhwng disgiau deilen BTx623 a SC155-14 wedi'u trin â'r un MAMP (Ffigur 7A). Cafodd 64.3 y cant o'r genynnau a ysgogwyd gan flg yn BTx623 eu hysgogi mewn fflg22-trin SC155-14E a 68.3 y cant o enynnau a achosir gan chitin yn BTx623 mewn genynnau a gafodd eu trin â chitin SC155-14 E. Yn yr un modd, o'r 2152 o enynnau a is-reoleiddiwyd ar driniaeth flg22 o BTx623, roedd canran uchel (75.9 y cant) hefyd wedi'u is-reoleiddio gan chitin yn BTx623. Allan o 1257 o enynnau a is-reoleiddiwyd gan flg22 yn SC{155-14E, roedd 70.8 y cant hefyd wedi'u his-reoleiddio gan chitin yn SC155-14E. Fodd bynnag, dim ond 29 y cant o'r genynnau is-reoleiddiedig flg22 yn BTx623 oedd hefyd wedi'u is-reoleiddio yn flg22-trin SC155-14E ac roedd 45 y cant o'r genynnau a reoleiddir i lawr â chitin yn BTx623 wedi'u is-reoleiddio mewn SC155-14E wedi'i drin â chitin (Ffigur 7A). Felly, er bod cydgyfeiriant sylweddol yn y llwybrau MTI i flg22 a chitin yn y ddau genoteip a gymharwyd, mae'r data hefyd yn awgrymu cymhlethdod diddorol ynghylch sut mae'r ddau genoteip hyn yn ymateb i wahanol MAMPs.

2.3. Dadansoddiad Cyfoethogi Swyddogaethol Gene yn Cymharu Ymateb MTI BTx623 a SC155-14E

Er mwyn pennu categorïau swyddogaethol genynnau a reoleiddir mewn ymateb i naill ai flg22 neu chitin ac ymateb gwahaniaethol y ddwy linell sorghum a brofwyd, defnyddiwyd y platfform PlantRegMap [47,48] i berfformio Dadansoddiad Cyfoethogi Set Genynnau yn seiliedig ar y DEGs a ganfuwyd yn y biolegol. categori proses. Mae Ffigur 8A, a B yn dangos y termau GO uchaf ar gyfer genynnau a gyfoethogwyd â phroses fiolegol gyda DEGs wedi'u huwchreoleiddio a DEGs wedi'u his-reoleiddio o BTx623 a SC155-14E. Darperir y rhestr gyflawn o DEG yn Nhablau S6-S13. Mae llawer o'r genynnau hyn yn gysylltiedig â phrosesau gan gynnwys ymateb straen, ymatebion amddiffyn planhigion, ymateb i ysgogiad, ymateb i ysgogiad biotig, ymateb i'r bacteriwm, ymateb i organeb arall, cyfathrebu celloedd, proses metabolig ffosfforws, a ffosfforyleiddiad protein.

Mae'r canlyniadau yn Ffigur 8A, a B yn dangos gwahaniaethau clir yn y mynegiant o genynnau a gysylltir fel arfer ag imiwnedd cynhenid ​​rhwng y ddau genoteip sorghum. Yn y termau GO cyfoethog hynny, canfuwyd rhai DEGs unigryw ym mhob cyflwr gyda gorgyffwrdd. Er enghraifft, roedd ymateb amddiffyn term GO (GO 0006952): 91 ac 84 DEG wedi'u huwchreoleiddio wedi'u cyfoethogi mewn BTx623 neu SC155-14E wedi'u trin â flg22, yn y drefn honno. O fewn y DEGs hynny, roedd 24 DEG yn unigryw yn BTx623 a dim ond yn SC155-14E y canfuwyd 15 DEG, a chyflwynwyd y lleill yn y ddau genoteip sorghum. Yn yr un modd, cyfoethogwyd 102 a 93 o DEG wedi'u huwchreoleiddio mewn BTx623 neu SC155-14E a gafodd eu trin â chitin, yn y drefn honno. O fewn y DEGs hynny, roedd 20 DEG yn unigryw yn BTx623 ac roedd 14 DEG yn unigryw yn SC155-14E, a chyflwynwyd y lleill yn y ddau genoteip sorghum.

Yn y term GO o "ymateb i chitin (GO: 0010200)", gwelsom 18 DEG wedi'u huwchreoleiddio allan o gyfanswm o 779 o enynnau yn y categori hwn wedi'u cyfoethogi yn y samplau SC155-14E a driniwyd â chitin (Ffigur 8 ), ond ni chyfoethogwyd unrhyw enyn yn y samplau BTx623 a driniwyd â chitin. Yn ogystal, cyfoethogwyd 16 DEG wedi'u huwchreoleiddio mewn samplau fflg22-SC155-14E, a chyfoethogwyd 12 DEG wedi'u huwchreoleiddio mewn samplau fflg22-wedi'u trin BTx623 (Ffigur 8). Datgelodd cymhariaeth o'r rhestrau DEG o dermau GO "response to chitin" yn flg22 a BTX623 a SC155-14E (Tabl S9) wedi'u trin â chitin fod y DEGs wedi'u cyfoethogi mewn flg22, neu SC wedi'i drin â chitin{155- 14 Roedd E yr un fath ac eithrio bod chitin wedi achosi dau DEG yn fwy na flg22. Mewn cyferbyniad, roedd pob un o'r 12 DEG a gyfoethogwyd mewn fflg22-wedi'u trin BTX623 yn wahanol i DEGs a ysgogwyd gan MAMPs yn SC155-14E. Gall y DEGs hynny a achosir gan MAMPs gyfrannu at ymateb ymwrthedd anthracnose yn SC155-14E gan fod chitin yn foleciwl MAMP nodweddiadol o waliau celloedd ffwngaidd sy'n ennyn ymatebion imiwn planhigion. Mae Stringlis et al. [49] hefyd yn adrodd set o i fyny-reoleiddio DEGs eu cyfoethogi yn GO term o "ymateb i chitin" o chitin, flg22, a rhizobacteria planhigion buddiol Pseudomonas simiae WCS417 trin Arabidopsis planhigion. Roedd Matic et al. [33] adroddodd fod 21 DEG wedi'u cyfoethogi yn nhymor GO o "ymateb i chitin" o ddadansoddiad RNA-seq deilen reis o gyltifar gwrthsefyll ond nid o gyltifar sy'n agored i niwed ar ôl haint gyda'r pathogen ffwngaidd Fusarium fujikuroi.

Mae genynnau PR (sy'n gysylltiedig â Pathogenesis) yn rhan o'r ymateb imiwnedd planhigion [50] ac mae ganddynt weithgaredd gwrthffyngaidd yn erbyn llawer o ffyngau ffytopathogenig [51]. Mae proteinau PR-10 yn broteinau mewngellol bach, asidig yn bennaf, gyda phriodweddau gwrthffyngaidd sydd wedi bod yn gysylltiedig ag ymatebion amddiffyn mewn rhywogaethau planhigion gan gynnwys sorghum [52]. Cafodd aelodau o deulu genynnau PR-10 eu hysgogi gan ymosodiadau pathogen mewn amrywiaeth eang o rywogaethau planhigion [53]. Mewn sorghum, mae Lo et al. [26] adroddwyd bod mynegiant PR-10 wedi'i ysgogi fel rhan o amddiffyniad gwesteiwr gweithredol sorghum yn erbyn pathogenau ffwngaidd dail C. heterostrophus a C. sublineolum. Mae Katie et al. [54] adroddodd fod sawl cyltifar sorghum yn dangos anwythiad sylweddol o symiau cymharol normal o PR-10 ar ôl brechu â sborau ffwngaidd o C. lunata ac F. capsicum mewn profion maes. Yn y cyflwr tŷ gwydr, dangosodd glumes planhigion wedi'u brechu anwythiad PR-10 mRNA, ac roedd yr ymateb yn fwy mewn dau gyltifar ymwrthol a brofwyd o gymharu â dau gyltifar a oedd yn agored i niwed.

Datgelodd ein canlyniadau, ymhlith y DEGs a nodwyd, fod pedwar genyn PR-10 wedi'u canfod (SORBI_3001G401300, SORBI{{3}G401200, SORBI{5}G400800, SORBI_3001). G401000). Yn SC155-14E cafodd pob un o'r pedwar PR-10 DEG eu huwchreoleiddio gan flg22 neu driniaeth chitin, mewn cyferbyniad, yn BTx623, ni chanfuwyd SORBI_3001G401000 mewn DEGs, a SORBI{{15} }Dim ond yn BTx623 y cyflwynwyd G401300 (uwch-reoleiddio) gyda thriniaeth chitin ond nid gyda thriniaeth flg22. Roedd hyn yn dangos y gellid defnyddio mynegiant genynnau PR mewn ymateb i lefelau cynnyrch ROS uwch ar ôl triniaeth MAMPs a gwrthiant yn erbyn anthracnose yn SC155-14E.

Mae asid salicylic (SA) yn arwydd imiwnedd planhigion sy'n hanfodol ar gyfer ymateb amddiffyn lleol ac ymwrthedd caffael systemig. Mae'n chwarae rhan bwysig mewn ymwrthedd ac amddiffyn planhigion rhag ymosodiadau pathogen [55]. Mewn sorghum, mae Tugizimana et al. [56] adroddodd newidiadau meintiol yn y lefelau o asid jasmonig, conjugates asid salicylic, ac abscisic-asid yn C. subline-ola sorgwm heintiedig. C. subline-ola yw asiant achosol anthracnose. Roedd genoteipiau sorghum gyda lefelau uwch o asidau amino (tryptoffan a tyrosine), asid jasmonig a chyfuniadau salicylic, a zeatin yn fwy ymwrthol i anthracnose. Yn yr astudiaeth hon, cafodd y term GO 'ymateb i asid salicylic' (GO:0009751) gan gynnwys 19 DEG wedi'u huwchreoleiddio ei gyfoethogi'n benodol mewn SC155-14E a gafodd ei drin â chitin (Tabl S9). Felly, gallai'r llwybr signalau salicylic chwarae rhan bwysig mewn ymateb i lefelau cynhyrchu ROS uwch ar ôl triniaeth MAMP ac ymwrthedd yn erbyn anthracnose yn SC155-14E.

Ymhellach, cafodd 169 o DEGs wedi'u huwchreoleiddio eu cyfoethogi mewn ymateb tymor GO i straen yn unig yn SC155-14E wedi'i drin â chitin (Tabl S9). Y termau GO eraill a geir yn SC155-14E a gafodd eu trin â MAMPs yn unig, ond nid yn BTx623 gyda'r un driniaeth yw prosesau metabolaidd eilaidd (GO: 0019748), proses biosynthetig ffosffatidylcholine (GO: 0006656), a phroses biosynthetig lipid ( EWCH: 0008610).

Ymhellach, cafodd 169 o DEGs wedi'u huwchreoleiddio eu cyfoethogi mewn ymateb tymor GO i straen yn unig yn SC155-14E wedi'i drin â chitin (Tabl S9). Y termau GO eraill a geir yn SC155-14E a gafodd eu trin â MAMPs yn unig, ond nid yn BTx623 gyda'r un driniaeth yw prosesau metabolaidd eilaidd (GO: 0019748), proses biosynthetig ffosffatidylcholine (GO: 0006656), a phroses biosynthetig lipid ( EWCH: 0008610).

Fe wnaethom hefyd archwilio cyfansoddiad genynnau sy'n cael eu cyd-reoleiddio rhwng y ddau genoteip ar ôl triniaeth flg22 neu chitin yn ogystal â'r setiau craidd o DEGs ym mhob triniaeth a dau genoteip trwy ddadansoddiad cyfoethogi GO (Ffigurau 4B a 7B). Darperir y rhestr lawn o DEGs yn Nhablau S14 ac S15. Dangosodd Ffigur 4B delerau GO cyfoethog y setiau craidd o gyfanswm y DEGs wedi'u rheoleiddio i fyny ac i lawr yn BTx623 a SC155-14E gyda'r holl driniaethau. Roedd y termau GO yn ymwneud ag ymateb MAMPs ac amddiffyn planhigion (ee, rhwymo chitin, ymateb amddiffyn, gweithgaredd protein kinase, ffosfforyleiddiad protein, gweithgaredd protein serine / threonine kinase) wedi'u cyfoethogi'n sylweddol mewn DEGs a reoleiddir i fyny tra bod GO yn nhermau proses biosynthetig metabolyn eilaidd, rhwymo ïon haearn, gweithgaredd oxidoreductase yn unig yn cyfoethogi mewn DEGs i lawr-reoleiddio. Roedd y canlyniad hwn yn debyg i ganlyniadau yn Arabidopsis lle cyfoethogwyd termau GO yn ymwneud ag ymateb i elicitors (flg22 peptidau o P. tebyg WCS417 a P. aeruginosa PAO1, chitin, a chelloedd bacteriol o P. tebyg WCS417) yn fwyaf arwyddocaol yn yr uwch-reoleiddio set graidd o DEGs [49].

Roedd Ffigur 7B yn dangos y termau GO sydd wedi'u cyfoethogi'n sylweddol o setiau o DEGs a gyd-reoleiddiwyd (hy, i fyny-neu i lawr-reoleiddio yn y ddau genoteip) rhwng BTx623 a SC155-14E ar ôl triniaeth flg22 neu chitin. Datgelodd y canlyniadau fod termau GO yn ymwneud ag ymateb MAMPs ac amddiffyn planhigion (ee, ymateb amddiffyn, gweithgaredd kinase protein, ffosfforyleiddiad protein, gweithgaredd serine protein / threonine kinase) wedi'u cyfoethogi yn unig mewn DEGs flg22 neu chitin a reoleiddir yn y ddau genoteip tra bod termau GO o broses biosynthetig metabolit eilaidd, rhwymo heme, rhwymo ïon haearn, gweithgaredd oxidoreductase o un atom o ocsigen a phroses biosynthetig phosphatidylcholine eu cyfoethogi yn unig mewn setiau i lawr-reoleiddio o DEGs.

2.4. Dadansoddiad Cyfoethogi Llwybr KEGG o Ymateb MTI BTx623 a SC155-14E

Mae Ffigur 9 yn dangos dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG o'r DEGs uwch-reoledig a geir yn y samplau BTx623 a SC{155-14E a driniwyd gan MAMP gan ddefnyddio offeryn ar-lein DAVID [57]. Darperir y rhestr lawn o DEGs yn Nhablau S16–S20. Mae'r canlyniadau'n nodi'r prif lwybrau KEGG penodol hynny a gyfoethogwyd o ganlyniad i actifadu MTI yn y ddau genoteip sorghum. Yn y llwybr KEGG "rhyngweithiad planhigion-pathogen", gwelsom fod 24 DEG wedi'u huwchreoleiddio wedi'u cyfoethogi yn y samplau SC155-14E a driniwyd â chitin, tra nad oedd yr un o'r DEGs wedi'i gyfoethogi yn y samplau BTx623 a driniwyd â chitin. Mae ymateb chitin cryfach genoteip SC155-14E yn cyd-fynd â gwrthiant mwy y genoteip hwn i'r clefyd ffwngaidd anthracnose [39]. Ar ben hynny, datgelodd cyfoethogi llwybr KEGG 28 o enynnau sy'n ymwneud â biosynthesis ffenylpropanoid term yn SC155-14E wedi'i drin â flg22. Mae llwybr biosynthesis ffenylpropanoid yn dechrau gyda phenylalanine y gellir ei drawsnewid yn gyfansoddion aromatig fel flavonoidau, bensenoidau, coumarin, hydroxycinnamates, a lignin [58,59]. Roedd llawer o ffenylpropanoidau a flavonoidau yn rhan o'r ymateb gwrthsefyll afiechyd [28,60]. Mae cynhyrchu ffytoalexins yn ymateb amddiffyn mawr yn erbyn pathogen anthracnose C. subline-ola [28] mewn sorghum. Mae'r 3- anthocyanidins deoxy yn grŵp anarferol o flavonoidau a gydnabyddir fel ffytoalecsinau mewn sorghum. Mae ffytoalecsinau yn foleciwlau bach gyda gweithgaredd gwrthficrobaidd a gynhyrchir ar ôl haint pathogen [61]. Mae Wang et al. Canfu [37] hefyd fod biosynthesis ffenylpropanoid term KEGG wedi'i gyfoethogi'n sylweddol mewn DEGs o blanhigion heintiedig C. subline-ola yn eu hastudiaeth transcriptomeg o sorghum. Dylem nodi bod canlyniadau cyfoethogi llwybr KEGG (Ffigur 9) hefyd wedi dangos ymateb uwch o BTx623 ar ôl triniaeth MAMPs mewn rhai llwybrau a allai chwarae rhan mewn rhyngweithiadau pathogenaidd planhigion (ee, mewn llwybrau biosynthesis ffenylalanîn a tryptoffan, biosynthesis gwrthfiotig).

Ymhellach, datgelodd canlyniadau dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG o'r DEGau is-reoleiddiedig fod deg DEG wedi'u is-reoleiddio wedi'u hanodi fel 'proteinau ffotosynthesis-antena' a bod 84 DEG wedi'u hanodi fel rhai a gymerodd ran yn y 'biosynthesis o fetabolion eilaidd' wedi'u cyfoethogi yn flg22 a gafodd eu trin. BTx623. Fodd bynnag, gall astudiaethau mynegiant genynnau o'r fath nodi genynnau a fynegir yn wahanol mewn ymateb i driniaeth MAMPs neu haint pathogen, ond nid yw o reidrwydd yn dangos bod y genynnau hyn yn hanfodol ar gyfer ymwrthedd yn erbyn pathogen penodol. Felly, byddai angen ymchwil pellach i ddeall y perthnasoedd achosol rhwng ymwrthedd ffwngaidd a gweithrediad y llwybrau KEGG hynny yn y ddau genoteip, fel y datgelwyd gan ddadansoddiad RNA-Seq.

Gwnaethom hefyd gynnal dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG ar gyfer y setiau craidd o DEGs ym mhob cyflwr (Ffigur 4C) yn ogystal â'r DEGs a gyd-reoleiddir rhwng y ddau genoteip ar ôl triniaeth flg22 neu chitin (Ffigur 7C). Datgelodd y canlyniadau fod chwe llwybr arwyddocaol, gan gynnwys y llwybr rhyngweithio planhigion-pathogen, wedi'u cyfoethogi mewn setiau craidd o DEGs wedi'u rheoleiddio i fyny yn unig, ond nid mewn setiau craidd o DEGs wedi'u rheoleiddio i lawr. Yn yr un modd, cafodd saith a thri llwybr, gan gynnwys y llwybr rhyngweithio planhigion-pathogen, eu cyfoethogi'n sylweddol mewn DEGs chitin wedi'u huwchreoleiddio a DEGs wedi'u huwchreoleiddio flg22 yn BTx623 a SC155-14E, yn y drefn honno. Mewn cyferbyniad, dim ond biogenesis ribosom yn y llwybr ewcaryotau a gyfoethogwyd mewn DEG a reoleiddir i lawr chitin yn y ddau genoteip.

2.5. Dilysu'r Data RNA-Seq Gan Ddefnyddio RT-PCR Meintiol o Genes Dethol

I gadarnhau'r data proffilio mynegiant genynnau a gafwyd gan RNA-seq, gwnaethom ddadansoddiad qRT-PCR i werthuso mynegiant naw genyn ymgeisydd a ddewiswyd. Dewiswyd y naw genyn hynny yn seiliedig ar y mynegiant a arsylwyd gan RNA-seq mewn tri chategori: (a) a fynegir yn yr un modd yn BTx623 a SC155-14E gyda flg22 neu driniaeth chitin; (b) wedi'i fynegi yn unig mewn MAMPs wedi'u trin SC155-14E ond gyda mynegiant isel iawn mewn BTx623 wedi'i drin a (c) wedi'i fynegi 2–21-plyg yn uwch mewn MAMPs a driniwyd SC{155-14E o gymharu â BTx623 . Datgelodd canlyniadau dadansoddiad qRT-PCR (Tabl 1) gytundeb llawn â'r lefelau mynegiant a bennwyd gan ddadansoddiad RNA-seq ar gyfer pob un o'r naw genyn a werthuswyd. Mae'r canlyniadau hyn yn rhoi hyder inni fod y mesuriadau a wneir gan RNA-seq yn adlewyrchu ymateb trawsgrifiadol y llinellau sorghum i driniaeth MAMP

2.6. Casgliadau

Yn yr astudiaeth hon, canfuwyd yn gyntaf yr amodau gorau posibl ar gyfer cymharu ymateb MTI y ddau genoteip trwy brofi cynhyrchiad ROS gan ddefnyddio tair set o ddail a dewiswyd yr ail ddail ieuengaf o blanhigion pymtheg diwrnod oed ar gyfer echdynnu RNA a dadansoddiad trawsgrifomig dilynol. Datgelodd cwrs amser o gynhyrchu ROS flg22- wedi'i ysgogi a chitin mewn llinell sorghum SC155-14E (Ffigur 1C) fod cynhyrchu ROS wedi'i sbarduno gan chitin wedi digwydd yn gynharach na'r hyn a ysgogwyd gan driniaeth flg22. Cawsom broffiliau mynegiant y clefyd ffwngaidd genoteip Sorghum bicolor SC155-14E sy'n gwrthsefyll anthracnose gydag ymateb uchel i driniaeth MAMPs ar gynhyrchu ROS a'r genoteip tueddol BTx623 gydag ymateb isel ar gynnyrch ROS i driniaeth MAMP yn ystod y camau cynnar o'r ymateb imiwnedd cynhenid.

Mae'r canlyniadau'n dangos amrywiad clir o fynegiant genynnau yn y genoteipiau sorghum BTx623 a SC155-14E mewn ymateb i driniaeth MAMP. Er bod yr ymatebion i'r ddau MAMP yn dangos gorgyffwrdd sylweddol o fewn pob llinell (86.6–70.8 y cant ), roeddent yn wahanol. Gwelwyd peth gorgyffwrdd, er yn is, (68.3-29 y cant) hefyd rhwng ymatebion y ddwy linell i'r un MAMP. Nodwyd nifer sylweddol o DEGs, 2272 allan o 10,535 DEG, ym mhob un o'r pedwar cyflwr ac maent yn diffinio'n betrus yr ymateb craidd i MAMP. Dylai'r rhestr hon o enynnau fod yn ddefnyddiol i'r labordai hynny sydd am broffilio'r ymateb mynegiant genynnau i driniaeth MAMP. Nododd y dadansoddiad RNA-seq setiau mawr o enynnau wedi'u mynegi'n wahaniaethol yn BTx623 a SC155-14E wedi'u trin â flg22 neu chitin o gymharu â rheolyddion ffug heb eu trin ar gyfer y ddwy linell hynny. At hynny, dangosodd cymhariaeth o DEGs a ddewiswyd gan ddefnyddio dwy biblinell biowybodeg wahanol ganlyniadau tebyg iawn. Datgelodd dadansoddiad proffil mynegiant manwl o'r DEGs hyn, dadansoddiad cyfoethogi GO a dadansoddiad llwybr KEGG amrywiad clir yn ymateb mynegiant genynnau'r ddau genoteip. Darganfu term GO a chyfoethogi llwybr KEGG fwy o imiwnedd a DEGs cysylltiedig â gwrthiant pathogen (genynnau PR, ymateb genynnau i chitin, ymateb genynnau i asid salicylic, ymateb i straen, biosynthesis ffenylpropanoid, ac ati) mewn SC a gafodd ei drin â MAMP{{18} }E samplau o gymharu â BTx623 gyda'r un driniaeth. Mae'r wybodaeth hon yn darparu gwybodaeth sylfaenol bwysig ar sut mae system imiwnedd gynhenid ​​​​y planhigyn cnwd allweddol hwn yn ymateb i enciliad MAMPs. O ystyried y diffyg gwybodaeth cyffredinol am ymateb imiwn cynhenid ​​planhigion cnydau, o'i gymharu â'r model Arabidopsis, mae'r rhestrau genynnau a'r dulliau a ddisgrifir yn darparu adnodd ar gyfer archwilio ymhellach ymateb sorghum i bathogenau a dylent hwyluso ymdrechion i wella ymwrthedd i glefydau yn y pen draw. y cnwd bwyd a biomas pwysig hwn.

3. Defnyddiau a Dulliau

3.1. Deunyddiau Planhigion

Defnyddiwyd dwy linell sorgwm a ddarparwyd gan Dr. William Rooney (Prifysgol A&M Texas, Gorsaf y Coleg, UDA) a Dr. Stephen Kresovich (Prifysgol Clemson, Clemson, UDA) yn yr astudiaeth hon. Mae BTx623 yn llinell sorghum safonol gyda dilyniant genom cyfan sydd ar gael [22], ac mae SC155-14E yn llinell a ddatblygwyd ar gyfer ymwrthedd anthracnose [39].

3.2. Asesiadau ROS

Cafodd hadau sorgwm o BTx623 a SC155-14E eu sterileiddio ar yr wyneb (70 y cant ethanol am 1 munud ac yna cannydd 10 y cant am 10 munud, eu rinsio â ddH2O awtoclafio) a'u plannu mewn cymysgedd potio Heulwen awtoclaf, a'u hegino mewn siambrau twf ( 16 h/8 h golau/tywyll, 28/26 ◦C, lleithder 60-70 y cant). Defnyddiwyd planhigion pymtheg diwrnod oed ar gyfer arbrofion.

Defnyddiwyd dau MAMP, flg22 (catalog Genscript # RP19986) a chitin o blisgyn cranc (Sigma-Aldrich, catalog # C3641), yn yr astudiaeth hon. Mae Flg22 yn peptid sy'n deillio o derfynfa N-flagellin bacteria pathogenig planhigion ac mae'n hysbys ei fod yn ennyn ymateb imiwn cynhenid ​​​​penodol mewn planhigion [62]. Mae Chitin yn foleciwl MAMP nodweddiadol sy'n deillio o waliau celloedd ffwngaidd, sy'n ennyn ymatebion imiwnedd planhigion [3]. Perfformiwyd profion ROS yn ôl Kimball et al. [38]. Er mwyn asesu'r amrywiad yn ymateb MAMP o fewn genoteipiau unigol, yn ogystal â lleoliad y dail, aseswyd pob un o'r tair dail llawn ehangedig o blanhigion pob genoteip yn unigol. Cafodd y dail o waelod i frig y planhigion sorgwm pymtheg diwrnod oed o bob genoteip eu marcio fel dail #1, #2, a #3. Dim ond rhan ganol y ddeilen a ddefnyddiwyd gennym ar gyfer samplu i fesur cynhyrchiad ROS. Yn syth ar ôl triniaethau, cofnodwyd signal cemiluminescent pob sampl am 30 munud gan ddefnyddio camera Photek CCD (Photek Ltd., East Sussex UK). Roedd wyth ffynnon yn cynnwys triniaeth ffug (heb MAMP) ac wyth ffynnon yn cynnwys triniaeth (gyda MAMPs). Ym mhob achos, cymharwyd tri atgynhyrchiad biolegol gyda chyfanswm o 8 sampl ar gyfer pob triniaeth.

3.3. Triniaeth Sampl gyda MAMPs

Defnyddiwyd planhigion pymtheg diwrnod oed ar gyfer arbrofion. Perfformiwyd y triniaethau MAMPs fel y disgrifiwyd yn Valdes-Lopez et al. [12] gyda mân addasiadau. Yn gryno, cafodd yr ail ddeilen (o'r brig hy, yr ail ddeilen ieuengaf) o bum planhigyn ar gyfer pob llinell sorghum ei datgysylltu ac yna ei drwytho â gwactod gyda ddH2O awtoclafio am 2 funud. Cafodd tua hanner cant o ddisgiau dail 1 cm o ddiamedr eu torri o ddail pob genoteip wedi'u treiddio gan ddŵr a'u cyfuno. Trosglwyddwyd pedwar deg pump o ddisgiau dail o bob genoteip i dri dysgl Petri wahanol (15 disg dail ym mhob dysgl petri) ac yna'n arnofio dros nos ar dymheredd ystafell ar ddH2O awtoclafio gyda'r platiau wedi'u gorchuddio â ffoil alwminiwm. Y diwrnod wedyn, tynnwyd y dŵr o bob dysgl Petri a'i ddisodli gan 10 ml ddH2O (ffug), 10 mL 1 µM flg22, neu 10 ml o hydoddiant chitin 20 mg/mL. Ar ôl 60-munud o driniaeth, cynaeafwyd tafelli dail ffug a MAMP i mewn i wahanol diwbiau a'u rhewi ar unwaith mewn nitrogen hylifol. Cafodd y samplau tafell dail (ar gyfer imiwnedd 101quenced"ies ied-11272) BTx623 a SC155-14E gyda thriniaethau ffug, flg22, neu chitin, tri atgynhyrchiad biolegol) eu storio ar −80 ◦C ar gyfer echdynnu RNA. Y cyfan perfformiwyd y gweithdrefnau a ddisgrifir uchod o dan amodau tywyll i ddileu unrhyw effaith ffotosynthesis posibl.

3.4. Echdynnu RNA, Dilyniannu, ac Adeiladu Llyfrgell

Perfformiwyd yr echdyniad RNA gan ddefnyddio'r pecyn Direct-zol RNA Miniprep Plus o Zymoresearch (catalog #R2071) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr

Perfformiwyd dilyniannu trwybwn uchel yng Nghyfleuster Craidd DNA Prifysgol Missouri. Adeiladwyd deunaw o lyfrgelloedd yn dilyn protocol y gwneuthurwr gydag adweithyddion yn cael eu cyflenwi ym mhecyn paratoi sampl sownd TruSeq mRNA Illumina. Pennwyd crynodiad y sampl gan Qubit fluorometer (Invitrogen) gan ddefnyddio pecyn assay RNA Qubit HS, a gwiriwyd cywirdeb RNA gan ddefnyddio system electrofforesis awtomataidd Fragment Analyzer. Yn fyr, cafodd y poly-A sy'n cynnwys mRNA ei buro o gyfanswm RNA (1 µg), roedd RNA yn dameidiog, cynhyrchwyd cDNA dwbl o RNA darniog, ac roedd y mynegai sy'n cynnwys addaswyr wedi'i glymu i'r pennau. Cafodd y lluniadau cDNA chwyddedig eu puro trwy ychwanegu gleiniau glanhau Axyprep Mag PCR. Gwerthuswyd lluniad terfynol pob llyfrgell wedi'i buro gan ddefnyddio system electrofforesis awtomataidd Fragment Analyzer, wedi'i feintioli gyda fflworomedr Qubit gan ddefnyddio pecyn assay Qubit HS dsDNA, a'i wanhau yn unol â phrotocol dilyniannu safonol Illumina ar gyfer dilyniannu ar y NextSeq 500. Roedd yr hyd dilyniannu yn sengl darllen ar 75 sylfaen.

3.5. Mapio a Phrosesu RNA-Seq Reads

Roedd data'r dilyniant yn cynrychioli chwe chyflwr gwahanol: BTx623 gyda thriniaeth ffug, flg22, neu chitin, a SC155-14E gyda thriniaeth ffug, flg22, neu chitin. Cynrychiolwyd pob cyflwr gan dri atgynhyrchiad biolegol, gan arwain at gyfanswm o 18 sampl. Yn gyntaf, cafodd 30 pen y darlleniadau eu "tocio" ar gyfer addaswyr Illumina, ar gyfer niwcleotidau amwys (N), ac (oherwydd technoleg NextSeq) ar gyfer poly-G artiffisial (a gynrychiolir fel G{100}) gan ddefnyddio cutadapt fersiwn 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, a gyrchwyd ar 21 Awst 2019) ar gyfer darllenwyr y mae eu 30 pen yn gorgyffwrdd â'r addasydd am o leiaf 3 sylfaen gyda hunaniaeth 90 y cant. Os oedd darlleniad yn cynnwys llai na deg gwaelod ar ôl y trimio hwn, os cafodd ei daflu (ynghyd â'i ddarllen mewn parau, os yw'n berthnasol). Archwiliwyd y sgoriau ansawdd ar gyfer y data RNA seq ar ôl tocio gan ddefnyddio FASTQC (fersiwn 0.11.9) [63]. Ar gyfer yr holl swyddi mewn darlleniadau, y sgôr ansawdd canolrifol yw tua 34, sy'n dangos bod cywirdeb y galw sylfaenol yn uwch na 99.9 y cant . Roedd darlleniadau ar gyfer pob sampl wedi'u halinio i'r genom cyfeirio (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) gyda Tophat 2.1.1. Darparwyd y ffeiliau alinio canlyniadol i Cufflinks 2.2.1 i gydosod trawsgrifiadau ar gyfer pob sampl. Y fersiwn anodiad a ddefnyddiwyd yn yr ymchwil hwn oedd Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Cyfunwyd samplau o'r un cyflwr gan ddefnyddio Cuffmerge. Y pwrpas oedd darparu sail unffurf ar gyfer cyfrifo mynegiant genynnau a thrawsgrifiad ym mhob cyflwr.

3.6. Dadansoddiad Biowybodeg o Ddata RNA-Seq

Dadansoddwyd data RNA seq gan ddefnyddio offer biowybodeg Bowtie{{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1, a Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) gyda pharamedrau rhagosodedig. Defnyddiwyd yr un biblinell gyda'r offer hyn ag a ddisgrifir yn Trapnell et al. [64]. I gadarnhau'r canlyniadau assay ymhellach, defnyddiwyd piblinell arall gyda HiSat2 (fersiwn 2.1.0), HTSeq (fersiwn 0.12.4), ac edgeR (fersiwn 3.26.8) i berfformio'r dadansoddiad. HiSat2 yw datblygiad nesaf TopHat2. Yn gyntaf, gwnaethom ddefnyddio HiSat2 i wneud yr aliniad gan ddefnyddio'r genom cyfeirio Sorghum. Yna fe ddefnyddion ni HTSeq i gyfrif faint o ddarlleniadau oedd wedi'u mapio i bob genyn. Ar gyfer hyn, roedd angen y ffeiliau bam a gynhyrchwyd o'r cam blaenorol a'r anodiad genom (ffeil gif). Sylwch fod y genom cyfeirio a'r ffeiliau anodi yr un peth â'r rhai a ddefnyddiwyd gennym yn yr arfaeth wreiddiol. Yn olaf, gwnaethom ddefnyddio'r pecyn R edgeR i bennu'r genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol ym mhob cyflwr

3.7. Adnabod Genynnau a Fynegwyd yn Wahanol
Cafodd y cynulliad cyfun ei fwydo i Cuffdiff, sy'n cyfrifo lefelau mynegiant ac yn profi arwyddocâd ystadegol y newidiadau a arsylwyd rhwng dau gyflwr. Cymharwyd yr amodau rhwng ffug vs flg22, a ffug vs. chitin ar gyfer BTx623, a SC155-14E, yn y drefn honno. Echdynnwyd y genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol gan ddefnyddio 0.001 trothwyon gwerth-p. Gwnaed y plotiau llosgfynydd gan ddefnyddio'r pecyn R (ggplot2 V3.3.0) i ddangos arwyddocâd newid mynegiant genynnau mewn amodau BTx623 a gafodd eu trin â flg22 neu chitin a SC155- 14E wedi'u trin â flg22 neu chitin, yn y drefn honno. Ystyriwyd bod y dotiau genyn â −log10 (gwerth-p) sy'n hafal i dri neu fwy na thri yn DEG. Ym mhob plot, roedd y dotiau genyn â log2 (plyg_newid) yn fwy na sero yn enynnau wedi'u huwchreoleiddio, fel arall, roedden nhw'n genynnau is-reoleiddio.

3.8. PCA Plot

Er mwyn archwilio'r berthynas rhwng gwerthoedd mynegiant genynnau tri atgynhyrchiad biolegol o bob llinell sorghum a phob triniaeth MAMP, cynhyrchwyd lleiniau dadansoddi prif gydrannau (PCA) gan ddefnyddio pecynnau R (ggfortify V{{{{{{{}}}}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Mae pob dot yn cynrychioli cyflwr ar ôl mapio o'r gofod nodwedd gwreiddiol (mynegiant genyn) i'r ddwy brif gydran gyntaf. Mae dotiau sy'n perthyn i'r un cyflwr yn tueddu i glystyru gyda'i gilydd

3.9. Map Gwres o DEGs

1 Is-adran Gwyddor Planhigion a Thechnoleg a Biocemeg, Canolfan CS Bond Gwyddorau Bywyd, Prifysgol Missouri, Columbia, MO 65211, UDA; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Adran Peirianneg Drydanol a Chyfrifiadureg, Canolfan CS Bond Gwyddorau Bywyd, Prifysgol Missouri, Columbia, MO 65211, UDA; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Uned Ymchwil Gwyddor Planhigion, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, UDA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu