CD73 Gorfynegiant mewn Podocytes: Marciwr Newydd O Anafiadau Podocyte mewn Clefyd Arennau Dynol
Feb 26, 2022
Crynodeb:Mae llwybr CD73 yn fecanwaith gwrthlidiol pwysig mewn amrywiol leoliadau afiechyd. Roedd arsylwadau mewn modelau llygoden yn awgrymu y gallai CD73 fod â rôl amddiffynnol ynddoniwed i'r arennau; fodd bynnag, dim tystiolaeth uniongyrchol o'i rôl mewn dynolclefyd yr arennauwedi ei ddisgrifio hyd yn hyn. Yma, rydym yn rhagdybio bod anaf podocyte mewn dynolafiechydon yr arennauyn newid mynegiant CD73 a allai hwyluso diagnosis podocytopathïau. Fe wnaethom asesu mynegiant CD73 ac un o'i dargedau swyddogaethol bwysig, y derbynnydd chemokine CC math 2 (CCR2), mewn podocytau oarenbiopsïau 39 o gleifion â podocytopathi (gan gynnwys glomerulosclerosis segmentaidd ffocal (FSGS), clefyd newid lleiaf (MCD), glomerwloneffritis membranous (MGN) ac amyloidosis) a grŵp rheoli. Cynyddwyd mynegiant podocyt CD73 ym mhob un o'r grwpiau clefyd yn sylweddol o'i gymharu â rheolyddion (p < 0.0{{10}}1–p="">< 0.0001).="" ar="" ben="" hynny,="" roedd="" cydberthynas="" negyddol="" amlwg="" rhwng="" mynegiant="" cd73="" a="" ccr2,="" fel="" y="" cadarnhawyd="" gan="" immunohistochemistry="" ac="" immunofluores-="" cence="" (pearson="" r="−" 0.5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="−" 0.4705,="" p="0.0313," yn="" y="" drefn="" honno),="" gan="" awgrymu="" felly="" rôl="" amddiffynnol="" o="" cd73="">anaf i'r arennau.Yn olaf, rydym yn nodi CD73 fel marciwr diagnostig posibl newydd o podocytopathïau dynol, yn enwedig o MCD sydd wedi bod yn enwog am y diffyg nodweddion patholegol y gellir eu hadnabod gan ficrosgopeg ysgafn ac imiwn-histocemeg.
Geiriau allweddol:podocyt; clefyd newid lleiaf posibl; CD73; CCR2;anaf i'r arennau;methiant arennol
Rhagymadrodd
Mae rôl hanfodol esblygiadol adenosine triphosphate (ATP) fel y ffynhonnell ynni mewngellol hollbresennol wedi'i diweddaru fwy na thri degawd yn ôl gyda syniad chwyldroadol bod aelodau'r system purinergig (ATP, adenosine di- a triphosphate (ADP ac AMP, yn y drefn honno) gall hefyd ddarparu signalau allgellog i gyfryngu rhyngweithiadau cellog [ 1 , 2 ]. Arweiniodd y cysyniad hwn at y ddealltwriaeth bod y system purinergig yn cymryd rhan mewn siapio ymatebion imiwn trwy fodiwleiddio proffil mynegiant derbynnydd, secretion cytocin, cynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) a treuliad pathogen mewngellol [3-7] Mae ATP allgellog yn cael ei drawsnewid/dadffosfforyleiddiad yn ADP ac AMP trwy CD39 (ecto-nucleosidtriphosphate diphosphohydrolase 1) ac yn olaf, mae AMP yn cael ei ddiraddio i adenosine gan CD73 (ecto-5 0 nucleotidase) [ 8 ] Gall CD73 fod yn bresennol ar ffurf bilen-rwymedig neu hydawdd Mae gan y ffurf bilen adeiledd dimer sy'n cynnwys dwy is-uned 70 kD unfath sy'n rhwymo i y bilen plasma trwy gysylltiad rhwng serine terfynell C a glycosylphosphatidyl inositol (GPI) [ 9 ]. Yn nodedig, ymddengys bod swbstradau CD39 ATP ac ADP yn atalyddion cystadleuol CD73 [ 9 - 11 ]. Mae mynegiant CD73 felly'n cynrychioli llwybr hanfodol tiwnio lefel adenosine mewn gofod allgellog. Nid yw CD73 yn foleciwl penodol i gell neu organ; ei fynegiant ar leukocytes, endotheliwm, celloedd epithelial neu mesenchymal gwahanol organau (aren, yr ysgyfaint, yr afu, y colon, yr ymennydd a'r galon) a bôn-gelloedd wedi'u dogfennu'n dda [ 12 – 14 ]. Adroddwyd gyntaf am rôl amddiffynnol adenosine trwy'r llwybr synthesis nitrig ocsid (NO) mewn anaf a achosir gan isgemia'r afu gan Peralta et al. [ 15 ]. Yn unol â'r data hyn, dangoswyd bod ei weithred yn lleddfu niwed acíwt i'r ysgyfaint, gwrthodiad llwybr anadlu alografft, clefyd impiad-yn erbyn gwesteiwr acíwt a sepsis [4,16-19].
BYDD CISTANCHE YN GWELLA METHIANT YR AREN/ARENAU
Fel y dangosir yn argyhoeddiadol mewn sawl model llygoden, gall CD73 gymryd rhan mewn rhyngweithio tiwbol-glomerwlaidd yn yaren. Dangoswyd bod CD{0}}genhedlaeth gyfryngol o adenosin sy'n deillio gan CD73 o ATP o darddiad tiwbaidd yn ystod difrod isgemia-atlifiad yn gwanhau'r llid trwy atal swyddogaeth effeithydd neutrophils [ 20 ]. Ar ben hynny, mae llygod diffygiol CD73-yn dangos llid awtoimiwnedd sy'n cyd-fynd â niferoedd llai o bodosytau a ffenestri endothelaidd [ 21 ]. Roedd y ffenomen hon yn gysylltiedig â lefelau serwm uwch o cytocinau pro-llidiol fel ffactor necrosis tiwmor (TNF)-alpha neu'r motiff chemokine CXC ligand 2 (CXCL-2). Yn y lleoliad dynolclefyd yr arennau,rhagdybiwyd bod difrod podocyt yn debygol o gynrychioli cymysgedd o fecanweithiau ymaddasol a dinistriol o ymateb cellog i ysgogiadau patholegol, nad ydynt o reidrwydd yn adlewyrchu arsylwadau cyhoeddedig o fodelau in vitro neu anifeiliaid. Mae etioleg anaf podocyt yn amrywio o straen mecanyddol (gor-hidlo glomerwlaidd), straen ocsideiddiol (fel mewn neffropathi gorbwysedd neu ddiabetig, anaf gwenwynig, ymdreiddiad celloedd llidiol neu fodelau anifeiliaid o afiechyd newid lleiaf) i straen imiwnolegol (hy, cymhleth imiwnedd ac ategu difrod cyfryngol yn ystod glomerulonephritis) [ 22 ]. Gall lleoliad llidiol glomerulonephritis ysgogi podocytau i syntheseiddio amrywiol cytocinau, o bosibl trwy signalau cyfryngol derbynnydd chemokine CC 2 (CCR2). Eto i gyd, ychydig sy'n hysbys am rôl CD73 mewn dynolclefyd yr arennau, yn enwedig wrth osod llid cronig ac anaf podocyte.
Yn yr astudiaeth bresennol, gwnaethom ddamcaniaethu bod CD73 yn chwarae rhan yn pathogenesis clefydau glomerwlaidd dynol a dadansoddwyd mynegiant podocyte CD73 mewn dynol.arenbiopsïau gan gleifion â phatholegau sy'n gysylltiedig â podocytopathi. Rydym yn dangos bod mynegiant arwyneb podocyte oCD73 yn farciwrofpodocyteddifrod dibynadwy, ac felly'n benodol yn cefnogi gwerth diagnostig CD73 mewn clefyd newid lleiaf posibl (MCD). At hynny, rydym yn adrodd am gydberthynas negyddol rhwng mynegiant podocyte CCR2 a CD73, sy'n awgrymu bod gorfynegiant CD73 yn cynrychioli ymateb addasol i friw glomerwlaidd.
Canlyniadau
Data Clinigol a Delweddu Uwchstrwythurol o Ddifrod PodocyteMae Tabl 1 yn amlinellu cyflwyniad clinigol achosion a gynhwyswyd yn yr astudiaeth o ran oedran, rhyw, creatinin a chyfanswm gwerthoedd proteinwria. Roedd gan bob claf FSGS ffurflen NOS sylfaenol (heb ei nodi fel arall). Ymhlith 12 o gleifion MGN, roedd 5 yn dderbynnydd ffosffolipase A2 (PLA2R)-positif (42 y cant). Yn y grŵp amyloidosis, roedd gan ddau glaf AA-amyloidosis (16.7 y cant) a 10 AL-amyloidosis (83.3 y cant); mewn 2 glaf ag AL-amyloidosis cadwyn golau kappa yn amlwg (20 y cant ) ac 8 yn gadarnhaol ar gyfer lambda (80 y cant o AL-amyloidosis grŵp). Ym mhob claf â MCD, FSGS, MGN ac amyloidosis, canfuwyd difrod podocyt yn glir gan ficrosgopeg electron (Ffigur 1).
Ffigur 1. Delwedd uwch-strwythurol o ddifrod podocyte cynradd ac uwchradd. ( a ) Lledaeniad corff podocyt ar bilen islawr glomerwlaidd (saeth) gan dynnu prosesau traed yn ôl mewn achos o MCD. ( b ) Elifiad proses traed podocyte helaeth (saeth) a gwagoli cytoplasmig (seren) mewn claf â FSGS sylfaenol. (c ) Elifiad proses y traed (saeth), gwagoli ac organynnau amlwg (saeth ddwbl) gyda deunydd electron-drwchus epipilenaidd gwaelodol (seren) mewn glomerwloneffritis pilenog cynradd. ( ch ) Croniad isepitheliaidd o ffibrilau amyloid (saeth dau ben) gyda datodiad podocyt yn olynol (fel arwydd o niwed anwrthdroadwy podocyte) mewn claf ag AL-amyloidosis (lambda). Mae pob electron micrograff yn cael ei gyflwyno ar 4000 × chwyddhad. Mewnosod - ffotomicrograffau microsgopeg golau cyfatebol (40 × /0.65 NA; maint bar wrth raddfa: 50 µm yn (a,c,d) a 100 µm yn (b); staenio PAS).
Mae Mynegiad Arwyneb o CD73 yn Gysylltiedig ag Anafiad Podocyte mewn Clefyd Arennau Dynol
Er mwyn archwilio a yw podocytau'n mynegi CD73 yn y lleoliad ffisiolegol ac i werthuso patrwmCD73 o osodiadau clefyd difater sy'n gysylltiedig â difrodwnsotocyted, dadansoddiad weperformedim- munohistochemical mynegiant CD73. Cadarnhaodd dadansoddiad uwch-strwythurol ddifrod podocyte fel afreoleidd-dra syto-ysgerbydol gydag o leiaf elifiad proses droed (Ffigur 1). Yn ein grŵp rheoli negyddol heb friw podocyt, ni ellid canfod unrhyw fynegiant podocyt arwyddocaol o CD73 er gwaethaf positifrwydd rheolaeth fewnol (capilarïau periwbwl) sydd fel arfer yn staenio positif (Ffigur 2). Ar y llaw arall, dangosodd grwpiau difrod podocyte (MCD, FSGS, MGN ac amyloidosis) ddadreoleiddiad ystadegol arwyddocaol iawn o podocyt CD73 (p < 0.{{1{{20}}}}}="" 001);="" roedd="" y="" cynnydd="" sylweddol="" yn="" gyson="" hefyd="" wrth="" gymharu="" endidau="" sengl="" gyda="" rheolaethau="" negyddol="" (p="" o="" leiaf="">< 0.001).="" yn="" ddiddorol,="" roedd="" graddau="" uwch-reoleiddio="" cd73="" yn="" tueddu="" i="" fod="" yn="" is="" yn="" y="" grŵp="" mcd,="" er="" ei="" fod="" yn="" sylweddol="" is="" yn="" unig="" o="" gymharu="" â="" samplau="" mgn="" (p="0.0043)" (ffigur="" 2).="" mewn="" grwpiau="" difrod="" podocyte,="" nid="" oedd="" unrhyw="" gydberthynas="" rhwng="" sgôr="" hanner="" meintiol="" cd73="" a="" phroteinwria="" ar="" lefel="" ddeuaidd="" (nephrotic/non-nephrotic)="" neu="" feintiol="" (g/24="" h)="" (spearman="" r="−" 0.0807,="" p="0" .6302="" a="" spearman="" r="−" 0.076,="" p="0.6497," yn="" y="" drefn="" honno;="" ffigur="" 3a).="" yn="" gyffredinol,="" nid="" oedd="" unrhyw="" gydberthynas="" rhwng="" sgôr="" cd73="" a="" lefel="" creatinin="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" ffigur="" 3b).="" yn="" ogystal,="" ni="" allem="" ganfod="" cydberthynas="" arwyddocaol="" rhwng="" mynegiant="" cd73="" a="" gorbwysedd="" (spearman="" r="−" 0.03024,="" p="0.8384)" neu="" diabetes="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0.1784,="" p="" {{45)="">
Mae dadreoleiddio CD73 sy'n Deillio o Podocyte mewn Clefyd Glomerwlaidd Dynol yn Cydberthyn yn Negyddol â Mynegiant y Derbynnydd CCR2 ac Nid yw'n Cydberthyn â Mynegiant Nephrin a PodocinGan werthfawrogi data cyhoeddedig ar is-reoleiddio mynegiant macrophage CCR2 yn dilyn gorfynegiant CD73 mewn model bôn-gelloedd, fe wnaethom ddamcaniaethu bod dadreoleiddio CD73 yn ystod anaf podocyt yn cydberthyn yn wrthdro â mynegiant CCR2 pro-llidiol ac yn perfformio dadansoddiad CCR2 immunohistochemical. Yn y grŵp rheoli, ni ellid canfod unrhyw fynegiant ysgafn neu ddim ond mynegiant ysgafn o CCR2, heb anghysondeb sylweddol o'i gymharu â llofnod CD73 yn yr un samplau. Mewn cyferbyniad, gellid gweld uwch-reoleiddio arwyneb CCR2 yn sylweddol (ond o ddwysedd amrywiol) yn y mwyafrif o samplau o fiopsïau difrod podocyte ac fe'i huwchreoleiddiwyd yn gyffredinol o'i gymharu â'r grŵp rheoli (p=0.0206; Ffigur Atodol S1). Nid oedd y grwpiau afiechyd yn wahanol iawn i'w gilydd yn hyn o beth.
Fe wnaethom ddadansoddi ymhellach gydberthynas bosibl rhwng dwyster mynegiant CD73 a CCR2. Yn wir, wrth gymharu sgorau CD73 a CCR2 o'r garfan biopsi anaf podocyte, gellid gweld cydberthynas negyddol amlwg (Spearman r=− 0.4821, p=0.{{18} }052), (Ffigur 4). O bwys, roedd glomeruli gyda podocytau positif CD yn tueddu i ddangos mynegiant CCR2 llai nid yn unig mewn podocytau ond hefyd mewn celloedd cyfagos, fel celloedd epithelial parietal (Ffigur 4). Cadarnhawyd y cydberthynas gwrthdro trwy werthuso cyd-staenio imiwnfflworoleuol ar gyfer CD73/CCR2 mewn podocytau wedi'u difrodi gan ficrosgopeg confocal (Spearman r=− 0.4478, p=0.0282), (Ffigur 5). Er mwyn mynd i'r afael â'r cysylltiad yn y pen draw rhwng positifrwydd CD73 a (colli) mynegiant protein podocyte-benodol, fe wnaethom berfformio staeniau echdyniad imiwnffliw ychwanegol ar gyfer neffrin a phodocin a gwerthuso eu patrwm mynegiant mewn rheolaeth, grwpiau MCD a FSGS (Ffigur 6a) yn ogystal â chyd-staenio gyda CD73 mewn samplau â nam podocyt (Ffigur 6b–e). Ni allem ganfod cydberthynas arwyddocaol rhwng dwyster fflworoleuedd cymedrig podocin neu fynegiant nephrin ar un ochr, a mynegiant cymedrig CD73 ar yr ochr arall (n=39, Spearman r=0.212, p {{33} }.1948 am podocin ac n=60, Spearman r=0.01906, p=0.8851 am nephrin).
Trafodaeth
Rydym yn disgrifio yma am y tro cyntaf y mynegiant o CD73 ar wyneb podocytes anafedig mewn dynolclefyd arennol. Dadansoddiarennolbiopsïau gan gleifion â niwed podocyte amlwg fel yn MCD, FSGS, MGN ac amyloidosis, rydym yn adrodd am ddadreoleiddio sylweddol o fynegiant podocyt CD73 ym mhob un o'r grwpiau hyn o gymharu â rheolaetharennau,yn annibynnol ar etioleg y difrod podocyte. At hynny, rydym yn adrodd ar gydberthynas gwrthdro rhwng mynegiant CD73 a CCR2 gan bodosytau grwpiau difrod podocyte. Dangoswyd bod hwb CCR2 podocyt-benodol yn cyfryngu diabetiganaf arennolmewn llygod [ 23 ]. Yn ogystal, adroddwyd bod gwarchae CCR2 mewn model murine o FSGS a achosir gan Adriamycin yn lleihau proteinwria ac anafiadau glomerwlaidd [24 ]. Mae astudiaeth ddiweddar gan Lee et al. - hefyd yn defnyddio model llygoden - yn nodi y gallai disbyddu CCR2 leddfu albwminwria a achosir gan ordewdra trwy rwystr o straen ocsideiddiol a chroniad lipid [ 25 ]. Yn wir, mewn system in vitro sy'n defnyddio bôn-gelloedd mesenchymal (MSC) o feinwe pericardiaidd murine, dangoswyd bod CD{7}} sy'n gorfynegi MSCs yn pennu prosesau gwneud iawn trwy weithgarwch gwrthlidiol, ymhlith ffactorau eraill hefyd oherwydd ataliad oCCR{ {9}}ymdreiddiad macrophage positif [ 13 ]. Felly, yng ngoleuni ein canlyniadau a'n data cyhoeddedig, mae'n demtasiwn rhagdybio y gallai mynegiant CD73 gan bodosytau weithredu'n amddiffynnol.anaf i'r arennau, o bosibl trwy lwybrau sy'n gwanhau CCR2. Mae cysylltiad agos rhwng signalau CCR2 ac adlyniad ac actifadu macrophage [ 26 , 27 ]. Gan y gall macroffagau ddylanwadu ar pathogenesis sy'n gysylltiedig â podocytopathiafiechydon yr arennau(fel MGN cynradd, lle mae ymdreiddiad CD68 a mwy , CCR2 plws macroffagau wedi'i gydnabod fel dangosydd arwyddocaol o ran diwedd y cyfnodmethiant arennol[ 28 ]), astudiaethau pellach o gysylltiad rhwng cynnwys monocyte/macrophage, tarddiad (ymdreiddio yn erbyn preswylydd), proffiliau actifadu (M1 - proinflammatory vs. M2 - wedi'i actifadu fel arall) a mynegiant CD73 mewn dynolclefyd yr arennauyn angenrheidiol i wirio cydymffurfiaeth ein canlyniadau â data blaenorol o fodelau murine.
Mewn micromilieu llidiol y gellir ei weld mewn hypocsia, isgemia-atlifiad neu ddifrod meinwe hunanimiwn, mae celloedd lluosog yn rhyddhau aelodau o'r system signalau purinergig, yn bennaf ar ffurf ATP pro-llidiol neu ADP [ 29 , 30 ]. Yn y gosodiadau hyn, mae ecto-niwcleotidaseCD73a'i gynnyrchadenosinearffactorau pwysigmewn ymateb imiwn yn rheoleiddio ac yn distewi. Mewn modelau anifeiliaid, dangoswyd bod CD73 yn amddiffynnolarenanaf atdlifiad isgemia a'i gamweithrediad podocyt a achosir gan ddiffyg, gan arwain at lid awtoimiwn aclefyd yr arennau[ 21 , 31 ]. Datgelodd arbrofion llygoden in vivo eraill gan ddefnyddio anaf atlifiad isgemia ddylanwad gwrthlidiol pwysig CD73 a fynegir gan gelloedd epithelial tiwbaidd procsimol a'i gamau hanfodol mewnarenamddiffyniad yn ystod neffropathi diabetig trwy signalau derbynnydd adenosine-endothelial Adora2b [20,32]. Podocytopathies yw'r grŵp mwyaf cyffredin o friwiau glomerwlaidd sy'n arwain at brotein-wria. MCD, podocytopathi 'sylfaenol' prototeip, yw'r achos mwyaf cyffredin o broteinwria neffrotig mewn plant > 1 oed [ 33 , 34 ]. Mae damcaniaethau cyfredol ar bathogenesis MCD yn awgrymu rôl sylweddol o cytocinau a chyfryngwyr imiwnedd eraill yn amharu ar gyfanrwydd pilen islawr podocyte-glomerwlaidd [35 - 38 ]. Yr anghysondeb rhwng absenoldeb newidiadau gweladwy mewn microsgopeg golau a phroteinwria difrifol yw nodwedd MCD; Mae tystiolaeth uwch-strwythurol o ddifrod podocyte gan ficrosgopeg electronau felly yn gyflwr sin qua non ar gyfer diagnosis MCD hyd yma. Mae'r algorithm diagnostig hwn yn pwysleisio arwyddocâd offer diagnostig llinell gyntaf pellach yn hyn o beth. Gallai archwilio mynegiant CD73, yn enwedig wrth osod argaeledd cyfyngedig microsgopeg electron, felly helpu i wahaniaethu rhwng ffynonellau glomerwlar (hy, podocytopathig) ac allglomerwlaidd (ee, tiwbaidd neu baraproteinemig). Byddai'r gymhariaeth rhwng immunohistochemistry ac imiwnofflworoleuedd yn ein hastudiaeth yn siarad o blaid yr olaf.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR ARREN/ARENAU
Mae sawl cyhoeddiad wedi dogfennu'n argyhoeddiadol ddosbarthiad afreolaidd a cholli proteinau podocyt-benodol mewn amrywiolclefyd yr arennaulleoliadau sy'n cynnwys anaf podocyte a phroteinwria, fel yr adolygwyd yn ddiweddar [ 39 ]. Yn ein hastudiaeth, o fewn y grŵp difrod podocyte, ni allem ganfod cydberthynas arwyddocaol rhwng dwyster fflworoleuedd podocin/nephrin a dwyster mynegiant CD73. Fodd bynnag, mae cyfyngiadau penodol yn atal dehongliad pathoffisiolegol o ddata ystadegol podocin/nephrin yn erbyn CD73. Yn gyntaf, ar gyfer gwerthuso dwyster fflworoleuedd dewiswyd podocytau gan ddefnyddio galluoedd chwyddo technegol a chydraniad microsgopeg confocal. Er bod yr amodau hyn yn galluogi canfod cyrff podocyt yn hawdd, mae prosesau mawr ac yn enwedig prosesau traed yn parhau i fod yn aneglur, ac felly mae'n bosibl nad ydynt wedi'u marcio / dadansoddi. Yn ail, ni ellir cyfiawnhau'r cydberthynas rhwng mynegiant CD73 a phroteinau podocyt-benodol mewn glomeruli cyfan: er y byddai asesu podocin a nephrin ar y lefel hon yn gyfreithlon (gan ei bod yn rhesymol tybio nad oes unrhyw gelloedd glomerwlaidd eraill yn mynegi'r proteinau hyn) ni all hyn fod. hawlio ar gyfer CD73 a fynegir yn rhannol o leiaf gan gelloedd endothelaidd. Yn drydydd, mae gwerthusiad o ddwysedd fflworoleuedd cymedrig yn unig fel marciwr annibynnol o anaf podocyte yn amheus, gan nad yw'n cwmpasu patrwm dosbarthiad patholegol, gronynnog podocin a nephrin o fewn y glomerwlws, y gallem ei weld yn glir yn Ffigur 6. Felly, rydym yn gyndyn i briodoli absenoldeb cydberthynas CD{8}podocin a CD{73-nephrin yn ein dadansoddiad i lwybrau moleciwlaidd dargyfeiriol y marcwyr hyn. Mae angen astudiaethau podocyte in vitro pellach ac anifeiliaid i archwilio ymyrraeth yn y pen draw rhwng y rhaeadrau signalau hyn.
Gyda'i gilydd, gan gydnabod maint sampl bach fel prif gyfyngiad ein hastudiaeth, rydym yn dangos yma orfynegiant cyson CD73 gan bodosytau anafedig ac yn awgrymuCD73 fel marciwr diagnostig newydd o bodocytopathi. Mewn achosion o newid lleiaf posibl, gall ein canlyniadau helpu i nodi podocytau sydd wedi'u difrodi ac arwain at broses ddiagnostig sy'n cymryd llai o amser a chost. Yn ogystal, mae ein canlyniadau yn cyd-fynd â data cyhoeddedig o ddulliau arbrofol murine ac yn awgrymu rhyngweithio amddiffynnol rhwng CD73 a CCR2 mewn dynol.clefyd yr arennau. Mae angen astudiaethau aml-ganolfan pellach gyda charfannau mwy o gleifion i fynd i'r afael â mecanweithiau signalau CD73 mewn dynolarenclefyd a'i werth prognostig. Yn yr un modd, byddai angen niferoedd carfannau mwy i sefydlu cydberthynas bosibl rhwng difrifoldeb y clefyd a mynegiant CD73.
Deunydd a Dulliau
Carfan AstudioCafodd cyfanswm o 49 o fiopsïau sydd wedi’u cynnwys yn yr astudiaeth hon o 49 o gleifion gwahanol ddiagnosis rhwng 1 Ionawr 2018 a 31 Rhagfyr 2019 yn Ysbyty Athrofaol Mannheim, Prifysgol Heidelberg. Meini prawf dethol pellach oedd biopsi cynrychioliadol gyda'r posibilrwydd o berfformio diagnosis triphlyg gydag imiwn-histocemeg ac EM, gwybodaeth glinigol ddigonol, diagnosis clir a deunydd digonol ar gyfer yr astudiaeth hon. Roedd pob claf yn oedolyn ac yn Cawcasws. Amgaeodd yr ymchwiliadau 39 biopsïau gan gleifion ag anaf podocyte o etiolegau amrywiol (7 biopsïau gan gleifion â glomerwlosclerosis segmentol sylfaenol -FSGS; 8 o glefyd newid lleiaf posibl - MCD; 12 gan gleifion â glomerulonephritis membranous - MGN; 12 gan gleifion ag amyloidosis). Roedd rheolaethau negyddolarenbiopsïau gan 10 o gleifion heb friw podocyte a heb broteinwria (6 chlaf â nephrosclerosis ysgafn, 2 glaf â neffritis interstitial a 2 glaf heb newidiadau patholegol). Cafodd pob un o'r biopsïau uchod eu cynnwys yn y dadansoddiad o fynegiant podocyte CD73; ar gyfer CCR2, ar ôl gwahardd adrannau paraffin gyda nifer annigonol o glomerwli nad yw'n sglerotic (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Histoleg, Imiwnohistocemeg, Imiwnofflworoleuedd a Microsgopeg ElectronGwnaed yr adrannau cyfresol 1 µm ar fewnosod paraffinarenbiopsïau a'u staenio â hematocsilin/eosin (H/E), asid-Schiff cyfnodol (PAS), staen trichrome Masson yn ogystal ag imiwn-histocemeg arferol arferol at ddibenion diagnostig. Perfformiwyd staenio imiwnohisto-cemegol a immunofluorescent o fiopsïau mewnosod paraffin formalin-sefydlog ar gyfer â llaw gan ddefnyddio cwningen gwrth-ddynol CD73 gwrthgorff monoclonaidd (clôn D7F9A, Cell Signaling, Frankfurt am Main, yr Almaen) a llygoden monoclonaidd gwrth-dynol gwrthgorff CCR2 (clôn 7A7; Abcam, Caergrawnt, y DU), cwningen gwrthgorff gwrth-ddynol polyclonal i nephrin (Abcam, Caergrawnt, DU) a cwningen gwrth-gorff podocin gwrth-ddynol (Sigma, Saint Louis, MO, UDA), yn ôl protocolau gwneuthurwr. Cafodd pob un o'r biopsïau eu cynnwys yn y dadansoddiad o fynegiant podocyt CD73 yn ôl imiwn-histocemeg; ar gyfer CCR2, adrannau paraffin gyda nifer annigonol o glomerwli di-sglerotig (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
BYDD CISTANCHE YN GWELLA SWYDDOGAETH YR AREN/ARENOL
Microsgopeg Ysgafn a Dadansoddiadau MorffometrigCafodd y ddelwedd ei chaffael a'i dadansoddi gan ddefnyddio microsgop sganio PreciPoint M8 gyda meddalwedd Olympus PlanCN 40 × /0.65 Amcan a MicroPoint (adn.5 Mai 2016; PreciPoint, Freising) , Yr Almaen). Aseswyd gwerthusiad lled-feintiol o fynegiant arwyneb podocyte CD73 mewn staenio imiwn-histocemegol gan ddefnyddio graddfa sgorio 0–3 (0—dim mynegiant; 1—positifrwydd segmentol ffocal (1).<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 y cant podocytes positif i mewn<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 y cant o glomerwli). Dadansoddwyd podocytau positif a negyddol CD73 ar gyfer cydfynegiant CCR2 gan ddefnyddio system sgorio lled-feintiol ar sail dwyster (0 — dim mynegiant, 1 — mynegiant gwan, 2 — mynegiant cymedrol a 3 — mynegiant cryf, yn ôl rheolaeth bositif CCR2 mewnol biopsi— endotheliwm ac ymdreiddio i gelloedd imiwnedd). Perfformiwyd gwerthusiad yn annibynnol gan ddau batholegydd (SP a ZP) mewn modd dallu.
Microsgopeg CydffocalCafodd delweddau o CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) a niwclysau (DAPI) o bodosytau eu caffael yn ddilyniannol gyda microsgop confocal modur Olympus FV1000 gyda HeNe 594 nm, Argon 488 nm a deuod UV 405 nmlaser a thiwbiau photomultiplier (PMTs) a reolir gan feddalwedd FluoView, gan ddefnyddio'r amcan UPlanSApo 60 × /1.35. Cafodd y delweddau 12-did gyda 512 × 512 ffrâm picsel a maint picsel o 0.41 µm ar gyfer trosolygon a 0.10 µm ar gyfer cydraniad uchel eu caffael trwy gadw'r holl osodiadau ar y microsgop yn gyson. Cafodd y delweddau eu prosesu a’u dadansoddi’n lled-awtomatig ymhellach gan ddefnyddio macro ImageJ a ddatblygwyd yn fewnol (dyddiad cyrchu: 15 Rhagfyr 2020). Yn fuan, rhannwyd delweddau ar gyfer podocytau unigol, cymhwyswyd y trothwy, a mesurwyd dwyster cymedrig, eu dadansoddi'n ystadegol a'u plotio. Cafodd yr holl ddelweddau eu prosesu gyda gosodiadau cyson a'u harddangos gyda'r un lliw ffug wedi'i addasu'n gyfartal ar gyfer sianeli unigol ar ddelweddau cyfun
Dadansoddiadau YstadegolPerfformiwyd dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddioGraphPadPrismv. 8.4.3software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, UDA). Mae'r holl ddata yn cael eu hadrodd fel cymedr ± SEM. Cyfrifwyd gwahaniaethau ystadegol gan ddefnyddio prawf-t pâr neu heb ei baru yn ogystal â dadansoddiad cydberthynas Pearson, fel y nodwyd.