Dosbarthiad Nodedig o Ffactor Anwythol Hypocsia-1 mewn Celloedd Tiwbaidd Arennol Diwylliedig Gyda Hypoperfusion Wedi'i Efelychu Trwy Leoliad Coverlip

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Honda Tomoko¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Haniaethol

Mae hypocsia cronig yn y tubulointerstitium arennol yn chwarae rhan allweddol yn natblygiad cronigarenclefyd(CKD). Mae'n bwysig felly ymchwilio i hypocsia tiwbaidd a gweithgaredd ffactor hypocsia-anwythol (HIF)-1 mewn ymateb i hypocsia. Mae prinder y capilari peritubwlaidd yn achosi hypoperfusion mewn CKD; fodd bynnag, anaml yr ymchwiliwyd i effaith hypoperfusion ar HIFs. Fe wnaethon ni ysgogi gorlifiad a achosir gan leoliad gorchuddion slip mewn dynolaren-2 celloedd ac wedi arsylwi graddiant ocsigen o dan y slip gorchuddio. Dangosodd imiwnocytocemeg HIF-1 ffurfiant siâp toesen ar ymyl ardal pimonidazole-positif, a enwyd gennym y "HIF-ring". Amcangyfrifwyd bod tensiwn ocsigen y cylch HIF rhwng tua 4 mmHg a 20 mmHg. Nid oedd y canlyniad hwn yn gydnaws â rhai ymchwil blaenorol a ddangosodd HIF-1 yn cronni yn yr amrediad anocsig gyda thensiwn ocsigen homogenaidd. Gwelsom ymhellach bresenoldeb graddiant pH o dan slip gorchuddio, yn ogystal â newid yn y cylch HIF oherwydd newidiadau yn pH y cyfrwng meithrin, sy'n awgrymu bod y cylch HIF wedi'i ffurfio trwy ataliad o HIF-1 cysylltiedig i pH isel. Dangosodd yr ymchwil hwn fod actifadu HIF yn dynwared cyflwr ffisiolegol celloedd diwylliedig gyda gorlifiad.

GEIRIAU ALLWEDDOLgorlifiad, hypocsia, ffactor hypocsia-anwythol, graddiant ocsigen, pH

Llysieuyn Cistancheatal clefyd yr arennau, cliciwch yma i gael y sampl

1|RHAGARWEINIAD

Amlder cronigarenclefyd(CKD) yn cynyddu ar draws y byd wrth i gymdeithasau heneiddio (Tonelli a Riella, 2014). Mae dilyniant CKD yn anwrthdroadwy unwaith y bydd difrod arennol yn cyrraedd rhywfaint ac yn olaf yn arwain at glefyd arennol cyfnod olaf (ESRD), waeth beth fo'r afiechyd sylfaenol. Mae'r canlyniad hwn yn dynodi bodolaeth "llwybr cyffredin terfynol." Yn ôl dadansoddiadau patholegol y gorffennol, mae cydberthynas gryfach rhwng y dirywiad mewn swyddogaeth arennol a difrod tubulointerstitial na difrod glomerwlaidd. Cafwyd sawl adroddiad yn dangos bod ffibrosis arennol yn achosi hypocsia cronig yn y tubulointerstitium, ac mae'r hypocsia tubulointerstitial hwn yn gwaethygu CKD ac yn arwain at ESRD. Mae'r dystiolaeth hon yn dangos bod hypocsia tubulointerstitial yn chwarae rhan yn llwybr cyffredin terfynol CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Mae'rarenyn agored iawn i hypocsia oherwydd ei alw mawr am ocsigen, a bodolaeth siyntio ocsigen rhwng y rhydwelïau a'r gwythiennau mewn-arennol (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Felly, rydym yn ystyried ei bod yn hanfodol ymchwilio i hypocsia a'r ymateb i hypocsia yn y tubulointerstitium arennol.

Mae'r ymateb biolegol sylfaenol i hypocsia mewn organebau byw yn digwydd trwy'r llwybr ffactor hypocsia-anwythol (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza a Wang, 1992; Zhou et al., 2003). Mae HIF yn cynnwys - ac -is-unedau. Er bod yr -subunit yn weithredol yn gyfansoddiadol, mae'r -subunit yn cael ei ddiraddio ym mhresenoldeb ocsigen. O dan amodau normocsig, mae HIF- yn cael ei hydrocsyleiddio gan y parth prolyl hydroxylase (Ph.D.), gan ei wneud yn adnabyddadwy gan atalydd tiwmor von Hippel-Lindau (VHL). Mae'r gydnabyddiaeth hon yn arwain at hollbresennoldeb a diraddiad HIF-hydrocsylaidd yn y proteasom. O dan amodau hypocsig, mae HIF- yn cronni yn y sytosol, oherwydd bod HIF nad yw'n hydrocsyleiddio - yn dianc rhag diraddio. HIF cronedig- yn cael ei drawsleoli o'r cytosol i'r cnewyllyn, lle mae'n pylu â HIF-, ac yn gweithredu fel ffactor trawsgrifio, gan hyrwyddo mynegiant genynnau i lawr yr afon. O'r tri isffurf a nodwyd o is-uned HIF—HIF-1 , HIF-2 , a HIF-3 —mae'n hysbys bod celloedd epithelial tiwbaidd arennol yn mynegi HIF-1 (Tanaka et al ., 2016). Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos croniad dros dro neu ranbarthol o HIF yn yarengyda CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), ac mae'r HIF hwn yn cael ei actifadu yn y tensiwn llai o ocsigen yn y milieu CKD. Gallai’r camaddasiad i hypocsia mewn CKD gael ei achosi gan bresenoldeb ffactorau sy’n atal llwybrau HIF (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Mae effeithiau amddiffynnol actifadu HIF wedi'u hadrodd mewn sawl model anifeiliaid, gan gynnwys llygod mawr diabetig a achosir gan streptozotocin a llygod mawr nephrectomi 5/6 (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. mae atalyddion wedi denu sylw yn ddiweddar fel dulliau therapiwtig newydd o drin anemia arennol mewn cleifion â CKD (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al., 2019; ., 2016; Provenzano et al., 2016). Fodd bynnag, mae manylion dilyniant hypocsia arennol, a'r ffordd y mae cronni HIF yn digwydd yn yarengyda CKD, aros yn aneglur. Mae hydrocsyleiddiad HIF-ddibynnol ar ocsigen- yn digwydd yn y sytosol, ac felly mae'n bwysig mesur tensiwn ocsigen mewngellol ac allgellog. Defnyddir sawl dull ar gyfer mesur tensiwn ocsigen, gan gynnwys defnyddio microelectrodau neu ddelweddu cyseiniant magnetig sy'n dibynnu ar lefel ocsigen gwaed (BOLD-MRI). Fe wnaethom ddefnyddio microsgopeg delweddu oes ffosfforescence (PLIM) ar gyfer mesur meintiol o statws ocsigen mewngellol (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). Mae BTPDM1 yn lliw ffosfforescent sy'n seiliedig ar y cymhleth iridium (III) BTP, (bp) 2Ir(acc) (bp=benzoate-pyridine, aac=asetylacetone) gyda grŵp dimethylamino cationig, sy'n oddefol dosbarthu mewn lysosomau mewngellol. Cafodd ei syntheseiddio fel chwiliwr ffosffo-diweddar i fesur y pwysedd ocsigen mewngellol (Yoshihara et al., 2015). Galluogodd PLIM gyda BTPDM1 gaffael delweddau cydraniad uchel o bwysedd rhannol ocsigen mewn celloedd tiwbaidd arennol ar wyneb arennol llygod arferol, gan ddarparu data yn nodi presenoldeb graddiant ocsigen, hyd yn oed mewn arennau arferol (Hirakawa et al., 2018 ).

Mae graddiannau ocsigen mewn organau byw, gan gynnwysarennau, hyd yn oed o dan amodau arferol (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), ac felly gellir disgwyl graddiannau o'r fath yn CKD hefyd. Mae gorlifiad yn cael ei achosi gan faction prin y microfasgwlaidd yn CKD, lle mae anaf glomerwlaidd cynyddol yn arwain at ostyngiad yn llif gwaed capilarïau peritubwl, gan waethygu ffibrosis rhyng-ranol. Mae ffibrosis interstitial yn amharu ar ymlediad a chyflenwad ocsigen i'r celloedd tiwbaidd, ac yn arwain at ddiffygiad prin y microfasgwlaidd, gan waethygu ymhellach hypocsia tiwbaidd rhyng-gyfrannog (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Fodd bynnag, mae effeithiau biolegol hypoperfusion yn parhau i fod yn aneglur, oherwydd bod y rhan fwyaf o astudiaethau wedi ymchwilio i effeithiau hypocsia a HIF-1 ar gelloedd diwylliedig o dan amodau darlifiad homogenaidd a thensiwn ocsigen (Rexius-Hall et al., 2017). Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod celloedd diwylliedig mono-haenog wedi'u gorchuddio â gorchudd clawr yn darparu model da o orlifiad a achosir gan rwystr i ymlediad yn y cyfrwng meithrin. Mae’r gorlifiad wedi’i fodelu yn gysylltiedig â graddiant ocsigen oherwydd bod slip gorchuddio yn atal trylediad ocsigen o frig y cyfrwng i’r celloedd (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). Mewn monohaen o gelloedd diwylliedig wedi'u gorchuddio â slip gorchuddio, mae tensiwn ocsigen mewngellol yn disgyn yn bell o ymyl y slip gorchuddio oherwydd trylediad ocsigen cyfyngedig i gelloedd diwylliedig. O ganlyniad, mae graddiant ocsigen yn cael ei ffurfio o ymyl i ganol y slip gorchuddio, a gall y tensiwn ocsigen mewngellol ostwng i amrediad anocsig yng nghanol y clawr (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Yn yr astudiaeth gyfredol, fe wnaethom ganolbwyntio ar actifadu HIF ac ymchwilio i weld a oes newid ocsigen-annibynnol mewn mynegiant HIF ym mhresenoldeb hypoperfusion gyda graddiant ocsigen. Gan fod gorlifiad â graddiant ocsigen yn bodoli mewn tiwbiau arennol in vivo, gall arsylwi effeithiau ocsigen-annibynnol ar fynegiant HIF yn y model clawr slip roi mewnwelediad i'r mecanwaith sy'n sail i annigonolrwydd cronni HIF mewn CKD.

dyfyniad cistanchear gyfer aren

2|DEUNYDD S A DULLIAU

2.1|Diwylliant celloedd

Deorwyd celloedd diwylliedig mewn deorydd llaith gyda 5 y cant o CO2. Perfformiwyd deor hypocsig mewn deorydd CO2/aml-nwy personol APM-30D (Astec). Anogwyd anocsia gyda bag anocsia, AnaeroPack, a setiau tyfu anaerobig #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Celloedd HK-2 (Homo sapiens, dynolarenCafodd , gwryw, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), llinell gell epithelial tiwbyn procsimol anfarwoledig o aren ddynol oedolyn arferol, eu meithrin yng nghymysgedd cyfrwng/maethol F{{2} Eagle's addasedig Dulbecco } Ham (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) yn cynnwys 10 y cant o serwm buchol ffetws (FBS) (F7524, Sigma Aldrich), a hydoddiant penisilin-streptomycin (15070063, Thermo Fisher Scientific) mewn dysgl feithrin 10 cm. Ar gyfer trosglwyddo, dadunwyd celloedd HK-2 â trypsin (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a'u centrifugio ar 300 g am 5 munud.

Celloedd canser ceg y groth HeLa ac embryonig dynolarencafodd celloedd 293 (HEK293) eu meithrin mewn DMEM gyda glwcos isel (1000 mg / L) (D6046, Sigma Aldrich) yn cynnwys 5 y cant FBS mewn dysgl diwylliant 10 cm. Cafodd y celloedd hyn eu pasio fel celloedd HK-2.

Roedd celloedd epithelial tiwbyn procsimol arennol (RPTECs) (CC- 2553, Cambrex) yn cael eu cynnal gan ddefnyddio pecynnau RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Ar gyfer taith, dadunwyd RPTECs gan ddefnyddio trypsin, eu niwtraleiddio â Datrysiad Niwtraleiddio Trypsin (CC-5002, Lonza Ltd.), a'i allgyrchu ar 200 g am 5 munud.

2.2|Sefydlu model hypoperfusion trwy osod slip clawr

Glanhawyd slipiau gorchuddio siâp crwn â diamedr 15 mm (C015001, Matsunami) gan ddefnyddio uwchsain a'u storio mewn 99.5 y cant ethanol cyn eu defnyddio. Defnyddiwyd dau ddull, yn seiliedig ar arsylwi celloedd y tu allan i'r slip clawr.

Roedd celloedd diwylliedig unhaenog yn cael eu rhyngosod rhwng slip gorchuddio a gwaelod dysgl (Ffigur S1a,b), neu ddull arall (Ffigur S1c), fel y disgrifir isod. Dewiswyd y dull traddodiadol neu'r dull amgen i sefydlu ein model coverlip ar gyfer delweddu byw, boed yn ddelweddu ocsigen neu'n ddelweddu PH. Ar gyfer imiwnocytocemeg (ICC), dewiswyd y dull amgen, oherwydd wrth ddefnyddio'r dull traddodiadol, roedd mwyafrif y celloedd yn aml yn gwahanu oddi wrth waelod y ddysgl wrth dynnu gorchuddion slip ar gyfer sefydlogiad celloedd (Ffigur S2a).

2.2.1|Dull traddodiadol

Ar Ddiwrnod 1, gosodwyd celloedd ar waelod dysgl gwydr 27 mm (3910-035, Iwaki) ar gydlifiad o 100 y cant * (tua 5.0 × 105/dish). Cawsant eu meithrin yn DMEM/ F12 yn cynnwys 10 y cant o FBS heb doddiant gwrthfiotig dros nos. Ar Ddiwrnod 2, gosodwyd slip gorchuddio dros y celloedd diwylliedig am y cyfnod a nodir (Ffigur S1b).

2.2.2|Dull amgen

Cafodd celloedd eu hadu ar slip gorchuddio mewn dysgl diwylliant 35 mm ar gydlifiad 100 y cant (tua 5.0 × 105/pryd) ar Ddiwrnod.

1. Cawsant eu meithrin yn DMEM/F12 yn cynnwys 10 y cant o FBS heb doddiant gwrthfiotig dros nos. Ar Ddiwrnod 2, gwrthdrowyd y clawr clawr, i lynu arwyneb ei gelloedd ar waelod dysgl wydr 27 mm newydd am gyfnod penodol (Ffigur S1c).

Fe wnaethon ni hefyd greu model slip clawr gan ddefnyddio slipiau gorchuddio siâp crwn gyda diamedr o 10 mm (CS01005, Matsunami) (Ffigur S2b).

2.3|Delweddu ocsigen byw gyda BTPDM1

Paratowyd celloedd diwylliedig ar Ddiwrnod 1, fel y disgrifir uchod. Ar Ddiwrnod 2, rinsiwyd y celloedd ddwywaith â hydoddiant Halen Cytbwys Hanks (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) a'u deor â 500 nM BTPDM1, llifyn lipoffilig cationig yn seiliedig ar iridium a ddefnyddir fel stiliwr ffosfforws mewngellol (Yoshihara et al. 2015), yn DMEM/F12 heb ffenol coch (21041-025, Thermo Fisher Scientific) am 30 munud. Ar ôl i'r celloedd gael eu golchi ddwywaith gyda HBSS, cawsant eu rhyngosod rhwng clawr a gwaelod dysgl, fel y disgrifir uchod. Gwelwyd dwyster ffosfforescence o BTPDM1 mewn celloedd diwylliedig wedi'u gorchuddio â gorchuddion gan ddefnyddio hidlydd cyffro ac allyriadau, a chanfuwyd ffosfforescence BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd, BZ-X710 (Keyence Corporation). Addaswyd delweddau a gafwyd o'r microsgop fflwroleuol gwrthdro ar gyfer disgleirdeb a chyferbyniad gan ddefnyddio meddalwedd dadansoddi BZ-X.

2.4|Imiwnocytocemeg

Cafodd celloedd ar slip gorchuddio eu meithrin gyda 200 µM pimonidazole HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) yn DMEM/F12 heb ffenol goch am 1 awr, ac ar ôl hynny cafodd y slip clawr ei droi a'i gysylltu â dysgl gwydr gorchudd, fel a ddisgrifiwyd yn flaenorol. Yna cafodd y celloedd eu meithrin yn DMEM/F12 heb ffenol goch am gyfnod penodol. Pan na ddefnyddiwyd gwrth-staenio pimonidazole, cafodd rhag-driniaeth â pimonidazole ei hepgor.

Ar ôl cwblhau'r cyfnod meithrin, casglwyd pob slip gorchuddio, a gosodwyd y celloedd ar unwaith â methanol / aseton (1: 1) ar rew, lle buont am 30 munud. Ar ôl golchi ddwywaith â halwynog byffer ffosffad (PBS) Dulbecco (D5652, Sigma Aldrich), cafodd y gellbilen ei threiddio am 30 munud, a'i deor â 5 y cant o albwmin serwm buchol (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) am 30 munud, ac wedi hynny gyda bloc protein di-serwm (X0909, DAKO) am 10 munud. Cafodd y celloedd eu staenio â gwrthgorff cyntaf ac yna ail wrthgorff fflwroleuol. Rhoddir rhestr o'r gwrthgyrff cyntaf yn Nhabl S1. Defnyddiwyd imiwnoglobwlin gwrth-gwningen polyclonaidd FITC-moch (F0205, gwanhau 1:20, DAKO) fel y gwrthgorff cyntaf os oedd y gwesteiwr yn gwningen. Defnyddiwyd y gwrthgorff fflwroleuol Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, gwanhau 1:500, Thermo Fisher Scientific) fel y gwrthgorff cyntaf os mai llygoden oedd y gwesteiwr, ac yna IgG gwrth-lygoden biotinylated (H plws L) (BA{{23}). }, gwanhau 1:1000, Labordai Vector), fel yr ail wrthgorff. Perfformiwyd staenio niwclear gan ddefnyddio bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (B2261, Sigma Aldrich) ar gyfer pob sampl.

Gwelwyd signalau fflwroleuol gan ddefnyddio microsgop fflwroleuol gwrthdro, BZ-X710 (Keyence Corporation) gyda'r hidlwyr canlynol: Texas Red gyda thonfedd cyffro (Ex) o 560/40 nm, tonfedd allyriadau (Em) o 630/75 nm, GFP ( Ex: 470/40 nm, Em: 525/50 nm), a DAPI (Ex: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Addaswyd delweddau ar gyfer disgleirdeb a chyferbyniad gan ddefnyddio meddalwedd dadansoddi BZ-X.

2.5|ICC o HIF o gelloedd HK-2 wedi'u trin â chlorid cobalt

Addaswyd y dull amgen i gynhyrchu model coverlip o gelloedd HK-2 wedi'u trin â chlorid cobalt. Cafodd celloedd HK-2 eu hadu ar ddwysedd hanner cydlifiad (2.5 × 105/dysg) ar slip gorchuddio ar Ddiwrnod 1 a'u trin â 300 µM cobalt clorid hexahydrate (C 8661, Sigma Aldrich) am 16 awr. Diwrnod 2. Ar Ddiwrnod 3, gwrthdröwyd y coverlip i atodi'r arwynebau celloedd i waelod dysgl gwydr 27 mm newydd am 3 h, a pherfformiwyd ICC o HIF.

2.6|Blotio gorllewinol

Ymchwilio i groniad HIF o dan wahanol densiynau ocsigen ac ar lefelau pH gwahanol, 1.0 × 106 HK-2 cell fesul dysgl feithrin 10 cm eu deor o dan normocsia, 2 y cant o ocsigen, 1 y cant o ocsigen, neu anocsia, am 5 h, neu yn DMEM/F12 ar pH 7.4, pH 6.0, neu pH 5.0 am 5 h.

Cafodd y celloedd hyn eu gosod mewn byffer RIPA yn cynnwys 50 mM Tris-buffer (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 w/v y cant o sodiwm deoxy- cholate, 0.1 w/v y cant SDS, ac 1.0 w/v y cant NP40.

Ar gyfer blotio gorllewinol, byffer sampl SDS sy'n cynnwys {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6.8), 10 y cant SDS, 36 y cant glyserol, 0.012 y cant bromophenol glas, a 0.1 M dithiothreitol (DTT) ei ychwanegu at y proteinau. Cafodd proteinau sy'n cynnwys byffer sampl SDS eu hanwybyddu trwy eu berwi ar 95 gradd am 5 munud.

Gwahanwyd y proteinau gan electrofforesis ar geliau polyacrylamid 10 y cant SDS. Yna trosglwyddwyd y proteinau i bilen AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) mewn byffer trosglwyddo (byffer Tris-base 48 mM, glycin 39 mM, 0.04 y cant SDS, a 20 v/v y cant methanol) gan ddefnyddio Trans-Blot® System Trosglwyddo TurboTM (Bio-Rad). Cafodd y pilenni eu deor ar dymheredd ystafell gyda gwrthgyrff cynradd, gwrth-gorff gwrth-HIF1 (DS100-134, gwanhau 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071), a gwrthgorff gwrth-actin (A2066 , gwanhau 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), ac wedi hynny yn y gwrthgorff eilaidd, imiwnoglobwlin gwrth-gwningen gafr polyclonaidd/HRP (P0448, gwanhau 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26) }}). Defnyddiwyd PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (32132, ThermoFisher Scientific) i'w ganfod. Gwelwyd cemegioleuedd gan ddefnyddio Dadansoddwr Luminoimage ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Cadarnhawyd atgynhyrchu trwy berfformio o leiaf dri arbrawf annibynnol. Mesurwyd dwyster y bandiau gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol (Schneider et al., 2012).

2.7|Assay gohebydd Luciferase

Perfformiwyd assay gohebydd luciferase i fesur cronni HIF1 mewn deor diwylliant hypocsig homogenaidd. Yn flaenorol, gwnaethom adeiladu genyn luciferase wedi'i dagio wedi'i yrru gan elfen sy'n ymateb i hypocsia (HRE) a datblygu'r Fector Gohebydd Ymatebol i Hypoxia (Transgene Construction). Adeiladwyd hwn o gopïau tandem o'r HRE o'r genyn ffactor twf endothelaidd fasgwlaidd llygod mawr wedi'i is-glocio i ranbarth 5' uned drawsgrifio am CMV-hyrwyddwr-luciferase (cyn-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al., 2004).

Paratowyd celloedd HK{{{0}} ar grynodiad o 1.0 × 105 y ffynnon mewn 12-blatiau meithrin ffynnon (150628, Thermo Fisher Scientific). Cafodd y celloedd eu cyd-drawsnewid â 500 ng o pGL3-Fectorau HRE-luciferase Sylfaenol a 30 ng o fectorau rheoli pRL-SV40 Renilla luciferase (Promega), gan ddefnyddio 2 µl FuGENE® HD Transfection Reagent (E2311, Promega) fesul yn dda. HK-2 celloedd wedi'u cyd-drawsgludo â 500 ng ofpGL3-Fectorau luciferase firefly sylfaenol a 30 ng ofpRL-SV40 fectorau rheoli Renilla luciferase (Promega) fel rheolydd negyddol.

Deorwyd y celloedd a drosglwyddwyd o dan normocsia, hypocsia 2 y cant, hypocsia 1 y cant, neu fag anocsia, am 5 awr. Yna cynaeafwyd y celloedd gan ddefnyddio 100 µl o glustogfa lysis protein goddefol, ar gyfer y assay luciferase deuol. Defnyddiwyd luminometer LB9507 (EG a Berthold) ar gyfer y mesuriadau. I gywiro ar gyfer effeithlonrwydd transfection, rhannwyd gwerth cymharol yr uned golau firefly luciferase â gwerth y Renilla luciferase.

cistanche for gol

2.8|Dadansoddiad o apoptosis

Gorchuddiwyd celloedd diwylliedig â slip gorchuddio am 0 mun, 15 munud, 30 munud, 1 h, 3 h, 6 h, a 24 h, ac yna eu casglu gan ddefnyddio trypsin. Paratowyd celloedd a gafodd eu trin â hydrogen perocsid 3 y cant (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) am 30 munud fel rheolaeth apoptotig. Perfformiwyd dadansoddiad meintiol o apoptosis gan ddefnyddio Muse Annexin V a Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) mewn Analyzer Cell Muse™ (Millipore), yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

2.9|PCR meintiol amser real (qRT-PCR)

Cyflawnwyd cyfanswm echdynnu RNA a synthesis cDNA yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr ar gyfer RNAiso Plus (9109, Takara) a PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) yn y drefn honno. Perfformiwyd PCR amser real gan ddefnyddio THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) yn System Canfod PCR Amser Real CFX Connect (Bio-Rad). Cafodd lefelau trawsgrifiad eu normaleiddio i lefel mynegiant mRNA -actin. Perfformiwyd qRT-PCR mewn triphlyg gan ddefnyddio paent preimio genyn-benodol. Mwyhawyd HIF-1 gan ddefnyddio preimwyr blaen, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ a chefn, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′. -tynnwyd actin gan ddefnyddio preimwyr blaen, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′, a gwrthdroi 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′.

2.10|Trawsnewid gyda siRNA

Er mwyn ymchwilio i HIF a achosir gan RNAi-1 wedi'i ddymchwel mewn celloedd HK-2, paratowyd 5.{4}} × 104 HK-2 celloedd fesul ffynnon mewn platiau chwe ffynnon. Defnyddiwyd dau fath o RNAi—HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] a siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) — gyda Lipofectamine RNAiMAX Adweithydd Trawsnewid (Thermo Fisher Scientific). Fel rheolydd negyddol, defnyddiwyd Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Cymysgwyd 1.5 µl pob siRNA a 5 µl RNAiMAX. siRNA- celloedd transfected eu deor o dan normocsig neu hypocsig (1 y cant O2) amodau ar gyfer 48 h a RNA ei dynnu. Archwiliwyd effeithlonrwydd dymchwel-HIF-1 gan ddefnyddio qRT-PCR.

2.11|Delweddu byw o effeithiau graddiant PH

Gwnaethom ddelweddu graddiant pH mewngellol celloedd byw o dan slip gorchuddio. Cafodd celloedd eu trin â Dangosydd pH mewngellol pHrodo Green AC (t35373, ThermoFisher Scientific) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, cyn gweithredu'r model slip cover. Defnyddiwyd microsgop fflworoleuedd gwrthdro, BZ-X710 (Keyence Corporation) gyda hidlydd GFP i arsylwi ar y trawsnewidiad amser o ran graddiant dwyster fflworoleuedd o dan slip gorchuddio.

2.12|Dadansoddiad meintiol o'r cylch HIF

2.12.1|Safle cylch HIF

Fe wnaethom fesur pellter y cylchoedd HIF a'r ardaloedd pimonidazole-positif o'r ymylon gorchuddion gan ddefnyddio ImageJ, fel a ganlyn. Penderfynwyd ar ardaloedd cylchoedd allanol a mewnol y cylch HIF a chylch pimonidazole-positif, a chyfrifwyd radiws pob cylch. Tynnwyd pob gwerth o 7.5 mm, sef radiws slip gorchuddio 15 mm, i gyfrifo ei bellter o ymyl slip gorchuddio. Perfformiwyd tri arbrawf annibynnol o ICC o HIF ym mhob cyflwr.

2.12.2|Diffiniad o'r cylch HIF

Fe ddefnyddion ni ddelweddau fflwroleuol a gafwyd o fodel coverlip a ddeorwyd o dan normocsia a pH niwtral. Fe wnaethom ddiffinio safle'r cylch HIF a'i thu allan a'i thu mewn fel graddfa 2.5–3.0 (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.0 graddfa (1.12– 1.35 mm), a graddfa 5.0–5.5 (2.24–2.47 mm) o ymyl slip clawr, yn y drefn honno, gan ddefnyddio ImageJ. Fe wnaethom fesur pum safle o signalau HIF fesul sampl a chyfrifo'r cyfartaledd. Perfformiwyd tri arbrawf annibynnol o ICC o HIF.

powdr echdynnu cistanche

2.13|Mesur pwysedd ocsigen yn ôl delwedd PLIM

2.13.1|Adeiladu llinell galibradu i fesur pwysedd ocsigen

Gwnaethpwyd cromlin raddnodi o gelloedd HK-2, yn seiliedig ar y dull a ddisgrifiwyd yn ein hadroddiad blaenorol (Yoshihara et al., 2015). Cafodd celloedd HK-2 wedi'u llwytho â 500 nM BTPDM1 am 30 munud eu meithrin mewn deorydd aml-nwy cyfnewidiadwy ocsigen-crynodiad wedi'i gyfarparu â microsgop fflwroleuol gwrthdro a oedd yn gysylltiedig â'r system mesur oes. Lluniwyd llinell galibradu yn seiliedig ar ddadansoddiadau Stern-Volmer gan ddefnyddio oes ffosfforescence (PL) celloedd HK-2 o dan sawl tensiwn ocsigen gwahanol gan ddefnyddio

hafaliad (1)

lle mae τp yn cynrychioli'r PL mewn pO2, mae τ0 yn cynrychioli'r PL mewn deocsigeniad, mae kq yn cynrychioli'r cysonyn cyfradd diffodd, ac mae pO2 yn cynrychioli gwasgedd rhannol ocsigen. Gan ddefnyddio'r llinell galibradu hon, gellid cyfrifo'r pwysedd ocsigen o'r PL.

2.13.2|Delwedd PLIM o fodel clawr slip

Paratowyd celloedd HK-2 wedi'u llwytho â 500 nM BTPDM1 am 30 munud. Cafodd model coverlip ei adeiladu a'i feithrin mewn deorydd aml-nwy y gellir ei newid crynodiad O2 gyda microsgop fflwroleuol gwrthdro, wedi'i gysylltu â'r system mesur oes.

Recordiwyd delweddau microsgopeg delweddu oes ffosfforoleuedd (PLIM) gan ddefnyddio micro-sgop fflworoleuedd gwrthdro gyda system sganio confocal (Hirakawa et al., 2018). Cafwyd delweddau PLIM ar ôl deori 30 munud mewn 21 y cant O2 neu 4 y cant O2. Cymerwyd pedair delwedd PLIM fesul sampl, o'r rhanbarthau uchaf, gwaelod, chwith a dde ger ymyl y slip clawr, i bennu'r PL cyfartalog, gan ystyried yr amrywiad mewn PLs mewn slip clawr.

2.13.3|Adnabod y cylch HIF mewn delwedd PLIM

Roedd Pimonidazole yn bositif o dan 10 mmHg o bwysedd ocsigen. Yr hyn sy'n cyfateb i PL o 10 mmHg o bwysedd ocsigen oedd 4034.6 ns, yn ôl y llinell raddnodi, felly gellid nodi llinell allanol y cylch pimonidazole yn y ddelwedd PLIM. Yn dilyn hynny, gellid dod o hyd i safleoedd y cylchoedd HIF allanol a mewnol yn y ddelwedd PLIM trwy ddefnyddio dadansoddiad meintiol pellter. Fe wnaethom fesur yr ystod o PLs cyfartalog sy'n cyfateb i'r cylch HIF mewn 21 y cant O2 a 4 y cant O2.

2.13.4|Mesur pwysedd ocsigen y cylch HIF

Fe wnaethom gyfrifo ystod pwysau ocsigen y cylch HIF o'r PLs, gan ddefnyddio'r llinell raddnodi. Dadansoddwyd delweddau PLIM gan ddefnyddio SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|Dadansoddiad ystadegol

Defnyddiwyd prawf Dunnett i gymharu grwpiau arbrofol a rheoli, ac ystyriwyd bod gwerthoedd < .05="" yn="" dynodi="" gwahaniaethau="" ystadegol="" arwyddocaol.="" defnyddiwyd="" profion="" t="" myfyrwyr="" i="" gymharu="" tri="" grŵp="" neu="" fwy,="" a="" defnyddiwyd="" gwerth-p="" addasedig="" bonferroni.="" perfformiwyd="" yr="" holl="" ddadansoddiadau="" ystadegol="" gan="" ddefnyddio="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" tybiwyd="" bod="" gwerthoedd="" yn="" deillio="" o="" boblogaeth="" sydd="" wedi'i="" dosbarthu'n="" normal,="" ac="" fe'u="" dangosir="" fel="" cymedrig="" ±="" gwyriad="" safonol="">

beth yw cistanche

3|CANLYNIADAU

3.1|Ffurfiant graddiant ocsigen yn y model hypoperfusion

Fe wnaethom gadarnhau bodolaeth graddiant ocsigen yn y model hypoperfusion a achosir gan osod gorchuddion slip trwy asesu tensiwn ocsigen yn uniongyrchol, gan ddefnyddio ffosfforeiddiad. Gall mesur dwyster ffosfforescence ragweld tueddiad bras mewn pwysedd ocsigen (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Gwelsom ddwysedd ffosfforescence model gorchuddiol o gelloedd HK-2 wedi'u trin â BTPDM1. Roedd delweddau o ddwysedd ffosfforescence yn dangos hypocsia yn y rhan fwyaf o'r ardal y tu mewn i'r slip gorchuddio, ond dim hypocsia ger yr ymyl, sylw a awgrymodd fodolaeth graddiant ocsigen o amgylch ymyl y slip gorchuddio mewn celloedd HK-2 wedi'u gorchuddio ag a slip clawr (Ffigur 1a). Gan fod dwyster ffosfforescrwydd yn dibynnu ar grynodiad y stiliwr, ac ar yr amser cyffro, mae mesuriad oes ffosfforescence (PL) yn ddefnyddiol ar gyfer dadansoddiad meintiol o bwysedd ocsigen (Yoshihara et al., 2015). Felly, ar gyfer mesur meintiol tensiwn ocsigen celloedd diwylliedig o amgylch ymyl slip gorchuddio, cawsom ddelweddau PLIM o gelloedd HK-2 wedi'u gorchuddio â slip gorchuddio am 30 munud (Ffigur 1b). Estynnodd PL wrth i'r pellter o ymyl y clawr gynyddu. Gwnaethom gadarnhau bod y tensiwn ocsigen, a gyfrifwyd gan ddefnyddio llinell galibradu (Ffigur S3), wedi lleihau wrth i'r pellter o ymyl y slip gorchuddio gynyddu, gan ddarparu tystiolaeth o fodolaeth graddiant ocsigen o amgylch ymyl y slip gorchuddio (Ffigur 1c). Dangosodd archwiliad o broffil amser dwyster y ffosfforescrwydd fod y graddiant ocsigen wedi dechrau ffurfio 10 munud ar ôl gosod slip clawr.

(Ffigur 1d).

3.2|Dosbarthiad unigryw HIF-1 yn y model hypoperfusion, "cylch HIF"

Archwiliwyd y dosbarthiad HIF-1 yn y model gorlifiad gyda graddiant ocsigen. Dangosodd ICC celloedd HIF-1 mewn celloedd HK-2 welliant siâp toesen ar ymyl yr ardal pimonidazole-positif, a alwyd gennym yn "gylch HIF" (Ffigur 2a). Roedd dwyster y signal HIF-1 yn sylweddol uwch ar y cylch HIF nag yn ei ardaloedd mewnol neu allanol (Ffigur 2b). Cadarnhawyd y ffenomen hon gan ddefnyddio ICC gyda gwrthgorff HIF-1 arall (Ffigur S4a) neu linellau celloedd tiwbaidd eraill (Ffigur S4b,c). Gwnaethom hefyd gynnal dadansoddiad ICC o HIF-1 mewn mathau eraill o gelloedd diwylliedig, megis celloedd canser ceg y groth HeLa. Er bod adlyniad gwan y celloedd hyn i orchuddion wedi gwneud gwerthusiad manwl o ddosbarthiad HIF-1 yn anodd, gwelsom welliant siâp toesen o HIF-1 mewn celloedd HeLa (Ffigur S4d).

Dechreuodd y cylch HIF a'r ardal pimonidazole-positif ffurfio sawl awr ar ôl lleoli gorchuddion, ac ymddangosodd y fodrwy HIF yn sefydlog erbyn 3 h (Ffigur 2c). Arweiniodd dymchweliad HIF-1 at ddiflaniad y signal HIF-1 , gan gynnwys y cylch HIF (Ffigur 2d, Ffigur S4e), sy'n nodi bod y cylch HIF yn dibynnu ar HIF-1 .

Er mwyn ymchwilio i'r posibilrwydd bod ffurfiant cylch HIF yn dibynnu ar ocsigen, fe wnaethom ymchwilio i ddosbarthiad HIF-1 yn y model cloriau o dan ddeor gyda gwahanol densiynau ocsigen. Fe wnaethom osod dysgl mewn siambrau hypocsig gyda gwahanol densiynau ocsigen yn syth ar ôl gwneud model coverlip. Yn ystod deori hypocsig, gwelsom ei bod yn ymddangos bod cylch HIF a'r ardal pimonidazole-positif yn ehangu tuag allan (Ffigur 3a). Fe wnaethom fesur pellter pob cylch HIF ac ardal pimonidazole-positif o ymyl gorchuddion o dan normocsia, 4 y cant O2, ac 1 y cant o ddeor O2. Ehangodd y cylch HIF a'r ardal pimonidazole-positif tuag allan wrth i'r tensiwn ocsigen o'i amgylch leihau (Ffigur 3b). Roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod y cylch HIF yn dibynnu ar HIF-1 a thensiwn ocsigen.

Er mwyn cadarnhau bod cronni siâp toesen yn ffenomen benodol o HIF, fe wnaethom berfformio ICC gyda genynnau cadw tŷ yn y model coverlip. Roedd y signalau GAPDH ac actin yn cael eu cynnal dros holl arwynebedd slip gorchuddio ac roedd modd eu cymharu rhwng rhanbarth y cylch HIF a'r rhanbarthau eraill (Ffigur S5a,b).

3.3|Mesur amrediad pwysedd ocsigen y cylch HIF

Gwnaethom gadarnhau'r gwelliant siâp cylch o groniad HIF-1 mewn celloedd diwylliedig wedi'u gorchuddio â slip gorchuddio, ffenomen sy'n dibynnu ar densiwn ocsigen. Er mwyn pennu ystod y tensiwn ocsigen dan sylw, dadansoddwyd gwasgedd ocsigen y cylch HIF gan ddefnyddio techneg oes ffosfforescence. Cawsom ddelweddau PLIM o'r model coverlip ar ôl deori 30 munud yn 21 y cant O2 neu 4 y cant O2 (Ffigur 4a). Ffurfiwyd y cylch HIF ar ymyl y cylch pimonidazole yn ICC HIF (Ffigur 3b). Gwnaethom nodi'r safle yn y ddelwedd PLIM a oedd yn cyfateb i'r ardal pimonidazole-positif yn ICC HIF ac wedi hynny nodwyd y safle sy'n cyfateb i'r cylch HIF (Ffigur 4b), gan ddefnyddio dadansoddiad meintiol o'r data pellter o'r cylch HIF a'r ardal pimonidazole-positif (Ffigur 3b). Fe wnaethom hefyd fesur ystod PLs y cylch HIF ac yna defnyddio llinell galibradu (Ffigur S3) i gyfrifo pwysedd ocsigen y cylch HIF yn 21 y cant O2 (4.20 [3.46-4.97] ~35.9 [28.5-44.9] mmHg) , a 4 y cant O2 (2.19 [0.21–4.32] ~20.4 [17.1–24.1] mmHg) (Ffigur 4c).

3.4|HIF-1 croniad o dan densiwn ocsigen homogenaidd

Er y gellir priodoli signalau gwan o HIF-1 y tu allan i'r cylch HIF mewn model slip clawr i hypocsia annigonol, rhaid i'r rhai y tu mewn i'r cylch, lle dylai HIF-1 fod wedi'i ysgogi'n gryfach gan y tensiwn ocsigen is, cael ei reoli gan ffenomen ocsigen-annibynnol. I archwilio'r ffenomenau sy'n achosi diffyg cronni uchaf o HIF-1 yn yr ardal anocsig sy'n digwydd yn y model gorlifiad yn unig, archwiliwyd a oedd perthynas wrthdro rhwng tensiwn ocsigen a chroniad HIF o dan ddeoriad. gyda tensiwn ocsigen homogenaidd. Dangosodd dadansoddiad o lysadau celloedd gorllewinol o dan wahanol densiynau ocsigen homogenaidd gynnydd mewn croniad HIF-1 yn ystod cyfnod magu anocsig (Ffigur 5a). Nododd asesiad gohebydd HRE-luciferase hefyd fod croniad HIF-1 wedi cynyddu gyda thensiwn ocsigen is o dan amodau tensiwn ocsigen homogenaidd (Ffigur 5b). Roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod cronni HIF-1 yn dibynnu ar densiwn ocsigen, gyda'r croniad mwyaf a welwyd yn yr ystod anocsig. Dylai nodweddion HIF-1 amrywio rhwng model hypoperfusion a model â thyndra ocsigen homogenaidd. Fe wnaethom ddyfalu y gallai ffenomen unigryw cronni HIF{-1 yn y model hypoperfusion hwn gael ei bennu gan ffactor heblaw tensiwn ocsigen.

3.5|Roedd ffurfio modrwyau HIF yn annibynnol ar PhD

Archwiliwyd a oedd diraddio HIF, mecanwaith posibl o ffurfio cylch HIF, wedi'i ddadreoleiddio y tu mewn i'r cylch HIF. Roedd y syniad hwn yn ymddangos yn annilys, oherwydd mae hydroxylation gan Ph.D., proses sy'n cyfyngu ar gyfraddau o ddiraddio HIF, yn gofyn am ocsigen fel swbstrad. Defnyddir clorid cobalt yn eang fel sefydlogwr HIF cemegol. Fe wnaethom adeiladu model coverlip o gelloedd HK-2 wedi'u trin â chlorid cobalt a chynnal dadansoddiad ICC o HIF. Ni wnaeth y signal HIF-1 gynyddu y tu mewn i'r cylch HIF, a ddaeth yn aneglur oherwydd y cynnydd yn y signal HIF-1 y tu allan i'r cylch (Ffigur 6c). Cynhyrchodd ICC celloedd HK-2 gyda dymchwel PHD2, y credir ei fod yn brif HIF hydroxylase prolyl mewn arbrofion meithrin celloedd (Strowitzki et al., 2019), ganlyniadau tebyg (Ffigur S6). Dangosodd y canlyniadau hyn nad oedd echel PHD-VHL diraddio HIF yn gysylltiedig â ffurfio cylch HIF.

3.6|Effaith pH ar groniad HIF-1

Disgrifiodd adroddiad blaenorol y defnydd o fodel gorchuddiol o myocytes cardiaidd a oedd â gostyngiad mewn pH y tu mewn i'r clawr (Pitts & Toombs, 2004). Gwnaethom ymchwilio i'r pH o dan slip gorchuddio a'i effaith ar ffurfiant cylch HIF. Fe wnaethom drin celloedd HK-2 gyda dangosydd pH mewngellol, y mae ei ddwysedd fflworoleuedd yn caniatáu gwerthuso pH yn y celloedd. Dangosodd delweddu byw fod y pH wedi gostwng dros y rhan fwyaf o'r arwynebedd mewnol, ond nid yn agos at ymyl y slip gorchuddio, sy'n awgrymu bodolaeth graddiant pH o amgylch yr ymyl yn y model slip gorchuddio (Ffigur 6a). Dangosodd dadansoddiad meintiol o'r gydberthynas rhwng dwyster fflworoleuedd a phellter o ymyl slip gorchuddio fod y cyntaf yn uwch wrth i'r pellter gynyddu, sylw a oedd yn cefnogi bodolaeth graddiannau pH ac ocsigen o amgylch ymyl y slip gorchuddio (Ffigur 6b). Canfu dadansoddiad blot gorllewinol o lysates celloedd o dan grynodiadau ocsigen homogenaidd fod deor gyda pH 5.0 canolig wedi atal HIF-1 ac yn cronni o dan amodau hypocsig (Ffigur S7a-d). Cadarnhawyd gennym hefyd fod croniad HIF o dan hypocsia o dan amodau pH gwahanol wedi gostwng o dan pH 6.0 (Ffigur S8a–c).

Pwysleisiodd un adroddiad bwysigrwydd cyflyrau ychydig yn asidig, ar lefel pH tua 6.0. Yn ôl yr astudiaeth hon, roedd ail-ocsigeniad ar ôl hypocsia yn asideiddio'r cyfryngau, a achosodd atafaeliad niwcleol o VHL. Yn ei dro, ataliwyd diraddio HIF mewn myotiwbiau C2C12, niwronau PC12, a 786-0 celloedd canser arennol (Mekhail et al., 2004). Yn ein hastudiaeth, ni fu unrhyw newid yn nosbarthiad VHL mewn celloedd tiwbaidd rhwng y rhanbarthau â chroniad HIF-1 a’r rhai y cafodd ei atal, mewn model slip clawr gyda gwerthoedd pH o 5.0 i 7.4 (Ffigur S9a–c). Mae celloedd tiwbaidd yn agored i ystod eang o gyflyrau pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), felly fe wnaethom ymchwilio i amrywiad y cylch HIF mewn cyfryngau o wahanol pH gwerthoedd rhwng 5.0 a 8.5. Gwelwyd y cylch HIF yn glir mewn cyfryngau gyda pH 8.5 a 7.4 (Ffigur 6c). Roedd y cylch HIF hefyd yn bodoli ar pH 6.5 ond roedd wedi'i guddio (Ffigur 6c). Gwanhawyd y signal HIF-1 yn holl arwynebedd slip gorchuddio ar pH 5.0. (Ffigur 6c). Gwnaethom ddadansoddiad meintiol pellach o'r berthynas leoliadol rhwng y cylch HIF ac ymyl yr ardal pimonidazole-positif (Ffigur 7a) a darganfod bod lleoliad y cylch yn amrywio yn dibynnu ar y pH. Roedd y cylch mewnol yn tueddu i ehangu tuag allan ar pH 6.5, o'i gymharu â pH 7.4, tra bod y cylch allanol yn crebachu'n sylweddol i mewn ar pH 8.5, yn seiliedig ar ymyl yr ardal pimonidazole-positif (Ffigur 7b,c). Cadarnhawyd gennym hefyd fod gweithgareddau genynnau cadw tŷ yn cael eu cynnal mewn model clawr slip o dan ddeor asidig (Ffigur S10). Felly, mae'n ymddangos bod pH yn chwarae rhan bwysig yn y mecanwaith sy'n sail i ffurfio cylch HIF.

4|TRAFODAETH

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom nodi dosbarthiad unigryw o HIF-1 mewn celloedd tiwbaidd arennol, gan ddefnyddio model o orlifiad a achosir gan osod gorchuddion slip. Canfuom fod ffurfio a chynnal y cylch HIF yn cael ei reoli gan bwysau ocsigen a pH, a bod y ddau yn bodoli mewn graddiant yn ymyl gorchuddion model slip clawr. Yn seiliedig ar y canlyniadau hyn, rydym yn cynnig mecanwaith posibl ar gyfer ffurfio cylch HIF, sy'n cynnwys HIF-1 yn cronni gyda thensiwn ocsigen yn lleihau, a'r croniad yn cael ei atal oherwydd pH isel o fewn pellter penodol o ymyl slip gorchuddio (Ffigur 8 ).

Mae gorlifiad yn cael ei achosi gan wynebiad prin o ficro-fasgwlaidd yn CKD (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Yn ein gwaith blaenorol, fe wnaethom ddefnyddio delweddu in vivo i ddangos presenoldeb graddiant ocsigen mewn celloedd tiwbaidd arennol arennau llygoden arferol (Hirakawa et al., 2018). Disgwylir hefyd i densiwn ocsigen fod yn heterogenaidd mewn celloedd tiwbaidd yn CKD. Fodd bynnag, mae'n parhau i fod yn aneglur a yw bodolaeth hypoperfusion â graddiant ocsigen yn effeithio ar y system amddiffyn rhag hypocsia, HIF. Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom ymchwilio i ddosbarthiad HIF mewn celloedd tiwbyn procsimol diwylliedig o dan fodel gorlifiad a darganfod bod graddiant ocsigen mewn celloedd tiwbaidd arennol diwylliedig wedi'i fodelu'n llwyddiannus gan ddefnyddio slip gorchuddio gwydr crwn. Roedd tystiolaeth o arbrofion yn defnyddio tensiwn ocsigen homogenaidd yn dangos bod HIF-1 , y mae ei hydroxylation a'i ddiraddiad dilynol yn dibynnu ar ocsigen yn bennaf, wedi cronni. Hynny yw, mae swm yr HIF-1 yn cynyddu wrth i'r tensiwn ocsigen leihau. Yn ein model slip slip, fodd bynnag, cafodd HIF-1 ei atal yn yr ardal anocsig ac roedd ganddo'r croniad uchaf o bellter penodol o ymyl slip gorchuddio. Nid yw'r croniad HIF siâp toesen hwn erioed wedi'i ddangos o'r blaen. Fe wnaethom ddangos y gellid arsylwi symudiad cylch HIF waeth beth oedd tensiwn ocsigen yr atmosffer deor, ond roedd ei leoliad yn dibynnu ar y tensiwn ocsigen. Mesurwyd amrediad y tensiwn ocsigen ar y cylch HIF tua 4-20 mmHg gan ddefnyddio PLIM gyda BTPDM1. Canfu’r rhan fwyaf o astudiaethau blaenorol, a oedd yn canolbwyntio ar gelloedd diwylliedig mewn atmosffer â thensiwn ocsigen homogenaidd, fod maint y protein HIF-1 wedi cynyddu yn yr ystodau hypocsig neu anocsig (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Felly, yn ein model, mae'n rhaid bod ffactor heblaw'r tensiwn ocsigen wedi effeithio ar ffurfio cylch HIF; roedd yn annibynnol ar Ph.D., proses sy'n cyfyngu ar gyfraddau o ddiraddio HIF. Datblygiad arloesol wrth egluro mecanwaith ffurfio cylch HIF oedd ein darganfyddiad o rôl y graddiant pH, yn ogystal â'r graddiant ocsigen, yn y model gorchuddion gwefusau, a oedd yn cyfyngu ar fewnlif y cyfryngau tebyg i hypoperfusion in vivo. model. Yn y model hypoperfusion hwn, gostyngodd y pH mewngellol wrth i'r pellter o ymyl y llithriad gorchudd gynyddu, a gwelwyd graddiant pH o amgylch ymyl y slip gorchuddio. Fe wnaethom ddangos bod croniad HIF-1 wedi'i atal ar pH isel, tua pH 5.0, o'i gymharu â deori tua pH niwtral o dan densiwn ocsigen homogenaidd. Ehangodd ymyl allanol y cylch HIF tuag allan ar pH 6.5, a giliodd ymyl fewnol y cylch HIF i mewn ar pH 8.5, yn seiliedig ar ymyl yr ardal pimonidazole-positif. Cafodd y cylch HIF ei guddio o dan amodau asidig, a diflannodd y signal HIF ar pH 5.0. Felly, gwnaethom egluro pwysigrwydd pH ar gyfer ffurfio cylch HIF mewn model slip clawr. Fe wnaethom ddangos y posibilrwydd bod y cylch HIF wedi'i ffurfio trwy atal cronni HIF gan pH isel y tu mewn i'r cylch.

Mae sawl astudiaeth flaenorol sy'n defnyddio'r dull slip clawr wedi defnyddio celloedd canser. Yn ôl un adroddiad sy'n defnyddio'r llinell gell hepatoma dynol Hep3B, sy'n mynegi'r newidiad ocsigen-ddibynnol o brotein fflwroleuol gwyrdd (AcGFP1), dangosodd delweddu byw o gelloedd wedi'u gorchuddio â gorchuddion hirsgwar redshift wrth i'r pellter o ymyl slip gorchuddio gynyddu (Takahashi & Sato, 2010). Symudodd sbectrwm allyriadau celloedd hepatoma o donfedd fflworoleuedd protein fflwroleuol gwyrdd (GFP) i goch wrth i'r tensiwn ocsigen leihau. Mewn astudiaeth arall, mesurwyd tyndra ocsigen celloedd SCC â gorchuddion 15- mm crwn gan ddefnyddio techneg oes ffosfforoleuedd. Y tensiwn ocsigen oedd 6.9 mmHg a 166 mmHg, wedi'i gyfrifo o PL, sef 3.89 µs a 893 µs, 0–2 mm y tu mewn, a 0–1 mm y tu allan i ymyl y slip gorchuddio, yn y drefn honno (Yoshihara et al., 2015). Mae'r dull coverlip hefyd wedi cael ei ddefnyddio gyda myocytes cardiaidd, system sydd wedi denu sylw fel model addawol in vivo isgemia-atlifiad. Dangosodd Kelly et al fod myocytes wedi'u gorchuddio â slip gorchuddio wedi mynd trwy newidiadau morffolegol amlwg dros amser, ynghyd â newidiadau i botensial pilen mitocondriaidd a dynameg pilen plasma, gan arwain yn y pen draw at farwolaeth myocyte. Roeddent hefyd yn dangos bod pH mewngellol myocytes sydd wedi'u gorchuddio â slip gorchuddio yn gostwng yn gyflym i tua pH 4 yng nghanol clawr (Pitts & Toombs, 2004). Gall model gorchudd-slip, sy'n atal trylediad ocsigen neu faetholion i gelloedd diwylliedig o dan slip gorchuddio, ddynwared model in vivo o barthau isgemia, normal ac ymylol yn y canol, y tu allan, ac ymyl slip gorchuddio yn y drefn honno. Mae sawl astudiaeth wedi defnyddio'r model hwn fel model isgemia-atlifiad o myocytes in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Hyd eithaf ein gwybodaeth, ein hastudiaeth ni yw'r gyntaf i gymhwyso dull slip gorchuddio i gelloedd tiwbaidd. Yn ein system, roedd y pellter o ymyl slip clawr i ranbarth sy'n cyfateb i 10 mmHg o densiwn ocsigen, lle dylai pimonidazole droi'n bositif, yn 1.22 mm, a gostyngodd tensiwn ocsigen i mor isel â sero o fewn pellter o 2 mm o ymyl y slip slip . Gall y canlyniad hwn fod yn gydnaws ag adroddiadau blaenorol sy'n defnyddio tua 15 mm coverlip, gan ddangos bodolaeth graddiant ocsigen o leiaf o fewn 2 mm i'r ymyl (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Fe wnaethom archwilio cyfradd apoptosis celloedd o dan orchuddion (Ffigur S11) a darganfod bod GAPDH ac actin yn cael eu cynnal hyd yn oed y tu mewn i'r cylch HIF, gan nodi nad oedd y cylch HIF yn cael ei achosi gan apoptosis celloedd neu farwolaeth y tu mewn i'r cylch HIF yn unig.

Mae sawl astudiaeth wedi mesur y tensiwn ocsigen yn yr arennau gan ddefnyddio gwahanol ddulliau. Dyma rai enghreifftiau o fesur tensiwn ocsigen yr arennau arferol: 50 mmHg a 30 mmHg yn y cortecs a'r medwla gan ddefnyddio microelectrodau; a 49 mmHg a 41 mmHg yn y segmentau S1 a S2 o gelloedd tiwbaidd y cortecs gan ddefnyddio PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Byddai tensiwn ocsigen arennau sâl yn is. Yn ôl adroddiad blaenorol gan ddefnyddio microelectrodau ocsigen, roedd gan lygod mawr diabetig densiwn ocsigen parenchymal arennol is: 36 mmHg ac 11 mmHg yn y cortecs a medulla yn y drefn honno (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Gan fod microelectrodau ocsigen yn mesur y tensiwn ocsigen parenchymal cyfartalog, disgwylir ystod ehangach mewn arennau sâl. Gostyngodd y tensiwn ocsigen mewngellol i sero mmHg mewn model o aren isgemig y cafodd ei rhydweli arennol ochrol a'i gwythïen eu clampio (Hirakawa et al., 2015). O ystyried y canfyddiadau hyn, roedd yn ymddangos bod ystod y tensiwn ocsigen ar y cylch HIF, tua 4-20 mmHg, yn gredadwy in vivo.

Fe wnaethom ddarganfod ymhellach fod pH yn effeithio ar ffurfiant cylch HIF yn ogystal â thensiwn ocsigen. Gan fod celloedd epithelial tiwbaidd yn yr aren yn agored yn barhaus i hylif wrinol, dylai pH celloedd tiwbaidd gael ei effeithio gan wrin. O ystyried yr ystod eang o pH mewn wrin, penderfynom astudio celloedd sydd wedi'u deor ar ystod pH o 5.0–8.5. Bu astudiaethau i'r ystod pH mewn arennau arferol. Canfu un astudiaeth mai pH y cortecs oedd 7.39 ± 0.{{10}}8, a bod y medwla yn 7.20 ± {{2{{39} }}}.09, fel y'i mesurwyd gan ddefnyddio microelectrodau (Burke et al., 1999). Dangosodd astudiaeth arall, gan ddefnyddio delweddu pH yn seiliedig ar MRI, werthoedd pH o 7.3 ± 0.13 a 7.0 ± 0.29 yn y drefn honno (Raghunand et al., 2003). Adroddwyd bod pH arennol wedi gostwng o 6.5 i 6.32, ac i mor isel â 5.83 mewn achos difrifol, mewn model llygoden o CKD ag asidosis (Pavuluri et al., 2019). Mae'r arsylwadau hyn wedi darparu tystiolaeth o ostyngiad mewn pH ac amrywiad mewn CKD. Fodd bynnag, nid yw effaith pH ar HIF-1 a achosir gan hypocsia cronig mewn CKD wedi cael ei harchwilio'n ddigon da. Yn yr astudiaeth bresennol, gwelwyd symudiad yn y cylch HIF rhwng pH 6.5 a pH 7.4, ystod pH sy'n gredadwy yn CKD. Roedd y canlyniad hwn yn cefnogi'r ddamcaniaeth bod gostyngiad bach mewn pH yn effeithio ar groniad HIF-1 mewn CKD. Yn seiliedig ar y dystiolaeth o ostyngiad mewn pH o dan 6.0 mewn achosion difrifol o CKD, mae hefyd angen asesu cyflwr ffisiolegol HIF ar pH is. Er y bu adroddiadau bod amgylchedd asidig, hyd yn oed mewn normocsia, yn sefydlogi HIF-1 , ymchwiliodd y rhan fwyaf o'r adroddiadau hyn i amodau asidedd ysgafn, dros pH 6.0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . Yn y gwaith hwn, fe wnaethom ddangos ataliad o groniad HIF{-1 mewn celloedd tiwbaidd ar pH 5.0, a gwanhau signalau HIF-1 mewn model slip gorchuddio wedi’i ddeor ar pH 5.0. Felly, gallai gostyngiad mewn pH arennol mewn CKD in vivo gael ei gydberthyn ag actifadu HIF annigonol, yn ogystal â thocsinau uremig yn yr aren hypocsig, gan waethygu dilyniant CKD (Tanaka et al., 2013).

Mae gan ein hastudiaeth nifer o gyfyngiadau. Yn gyntaf, ym maes hypoperfusion, dylai'r cyfryngau diwylliant fod yn ddiffygiol mewn maetholion, yn ogystal â phresenoldeb diffyg ocsigen a gostwng pH. Fodd bynnag, mae'n anodd amlinellu effeithiau pH, tensiwn ocsigen, a ffactorau eraill a achosir gan orlifiad. Yn y corff, mae isgemia, hypoperfusion patholegol y gwaed a achosir gan gyfuniad o ocsigen isel a maetholion isel, yn digwydd mewn organau a chelloedd. Mae'n bwysig deall y gwahaniaethau rhwng synhwyro hypocsia a synhwyro isgemia. Er gwaethaf yr anhawster i egluro effaith fiolegol pob ffactor, mae ein model hypoperfusion yn ffisiolegol gredadwy, gan ddynwared y statws patholegol in vivo. Yn ail, mae gwneud model slip gorchuddio yn gofyn am sgil ac ymarfer, gan fod y rhan fwyaf o gelloedd yn dod yn ddatgysylltiedig yn achlysurol wrth dynnu slip gorchuddio, yn enwedig wrth ddefnyddio'r dull traddodiadol (Ffigur S2a). Roedd y mater hwn yn dibynnu ar y llinell gell a ddefnyddiwyd. Er enghraifft, roedd yn anodd i ni gymhwyso model slip clawr i gelloedd HEK 293 oherwydd bod eu hymlyniad i slip clawr yn gymharol wan. Yn drydydd, roedd yn ddymunol lleihau'r difrod i gelloedd diwylliedig o dan slip gorchuddio. Cynyddodd nifer y celloedd a ddifrodwyd wrth i'r cyfnod y cawsant eu gorchuddio gynyddu, fel y dangosir gan y dadansoddiad o apoptosis. Fe wnaethom benderfynu bod 3 h yn briodol ar gyfer amcangyfrif y cylch HIF pan oedd yn ymddangos yn statig, a daeth tua cyn lleied â 10 y cant o gelloedd yn apoptotig (Ffigur S11). Y pedwerydd cyfyngiad oedd yr anhawster o gysylltu celloedd wedi'u meithrin â slip gorchuddio mewn ffordd unffurf ym mhob sampl (Ffigur S2b,c). Gallai'r gwahaniaeth mewn ymlyniad rhwng dull traddodiadol a dull amgen o wneud model gorchuddion gwefus hefyd fod wedi effeithio ar yr astudiaeth. Fe wnaethon ni fesur yr ystod o densiwn ocsigen sy'n cyfateb i'r cylch HIF trwy dechneg oes ffosfforescence, lle gwnaethom greu model clawr slip gan ddefnyddio dull traddodiadol. Gan fod y cylch HIF yn ystod imiwnocytemeg wedi'i ddelweddu gan ddefnyddio dull amgen, gallai'r gwir densiwn ocsigen fod yn wahanol. Gwnaethom leihau'r gwallau hyn trwy ddefnyddio'r dystiolaeth bod pimonidazole yn bositif ar 10 mmHg neu lai o'r tensiwn ocsigen. Y pumed cyfyngiad yw nad yw pH mewngellol o reidrwydd yr un peth â pH y cyfrwng meithrin. Mae sawl adroddiad yn y gorffennol wedi dangos bod pH mewngellol yn gyson â pH canolig i raddau mewn celloedd diwylliedig (Mihl et al., 2019), dim ond y duedd mewn pH mewngellol y gallem ei asesu trwy newid y pH canolig. In vivo, mae'r berthynas rhwng pH rhanbarthau mewngellol ac allgellog, fel wrin neu hylif corff, yn fwy cymhleth nag mewn celloedd diwylliedig. Felly, bydd angen astudiaethau pellach ar y ffordd y mae shifft pH yn rheoli cronni protein mewn vivo HIF-1 ar gyfer y dyfodol.

Cistanche budd: gwella arenswyddogaeth

Cyfyngiad arall yw y dylai pH gael effaith ar y marciwr hypocsia, pimonidazole. Fe wnaethom gymharu pellter ymyl yr ardal pimonidazole-positif o ganol slip gorchuddio o dan wahanol amodau pH yn ein model slip clawr. Roedd ymyl yr ardal pimonidazole-positif yn debyg rhwng pH 6.5, 7.4, ac 8.5 (Ffigur S12a, b). Roedd astudiaeth flaenorol hefyd yn dangos cynnal rhwymiad pimonidazole ar werthoedd pH gwahanol (Kleiter et al., 2006). Yn seiliedig ar y dystiolaeth hon, daethom i'r casgliad bod pimonidazole yn farciwr hypocsia priodol ar gyfer ein harbrofion gorchuddion slip. Y cyfyngiad terfynol yw, o ystyried ystod o densiwn ocsigen rhwng tua 4 mmHg ac 20 mmHg (0.52 y cant O2 i 2.6 y cant O2) o'r cylch HIF, Pt(II)- a Pd(II)-porffyrinau, a ddefnyddir yn eang fel biolegol mae gan stilwyr ocsigen fanteision ar gyfer mesur crynodiadau ocsigen isel iawn oherwydd eu hoes ffosfforoleuedd sylweddol hirach o gymharu â’r rhai sy’n defnyddio cyfadeiladau Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Fodd bynnag, yn gyffredinol, mae gan fesuriad ocsigen meintiol yn seiliedig ar ffosfforoleuedd, a gyfrifwyd gan ddefnyddio hafaliad Stern-Volmer, berfformiad gwell ar ystodau O2 isel (Papkovsky a Zhdanov, 2016). Mae sawl astudiaeth flaenorol wedi dangos bod mesuriadau tensiynau ocsigen yn seiliedig ar gymhleth Ir(III) mor isel ag oddeutu 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Felly, credwn y dylai ystod tensiwn ocsigen y cylch HIF fod yn ganlyniad manwl gywir.

5|CASGLIADAU

I grynhoi, canfuom fod deall rolau ocsigen a pH yn hanfodol ar gyfer deall cyflwr ffisiolegol HIF mewn CKD, a gellir ei ennill trwy ymchwilio i gelloedd tiwbaidd â gorlifiad. Roedd y model coverlip, gyda’i gyfyngiadau ar fewnlif y cyfryngau, yn fodel da o hypoperfusion in vivo, yn enwedig yn y tiwbiau yn CKD, gan fod ffurf brin y capilarïau peritubwl yn un o brif nodweddion CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Gall y model hypoperfusion hwn hefyd ddynwared y graddiannau ocsigen a pH mewn vivo, megis tiwmorau a briwiau isgemig. Mae'r model yn darparu agwedd addawol tuag at egluro'r mecanweithiau biolegol hyn.

GWRTHDARO DIDDORDEB

Nid oes gan bob awdur unrhyw wrthdaro buddiannau i'w ddatgan.

CYFRANIADAU AWDURON

Cyfrannodd yr holl awduron at ffurfio'r cysyniad cyffredinol. Perfformiodd TH yr arbrofion cyffredinol. Dadansoddodd TH ac YH y canlyniadau a gwneud y ffigurau. Ysgrifennodd TH y llawysgrif wreiddiol. Perfformiodd KM, TY, a ST yr arbrawf gan ddefnyddio techneg oes ffosfforescence a golygodd y rhan o'r llawysgrif. YH, TT, a MN a olygodd y llawysgrif gyffredinol. Mae'r holl awduron wedi darllen a chymeradwyo'r llawysgrif derfynol.

CYFEIRIAD

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir(iii) delweddu ocsigen yn seiliedig ar gymhleth o gelloedd byw a ffwndws llygadol gyda chamera ICCD â gatiau. Gwyddorau Ffotocemegol a Ffotobiolegol, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, therapi trosi a chynnal a chadw ar gyfer anemia mewn cleifion haemodialysis: Hap-brawf cam 2b a reolir gan blasebo ac yna treial hirdymor. Neffron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, & Harris, AL (2002). Rheoleiddio elfen VL30 llygod mawr mewn celloedd canser y fron dynol mewn hypocsia ac anocsia: Rôl HIF-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173-1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016). Mae actifadu derbynnydd hydrocarbon aryl yn cyfryngu atal mynegiant erythropoietin ffactor-ddibynadwy hypocsia gan sylffad indoxyl. American Journal of Phisiology. Ffisioleg Cell, 310(2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Ffactorau sy'n cynnal graddiant pH o fewn yr aren: rôl y bensaernïaeth fasgwlaidd. Kidney International, 56(5), 1826-1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). Rôl y ffactor trawsgrifio alffa HIF mewn mwy o gellraniad ar densiynau ocsigen ffisiolegol. PLoS Un, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019 ).

Roxadustat ar gyfer anemia mewn cleifion â chlefyd yr arennau nad ydynt yn cael dialysis. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., Ef, C., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Astudiaethau Cam 2 o atalydd prolyl hydroxylase ffactor hypocsia-anwythol FG-4592 ar gyfer trin anemia yn Tsieina. Neffroleg, Dialysis, Trawsblannu, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Mae sylffad indoxyl, tocsin uremig cynrychioliadol, yn atal cynhyrchu erythropoietin mewn modd sy'n ddibynnol ar HIF. Ymchwiliad Labordy, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., & Moon, IS(2015). Mae hydoddiant glwcos-inswlin-potasiwm yn amddiffyn myocytes fentriglaidd llygod mawr newydd-anedig mewn model isgemia / atlifiad gorchuddio'r slip in vitro. Korean Circulation Journal , 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D., & Macdougall, IC (2017). Opsiynau newydd ar gyfer anemia clefyd cronig yn yr arennau. Atchwanegiad Rhyngwladol yr Arennau, 7(3), 157–163. cusan.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson,S. et al (2010). Amddiffyniad arennol mewn clefyd cronig yn yr arennau: actifadu ffactor anwythol hypocsia yn erbyn rhwystr angiotensin II. American Journal of Phisiology. Ffisioleg Arennol, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Mae asidosis yn gweithredu trwy HSP90 mewn modd Ph.D./VHL- annibynnol i hyrwyddo swyddogaeth HIF a chynnal bôn-gelloedd mewn glioma. Ymchwil Canser, 76(19), 5845–5856. GALLU-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Methiant arennol acíwt-ar-cronig yn y llygoden fawr: iawndal swyddogaethol a goddefgarwch hypocsia. American Journal of Nephrology , 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Pam mae diabetes mellitus yn ffactor risg ar gyfer neffropathi a achosir gan gyferbyniad? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Mae delweddu oes ffosfforescence intravital o'r cortecs arennol yn mesur hypocsia arennol yn gywir. Kidney International, 93(6), 1483-1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Hypocsia arennol mewn CKD; Pathoffisioleg a dulliau canfod. Ffiniau mewn Ffisioleg, 8, 99.