Dilyniannu Genom Cyfan Ar Gyfer Diagnosis o Anhwylderau Ehangu Ailadrodd Niwrolegol yn y DU: Astudiaeth Cywirdeb Diagnostig Ôl-weithredol A Darpar Ddilysiad Clinigol

Am fwy o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

Crynodeb

Cefndir

Mae anhwylderau ehangu ailadroddus yn effeithio ar tua 1 o bob 3000 o unigolion ac maent yn glefydau clinigol heterogenaidd a achosir gan ehangu ailddarllediadau DNA tandem byr. Mae profion genetig yn aml yn benodol i locws, gan arwain at danddiagnosis pobl sydd â chyflwyniadau clinigol annodweddiadol, yn enwedig mewn cleifion pediatrig heb hanes teuluol cadarnhaol blaenorol. Mae dilyniannu genom cyfan yn cael ei ddefnyddio fwyfwy fel prawf llinell gyntaf ar gyfer anhwylderau genetig prin eraill, a'n nod oedd asesu ei berfformiad o ran diagnosis cleifion âniwrolegolanhwylderau ehangu ailadroddus.

Dulliau

Fe wnaethom asesu cywirdeb diagnostig dilyniannu genom cyfan yn ôl-weithredol i ganfod y loci ehangu ailadroddus mwyaf cyffredin sy'n gysylltiedig âniwrolegolcanlyniadau (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT, a TBP) gan ddefnyddio samplau a gafwyd o fewn y Gwasanaeth Iechyd Gwladol yn Lloegr gan gleifion yr amheuwyd bod ganddyntniwrolegolanhwylderau; defnyddiwyd canlyniadau profion PCR blaenorol fel y safon gyfeirio. Archwiliwyd cywirdeb clinigol dilyniannu genom cyfan i ganfod ehangiadau ailadroddus yn rhagolygol mewn cleifion a brofwyd yn enetig yn flaenorol a chleifion heb ddiagnosis a recriwtiwyd yn 2013-17 i Brosiect Genomau 100 000 yn y DU, yr amheuwyd bod ganddynt enetig.niwrolegolanhwylder (ffurfiau teuluol neu gynnar o atacsia, niwroopathi, paraplegia sbastig, dementia, clefyd niwronau motor,parcinsonaiddsymudiadanhwylderau, anabledd deallusol, neu anhwylderau niwrogyhyrol). Pe bai galwad ehangu ailadroddus yn cael ei gwneud gan ddefnyddio dilyniannu genom cyfan, defnyddiwyd PCR i gadarnhau'r canlyniad.

Canfyddiadau

Gwerthuswyd cywirdeb diagnostig dilyniannu genom cyfan i ganfod ail-ehangiadau yn erbyn 793 o brofion PCR a gyflawnwyd yn flaenorol o fewn y GIG gan 404 claf. Dilyniannu genom cyfan wedi'i ddosbarthu'n gywir 215 o 221 o alelau ehangedig a 1316 o 1321 o alelau heb eu hehangu, gan ddangos sensitifrwydd 97·3 y cant (95 y cant CI 94·2–99·0) a phenodoldeb 99·6 y cant (99·1–99). ·9) ar draws y 13 loci sy'n gysylltiedig â chlefyd o'u cymharu â chanlyniadau profion PCR. Mewn samplau gan 11 631 o gleifion yn y Prosiect Genomau 100 000, nododd dilyniannu genom cyfan 81 o ehangiadau ailadroddus, a brofwyd hefyd gan PCR: cadarnhawyd bod 68 yn ehangu dro ar ôl tro yn yr ystod pathogenig lawn, roedd 11 yn ddi-ail. - ehangiadau canolradd pathogenig neu amnewidiadau, ac roedd dau yn ailddarllediadau heb eu hehangu (cyfradd darganfod ffug o 16 y cant).

Dehongliad

Yn ein hastudiaeth, dangosodd dilyniannu genom cyfan ar gyfer canfod ehangiadau ailadroddus sensitifrwydd a phenodoldeb uchel, ac arweiniodd at nodiniwrolegolanhwylderau ehangu ailadroddus mewn cleifion heb eu diagnosio o'r blaen. Mae'r canfyddiadau hyn yn cefnogi gweithredu dilyniannu genom cyfan mewn labordai clinigol ar gyfer gwneud diagnosis o gleifion sydd ag aniwrolegolcyflwyniad sy'n gyson ag anhwylder ehangu ailadroddus.

Ariannu

Cyngor Ymchwil Feddygol, yr Adran Iechyd a Gofal Cymdeithasol, Gwasanaeth Iechyd Gwladol Lloegr, y Sefydliad Cenedlaethol dros Ymchwil Iechyd, ac Illumina.

Rhagymadrodd

Er gwaethaf datblygiadau diweddar yn ein dealltwriaeth o sail genetig prinniwrolegolanhwylderau, hyd at 70 y cant o gleifion ag anhwylderau o'r fath yn parhau i fod yn enetig heb ddiagnosis.1-3 Yn rhannol, mae hyn oherwydd yr heriau technegol o brofi am amrywiadau genetig cymhleth ac ailadroddus, gan gynnwys ehangu ailadroddus; amcangyfrifir bod ehangiadau o'r fath yn effeithio ar tua 1 o bob 3000 o bobl (atodiad t 1) a dyma brif achos mwy na 40 o anhwylderau niwrogenetig,4 gan gynnwys clefyd Huntington a syndrom X bregus. Mae anhwylderau ehangu ailadroddus yn heterogenaidd yn glinigol ac yn enetig, a gall ehangu ailadroddus fod yn gysylltiedig â chlefydau amrywiol. Er enghraifft, gall ehangiadau yn C9orf72 ymddangos naill ai fel sglerosis ochrol amyotroffig neu ddementia frontotemporal.5 Gall ehangu dro ar ôl tro mewn gwahanol loci hefyd esgor ar nodweddion ffenoteipaidd tebyg, gan eu gwneud yn anodd eu gwahaniaethu'n glinigol: mae ehangiadau ailadroddus mewn o leiaf ddeg genyn atacsia sbigocerebellar yn bresennol yn aml fel oedolion. -onset ataxia,6 a gall y rhai yn C9orf72 ac AR achosi clefyd niwronau motor.7,8

Mae anhwylderau ehangu ailadroddus yn cael eu hachosi gan gynnydd yn nifer y dilyniannau DNA tandem byr ailadroddus, ac mae'r trothwyon pathogenedd ar gyfer pob anhwylder yn locws-benodol. Mae maint yr ehangu yn amrywio o lai na 30 o ailadroddiadau (ee, yn CACNA1A) i filoedd o unedau ailadrodd (ee, yn FMR1, DMPK, C9orf72, a FXN, a all ymestyn hyd at 5 kb o ran maint). Mae ehangiadau ailadroddus yn arddangos ansefydlogrwydd moleciwlaidd, a all arwain at newidiadau ym maint ailadrodd (yn gyffredinol yn cynyddu mewn hyd) ar draws cenedlaethau a meinweoedd.4 Yn yr amodau hyn, mae cynnydd yn nifer yr ailadroddiadau yn aml yn arwain at ddechrau cynharach a chlefyd mwy difrifol yn olynol. cenedlaethau.4 Gall anhwylderau ehangu ailadroddus pediatrig ymddangos fel syndromau aml-system heb lofnodion ffenoteipaidd penodol,9 ac felly mae plant â'r anhwylderau hyn yn fwy tebygol o gael eu tanddiagnosio pan nad oes hanes teuluol o anhwylder ehangu ailadroddus na phan fydd yn bresennol.10– 12

Mae asesiad labordy o ehangu ailadroddus fel arfer wedi'i gyfyngu i asesiad moleciwlaidd wedi'i dargedu o locws unigol wedi'i arwain gan y diagnosis clinigol a amheuir gan ddefnyddio dulliau blotio PCR neu Ddeheuol,13 a all fod yn gostus ac yn cymryd llawer o amser. Yn ogystal, oherwydd nodweddion ffenotypig amrywiol a gorgyffwrdd yr anhwylderau hyn, gall loci ehangu ailadroddus sy'n gysylltiedig â chlefydau aros heb eu profi.14

Mae dilyniannu genom cyfan yn dod i'r amlwg fel arf diagnostig rheng flaen mewn cleifion â chlefydau prin15 ond, tan yn ddiweddar, credwyd bod ganddo allu cyfyngedig i asesu loci sy'n cynnwys ehangu dro ar ôl tro.16 Fodd bynnag, mae datblygiadau mewn biowybodeg wedi'i gwneud yn bosibl canfod clefydau -sy'n achosi ehangu dro ar ôl tro o ddata dilyniannu cenhedlaeth nesaf.17–22 Yma, rydym yn adrodd ar asesiad diagnostig o ddull dilyniannu genom cyfan i ganfod ail-ehangiadau gan ddefnyddio data PCR ôl-weithredol, a'i ddilysiad clinigol mewn cleifion yn y Prosiect Genomau 100000 sy'n ag amheuaeth o anhwylder niwrolegol, heb ei ddiagnosio â phrofion genetig blaenorol.

Dulliau

Astudio dylunio a chyfranogwyr

Roedd y gwerthusiad hwn o ddilyniannu genom cyfan ar gyfer canfod ail-ehangiadau yn cynnwys asesiadau cywirdeb diagnostig a chywirdeb clinigol. Gwerthuswyd cywirdeb diagnostig gan ddefnyddio data gan gleifion a oedd wedi cael eu profi yn flaenorol gan PCR ar gyfer ehangu ailadroddus y gwyddys ei fod yn achosi clefyd niwrolegol.4 Nodwyd cleifion o ddwy ffynhonnell: y Prosiect Genomau 100 000 a'r Labordy Genomig yn Ysbytai Prifysgol Caergrawnt ( Caergrawnt, DU). Ar gyfer y ddwy set o gleifion, roedd profion PCR wedi’u cynnal ar samplau cleifion gan labordai yn y Gwasanaeth Iechyd Gwladol (GIG) fel rhan o asesiad clinigol arferol: ar gyfer samplau yn y Prosiect Genomau 100000, cynhaliwyd profion PCR cyn recriwtio i’r prosiect gan y Labordy Niwrogeneteg Ysbyty Coleg Prifysgol Llundain (Llundain, DU); cafwyd samplau gydag ehangiadau ailadroddol a gadarnhawyd gan PCR gan gleifion a brofwyd gan y Labordy Genomig yng Nghaergrawnt. Nodwyd cleifion â chanlyniadau profion PCR-positif a PCR-negyddol ar gyfer anhwylderau ehangu ailadroddus i'w cynnwys yn ein hastudiaeth trwy systemau cofnodion labordy; roedd yr holl gleifion wedi rhoi caniatâd gwybodus ysgrifenedig i ddefnyddio eu sampl at ddibenion sicrwydd ansawdd ac ymchwil a hyfforddiant, fel rhan o optimeiddio a dilysu gwasanaethau clinigol.

Gwnaed dilyniant genom cyfan o bob sampl mewn un o ddau labordy: Genomics England (Hinxton, UK) ar gyfer samplau Prosiect Genomau 100000 (n{2}}) a Labordy Gwasanaethau Clinigol Illumina (ICSL; San Diego, CA, UDA) ar gyfer samplau a gafwyd gan y Labordy Genomig yng Nghaergrawnt (n=150). Ar y cyfan, defnyddiwyd y set ddata hon ar gyfer rhan cywirdeb diagnostig yr astudiaeth, ac roedd yn cynnwys PCR a data dilyniannu genom cyfan gan 404 o gleifion, yn cwmpasu 13 loci sy'n cynrychioli'r anhwylderau ehangu ailadrodd niwrolegol mwyaf cyffredin: 11 loci yn gysylltiedig ag ataxia a hwyr- anhwylderau niwroddirywiol cychwynol (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72, a FXN), un locws sy'n gysylltiedig ag anabledd deallusol (FMR1), ac un locws sy'n gysylltiedig â nychdod myotonic (DMPK). Ar gyfer pob locws, roedd data prawf PCR ar gael ar gyfer o leiaf un alel estynedig (atodiad t 24).

Aseswyd cywirdeb clinigol trwy archwilio cysondeb ehangu dro ar ôl tro, fel y’i canfuwyd gyda dilyniant genom cyfan, gyda diagnosis clinigol a amheuir ar ôl cadarnhad PCR mewn cleifion ag amheuaeth o anhwylderau niwrolegol genetig (ffurfiau teuluol neu gychwyn cynnar o atacsia, niwroopathi, paraplegia sbastig, dementia , clefyd niwronau motor,parcinsonaiddanhwylderau symud, anabledd deallusol, neu anhwylderau niwrogyhyrol) a recriwtiwyd i Brosiect Genomau 100000 yn 2013–17. Mae’r Prosiect Genomau 100000 yn rhaglen yn y DU i asesu gwerth dilyniannu genom cyfan mewn cleifion ag anghenion diagnostig heb eu diwallu mewn clefydau prin a chanser. Yn dilyn cymeradwyaeth foesegol i Brosiect Genomau 100000 gan Bwyllgor Moeseg Ymchwil De Caergrawnt Dwyrain Lloegr (cyfeirnod 14/EE/1112), gan gynnwys ar gyfer dadansoddi data a dychwelyd canfyddiadau diagnostig i’r cleifion, cafodd y cleifion hyn eu recriwtio gan weithwyr gofal iechyd proffesiynol ac ymchwilwyr o 13 o Ganolfannau Meddygaeth Genomig yn Lloegr ac fe'u cofrestrwyd yn y prosiect os oeddent hwy neu eu gwarcheidwad yn rhoi caniatâd ysgrifenedig i'w samplau a'u data gael eu defnyddio mewn ymchwil, gan gynnwys yr astudiaeth hon. Roedd probandiau ac, os yw'n ymarferol, aelodau eraill o'r teulu, wedi'u cofrestru yn unol â meini prawf cymhwyster a osodwyd ar gyfer cyflyrau clefydau prin penodol (atodiad tt 5-11). Recriwtiwyd cleifion i’r Prosiect Genomau 100000 ar ôl profion genetig safonol yn y GIG, fel y nodir yn y meini prawf cymhwysedd. Cofnodwyd data clinigol sylfaenol safonol gan ddefnyddio Ontoleg Ffenoteipio Dynol (HPO)23 yn erbyn modelau data penodol i glefydau.24 Casglwyd hefyd statws afiechyd aelodau'r teulu, o'i gymharu ag arwydd clinigol y proband ar gyfer profi.

Er mwyn nodi ehangiadau ailadroddol achosol mewn cleifion â chlefyd heb ei ddiagnosio'n enetig, gwnaethom brofi cleifion yr amheuir bod ganddynt anhwylderau genetig sy'n gyson â chlefyd ehangu ailadroddus. Dewiswyd cleifion ar sail cytgord eu clefyd a thelerau HPO ag anhwylderau sy'n gysylltiedig ag ehangu dro ar ôl tro. Holwyd data dilyniannu genom cyfan cleifion i chwilio am ehangiadau mewn setiau penodol o ailddarllediadau gan ddefnyddio pedwar panel ehangu ailadroddus gwahanol yn ôl eu nodweddion clinigol (atodiad t 5). Yr ehangiadau ailadroddus a ddewiswyd i'w cynnwys ar y paneli hyn yw'r loci ehangu ailadroddus mwyaf cyffredin sy'n achosi clefydau niwrolegol. Profwyd cleifion â nodweddion clinigol a allai fod yn gydnaws â mwy nag un anhwylder ehangu ailadroddus ar baneli lluosog. Pe bai galwad ehangu ailadroddus yn cael ei gwneud gan ddefnyddio dilyniannu genom cyfan, cynhaliwyd profion cadarnhau gan PCR.

Ar gyfer pob claf y cadarnhawyd ei fod yn ehangu dro ar ôl tro, hysbyswyd y clinigwr lleol o'r canlyniad diagnostig posibl, ac aseswyd cyfraniad yr ehangu dro ar ôl tro i nodweddion clinigol y claf. Ar gyfer ehangu ailadroddus a oedd yn esbonio nodweddion clinigol y claf yn llawn neu'n rhannol, cyhoeddwyd adroddiad diagnostig yn unol â gweithdrefnau safonol lleol.

Gweithdrefnau

Ar gyfer samplau hanesyddol y GIG a ddefnyddiwyd yn rhan cywirdeb diagnostig ein hastudiaeth, roedd ehangu ailadroddus wedi’i brofi’n flaenorol gan ddefnyddio ymhelaethu PCR a dadansoddi darnau. Perfformiwyd blotio deheuol ar gyfer ehangiadau C9orf72 mawr. Yn y rhan cywirdeb clinigol o'n hastudiaeth, profodd PCR ehangiadau ailadroddus a ganfuwyd trwy ddilyniannu genom cyfan mewn cleifion o'r Prosiect Genomau 100 000 gan PCR mewn samplau a storiwyd yn labordai genetig y GIG. Rhoddir manylion ychwanegol, gan gynnwys dilyniannau preimio, yn yr atodiad (tt 2–3, 25–26).

Paratowyd DNA ar gyfer dilyniannu genom cyfan gan ddefnyddio paratoad llyfrgell TruSeq DNA Heb PCR, a pherfformiwyd dilyniannu pen pâr 150 bp neu 125 bp ar lwyfannau HiSeq 2000 neu HiSeq X yn y cyfleuster genomau trwybwn uchel ar gyfer Genomics England, ac yn yr ICSL . Cafodd genomau eu dilyniannu i ddyfnder cyfartalog o 35 × (31 × i 37 ×; atodiad t 27). Perfformiwyd genoteipio ailadroddus tandem byr gan ddefnyddio pecyn meddalwedd ExpansionHunter fersiwn 3.1.2.25,26 Yn gryno, mae ExpansionHunter yn adlinio darlleniadau dilyniannu ar draws set ragddiffiniedig o ailddarllediadau tandem byr i amcangyfrif maint y ddau alel gan unigolyn (atodiad t 3).

Mae allbwn ExpansionHunter yn cynnwys amcangyfrif o nifer yr elfennau ailadrodd, maint cyffredinol, a therfyn hyder ar gyfer pob locws a aseswyd. Mae canllawiau gan y Gymdeithas Patholeg Feddygol a Choleg Patholegwyr America yn argymell arolygiad gweledol o alwadau amrywiadwy yn ystod yr asesiad arferol o amrywiadau dilyniannu trwybwn uchel.27

Fodd bynnag, ni all offer delweddu cyffredin fel Integrative Genomeg Viewer ddelweddu amrywiadau ailadrodd tandem byr yn ddigonol.28 I archwilio data dilyniannu genom cyfan sy'n sail i bob galwad genoteip, defnyddiwyd offeryn delweddu graff, sy'n galluogi delweddu haploteipiau a'r pentwr darllen cyfatebol yn uniongyrchol. o genoteipiau ExpansionHunter (atodiad tt 3, 15). Cynhaliwyd archwiliad gweledol o'r graff pileup ar yr holl alwadau ailadrodd tandem byr dilyniannu genom cyfan i gadarnhau bod rhagfynegiad ExpansionHunter ar gyfer alelau wedi'i gynnwys yn gyfan gwbl ym mhob darlleniad (hy, roedd y dilyniant ailadrodd yn llai na hyd darllen y dilyniant); i gadarnhau presenoldeb ehangiad monoallelig neu biallelig; i ganfod galwadau ffug-bositif; ac i ganfod alelau ffug-negyddol mewn ehangiadau ailadroddol bialelig, megis FXN (atodiad tt 4, 16).

Mae ExpansionHunter yn amcangyfrif maint ailadrodd o ddata dilyniannu genom cyfan trwy ddadansoddi darlleniadau dilyniannu sy'n cynnwys ailadrodd tandem byr yn llawn neu'n rhannol. Os yw alel ailadrodd tandem byr yn fyrrach na'r hyd a ddarllenwyd, mae ExpansionHunter yn rhagweld yr union faint; os yw alel ailadrodd tandem byr yn hirach na'r hyd a ddarllenwyd, mae ExpansionHunter yn amcangyfrif maint ailadrodd o fewn CI, yn dibynnu ar gyfansoddiad dilyniant locws, dyfnder y dilyniant, ac ansawdd y dilyniant.

Dadansoddiad ystadegol

Fe wnaethom ddosbarthu ailddarllediadau fel rhai wedi'u hehangu gan ddilyniannu genom cyfan os oedd y maint a ragfynegwyd gan ExpansionHunter yn uwch na'r toriad rhagbrofi, neu heb ei ehangu os oedd y maint a ragfynegwyd yn is na'r toriad (atodiad t 28).

Cyfrifwyd sensitifrwydd a CI ar gyfer canfod ehangiad ailadroddol dilyniannu genom cyfan fel cyfran yr alelau ag ailddarllediadau estynedig ymhlith alelau a gadarnhawyd yn flaenorol gan PCR ac ailddarllediadau estynedig. Amcangyfrifwyd y penodoldeb fel cyfran yr alelau heb eu hehangu ymhlith ailddarllediadau heb eu hehangu a brofwyd yn flaenorol gan PCR. Ceir disgrifiad llawn o'r fformiwlâu ystadegol yn yr atodiad (t 1).

I gymharu meintiau ailadrodd yn ôl PCR ag amcangyfrifon maint ailadrodd yn ôl dilyniannu genom cyfan, cymharwyd alelau wedi'u meintoli PCR â meintiau ailadrodd a ragfynegwyd gan ExpansionHunter ar gyfer alelau sy'n fyrrach na'r hyd a ddarllenwyd ar draws pob un o'r 13 loci ailadrodd tandem byr. Cyfrifwyd cydgordiant yn ôl canran y meintiau ailadrodd a ragfynegwyd gan ExpansionHunter a oedd yn cytuno â maint meintiol PCR, gan ystyried y gwall PCR o ailadrodd plws neu finws un. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd ystadegol R fersiwn 3.6.3.

Rôl y ffynhonnell ariannu

Arweiniwyd cynllun yr astudiaeth, cofrestriad cleifion, casglu data, a dilyniannu gan weithwyr Genomics England ac ymchwilwyr academaidd. Perfformiodd gweithwyr Illumina y broses o ddilyniannu 150 o samplau cleifion fel cydran gynlluniedig o'r astudiaeth cywirdeb diagnostig dilyniannu genom gyfan a datblygwyd ExpansionHunter. Perfformiodd gweithwyr Genomics England, ymchwilwyr academaidd, a chyd-awduron RTH, ED, ac MAE y dadansoddiad a'r dehongliad o ehangu ailadroddus mewn cleifion a recriwtiwyd i'r Prosiect Genomau 100 000. Nid oedd gan y ffynonellau ariannu unrhyw rôl o ran dehongli data nac ysgrifennu'r adroddiad.

Canlyniadau

Gwerthuswyd cywirdeb diagnostig dilyniannu genom cyfan i ganfod ail-ehangiadau yn erbyn 793 o brofion PCR a gyflawnwyd yn flaenorol o fewn y GIG gan 404 claf (profwyd 64 o gleifion am fwy nag un ailadrodd; ffigur 1). O'r profion hyn, dosbarthwyd 183 fel rhai ag ailadroddiad estynedig a 610 fel rhai heb ehangu dro ar ôl tro gan PCR, gan arwain at gyfanswm o 221 wedi'u hehangu a 1321 o alelau unigol heb eu hehangu ar draws 13 o loci clefyd (atodiad tt 24, 28). Dilyniant genom cyfan wedi'i ddosbarthu'n gywir 215 o 221 o alelau ehangedig a 1316 o 1321 o alelau heb eu hehangu o gymharu â chanlyniadau profion PCR (atodiad tt 27, 29), gan ddangos sensitifrwydd cychwynnol o 97·3 y cant (95 y cant CI 94·2–99). ·0) a phenodoldeb o 99·6 y cant (99·1–99·9; tabl 1). Yn dilyn cywiro gweledol pob galwad yn seiliedig ar ansawdd y darlleniadau, cynyddodd sensitifrwydd i 99·1 y cant (96·8–99·9) a phenodoldeb i 100 y cant (99·7–100; ffigur 2A, tabl 1). Roedd delweddu'r alelau estynedig yn galluogi canfod canlyniadau ffug-gadarnhaol ac ailddosbarthu'r holl alelau ffug-negyddol yn FXN, a dim ond un alel oedd wedi'i ddosbarthu'n gywir fel un wedi'i ehangu mewn samplau ag ehangiadau biallelig (atodiad tt 17, 18).

Cafodd hyd ailadrodd ei feintioli gan PCR mewn 509 o brofion PCR yn holi 945 o alelau ar draws 13 loci ehangu ailadroddus. Dangosir cydberthynas rhwng ExpansionHunter a PCR ar gyfer meintiau ailadrodd sy'n fyrrach ac yn fwy na hyd darllen y dilyniant (hy, 150 bp) yn yr atodiad (atodiad t 19). Gwelwyd cydgordiad uchel ar gyfer ailddarllediadau a oedd yn fyrrach na'r hyd a ddarllenwyd, gyda chytundeb o 92·7 y cant (836 o 902) rhwng PCR ac ExpansionHunter. Gwelwyd amrywioldeb locws, gyda chydgordiad uchel rhwng ExpansionHunter a PCR ar gyfer ATXN2, ATXN7, CACNA1A, a HTT, a chydgordiant isel ar gyfer DMPK neu TBP (atodiad t 30). Cafodd hyd yr alelau sy'n fwy na'r hyd a ddarllenwyd eu tanamcangyfrif gan ExpansionHunter, a effeithiodd ar gywirdeb galw i mewn DMPK, FMR1, a FXN (ffigur 2B, atodiad tt 19, 31).

Er bod ExpansionHunter yn gallu nodi alelau mawr estynedig yn gywir yn FMR1, DMPK, C9orf72, a FXN (atodiad t 29), roedd yr amcangyfrifon maint a ragfynegwyd yn tueddu i fod yn is na'r rhai a gafwyd gan PCR wrth i faint ailadrodd gynyddu o fewn yr ystod pathogenig, a effeithiodd ar y y gallu i wahaniaethu rhwng ehangiadau mawr a bach yn DMPK, C9orf72, a FXN, neu rhwng ehangiadau llawn a thrawsnewidiadau yn FMR1 (atodiad t 31). Er enghraifft, roedd gan loci gyda hyd ailadrodd a aseswyd gan PCR sy'n fwy na 200 o ailadroddiadau yn FMR1 ac a ddosbarthwyd fel treiglad llawn, faint ailadrodd cymedrig a amcangyfrifwyd gan ExpansionHunter o 92·6 (SD 17·8; atodiad t 31).

Er mwyn profi gallu canfod ehangu ailadroddus trwy ddilyniannu genom cyfan i ddatrys diagnosis cleifion a brofwyd yn flaenorol a chleifion nad oedd wedi'u diagnosio'n enetig, gwnaethom brofi 11 631 o gleifion yr amheuwyd bod ganddynt anhwylder niwrolegol genetig a recriwtiwyd i'r Prosiect Genomau 100000 (ffigur 1). Gwerthuswyd data dilyniannu genom cyfan gan ddefnyddio pedwar panel ehangu ailadroddus gwahanol yn unol â nodweddion clinigol y claf. Dangosir nifer y cleifion a brofwyd gyda phob un o’r pedwar panel yn nhabl 2.

Yn gyffredinol, canfuwyd a chadarnhawyd yn weledol ehangu ailadroddus mewn samplau gan 105 claf (tabl 2, atodiad tt 20, 33). O'r rhain, roedd 81 o samplau ar gael i'w profi er mwyn cadarnhau gan PCR, a chadarnhawyd bod gan 68 ehangiad ailadroddus (0·6 y cant cynnyrch): 45 (1·2 y cant ) o 3692 ym mhanel A, wyth ({ {18}}·3 y cant ) o 2743 ym mhanel B, pump (0·6 y cant ) o 860 ym mhanel C, a deg (0·1 y cant ) o 6731 ym mhanel D. Tri ar ddeg o 81 galwad ehangu ni chawsant eu cadarnhau fel ehangiadau ailadroddus pathogenig (cyfradd darganfod ffug o 16 y cant). O'r rhain, roedd dau yn alelau heb eu hehangu yn ATXN1 ac ATXN2, roedd pedwar yn alwadau maint canolradd FMR1 (atodiad t 21), ac roedd saith yn drynewidiadau FMR1.

Darperir manylion clinigol y 68 o gleifion ag ehangu ailadroddus a gadarnhawyd gan PCR, gan gynnwys eu cyflwyniadau clinigol, yr ehangu ailadroddus a nodwyd, a chyfraniad yr ehangu dro ar ôl tro at nodweddion clinigol y claf yn nhabl 3; mae termau HPO, maint ailadrodd a amcangyfrifwyd gan ExpansionHunter, ac a oes adroddiad diagnostig wedi'i gyhoeddi wedi'u rhestru yn yr atodiad (t 33).

Gwelwyd ehangiadau mewn cleifion a oedd yn cyflwyno gydag amrywiaeth eang o gyflwyniadau clinigol gorgyffwrdd a brofwyd gyda phanel A (tabl 3, atodiad t 22), gan gynnwys ehangiad ailadroddol ATXN2 mewn claf â chlefyd Parkinson sy'n ymateb i lefodopa yn gynnar a hanes o atacsia serebelaidd cynyddol. , ac ehangiadau AR mewn pedwar claf a gafodd ddiagnosis clinigol o glefyd Charcot-Marie-Tooth, gan gynnwys un â niwroopathi demyelinating a gadarnhawyd yn enetig (hy, clefyd Charcot-Marie-Tooth math 1, claf 42; atodiad t 33). Arsylwyd ystod eang o ddiagnosis clinigol blaenorol mewn cleifion ag ehangiadau ailadroddus pathogenig.

Er enghraifft, mewn saith claf â sglerosis ochrol amyotroffig neu glefyd niwronau motor arall, nodwyd ehangiadau yn AR (n=4) a C9orf72 (n=3). Mewn cleifion yr amheuir bod ganddynt atacsia etifeddol, canfuom ehangiadau mewn loci nad oedd wedi’u hasesu fel rhan o waith diagnostig arferol o fewn y GIG ar adeg recriwtio, gan gynnwys ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP, a HTT ( bwrdd 3). Canfuom hefyd ehangiadau ailadroddus mewn cleifion â nodweddion clinigol sy'n gyson ag anhwylderau ehangu ailadroddus amgen, gan gynnwys ehangiad C9orf72 mewn clefyd Parkinson cynnar a theuluol (claf 24, Tabl 3) ac ehangiadau ailadroddus yn yr ystod treiddiad is yn HTT (38 ailadrodd). mewn dwy chwaer ag anhwylder symud, dementia, iselder, ac anawsterau lleferydd (cleifion 44 a 45), gan danlinellu'r her ddiagnostig a gyflwynir gan yr anhwylderau ehangu ailadroddus hyn.

Canfuwyd bod gan wyth o blant a brofwyd gyda phanel B ehangiadau CAG mawr (ffigur 3), ac eglurodd saith ohonynt nodweddion clinigol y claf yn llawn. Nid oedd gan chwe chlaf hanes teuluol llawn gwybodaeth ac nid oeddent wedi cael cynnig profion ehangu ailadroddus fel rhan o’u hasesiad clinigol ar adeg eu recriwtio (cleifion 48–53; tabl 3, atodiad t 33). Roedd gan ddau o'r plant hyn ehangiadau HTT mawr (90-100 o ailadroddiadau CAG). Mae'n werth nodi bod un plentyn wedi etifeddu'r ail dro gan riant nad oedd wedi effeithio arno heb hanes teuluol o glefyd Huntington. Mae profion teuluol yn mynd rhagddynt, ond mae alel treiddiad is wedi'i nodi yn y teulu estynedig, sy'n dangos bod yr ailadrodd wedi cynyddu o fwy na 60 o unedau ailadrodd mewn un genhedlaeth (claf 52). Ar adeg ysgrifennu, nid oedd unrhyw un yn y teulu yn dangos unrhyw arwyddion o glefyd Huntington, ac mae cwnsela a phrofion genetig yn parhau ar gyfer y rhieni. Roedd dau blentyn iau na 5 oed yn cario ehangiadau mawr ailadroddus yn ATXN7 ac yn cael eu cyflwyno â chlefyd aml-system cymhleth. Ar gyfer un o'r plant hyn (claf 50), dangosodd ei riant broblemau cerddediad 2 flynedd ar ôl ymrestru yn y Prosiect 100000 Genom. Yn yr un modd, canfuwyd bod gan ferch 10 oed ag anabledd deallusol 99-ehangiad ailadroddus yn ATXN2, er gwaethaf y ffaith bod y ddau riant wedi'u dynodi fel rhai heb eu heffeithio, a chanfuwyd bod merch 18 oed â dementia yn cario 99- {19}}ailadrodd ehangu yn ATN1 (atodiad t 33).

Canfuwyd pum ehangiad yn DMPK (panel C), gan gynnwys mewn plentyn a mam â diagnosis clinigol o nychdod cyhyrol, mewn dau frawd neu chwaer yr amheuir bod ganddynt myopathi distal, ac mewn glasoed â myopathi cynhenid ​​(cleifion 54-58). Canfuwyd ehangiadau FMR1 (panel D) mewn naw bachgen ac un ferch, ac roedd diagnosis o syndrom Fragile X yn egluro’r nodweddion clinigol a gyflwynwyd yn llawn neu’n rhannol (cleifion 59-68).

Trafodaeth

Mae diagnosis anhwylderau ehangu ailadroddus yn heriol mewn gofal iechyd oherwydd nodweddion clinigol heterogenaidd sy'n gorgyffwrdd a chanfyddiadau clinigol amhenodol, a all gynyddu mewn difrifoldeb gydag oedran ac ym mhob cenhedlaeth ddilynol. Mae anhwylderau ehangu ailadroddus ymhlith yr achosion mwyaf cyffredin o glefydau niwrolegol etifeddol.4 Serch hynny, efallai na fydd cleifion yn cael diagnosis digonol, naill ai oherwydd nad oes digon o brofion genetig wedi'u cynnal neu oherwydd nad yw'r amrywiadau genetig achosol wedi'u darganfod eto. Mae dulliau profi yn dameidiog ar hyn o bryd, ac efallai y bydd cleifion yn cael y locws ehangu ailadroddus anghywir wedi'i brofi29 neu'n cael prawf moleciwlaidd ar gyfer dosbarth gwahanol o amrywiad oherwydd bod nodweddion clinigol yn gorgyffwrdd ag anhwylderau genetig niwrolegol eraill.30

Mae dilyniannu genom cyfan wedi'i ddefnyddio mewn lleoliadau lluosog fel prawf diagnostig llinell gyntaf ar gyfer anhwylderau niwrolegol prin ond credwyd yn flaenorol fod ganddo allu isel i ganfod ehangiadau ailadroddus.16 Mae sawl offer wedi'u datblygu i nodi ehangiadau o genom cyfan dro ar ôl tro. dilyniannu yn y lleoliad ymchwil,31 ond nid oes yr un o'r dulliau hyn wedi'u cymhwyso i ddata dilyniannu genom cyfan a gasglwyd gan nifer fawr o gleifion mewn gwasanaeth gofal iechyd sengl. Rydym yn cyflwyno tystiolaeth y gall algorithm a gynlluniwyd i ganfod ehangiadau ailadroddus o ddilyniannu genom cyfan asesu'n ddibynadwy yr ehangiadau ailadroddus mwyaf cyffredin sy'n achosi clefydau a datrys achosion nas diagnosis genetig yn flaenorol mewn carfan fawr o gleifion ag anhwylderau niwrolegol. Mae ein canlyniadau'n nodi y gall dilyniannu genom cyfan wahaniaethu rhwng alelau nad ydynt wedi'u hehangu a'u hehangu gyda sensitifrwydd a phenodoldeb uchel ar draws 13 loc ehangu ailadroddus (y gellir eu gwella ymhellach trwy arolygiad gweledol), yn gallu cyfrifo maint yr alelau sy'n llai na'r hyd darllen yn gywir. , a gallai danamcangyfrif maint yr ehangiadau mawr yn FMR1, DMPK, FXN, a C9orf72.

Pan aseswyd canfod ehangu ailadroddus trwy ddilyniannu genom cyfan yn erbyn canlyniadau cadarnhaol a negyddol a gafwyd yn flaenorol mewn labordai genomig diagnostig clinigol gan ddefnyddio dulliau safon aur, canfuom o leiaf sensitifrwydd 97·3 y cant a phenodoldeb 99·6 y cant. Ar ben hynny, fe wnaethom ddangos y gellir gwella'r penodoldeb a'r sensitifrwydd trwy guradu'r pentwr darllen â llaw, gan alluogi canfod canlyniadau ffug-bositif ac ailddosbarthu alelau ffug-negyddol mewn samplau ag ehangiadau biallelig. O'r 6731 o gleifion a brofwyd ar gyfer FMR1 (panel D), rhagwelwyd y byddai 124 o alwadau'n cael eu hymestyn. Roeddem yn gallu eithrio 97 trwy arolygiad gweledol fel pethau positif anghywir tebygol. Mae hyn yn dangos y byddai 1 o bob 54 o brofion dilyniannu genom cyfan yn cael galwad FMR1 y byddai angen ei archwilio’n weledol i daflu galwad ffug-bositif bosibl. Mae gwaith yn mynd rhagddo i wella dull genoteipio ExpansionHunter i leihau nifer y galwadau ffug-bositif ar gyfer FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 o ailddarllediadau) yn achosi afiechyd mwy difrifol, ac ataxia spinocerebellar math 36 (NOP56), lle mae ehangiadau mwy na 650 o ailadroddiadau yn cael eu hystyried yn bathogenaidd a meintiau ailadrodd o 15-650 yn cael eu hystyried yn ganolradd ac yn amrywiadau o arwyddocâd ansicr.

Mae mwy na 40 o loci ehangu ailadroddus wedi'u nodi; dim ond yn ddiweddar y mae llawer o'r loci hyn wedi'u nodi ac maent bellach yn gysylltiedig â chyflyrau anesboniadwy o'r blaen, gan gynnwys atacsia serebelar â niwroopathi a syndrom areflexia vestibular (RFC1) 32 ac epilepsi myoclonig (SAMD12).33 Y loci ehangu ailadroddus mwyaf cyffredin sy'n achosi clefyd niwrolegol oedd a ddewiswyd ar gyfer ein hastudiaeth yn seiliedig ar argaeledd samplau rheoli cadarnhaol a negyddol.

Mae'r canfyddiadau a gyflwynir yma yn awgrymu y dylai ExpansionHunter allu dosbarthu alelau nad ydynt wedi'u hehangu a'u hehangu yn gywir ar unrhyw locws ehangu ailadroddus os yw'r alelau heb eu hehangu yn llai na'r hyd a ddarllenwyd (hy, 150 bp). Er bod gan y rhan fwyaf o loci ehangu ailadroddus alelau sy'n llai na 150 bp pan nad ydynt wedi'u hehangu, gallai rhai loci lle mae maint yr alel heb ei ehangu yn agos at 150 bp (ee, NOTCH2NLC)34 fod yn anoddach i'w genoteip gan ddefnyddio'r dull hwn. Ar gyfer loci lle mae'r ailadrodd estynedig yn sylweddol fwy na'r hyd a ddarllenwyd, gall dilyniannu genom cyfan ganfod ehangiadau pathogenig (ee, NOP56,35 RFC120,32). Gallai technolegau dilyniannu darllen hir newydd gynnig dulliau cyflenwol wrth genoteipio ehangiadau mawr.36

Rhoddodd asesiad o ehangu ailadroddus gan ddefnyddio dilyniannu genom cyfan mewn 11 631 o gleifion heb eu diagnosio a recriwtiwyd i'r 100 000 Prosiect Genomau 68 o gleifion â chanfyddiadau esboniadol. Recriwtiwyd cleifion i'r 100 000 Prosiect Genomau ar ôl profion genetig safonol; felly, mae cyfran yr ehangu ailadroddus a nodir yn y garfan hon yn cynrychioli cynnydd yn y cynnyrch diagnostig o brofion safonol y GIG, sy'n cynnwys profion locws-benodol ar gyfer anhwylderau ehangu ailadroddus megis FXN neu DMPK. O bwys, ni amheuwyd bod rhai diagnosis yn seiliedig ar nodweddion clinigol y claf, gan gynnwys chwe chlaf pediatrig nad oedd ganddynt hanes teuluol hysbys o anhwylder ehangu ailadroddus. Mae’r meintiau ehangu ailadrodd cymedrig a ragwelir gan ddilyniannu genom cyfan mewn cleifion pediatrig a ddisgrifir yn yr astudiaeth hon yn sylweddol fwy na’r cymedr mewn oedolion, yn gyson â’r disgwyliad bod ehangiadau mwy yn gysylltiedig â dyfodiad cynharach a mwy difrifol, hyd yn oed mewn plant. Mae angen rhagor o waith, ond mae’r canfyddiad hwn yn awgrymu y gallai asesiad o bathogenedd sy’n ddibynnol ar oed ac yn dibynnu ar faint gefnogi diagnosis pediatrig drwy leihau’r perygl posibl o ganfod alelau risg cychwyniad oedolyn, gan arwain at brofion rhagfynegol digymell mewn plant.

Mae ein canfyddiadau yn galluogi sefydlu llif gwaith diagnostig clinigol ar gyfer dilyniannu genom cyfan (atodiad t 23). Rydym yn cynnig bod archwiliad gweledol yn cael ei wneud ar gyfer pob galwad a ddosberthir yn ehangedig i ganfod positifau ffug, ac ar gyfer ehangiadau biallelig y mae un alel estynedig yn unig wedi'i ganfod ar ei gyfer (ee, FXN). Rydym yn argymell bod labordai'n defnyddio ExpansionHunter i asesu presenoldeb ehangiad heb gadw at amcangyfrif maint a chynnal profion PCR i gadarnhau fel elfen safonol o'r llif gwaith profi.

Mae clefydau etifeddol prin yn cynnwys ystod eang o nodweddion clinigol, gan wneud profion genomig penodol i locws yn aneffeithlon, llafurus a drud. Rydyn ni'n cyflwyno tystiolaeth y gallai dilyniannu genom cyfan gradd glinigol gyda'r potensial i wneud diagnosis o ystod o glefydau niwrolegol prin sy'n nodweddiadol yn cyflwyno gydag un amrywiadau rhif sylfaen, indel, neu gopi rhif bellach gael ei ymestyn i ehangu ailadroddus. Gan fod dilyniannu genom cyfan yn darparu un prawf sy'n gallu nodi'r ehangiadau ailadrodd mwyaf cyffredin, yn ogystal â galluogi profi treigladau pwynt ac amrywiadau rhif copi mewn genynnau sy'n gysylltiedig â'r cyflyrau hyn ar yr un pryd, mae'n cynnig cyfle i nodi'r rhan fwyaf o gleifion â'r anhwylderau heterogenaidd hyn. nad ydynt wedi cael diagnosis drwy ddefnyddio profion locws penodol. Yn y cyfnod o therapïau sy'n dod i'r amlwg ar gyfer yr anhwylderau hyn, gallai canfod cynnar ddod yn hollbwysig.37 Mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi gweithredu dilyniannu genom cyfan ar gyfer canfod ehangu ailadroddus mewn labordai diagnostig clinigol, dull sydd eisoes wedi'i gynnwys yn Genomig Cenedlaethol GIG Lloegr. Cyfeiriadur Prawf,38 ar gyfer ymchwilio i glefyd niwrolegol prin heb ei ddiagnosio.

Cyfeiriadau

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Nenfwd diagnostig ar gyfer dilyniannu exome mewn ataxia serebelar ac anhwylderau niwrolegol cysylltiedig. Hum Mutat 2020; 41:487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Paraplegia sbastig etifeddol yng Ngwlad Groeg: nodweddu poblogaeth na chafodd ei harchwilio o'r blaen gan ddefnyddio dilyniant cenhedlaeth nesaf. Eur J Hum Genet 2016; 24:857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Cynnyrch diagnostig panel genynnau dilyniannu cenhedlaeth nesaf wedi'i dargedu ar gyfer anhwylderau symud cychwyn pediatrig: astudiaeth carfan blwyddyn 3-. Genet Blaen 2019; 10:1026.

4 Paulson H. Clefydau ehangu ailadroddus. Handb Clin Neurol 2018; 147:105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 dementia blaen-amerobig a/neu sglerosis ochrol amyotroffig. Seattle, WA: Prifysgol Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Atacsia spinocerebellar. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Niwrogeneteg glinigol: atacsia spinocerebellar tra-arglwyddiaethol awtosomaidd. Neurol Clin 2013; 31:987–1007.

8 La Spada A. Atroffi cyhyr yr asgwrn cefn a bylbar. Yn: Adam AS, Ardinger HH, Pagon RA, et al, gol. Adolygiadau Gene. Seattle, WA: Prifysgol Washington, 1999.

9 Gousse G, H Naturiol, Touraine R, et al. Ffurf angheuol o ataxia spinocerebellar math 7 gyda dyfodiad cynnar yn ystod plentyndod. Arch Pediatr 2018; 25:42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Ataxin-7 agregu a hollbresennol mewn babanod SCA7 gyda 180 o ailadroddiadau CAG. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Atacsia math 2 spinocerebellar yn cyflwyno gydag atchweliad gwybyddol yn ystod plentyndod. J Neurol Plentyn 2008; 23:999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Ataxia spinocerebellar 3 sy'n cychwyn yn ystod plentyndod: dystonia tafod fel amlygiad cynnar. Cryndod Hyperkinetic Mov 2019; cyhoeddwyd ar-lein Medi 13.

13 Aderyn TD. Dystroffi myotonig math 1. Yn: Adam AS, Ardinger HH, Pagon RA, et al, gol. Adolygiadau Gene. Seattle, WA: Prifysgol Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Amlder SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS a C9orf72 yn ailadrodd ehangiadau mewn cleifion SCA negyddol ar gyfer yr isdeipiau SCA mwyaf cyffredin. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Dilyniannu genom cyfan cleifion â chlefydau prin mewn system iechyd gwladol. Natur 2020; 583:96–102.

16 EA Ashley. Tuag at feddyginiaeth fanwl. Nat Parch Genet 2016; 17:507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Defnydd diagnostig a chlinigol o ddilyniannu genom cyfan mewn carfan o deuluoedd Tsieineaidd heb ddiagnosis sydd â chlefydau prin. Cynrychiolydd Gwyddonol 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Proffilio tirwedd genom-eang o ehangiadau ailadroddus tandem. Asidau Niwcleig Res 2019; 47:e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Canfod ehangiadau o ailddarllediadau tandem mewn carfannau wedi'u dilyniannu â data dilyniannu darllen byr. Am J Hum Genet 2018; 103:858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Adnabod ailddarllediadau estynedig yn seiliedig ar fiowybodeg: mae ehangiad pentamer intronig digyfeiriad yn RFC1 yn achosi CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AC, Ajay SS, Rajan V, et al. Amrywiadau rhif copi mewn dilyniannu genomau clinigol: lleoli a dehongli ar gyfer clefyd prin a heb ei ddiagnosio. Genet Med 2019; 21:1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Darganfod genom-eang o ailddarllediadau DNA tandem sy'n cael eu hehangu mewn awtistiaeth. Natur 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Ontoleg Ffenoteip Dynol: offeryn ar gyfer anodi a dadansoddi clefyd etifeddol dynol. Am J Hum Genet 2008; 83:610–15.

24 Genomeg Lloegr. Modelau data clinigol ar gyfer cyflyrau clefydau prin. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (cyrchwyd Awst 4, 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Canfod ehangiadau hir ailadrodd o ddata dilyniant genom cyfan di-PCR. Genom Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: offeryn seiliedig ar graff dilyniant i ddadansoddi amrywiad mewn rhanbarthau ailadrodd tandem byr. Biowybodeg 2019; 35:4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Safonau a chanllawiau ar gyfer dilysu piblinellau biowybodeg dilyniant cenhedlaeth nesaf: argymhelliad ar y cyd gan Gymdeithas Patholeg Foleciwlaidd a Choleg Patholegwyr America. J Mol Diagn 2018; 20:4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Gwyliwr genomeg integredig. Nat Biotechnol 2011; 29:24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. homogenedd ffenoteipaidd y cyflwyniad tebyg i glefyd Huntington mewn teulu SCA17. Niwroleg 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Clefyd Bird T. Huntington, tebygrwydd clefyd Huntington, a chorea etifeddol anfalaen: beth sy'n newydd? Ymarfer Anhwylder Clin Mov 2016; 3:342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Datblygiadau diweddar o ran canfod ehangu ailadroddus gyda dilyniannu cenhedlaeth nesaf darllen byr. F1000Res 2018; 7:736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Mae ehangu biallelig o ailadrodd intronic yn RFC1 yn achos cyffredin o atacsia sy'n dechrau'n hwyr. Nat Genet 2019; 51:649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Ehangiadau o ailadroddiadau intronic TTTCA a TTTTA mewn epilepsi myoclonig teuluol oedolion diniwed. Nat Genet 2018; 50:581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. CGG digodio yn ailadrodd ehangiadau mewn clefyd cynhwysiant mewn-niwclear niwronaidd, myopathi oculopharyngodistal, a chlefyd sy'n gorgyffwrdd. Nat Genet 2019; 51:1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pab K, et al. Diagnosis cyflym o atacsia spinocerebellar 36 mewn teulu tair cenhedlaeth gan ddefnyddio data dilyniannu genom cyfan darllen byr. Anhwylder Symud 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Dilyniant darllen hir yn dod i'r amlwg mewn geneteg feddygol. Genet Blaen 2019; 10:426.

37 Ellerby LM. Anhwylderau ehangu ailadroddus: mecanweithiau a therapiwteg. Niwrotherapiwteg 2019; 16:924–27.

38 System Iechyd Genedlaethol. Cyfeiriadur Profion Genomig Cenedlaethol: meini prawf profi ar gyfer clefydau prin ac etifeddol. Hydref, 2021.