Mae Homozygous Dab1 3// yn Achos Newydd Posibl o Anomaleddau Cynhenid Awtosomal o'r Mice Aren a'r Llwybr Wrinol
Feb 28, 2022
Cyflwyniad
Yotari mwtant llygod, a gafwyd drwy gaffael mwtaniad yn ddigymell yn y genyn Dab1, arddangos annormaleddau histolegol yn y system nerfol ganolog [1,2], yn debyg iawn i rai'r ail-wneud (reelin//) llygod, sy'n awgrymu bod ail-roi a DAB1 yn perthyn i'r un llwybr signalau [1–4]. Adroddwyd bod yr achosion o'r llwybr reelin/DAB1 yn gysylltiedig ag anhwylderau seiciatrig amrywiol [5–7]. Yn ddiddorol, ar wahân i'r system nerfol ganolog, mae presenoldeb DAB1 a phroteinau ail-roi'r gorau iddi hefyd wedi'i chadarnhau yn y system nerfol ymylol a rhai meinweoedd eithafol. Mae presenoldeb DAB1 wedi'i ganfod mewn podocytau llygoden [8] a'r ffetws dynolArennau[9] er bod mynegiant wedi'i adrodd yn ystod datblygiad y llygoden a'r ffetws dynol, yn ogystal ag mewn rhai celloedd endootheliol ar hyd pibellau gwaed yn y llygoden oedolion [9–11]. Gall y llwybr ail-roi canonaidd/DAB1 sbarduno proteinau gwahanol i lawr yr afon, gan gynnwys derbynyddion NOTCH2, sy'n chwarae rolau hanfodol mewn penderfyniadau tynged celloedd a gwahaniaethu yn ystodarendatblygiad [12–14]. Mae'n ofynnol i dderbynyddion NOTCH2 ffurfio tiwbiau procsi a photocytau [13], ond unwaith y cyflawnir aeddfediad neffron, mae'r llwybr hwn yn cael ei dawelu'n bennaf [15]. Mewn amodau acíwtclefydau'r arennau,gall mwy o fynegiant o NOTCH2 gyfrannu at adfywio, tra bod mynegiant parhaus yn gysylltiedig â ffibrosis rhyng-sefydliadol a sgleiniog [15]. Gall israddio signalau NOTCH leihau awtoffagy yn fawr ac achosi nam gwahaniaethu podocyte yn ystod y datblygiad [16].
O ganlyniad, mae podocytau camweithredol yn chwarae rhan hanfodol mewn clefyd sgleiniog, yn enwedig mewn syndrom neffrotig idiopathig dynol [17,18] ac mewn ychydig iawn o newid syndrom neffrotig (MCNS) [19]. Felly, mae awtoffagy yn cynnal homeostasis cellog o dan amodau ffisiolegol arferol, ond mewn amodau patholegol, gall symud ymlaen i farwolaeth awtoffagig [20]. Biofarcwr awtophagy a ddefnyddir yn eang yw LC3B, protein strwythurol o atgofion awtophagosomal [21]. Hefyd, mae croestalk cymhleth rhwng awtoffagy a apoptosis yn cyfrannu at gynnal cydbwysedd homeostatig fel ymateb i ficroamgylchedd y gell. Mae'n hysbys bod digwyddiadau apoptotig yn cynyddu mewn nifer yn ystodarendatblygiad [22] ac yn lleihau'n fawr ar ôl i aeddfedu ddod i ben, ac eithrio mewn amodau oanaf i'r arennau[23]. Yn ddiamau, mae apoptosis yn fecanwaith cymhleth a reoleiddir drwy ryngchwarae sawl llwybr ond yn bennaf yn dod i ben gydag actifadu caspase3 (CASP3), y mae ei actifadu yn un o'r marcwyr a ddefnyddir amlaf ar gyfer canfod apoptosis [23].
Yn yr adroddiad hwn, ein nod oedd dadansoddi sut mae dab1 genynnau swyddogaethol yn chwyddoarenmorffoleg a mynegiant a lleoleiddio reelin, NOTCH2, LC3B, a phroteinau CASP3 wedi'u glanhau mewn llygod ôl-enedigolArennau. Cymerwn fod y proteinau hyn yn cael eu mynegi yn y llygoden ôl-enedigolarenac mae eu rhyngweithio swyddogaethol yn cyfrannu at gynnal eu strwythur a'u swyddogaeth. Yn ogystal, gan fod presenoldeb DAB1 wedi'i gadarnhau yn ystod dynol y ffetwsarendatblygiad [9], gellid rhagdybio y gallai ei ddiffyg gweithredu achosi anhrefn mewn sbectrwm eang o anomaleddau cynhenid o'rarena llwybr wrinol (CAKUT).
Allweddeiriau:yotari; swyddogaeth yr arennau; datblygu arennau ôl-enedigol; staenio imiwnedd; microsgopi electron trawsyrru
BYDD CISTANCHE YN GWELLA SWYDDOGAETH YR ARENNAU/ARENNAU
Deunyddiau a Dulliau
Casglu SamplauFel mwtanau confensiynol Dab1 null, defnyddiwyd yotari (Dab1/ ) llygod a ddisgrifiwyd yn flaenorol gan Howell et al. [24]. Roedd primerau PCR a ddefnyddiwyd ar gyfer genoteipio'r llygod yn yotari: GCCCTTCAGCATCACCATGCT a CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, math gwyllt o dab1 locws: GCCCTTCAGCATCACCATGCT a CCTTGTTTCTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Codwyd C57BL/6 N llygod a'u grwpio mewn cewyll polycarbonad safonol (gan gynnwys o leiaf un o bob genoteip) gyda mynediad ad libitum i fwyd a dŵr mewn tymheredd a reolir (23 ± 2 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 12 h 2 0 3 0 3 0 12 h. Ar ddiwrnodau ôl-enedigol 4, 11 a 14 (P4, P11, a P14), roedd llygod yn anesthetig iawn gyda phentobarbital a thrawscardiaidd wedi'u taro am 10 munud gyda salîn clustogi ffosffad (PBS, pH 7. 2) a 4% paraformaldiffyg (PFA) yn 0.1 M PBS.Arennauwedi'u tynnu a'u ffio gyda 4% PFA mewn 0.1 M PBS dros nos ar gyfer dadansoddiadau histolegol confensiynol (hematoxylin–eosin (H&E), staeniau imiwnhistocemegol ac imiwnedd) ac mewn cymysgedd o 2% PFA + 2.5% o glwtaraldiffyg (GA) ar gyfer archwiliad microsgop electron. Ar ôl ffibr, paratowyd meinwe ar gyfer archwiliad histolegol pellach, fel yr ydym wedi disgrifio o'r blaen [25,26].
Imiwnedd ac Imiwnedd GwrthstaenAr ôl dadfeiliad ac ailhydradu, roedd adrannau'n cael eu gwresogi am 20 munud yn y glustog 0.01 M citrate (pH 6.0) mewn stêm ddŵr ac, wedi hynny, wedi'i oeri i lawr i dymheredd yr ystafell. Cymhwyswyd clustogi blocio (ab 64226, Abcam, Caergrawnt, y DU) am 30 munud i eithrio staeniau amhenodol. Yna, roedd adrannau'n cael eu deori mewn siambr lleithder dros nos gyda gwrthgyrff sylfaenol (Tabl 1). Ar ôl golchi mewn PBS, cymhwyswyd gwrthgyrff eilaidd (Tabl 1) am awr a'u golchi yn PBS eto. Yna, roedd niwclei wedi'i staenio gyda 4060 -diamidino-2-ffenylindole (DAPI) am 2 funud, wedi'i olchi mewn PBS, ac wedi'i orchuddio. Gwnaethom gyflawni'r prawf rhagddyddio fel bod pob gwrthgyrff sylfaenol yn cael eu defnyddio gyda'r peptid cyfatebol ac yn cymhwyso eu cyfuniad i'r adrannau. Nid oedd y canlyniadau'n dangos unrhyw staeniau gwrthgyrff. Yn ogystal, perfformiwyd rheolaethau gyda hepgor y prif wrthgyrff i bennu lefelau o rwymo gwrthgyrff eilaidd nad ydynt yn benodol.
Ar gyfer staenio imiwnperoxidase, gwrth-CASP3 polyclonol cwningen (1:100 o wanhau, ab13847, Abcam, Caergrawnt, y DU) yn cael ei gymhwyso fel gwrthgyrff sylfaenol am awr mewn siambr hiwmor ar ôl trin yr adran gyda 0.1% H2O2. Ar ôl golchi mewn PBS, perfformiwyd canfod eilaidd gan ddefnyddio'r cyswllt a'r perocsid streptavidin, pob un ar gyfer cofnodion ffibr (DakoCytomation, CA 93013 UDA, LOT 03477) a diaminobenzidine (Dako, CA 93013 UDA, LOT 10051369), a reolir yn ofalus er mwyn osgoi gor-redeg cefndir. Roedd Nuclei wedi'i staenio â hematoxylin, wedi'i rinsio mewn dŵr tap am 10 munud, wedi'i ddadhydradu'n fyr mewn cyfres o atebion ethanol, ac wedi'u gorchuddio.
Paratoi Meinweoedd ar gyfer Microsgop Electron Trawsyrru (TEM)Ar ôl ffibr gyda chymysgedd o 2% PFA a 2.5% GA yn 0.1 M PBS am 2 h, golchwyd y samplau gyda PBS a'u postio mewn ateb dyfrol o 2% osmium tetroxide am 2 h. Cafodd yr holl samplau eu golchi ddwywaith yn PBS, eu dadhydradu mewn graddau esgynnol o ethanol a'u gwreiddio yn Epon 812 (Offer Labordai TAAB, Darllen, y DU). Torrwyd adrannau cyfresol (70 nm mewn trwch) ar ultramicrotome Ultracut UCT (Leica Microsystemau, Wetzlar, yr Almaen) a'u staenio gydag 1% o acen uranyl a citrate plwm.
Caffael a Dadansoddi DataCynhaliwyd y dadansoddiad gyda microsgop epiflfluorescence (Olympus BX51, Tokyo, Japan) gyda chamera digidol DP71 (Olympus), microsgop electron trosglwyddo JEM 1400 (JEOL, Tokyo, Japan) yn gweithredu ar 80 kV ac wedi'i ffotograffu â system camera dyfais sy'n gysylltiedig â jeOL (CCD) (Technegau Microsgopi Uwch, Danvers, MA, UDA) ac yn olaf, microsgop golau (BX40, Olympus, Tokyo, Japan). Proseswyd yr holl ddelweddau a ddadansoddwyd gyda meddalwedd ImageJ ac Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, UDA). Fesul grŵp a archwiliwyd, defnyddiwyd tri i bedwar anifail. Pawb a gasglwydArennaueu torri ar 5 μm o adrannau trwchus, ac uchafswmarenadroddwyd am hyd a bennwyd drwy ddefnyddio'r samplau hyn. Pennwyd tiwbiau cymhleth procsi cymedrig (PCT), tiwbiau cymhleth pell (DCT) a diamedr sgleiniog gan gyfartaledd o 100 o ddieeter strwythur fesul sampl a ddadansoddwyd. Gan fod gan segmentau neffron siapiau afreolaidd, cymerwyd y diamedr mwyaf o bob segment a archwiliwyd fel cynrychiolydd. Gwerthuswyd y dwysedd staenio yn lled-weithredol ar bedair gradd: absenoldeb unrhyw adweithedd ysgafn (( ), adweithedd ysgafn (+), adweithedd cymedrol (++), ac adweithedd cryf (+++) (Tabl 2). Cyfrifwyd nifer y DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, a chelloedd imiwnadweithiol CASP3 wedi'u glanhau a'u mynegi fel canran o gyfanswm y celloedd. Ar gyfer pob sampl, dadansoddwyd ugain PCT, DCT, a G ar ×40 o chwyddo gwrthrychol. Ar gyfartaledd, gwnaethom gyfartaleddu nifer y celloedd cadarnhaol fesul grŵp. Ystyriwyd bod unrhyw lefel o staeniau niwclear, cytoplasmig neu gofiadwy yn gadarnhaol. Dadansoddodd tri ymchwilydd y delweddau'n annibynnol. Profwyd cytundeb rhyng-radd gyda dadansoddiad cydberthyniad rhyng-ddosbarth, a arweiniodd at >0.75, sy'n dangos cytundeb rhagorol [27].
Dadansoddiad YstadegolPerfformiwyd prawf t dau-deilwra i ddadansoddi'r gwahaniaethau yn y diamedr cyfartalog rhwng PCT, DCT a G o anifeiliaid o fath gwyllt ac yotari. Cyflwynwyd y diamedr fel cymedrig ± wyriad safonol (DC). Pennwyd lefel yr arwyddoldeb ar p< 0.05.="" a="" twoway="" anova="" test="" followed="" by="" tukey’s="" multiple="" comparison="" test="" was="" used="" to="" examine="" the="" differences="" in="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" between="" pct,="" dct,="" and="" glomeruli="" at="" all-time="" points.="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" expressed="" as="" the="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" the="" level="" of="" signifificance="" was="" set="" at="" p="">< 0.05.="" the="" analysis="" was="" performed="" in="" graphpad="" software="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Canlyniadau
Staenio Hematoxylin-Eosin (H&E) a Mesur Diamedr yr ArennauStaenio H&E o adrannau midsagittal o'rArennauo gwbl, mae pwyntiau amser a archwiliwyd yn tynnu sylw at y bacharenffenoteip o yotari llygod o'i gymharu â'r math gwyllt (Ffigur 1a). Yn 4P cymedrarendiamedr anifeiliaid yotari oedd tua 55 μm na thua 75 μm. Yn ogystal, roedd y gwahaniaeth hwn yn amlwg ar adegau diweddarach oherwydd twf arafach yArennauyn yotari o'i gymharu â thwf cynyddol yArennaumewn anifeiliaid o fath gwyllt. Penderfynu a yw'r gostyngiad yn gyffredinolarenachoswyd maint gan ostyngiad ym maint segment neffron, ar gyfartaledd diamedr PCT, DCT a G fesul grŵp. Yn wir, bu gostyngiad yn y diamedr cymedrig G, PCT a DCT yn y grŵp yotari o'i gymharu â'r math gwyllt (Ffigur 1b, t< 0.05).="" additionally,="" h&e="" staining="" revealed="" thinner="" cortex="" and="">Arennolestyniad y pelfis mewn anifeiliaid yotari a DCT wedi'i wanhau ychydig yn wasgaredig ar 14P. Mae strwythur a phatrwm sylfaenol aeddfedu sgleiniog yr un fath yn y ddau grŵp anifeiliaid a archwiliwyd.
Dadansoddiad Histolegol Disgrifiadol yn seiliedig ar Ficrofusnesau TEMAr ficrofusnesau a gafwyd gan TEM, dangosodd menmeruli o llygod gwyllt ymddangosiad nodweddiadol pob rhan o'r rhwystr ffibr, a ddatblygwyd ac a oedd fel arfer yn cael ei ddatblygu a'i adnabod (Ffigur 2a). Roedd podocytes, prosesau traed podocyte a pediclau, slitiau hidlo, membran islawr sgleiniog, a'r lwmen capilari gyda'r endootheliwm wedi'i ffensio yn hawdd eu hadnabod (Ffigur 2a). Ar y llaw arall, yn sgleiniog yotari llygod, gellid arsylwi ar ddifrod podocyte cynyddol gydag effacement proses traed a diffyg slitiau ffibr (Ffigur 2b–d). Gwelwyd y newidiadau uwchadeileddol hyn ym mhobArennauarchwilio ac yn cynnwys y rhan fwyaf o'r menmeruli a archwiliwyd. Ni welwyd unrhyw annormaleddau yn y PCT na'r DCT o yotari llygod nag anifeiliaid o fath gwyllt (Ffigur 2e–h). Yn y PCT, roedd rhyngwynebau celloedd wedi'u diffi nio'n wael oherwydd afreoleidd-dra cofiadwy celloedd a rhyngddibynnol celloedd gyda'u cymdogion. Roedd y cytoplasm yn gyffredin, yn cynnwys niwclei nodedig, gwiddondria huawdl, infoldings basal, a llawer o byllau tiwtor rhwng microvilli, a oedd yn ffurfio ffin brwsh yn y membran gwenyddol. Datgelodd dwysáu uwch arwyneb gwennol celloedd epiotheliol PCT sy'n cynnwys microvilli hir i ffurfio'r ffin brwsh a chyffyrdd tynn rhwng ffiniau celloedd celloedd celloedd epiotheliol lymol celloedd epiotheliol cyfagos (Ffigur 2e,f). Ar y llaw arall, roedd arwyneb gwennol celloedd epiotheliol DCT yn cynnwys ychydig o ficrofusnesau byr a nifer o fesiclau (Ffigur 2g,h).
Ffigur 2. Microsgop electron trawsyrru (TEM) microffotograffau o fath gwyllt ac yotariArennau. Dangosodd Glomeruli o anifeiliaid o fath gwyllt (a) rwystr ffibr a ddatblygwyd fel arfer gydag endootheliwm wedi'i ffensio (E) o'r capilari (C), membran islawr (BM), podocytes (P) gyda phediclau (PE), a slitiau hidlo (FS). Yn yArennauo anifeiliaid yotari, gellid sylwi ar y pediclau a'r diffyg slitiau hidlo (seren, b–d). Ni welwyd unrhyw annormaleddau yn y tiwbiau cymhleth procsi (PCT) neu'r tiwbiau cymhleth pell (DCT) o yotari llygod o'i gymharu â'r anifeiliaid o fath gwyllt (e–h). Yn y PCT, roedd y cytoplasm yn gyffredin, yn cynnwys niwclei (N) sy'n enwog amlwg, mitochondria huawdl (M), infoldings basal (BI), a llawer o byllau tiwtor (TP) rhwng microvilli, a oedd yn ffurfio ffin brwsh (BB) yn y membran gwenyddol (e,f). Datgelodd dwysáu uwch arwyneb gwenyddol celloedd epiotheliol PCT sy'n cynnwys microvilli hir i ffurfio'r ffin brwsh a chyffyrdd tynn (TJ) rhwng ffiniau celloedd lymol celloedd epiotheliol cyfagos (e,f). Ar y llaw arall, arwyneb gwenyddol celloedd epiotheliol DCT sy'n cynnwys ychydig o ficrofusnesau byr a nifer o fesiclau (g,h). Y bar graddfa mewn delweddau (a–d) a mewnosodiadau (e–h) yw 1 μm; y bar graddfa mewn delweddau (e–h) yw 2 μm.
Lleoleiddio a Colocaleiddio Reelin a DAB1Mynegwyd reelin yn wan gydag adweithedd ysgafn i gymedrol (Tabl 2) yn y menmeruli a'r DCT o'r holl anifeiliaid a archwiliwyd ar bob pwynt amser a arsylwyd (p< 0.05,="" figure 3a).="" only="" in="" the="" pct="" of="" yotari mice="" was="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" significantly="" higher="" than="" wild-type="" animals="">< 0.05,="" figure 3a).="" in="" the="" glomerular="" cells,="" the="" localization="" of="" staining="" was="" perinuclear,="" while="" in="" the="" pct="" and ="" dct,="" it="" was="" scattered="" throughout="" the="" cytoplasm="">
tanio 4. Staenio imiwnedd yotari ôl-enedigolArennaugyda marciwr reelin (a) a staenio imiwnedd dwbl o'r math o wyllt ôl-enedigolArennaugyda DAB1 a rhoi'r gorau i farciau (b). (a,b) Mae staenio DAPI DNA niwclear wedi'i uno â DAB1, a dangosir imiwnedd gwrth-imiwnedd yn gyfochrog (uno). Y pwyntiau amser a arsylwyd oedd P4, P11, P14. Mynegiant o'r marcwyr a archwiliwyd yn y sgleiniog (G), mae tiwbiau cymhleth procsi (PCT) a thiwbiau cymhleth pell (DCT) wedi'u marcio â'r saethau, tra bod seren yn nodi mynegiant o'r reelin yn y matrics alloffer (a). Mae mewnosodiadau yn dangos y mynegiant amlycaf yn y ddelwedd. Datgelodd staeniau niwclear DAPI fod DAB1 yn cael ei roi ar y cyd yn wael ac yn rhoi'r gorau iddi, yn bennaf yn y DCT (pen saethau). Mae'r bar graddfa yn 20 μm ac mae'n cyfeirio at bob delwedd.
Nid oedd bron unrhyw adweithedd imiwnedd DAB1 mewn menmeruli a PCT o anifeiliaid o fath gwyllt yn P4, tra bod canran y celloedd cadarnhaol gydag adweithedd ysgafn (Tabl 2) wedi cynyddu'n sylweddol yn P11 a P14 (p< 0.05,="" figure="" 3b).="" in="" the="" dct,="" dab1="" was="" expressed="" mostly="" at="" the="" apical="" and="" lateral="" parts="" of="" cell="" membranes="" (figure="" 4b)="" with="" strong="" reactivity="" (table="" 2).="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" previous="" structures,="" around="" 60%="" (figure="" 3b),="" especially="" in="" the="" macula="" densa="" (figure="" 4b).="" there="" was="" almost="" no="" colocalization="" of="" the="" dab1="" and="" reelin="" except="" in="" the="" dct="" of="" wildtype="" animals="" at="" p14="" (arrowhead,="" figure="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" of="" 14="" figure="" 4.="" immunoflfluorescence="" staining="" of="" postnatal="">Arennaugyda marciwr reelin (a) a staenio imiwnedd dwbl o fath gwyllt ôl-enedigolArennaugyda DAB1 a rhoi'r gorau i farciau (b). (a,b) Mae staenio DAPI DNA niwclear wedi'i uno â DAB1, a dangosir imiwnedd gwrth-imiwnedd yn gyfochrog (uno). Y pwyntiau amser a arsylwyd oedd P4, P11, P14. Mynegiant o'r marcwyr a archwiliwyd yn y sgleiniog (G), mae tiwbiau cymhleth procsi (PCT) a thiwbiau cymhleth pell (DCT) wedi'u marcio â'r saethau, tra bod seren yn nodi mynegiant o'r reelin yn y matrics alloffer (a). Mae mewnosodiadau yn dangos y mynegiant amlycaf yn y ddelwedd. Datgelodd staeniau niwclear DAPI fod DAB1 yn cael ei roi ar y cyd yn wael ac yn rhoi'r gorau iddi, yn bennaf yn y DCT (pen saethau). Mae'r bar graddfa yn 20 μm ac mae'n cyfeirio at bob delwedd. Nid oedd bron unrhyw adweithedd imiwnedd DAB1 mewn menmeruli a PCT o anifeiliaid o fath gwyllt yn P4, tra bod canran y celloedd cadarnhaol gydag adweithedd ysgafn (Tabl 2) wedi cynyddu'n sylweddol yn P11 a P14 (p< 0.05,="" figure="" 3b).="" in="" the="" dct,="" dab1="" was="" expressed="" mostly="" at="" the="" apical="" and="" lateral="" parts="" of="" cell="" membranes="" (figure="" 4b)="" with="" strong="" reactivity="" (table="" 2).="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" signifificantly="" higher="" than="" in="" previous="" structures,="" around="" 60%="" (figure="" 3b),="" especially="" in="" the="" macula="" densa="" (figure="" 4b).="" there="" was="" almost="" no="" colocalization="" of="" the="" dab1="" and="" reelin="" except="" in="" the="" dct="" of="" wild-type="" animals="" at="" p14="" (arrowhead,="" figure="">
Patrymau Mynegiant Gofodol a Thymherus o NOTCH2 a LC3BRoedd canran y celloedd NOTCH2-gadarnhaol yn llai nag 20% yn sgleiniog y ddau genoteip anifeiliaid o gwbl. Dim ond ar ganran P14 o gelloedd cadarnhaol oedd yn sylweddol uwch yn sgleiniog anifeiliaid yotari nag anifeiliaid o fath gwyllt (p< 0.05,="" figure="" 3c).="" the="" staining="" intensity="" was="" mild="" to="" moderate="" (table="" 2),="" mostly="" located="" perinuclearly="" (figure="" 5a–f).="" in="" the="" pct="" and="" dct="" of="" both="" animal="" genotypes="" percentage="" of="" positive="" cells="" increased="" through="" time.="" at="" p14,="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" significantly="" higher="" in="" pct="" and="" dct="" of="" yotari="" animals="" than="" pct="" and="" dct="" of="" wild-type="" animals="" (p="">< 0.05,="" figure="" 3c).="" signal="" intensity="" at="" all="" observed="" time="" points="" was="" mild="" to="" moderate="" (table="" 2)="" and="" scattered="" throughout="" the="" cytoplasm="" (figure="" 5a–f).="" figure="" 5.="" immunofluorescence="" staining="" of="" postnatal="" wild-type="" and="" yotari="">Arennaugyda marcwyr NOTCH2 a LC3B a staenio imiwnperoxidase gyda marciwr caspase3 (CASP3) wedi'i glyfar. (a–f) Mae staenio DAPI DNA niwclear wedi'i uno â NOTCH2 a LC3B. Y pwyntiau amser a arsylwyd oedd P4, P11, P14. Mynegiant o'r marcwyr NOTCH2 a LC3B yn y sgleiniog (G), mae tiwbiau cymhleth procsi (PCT) a thiwbiau cymhleth pell (DCT) wedi'u marcio â'r saethau. Gellir arsylwi ar adweithedd LC3B arbennig o gryf yn capsiwl Bowman o glomeruli pydru (seren, e). Mae mewnosodiadau yn dangos y mynegiant amlycaf yn y ddelwedd. Roedd CASP3 wedi'i fynegi'n wael ym mhob pwynt amser a arsylwyd. Yr unig fynegiant arwyddocaol oedd yn sgleiniog yotari llygod ar P14 (saethau). Mae'r bar graddfa yn 20 μm ac mae'n cyfeirio at bob delwedd. Biomoleciwles 2021, 11, 609 9 o 14 3.4. Patrymau Mynegiant Gofodol a Temporal o NOTCH2 a LC3B Roedd canran y celloedd NOTCH2-gadarnhaol yn llai nag 20% yn sgleiniog y ddau genoteipiau anifeiliaid o gwbl. Dim ond ar ganran P14 o gelloedd cadarnhaol oedd yn sylweddol uwch yn sgleiniog anifeiliaid yotari nag anifeiliaid o fath gwyllt (p< 0.05,="" figure="" 3c).="" the="" staining="" intensity="" was="" mild="" to="" moderate="" (table="" 2),="" mostly="" located="" perinuclearly="" (figure="" 5a–f).="" in="" the="" pct="" and="" dct="" of="" both="" animal="" genotypes="" percentage="" of="" positive="" cells="" increased="" through="" time.="" at="" p14,="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" signifificantly="" higher="" in="" pct="" and="" dct="" of="" yotari="" animals="" than="" pct="" and="" dct="" of="" wild-type="" animals="" (p="">< 0.05,="" figure="" 3c).="" signal="" intensity="" at="" all="" observed="" time="" points="" was="" mild="" to="" moderate="" (table="" 2)="" and="" scattered="" throughout="" the="" cytoplasm="" (figure="">
Ffigur 5. Staenio imiwnedd y math o wyllt ôl-enedigol a'r yotariArennaugyda marcwyr NOTCH2 a LC3B a staenio imiwnperoxidase gyda marciwr caspase3 (CASP3) wedi'i glyfar. (a–f) Mae staenio DAPI DNA niwclear wedi'i uno â NOTCH2 a LC3B. Y pwyntiau amser a arsylwyd oedd P4, P11, P14. Mynegiant o'r marcwyr NOTCH2 a LC3B yn y sgleiniog (G), mae tiwbiau cymhleth procsi (PCT) a thiwbiau cymhleth pell (DCT) wedi'u marcio â'r saethau. Gellir arsylwi ar adweithedd LC3B arbennig o gryf yn capsiwl Bowman o glomeruli pydru (seren, e). Mae mewnosodiadau yn dangos y mynegiant amlycaf yn y ddelwedd. Roedd CASP3 wedi'i fynegi'n wael ym mhob pwynt amser a arsylwyd. Yr unig fynegiant arwyddocaol oedd yn sgleiniog yotari llygod ar P14 (saethau). Mae'r bar graddfa yn 20 μm ac mae'n cyfeirio at bob delwedd.
Yn y sgleiniog a'r DCT o genoteipiau anifeiliaid, cynyddodd canran y celloedd LC3B-gadarnhaol dros amser (p< 0.05,="" figure="" 3d).="" at="" p11="" and="" p14,="" the="" percentage="" of="" positive="" cells="" was="" signifificantly="" higher="" in="" the="" glomeruli="" of="" yotari="" animals="" than="" the="" glomeruli="" of="" wild-type="" animals="" (p="">< 0.05,="" figure="" 3d).="" in="" the="" glomeruli="" of="" yotari="" animals="" staining="" intensity="" was="" mostly="" moderate="" to="" strong="" (table="" 2)="" located="" in="" the="" perinuclear="" and="" nuclear="" space="" (figure="" 5a–f),="" at="" all="" observed="" time="" points,="" while="" in="" the="" glomeruli="" of="" wild-type="" mice,="" the="" intensity="" was="" mostly="" moderate="" (table="" 2).="" pct="" of="" yotari="" and="" wild-type="" animals="" contained="" around="" 20%="" of="" positive="" cells="" at="" all="" observed="" time="" points="" (p="">< 0.05,="" figure="">
Mynegiant CASP-3 wedi'i GlyfarNid oedd bron unrhyw fynegiant o'r CASP-3 wedi'i actifadu yn yArennauo anifeiliaid o'r math gwyllt o gwbl a arsylwyd ar adegau amser. Yn y PCT a DCT yotari llygod, roedd sawl cell unigol yn CASP-3-gadarnhaol (Ffigur 3e). Dim ond yn sgleiniog arennau yotari yn P14 (Ffigur 5e), cynyddodd canran y celloedd cadarnhaol yn sylweddol o'i gymharu âArennauo llygod o'r math gwyllt (p< 0.05,="" figure="">
Trafodaeth
Arenmae morffogenesis a datblygiad yn brosesau cymhleth a gydlynir yn union drwy ryngchwarae nifer fawr o genynnau. Anomaleddau cynhenid yarena llwybr wrinol (CAKUT) yw'r diffyg geni mwyaf cyffredin sy'n gyfystyr â 23% o'r holl ddiffygion o'r fath ac sy'n cynrychioli prif achos diwedd y cyfnodclefyd yr arennaumewn plant [28,29]. Gall anhwylderau genynnau sengl fod yn brif ffynhonnell CAKUT, a hyd yn hyn, mae mwtaniad mewn mwy nag 20 o genynnau wedi'i nodi fel achos CAKUT [30]. Gan fod ein gwaith blaenorol yn dangos mynegiant mawr o DAB1 yn ystod y ffetws arferolarendatblygiad [9], roeddem yn tybio y gallai DAB1 chwarae rôl sylweddol yn ystod mamalaiddarendatblygiad. Er mwyn profi ein damcaniaeth, buom yn ymchwilio i'rarenmorffoleg a phatrymau mynegiant o reelin, NOTCH2, LC3B, a phroteinau CASP3 wedi'u actifadu yn Dab1 yn curo llygod.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA POEN YR ARENNAU/ARENNOL
Yn hollti drwy'r yotari llygodArennaudatgelu cortecs teneuach a chymedr llawer llaiarena diamedr PCT, DCT a G o'i gymharu ag anifeiliaid o fath gwyllt. Mae'r gostyngiad ynarenmaint a achosir gan waddol neffron insuffificient yn cael ei adnabod felArennolhypoplasia, un o'r anhwylderau CAKUT mwyaf cyffredin, sy'n rhagflaenu gorbwysedd oedolion a chlefyd cronig yr arennau [31]. Yn ogystal, datgelodd y microffotograffeg a gipiwyd gyda'r TEM fod yotari llygod yn arddangos difrod podocyte amlwg gydag effacement proses traed a diffyg slitiau ffibr. Ar ôl yr anaf, mae podocytau'n mynd drwy'r broses o effacement lle maent yn colli eu strwythur, gan arwain at leihad yn eu swyddogaeth rhwystr ffibr [32]. Nodweddir pob math o syndrom neffrotig, yn ogystal â sgleiniog segmentaidd (FSGS), gan ddiffygion mewn strwythur neu swyddogaeth podocyte [33].
Dangosodd ein hastudiaeth bresennol y mynegiant uchaf o DAB1 yn y rhannau gwenyddol a ochrol o atgofion celloedd y DCT, tra bod REELIN wedi'i wasgaru'n bennaf drwy'r cytoplasm o'r PCT. Yn y pwyntiau amser yr ymchwiliwyd iddynt, ni welwyd unrhyw newidiadau morffolegol mewn tiwbiau o yotari llygod, ond mae angen ymchwilio ymhellach i egluro rôl DAB1 mewn compartmentau tiwtor. Roedd y proteinau DAB1 a REELIN yn cael eu coleddu'n achlysurol, yn y DCT yn bennaf. Mae'r ffidilau hyn yn dilyn ein gwaith blaenorol yn ymwneud â mynegi'r ddau brotest hyn yn ystod dynol y ffetwsarendatblygiad [9]. Gallai hyn awgrymu bod gan DAB1 a rhoi'r gorau i rolau tebyg mewn pobl a llygodenArennaudrwy actifadu rhai o'r llwybrau i lawr yr afon, megis Crk, MAPK a PI3K/Akt/mTOR rhaeadrau signalau [34–36]. Datgelodd ein data hefyd fwy o fynegiant o'r ail-roi yn sgleiniog yotari llygod. Yn ddiddorol, mae astudiaeth flaenorol wedi dangos bod ffosfforiad DAB1 a mwy o fynegiant o'r ail-roi yn y sgleiniog yn cael eu hategu gan orbwysedd, proteinuria, ac anaf podocyte yn y llygod ang II[10].
Yn ogystal, datgelodd staenio imiwnedd fwy o fynegiant o dderbynyddion NOTCH2 yn sgleiniog P14 yotari llygod. Mae'n hysbys bod mynegiant NOTCH2 yn cael ei israddio unwaith y cyflawnir aeddfediad neffron, ac eithrio yn amodauanafiadau i'r arennau,megis neffropathi diabetig a FSGS [15,37]. Dangosodd Mice gyda syndrom neffrotig a ysgogwyd gan Adriamycin hefyd fwy o fynegiant o NOTCH2 wedi'i actifadu, sy'n lleddfu ffibrosis [38]. Yn y pwyntiau amser yr ymchwiliwyd iddynt, ni wnaethom sylwi ar fwy o ffibrosis, ond mae'n dal i egluro union rôl y NOTCH2 a fynegwyd yn y yotari ôl-enedigolArennau.Byddai angen arsylwi ymhellach i weld a yw newidiadau ffibr yn digwydd yn y camau diweddarach. Fodd bynnag, mae rhai ffibr eisoes sy'n awgrymu bod effaith tymor byr mwy o actifadu NOTCH2 yn gysylltiedig â buddiolwyr goroesi cryf ar gyfer podocytau a anafwyd, sy'n cael ei golli mewn modelau hirdymor, megis neffropathi diabetig [39].
Mae'n debyg bod mynegiant LC3B uwch yn sglein P11 a P14 yotari llygod wedi ail-fflagio croniad o'r awtoffagosomes yn y podocytau. Dangos yn glir bod awtophagy wedi'i gyflymu. Mae angen dadansoddi'r gymhareb o ymadroddion protein LC3-II ac LC3-I. O dan amodau arferol, mae awtoffagy yn angenrheidiol ar gyfer normalswyddogaeth yr arennau[40], yn enwedig mewn podocytau. Oherwydd ei gapasiti cyfyngedig ar gyfer is-adran celloedd a disodli, maent yn arddangos lefel basal uchel o awtoffagy [41]. Er gwaethaf y ffidilau hyn, mae gweddlun mewn mynegiant LC3B wedi'i adrodd mewn sawl clefyd sgleiniog [42–44], yn bennaf ar y cyd â'r broses o ddatblygu'r broses traed a'r syndrom neffrotig, fel y gwelir mewn derbynyddion prorenin llygod amodol [45,46]. Mae'r holl astudiaethau hyn yn awgrymu rôl amddiffynnol o awtoffagy gwell mewn amodau patholegol, a gefnogir ymhellach gan ffibr neffropathi a ysgogwyd gan Adriamycin, lle mae awtoffagy yn cael ei actifadu i ddiogelu rhag anaf podocyte [43], yn ogystal ag mewn clefyd sgleiniog sy'n ddibynnol ar oedran lle mae'n oedi dirywiad swyddogaethol cynyddol yswyddogaeth yr arennau[40]. Dadansoddiad o boblarendangosodd biopsies hefyd dystiolaeth o gynnydd mewn awtoffagy ar y cyd ag effacement proses traed mewn sawl clefyd sgleiniog, gan gynnwys syndrom neffrotig newid lleiaf (MCNS), sy'n un o'r achosion mwyaf cyffredin o syndrom neffrotig idiopathig [19]. Yn amodau neffropathi diabetig ac acíwt a ysgogwyd gan lipopolysaccharideanaf i'r arennau,gwella awtoffagy gyda rhai therapiwteg drwy atal y llwybr PI3K/AKT/mTOR yn lleddfu swyddogaeth yr arennau [47,48]. Mae'r holl ffibrau hyn yn awgrymu bod gan awtophagy rôl cytoprotective anhepgor ar gyfer addasu straen ynanaf i'r arennau, a gallai ei fodiwleiddio fod yn strategaeth therapiwtig addawol, er, o dan rai amgylchiadau, gall awtoffagy hefyd fod yn niweidiol a symud ymlaen i farwolaeth celloedd.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA METHIANT YR ARENNAU/ARENNAU
Ac eithrio'r gweddlun mewn awtoffagy, gellid gweld lefel uwch o apoptosis hefyd yn sglein P14 yotari llygod. Fel arfer, mae Autophagy yn atal apoptosis, ond o dan amgylchiadau patholegol penodol, gall hefyd gael effaith groes ar oroesi celloedd drwy wella a hyrwyddo apoptosis [42]. Ar ôl genedigaeth, apoptosis yn yArennauyn cael ei leihau'n fawr, ac eithrio yn amodauanaf i'r arennau,megis syndrom neffrotig idiopathig lle mae'n cyfrannu at ddatblygu'r clefyd [23]. achos newydd posibl anomaleddau cynhenid awtosomal o'rarena llwybr wrinol. Fodd bynnag, mae prif rôl DAB1 yn ystodarendatblygiad yn parhau'n aneglur. Yn ogystal, dangosodd y llygod hyn annormaleddau proses traed a lefel uwch o reelin, NOTCH2, LC3B a phroteinau CASP3 wedi'u glanhau yn y menmeruli a allai arwain at anafiadau sgleiniog, fel syndrom neffrotig, a allai fod yn achos posibl o farwolaeth yr anifeiliaid hyn yn ystod y cyfnod diddyfnu, mewn cydberthynas â hypoplasia. Er mwyn cadarnhau'r rhagdybiaeth hon, mae angen darparu gwybodaeth ychwanegol am bwysedd gwaed a pharamedrau labordy clinig eraill, megis lefelau serum creatinine, albwmin a phrotestiadau.