Oligoglycosidau Phenylethanoid Acylated Gyda Gweithgaredd Hepatoprotective O'r Planhigyn Anialwch Cistanche Tubulosa
Mar 15, 2022
am ragor o wybodaeth:Ali.ma@wecistanche.com
Mae Toshiba Morikawa et al
Haniaethol
Mae'r dyfyniad methanolic o goesynnau ffres oCistanche tubulosa(Orobanchaceae) yn dangos effeithiau hepatoprotective yn erbyn D-galactosamine (D-GalN) / lipopolysaccharide (LPS) a achosir gan iau anafu llygod. O'r dyfyniad, tri newyddffenylethanoidynysu oligoglycosidau, kankanosides H1 (1), H2 (2), ac I(3), ynghyd ag 16glycosidau ffenylethanoid(4-19) a dau oligosiwgr asetlyd (20,21). Penderfynwyd ar strwythurau 1-3 ar sail priodweddau sbectrosgopig yn ogystal â thystiolaeth gemegol. Ymhlith yr unigion, echinacoside (4, IC50=10.2 lM), acteoside (5, 4.6 lM), isoacteoside (6,5.3 lM), 20-acetylacteoside (8, 4.8 lM), a tubuloside Roedd A (10, 8.6 lM) yn atal marwolaeth hepatocytes a achosir gan D-GalN. Mae'r pum ynysu hyn, 4 (31.1 lM), 5 (17.8 lM), 6 (22.7 lM), 8 (25.7 lM), a 10 (23.2 lM), a cistantubuloside B1 (11, 21.4 lM) hefyd wedi lleihau TNF-a- sytowenwyndra ysgogedig mewn celloedd L929. Ar ben hynny, dangosodd prif etholwyr (4-6) effeithiau hepatoprotective in vivo ar ddosau o 25-100 mg / kg, PO.
Cliciwch i cistanche sgîl-effeithiau a chynhyrchion Cistanche
1. Rhagymadrodd
Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) yn blanhigyn parasitig lluosflwydd sy'n tyfu ar wreiddiau o Salvadora neu Calotropisspecies, ac yn dosbarthu yng Ngogledd Affrica, Arabia, a gwledydd Asia.2Stems oCistanche tubulosayn ogystal â chymorth mae salsa a Cistanche deserticola wedi cael eu defnyddio'n draddodiadol ar gyfer trin analluedd, anffrwythlondeb, lumbago, a gwendid y corff yn ogystal ag asiant hyrwyddo cylchrediad gwaed.2,3 Yn flaenorol, nifer offenylethanoids, iridoids, monoterpenes, a lignans eu hynysu o Tsieineaidd a PhacistanCistanche tubulosa.2,4–9 Yn ystod ein hastudiaethau nodweddu ar gyfansoddion bioactif yn y feddyginiaeth naturiol hon, fe wnaethom adrodd yn flaenorol bod pum iridoid, kankanosides AD a kankanol, monoterpeneglycoside, kkanoside E, dauffenylethanoidRoedd oligoglycosidau, kankanosides F a G (23), a siwgr oligo acylaidd, kankanose(21), wedi'u hynysu o'r echdyniad methanolig o goesynnau sych oCistanche tubulosa. gan noradrenalin mewn aorta thorasig llygod mawr ynysig.11 Yn ein hastudiaethau parhaus ar gyfansoddion yn y planhigyn, mae detholiad methanolig o goesynnau ffres oRoedd Cistanche tubulescanfuwyd ei fod yn dangos effaith amddiffynnol ar anaf i'r afu a achosir gan D-galactosamine (D-GalN)/lipopolysaccharide (LPS) mewn llygod. O'r dyfyniad methanolig, rydym wedi ynysu tri newyddffenylethanoidoligoglycosidau a enwir kankanosides H1 (1), H2 (2), ac yr wyf (3) togetherwith 16 glycosidau ffenylethanoid (4-19) a dau oligosugars acylated (20, 21). Mae'r papur hwn yn ymdrin ag ynysu ac egluro'r strwythurau newydd hynffenylethanoidoligoglycosidau (1-3).Trafodir hefyd ofynion strwythurol y glycosidau ffenylethanoid ar gyfer gweithgaredd hepatoprotective (Ffig. 1).
2. Canlyniadau a thrafodaeth
2.1. Effaith amddiffynnol echdyniad methanolig o goesynnau oCistanche tubulosaar anaf i'r afu a achosir gan D-GalN/LPS mewn llygod
Coesynnau ffres oCistanche tubulosa(wedi'i drin yn Urumqi, XinjiangProvince, Tsieina) eu tynnu gyda methanol dan reflux toyield dyfyniad methanolic (8.36 y cant o'r coesynnau ffres). Fel y dangosir yn Nhabl 1, mewn dosau o 250-500 mg / kg, PO, dangosodd yr echdyniad methanolig effaith ataliol ar y cynnydd mewn serwm aspartate amino transaminase (sAST) ac alanine aminotransaminase (sALT), marcwyr anaf i'r afu, a achosir gan D- GalN/LPS mewn llygod.
2.2. Cyfansoddion cemegol o goesynnau oCistanche tubulosa
Dyfyniad methanolig o goesynnau ffresCistanche tubulosayn destun cromatograffaeth colofn Diaion HP-20 (H2O?MeOH) i roi ffracsiynau H2O- a MeOH-eluted (5.63 y cant a 2.73 y cant, yn y drefn honno). Bu'r ffracsiwn eliwiedig MeOH yn destun cromatograffi SiO2 ac ODScolumn ac yn olaf HPLC i ddodrefnu tri newydd.ffenylethanoidoligoglycosidau, kankanosides H1 (1, 0.0008 y cant ), H2(2, 0.0001 y cant ), ac I (3, 0.0007 y cant ) ynghyd â 16glycosidau ffenylethanoid, echinacoside2,11 (4, 0.45 y cant ), acteoside2,11 (5, 0.28 y cant ), isoacteoside2,11 (6, 0.0 41 y cant ), cis-acteoside12,13 (7, 0.0007 y cant ), 20-acetylacteoside2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 y cant ), decaffeoylacteoside14 (9, 0.0002 y cant ), ochr tubulo A2,11 (10, 0.013 y cant ), cistantubulosides B19 (11, 0.0020 y cant ), B29 (12,0.0003 y cant ), arenarioside15 (13, 0.0006 y cant), wiedemanninoside C16 (14,0.0008 y cant ), cistantubuloside A9 (15, 0.0009 y cant ), syringalide A 30-OaL rhamnopyranoside4 (16, 0.0017 y cant ), campneosides I17,18 (II17,1 y cant) a . , 0.0005 y cant ), a salidroside11 (19, 0.0027 y cant ), a dau oligosugars acylated, cistanoside F11 (20, 0.0004 y cant) a kankanose11 (21, 0.0004 y cant ).
2.3. Adeileddau cancanosidau H1 (1), H2 (2), ac I (3)
Cafwyd Kankanoside H1 (1) fel powdr gwyn gyda chylchdroi optegol negyddol (½a-24D-45.3 yn MeOH). Roedd ei sbectrwm IR yn dangos bandiau amsugno ar 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{107}}70, a 1040 cm 1 y gellir eu priodoli i hydrocsylau, ester carbonyls, swyddogaethau ether, a modrwyau aromatig. Dangosodd y sbectra ïon positif- a negyddol FABMS o 1 gopa ïon lled-foleciwlaidd ar m/z 835(M plws Na) plws a m/z 811 (MH), yn y drefn honno, a phennwyd y fformiwla foleciwlaidd fel C37H48O20 gan gadarnhaol cydraniad uchel- mesur ion FABMS. Dangosodd y sbectra NMR 1H a 13C o 1 (CD3OD, Tablau 2 a 3), a neilltuwyd gan wahanol arbrofion NMR,19 signalau y gellir eu neilltuo i ddau fethylen [d 2.70(2H, m, H2-7), 3.66 , 4.07 (1H yr un, y ddau m, H2-8)], ortho- andmeta-coupled ABC-math protonau aromatig [d 6.52 (1H, dd, J=1.8,7.8 Hz, H{ {50}}), 6.65 (1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 6.67 (1H, d, J=7.8 Hz,H{{62 }})], dau bD-glwcopyranosyl moieties [d 4.29 (1H, d, J=7.8 Hz,terminal-Glc-H-1), 4.54 (1H, d, J {{76 }}.2 Hz, mewnol-Glc-H-1)], a moiety aa-L-rhamnopyranosyl [d 1.06 (3H, d, J=6.0 Hz, Rha-H{{89 }}), 4.80 (1H, br s, Rha-H-1)] ynghyd â grŵp asetyl [d 1.98(3H, s)] a grŵp traws-p-coumaroyl {traws-olefin [d 6.34,7.67 (1H yr un, y ddau d, J=16.0 Hz, H-8 a 7)] ac ortho-cypluA2B2-teipio protonau aromatig [d 6.80, 7.46 (2H yr un , y ddau d,J=8.7 Hz, H-3,5 a 2,6)]}. Roedd cysyllteddau rhwng y moieties oligoglycoside ac acyl yn 1 yn cael eu nodweddu gan arbrawf gan HMBC, a ddangosodd gydberthynas hirfaith rhwng y parau proton a charbon a ganlyn: mewnol-Glc-H{-1 a C-8 (dC71.9 ); mewnol-Glc-H-2 [d 4.88 (1H, dd-like)] a'r asetyl carbonylcarbon (dC 171.4); mewnol-Glc-H-4 [d 5.08 (1H, dd, J=9.6, 9.6 Hz)]a'r carbonyl carbonyl p-coumaroyl (dC 168.2); Rha-H-1 a mewnol-Glc-C-3 (dC 80.5); a therfynell-Glc-H-1 a mewnol-Glc-C-6 (dC69.3) (Ffig. 2). Yn olaf, hydrolysis alcalïaidd o 1 gyda 5 y cant potasiwm hydrocsid (KOH) rhyddhau asid traws-p-coumaric, a nodwyd gan ddadansoddiad HPLC, ynghyd â chynnyrch deacylated. Cafodd y cynnyrch dadacylated ei drin yn olynol ag asid hydroclorig 1.0 M (HCl) i ryddhau L-rhamnose a D-glucose, a nodwyd gan ddadansoddiad HPLC gan ddefnyddio synhwyrydd cylchdro optegol.10,11 Felly, eglurwyd strwythur kankanoside H1 i fod {{181 }}(3,4-dihydroxy ffenyl)ethyl OaL-rhamnopyranosyl-(1- 3)-[bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl{{196} }}O-trans-p-coumaroyl-bD-glucopyranoside (1).
Cafodd Kankanoside H2 (2) ei ynysu fel powdr gwyn gyda chylchdroi optegol negyddol (½a 25 D 52.4 yn MeOH). Canfuwyd bod ei fformiwla foleciwlaidd C37H48O20 yr un fath â fformiwla 1 trwy fesur FABMS cydraniad uchel ïon positif. Roedd priodweddau sbectrosgopig 2 yn debyg iawn i rai 1, ac eithrio signalau oherwydd y grŵp cis-p-coumaroyl [d 5.79, 6.95 (1H yr un, y ddau d, J=12.8 Hz, H{{ 22}} a 7), 6.76, 7.73 (2H yr un, y ddau d, J=8.7 Hz, H-3,5 a 2,6)]. Ymhellach, datgelodd arbrawf HMBC ar 2 foddau tebyg o gydberthnasau amrediad hir i'r rhai a ganfuwyd ar gyfer 1 rhwng y parau proton a charbon a ganlyn: inner-Glc-H-1 [d 4.51 (1H, d, J {{44) }}.8 Hz)] a C-8 (dC 72.0); mewnol-Glc-H-2 [d 4.88 (1H, m)] a'r carbonyl carbonyl asetyl (dC 171.4); mewnol-Glc-H-4 [d 4.98 (1H, dd, J=9.6, 9.7 Hz)] a'r carbonyl carbonyl p-couaroyl (dC 166.7); Rha-H-1 [d 4.77 (1H, d, J=1.4 Hz, Rha-H-1)] a mewnol-Glc-C-3 (dC 80.7 ); a therfynell-Glc-H-1 [d 4.28 (1H, d, J=7.8 Hz)] a mewnol-Glc-C-6 (dC 69.4) (Ffig. 2) . Erbyn yr astudiaeth ddiraddio, rhoddodd 2 asid cis-p-coumaric a dau siwgr yr un fath â'r rhai a gafwyd yn achos 1. O ganlyniad, eglurwyd bod adeiledd kankanoside H2 yn 2-(3,4- dihydroxy ffenyl)ethyl OaL-rhamnopyranosyl-(1-3)- [bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl-4-O-cis-p-couaroyl- bD-glucopyranoside (2).
Roedd Kankanoside I (3) hefyd wedi'i ynysu fel powdr gwyn gyda chylchdroi optegol negyddol (½a- 25D-62.2 yn MeOH). Pennwyd ei fformiwla foleciwlaidd, C35H46O18, gan fesuriadau FABMS aHRFABMS cadarnhaol a negyddol. Roedd priodweddau sbectrosgopig 3(CD3OD, Tablau 2 a 3) yn arosodadwy ar rai echinacoside (4), ac eithrio signalau oherwydd y rhan aglycone {{dau methylenes {d 2.95 (2H, dd, J=7). 3, 7.8 Hz, H2-7), [3.79 (1H, m), 4.10 (1H,dt, J=16.9, 7.3 Hz), H{{32} }]}, protonau aromatig monosubstituted [d7.18 (1H, m, H-4), 7.26–7.28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Alcalinhydrolysis o 3 gyda 5 y cant KOH rhyddhau asid traws-caffeic, a thedeacylated cynnyrch ei drin yn olynol gyda 1.0 M HCl i ryddhau L-rhamnose a D-glwcos. Yn olaf, eglurwyd cysylltedd yr acylgroup a'r moieties siwgr yn 3 gan yr arbrawf HMBC, fel y dangosir yn Ffigur 2. Ar sail y dystiolaeth uchod, eglurwyd bod strwythur kankanoside I yn2-phenylethyl OaL- rhamnopyranosyl-(1-3)-[bD-glucopyrano-syl-(1-6)]-4-O-trans-caffeoyl-bD-glucopyranoside (3)
2.4. Effeithiau cyfansoddion cemegol o goesynnau Cistanche tubulosa ar sytowenwyndra a achosir gan D-GalN mewn hepatocytes llygod meithrin cynradd
Cydnabyddir bod anaf i'r afu a achosir gan D-GalN/LPS yn datblygu ymatebion trwy imiwnolegol.19 Adroddir bod y math hwn o anaf i'r afu yn digwydd mewn dwy ffurf. Yn gyntaf, mae sensitifrwydd i TNF-a trwy ddisbyddu ofuridine triphosphate mewn hepatocytes yn cynyddu gan D-GalN. Yn ail, mae cyfryngwyr pro-llidiol, fel NO a TNF-a, yn cael eu rhyddhau o macroffagau a weithredir gan LPS (celloedd Kupffer). Adroddir bod gan apoptosis ofhepatocytes gan TNF-a rôl bwysig mewn anaf i'r afu a achosir gan D-GalN/LPS.20
Yn ein hastudiaethau blaenorol ar gyfansoddion hepatoprotective o feddyginiaethau naturiol, fe wnaethom adrodd bod nifer o gyfansoddion o Hovenia Dulcis, 21 Bupleurum scorzonerifolium, 22,23 Curcuma zedoaria, 24-26Angelica furcijuga, 27,28 Betula sativum,30 Salacia reticulata,31 Tilia Anastaticea, hierochuntica, 33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium,41 a Piper chaba42,43 yn dangos effeithiau hepato-amddiffynnol ar yr anaf DLP-amddiffynnol ar yr anaf DLP-Neidiog a achosir gan DLP. mewn llygod a/neu platyphylla var. japonica,29 Effaith ataliol Pisum ar sytowenwyndra a achosir gan D-GalN mewn depatocytes meithriniad cynradd. Ers y dyfyniad methanolic o'r coesynnau oCistanche tubulosawedi dangos effeithiau hepatoprotective ar anaf i'r afu a achosir gan D-GalN/LPS mewn llygod (vide ante), archwiliwyd effaith ataliol y cyfansoddion ar sytowenwyndra a achosir gan D-GalN mewn hepatocytes llygoden meithrin cynradd gan ddefnyddio'r 3-(4,{) {6}}dimethylthiazol-2-yl)-2,5-assay bromid diphenyltetrazolium (MTT). Fel y dangosir yn Nhabl 4, echinacoside (4, IC50=10.2 lM), acteoside (5, 4.6 lM), isoaceteoside(6, 5.3 lM), 20-asetylacteoside (8, 4.8 lM), tubulosides A (10,8.6 lM) a B11 (22, 14.6 lM), a kkanoside G11 (23, 14.8 lM) yn dangos gweithgaredd cryf. Roedd eu gweithgareddau yn fwy na gweithgareddau silybin masnachol (38.8 lM), 33-43 fel rheolaeth gadarnhaol.44,45 Gofynion strwythurol yglycosidau ffenylethanoid for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) dangosodd yr aglycone sydd â'r grŵp 3,4-dihydroxy actifedd cryfach na'r hyn sydd â'r 4-grŵp hydroxy (6 > 23); (3)lleihawyd y gweithgaredd gan 60-ObD-glucopyranosyl moiety (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" roedd="" y="" rhan="" 8-obd-glucopyranosyl="" sydd="" â'r="" grŵp="" o-caffeoyl="" 40-yn="" dangos="" gweithgarwch="" cryfach="" na'r="" hyn="" sydd="" â'r="" 60-grŵp="" o-caffeoyl="" (5="6," 8=""> 22) ); a (5) roedd cyflwyno'r 20-O-acetylmoiety wedi lleihau'r gweithgaredd (8 5 5, 22 <>
Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, data heb ei ddangos). Felly, canfuwyd nad oedd y cyfansoddion hyn yn effeithio ar orgynhyrchu NO a TNF-a o macroffagau a weithredir gan LPS.
2.5. Effeithiau'r cyfansoddion cemegol ar TNF-a-cytowenwyndra ysgogedig mewn celloedd L929
Er mwyn egluro effeithiau'r cyfansoddion ar sensitifrwydd hepatocytes i TNF-a, gostyngiad a achosir gan TNF-a-a achosir yn hyfywedd celloeddL929, archwiliwyd llinell gell TNF-a-sensitif,48 gan ddefnyddio assay theMTT. Heb samplau prawf, gostyngwyd hyfywedd celloedd i ca. 60 y cant ar ôl deori'r celloedd gyda 20 ng/mL TNF-a am 44 h o'i gymharu â'r achos heb TNF-a. Fel y dangosir yn Nhabl 5, echinacoside (4, IC50=31.1 lM), acteoside (5, 17.8 lM), isoaceteoside (6, 22.7 lM), 20-asetylacteoside (8, 25.7 lM), roedd tubuloside A (10,23.2 lM), a cistantubuloside B1 (11, 21.4 lM) yn atal y gostyngiad yn hyfywedd y gell, a chanfuwyd bod eu gweithgareddau yn fwy na rhai piperine42,43 a silybin. Mae gofynion strwythurol yglycosidau ffenylethanoid for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; a (5) roedd cyflwyno'r 20-moiety O-asetyl wedi lleihau'r gweithgaredd(8 < 5,="" 22="">< 6).="" canfuwyd="" y="" gofynion="" hyn="" yn="" debyg="" i'r="" rhai="" a="" arsylwyd="" yn="" y="" bennod="" flaenorol="" ynghylch="" yr="" effeithiau="" ataliol="" ar="" sytowenwyndra="" a="" achosir="" gan="" d-galn="" mewn="" hepatocytes="" llygod="" diwylliedig="">
Mae'r canfyddiadau in vitro hyn yn awgrymu'r mecanweithiau gweithredu posibl canlynol ar gyfer effaith hepatoprotective cyfansoddion coesauCistanche tubulosa: (i) gostyngiad mewn sytowenwyndra a achosir gan D-GalN (4-6, 8, 10, 22, a 23), a (ii) gostyngiad mewn sytowenwyndra TNF-a-anwythol (4-6, 8, 10, ac 11) .
2.6. Effeithiau amddiffynnol echinacoside (4), acteoside (5), ac isoacteoside (6) yn erbyn anaf i'r afu a achosir gan lygod D-GalN/LPS a'u dull gweithredu
Yn olaf, archwiliwyd effaith yr egwyddorglycosidau ffenylethanoid, echinacoside (4), acteoside (5), ac isoacteoside (6) ar anaf i'r afu a achosir gan D-GalN/LPS mewn llygod. Fel y dangosir yn Nhablau 6 a 4-6 rhwystrodd yn sylweddol y cynnydd mewn sAST a sALT a achosir gan D-GalN/LPS mewn llygod ar ddosau o 25-100 mg/kg, PO. Ar y llaw arall, nid oedd 4-6 yn effeithio ar orgynhyrchu TNF-a o macroffagau a weithredir gan LPS. At hynny, roedd 4-6 yn atal marwolaeth celloedd L929 a achosir gan TNF-a yn sylweddol, gan ddangos gostyngiad yn sensitifrwydd celloedd L929 i TNF-a (vide ante). Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod 4-6 yn lleihau sensitifrwydd y celloedd hyn i sytowenwyndra a achosir gan TNF-a. Mae llawer o gyfansoddion sy'n atal marwolaeth celloedd a achosir gan D-GalN a chynhyrchiad TNF-a wedi'u hadrodd,24,26,32 ond ychydig o gyfansoddion a adroddwyd sy'n lleihau sensitifrwydd hepatocytes yn ddetholus i TNF-a.42,43,49,50
I gloi, o goesynnau ffres oCistanche tubulosa, tri newyddglycosidau ffenylethanoid, kankanosides H1 (1), H2 (2), ac I (3) ynghyd ag 16 hysbysglycosidau ffenylethanoid(4-19) ac oligosugars dauasylated (20, 21) yn ynysig. Roedd y gofynion strwythurol ar gyfer eu heffeithiau amddiffynnol ar anaf hepatocyte a achosir gan D-GalN, ac effeithiau cytoprotective ar gelloedd L929 a achosir ganTNF-a fel a ganlyn; (1) roedd y rhan aglycone yn hanfodol ar gyfer y gweithgaredd; (2) dangosodd yr aglycone sydd â'r grŵp 3,4-dihydroxy actifedd cryfach na'r hyn a wnaeth cael y 4-grŵp hydrocsi;(3) roedd y 60-miety ObD-glucopyranosyl wedi lleihau'r actifedd; (4)dangosodd y rhan 8-ObD-glucopyranosyl â'r 40-grŵp O-caffeoyl weithgarwch cryfach na'r hyn a oedd â'r 60-grŵp O-caffeoyl; a (5) cyflwyno'r {{27} }}Fe wnaeth moiety o-asetyl leihau'r gweithgaredd. Ymhellach, prifathroglycosidau ffenylethanoid, echinacoside(4), acteoside (5), ac isoacteoside (6), yn atal y cynnydd mewn insAST a sALT mewn dosau o 25-100 mg/kg PO mewn llygod wedi'u trin â D-GalN/LPS, ac awgrymwyd bod yr effeithiau ataliol hynny yn yn dibynnu ar lai o sensitifrwydd hepatocytes i TNF-a. Mae mecanweithiau manwl gweithredu'rglycosidau ffenylethanoiddylid eu hastudio ymhellach.
3. Arbrofol
3.1. Cyffredinol
Defnyddiwyd yr offerynnau canlynol i gael data sbectrol a ffisegol: cylchdroadau penodol, Horiba SEPA-300 polarimedr digidol(l=5 cm); sbectra UV, sbectromedr Shimadzu UV-1600; sbectra IR, sbectromedr Shimadzu FTIR-8100; sbectra 1H a 13C NMR, JEOLJNM-ECA600 (600 a 150 MHz) a sbectromedrau JEOL JNM-ECS400 (400 a 100 HMz) gyda tetramethylsilane fel safon fewnol; FABMS a FABMS cydraniad uchel, massspectrometer JEOL JMS-SX 102A; Synhwyrydd HPLC, Shimadzu RID-10Mynegai plygiannol, Shimadzu SPD{18}A UV-vis, a synwyryddion cylchdro optegol Shodex OR-2. Defnyddiwyd colofnau HPLC, Cosmosil 5C18-MS-II, a pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4.6 mm id) a (250 - 20 mm id) at ddibenion dadansoddi a pharatoi, yn y drefn honno.
Defnyddiwyd yr amodau arbrofol canlynol ar gyfer cromatograffaeth: cromatograffaeth colofn gel silica cyfnod arferol (CC), gel silica 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63-210 rhwyll, sfferig, niwtral ); gel silica cyfnod gwrthdroi CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) a Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 rhwyll); arferol-cyfnod TLC, cyn-gorchuddio TLC platiau withsilica gel 60F254 (Merck, 0.25 mm); TLC cyfnod gwrthdroi, platiau TLC wedi'u gorchuddio ymlaen llaw gyda gel silica RP-18 F254S (Merck, 0.25 mm); HPTLC cyfnod gwrthdroi, platiau TLC wedi'u gorchuddio ymlaen llaw gyda gel silica RP-18 WF254S(Merck, 0.25 mm), cyflawnwyd y darganfyddiad trwy chwistrellu gyda 1 y cant Ce (SO4) 2-10 y cant H2SO4 dyfrllyd, ac yna gwresogi .
3.2. Deunydd planhigion
Coesynnau ffres oCistanche tubulosaa dyfwyd yn Urumqi, Talaith Xinjiang, Tsieina eu casglu ym mis Medi 2007. Nodwyd y deunydd planhigion gan un o'r awduron (MY). Mae taleb ar gyfer y deunydd planhigion ar ffeil yn ein labordy.
3.3. Echdynnu ac ynysu
Mae coesynnau ffres oCistanche tubulosa(2.98 kg) wedi'u torri'n fân a'u tynnu dair gwaith gyda methanol o dan adlif am 3 h. Darparodd anweddiad y toddydd dan bwysau llai echdyniad methanolig (249.1 g, 8.36 y cant ). Roedd y dyfyniad methanolig yn destun Diaion HP 20 CC (5.0 kg, H2O?MeOH) i roi ffracsiynau eliwiedig H2O- a MeOH (167.84 g, 5.63 y cant a 81.21 g, 2.73 y cant , yn y drefn honno). Roedd y ffrithiant MeOH-eluted (61.00 g) yn destun i gel silica cyfnod normal CC[1.8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0.4?1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH] i roi saith ffracsiwn [Fr. 1 (1.12 g), 2 (9.56 g), 3 (0.89 g), 4(10.69 g), 5 (8.84 g), 6 (12.52 g), a 7 (4.60 g)]. Gwahanwyd y ffracsiwn 2(9.56 g) gan gel silica cam gwrthdro CC [400 g, MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?aseton] i roi pum ffracsiwn [Fr. 2–1 (55.9 mg), 2–2 (4.48 g), 2–3 (3.42 g), 2–4 (1.16 g), a 2–5(31.9 mg)]. Roedd y ffracsiwn 2–3 (1.00 g) yn destun HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN–1 y cant AcOH dyfrllyd (7:93, v/ v)] rhoi saith ffracsiwn [Fr. 2–3–1 (66.5 mg), 2–3–2 (20.4 mg), 2–3–3 (26.0 mg), 2–3–4 (136.6 mg), 2–3–5 (38{{300}}.6 mg), 2–3–7 (84.9 mg)]. Cafodd y ffracsiwn2-3-4 (106.6 mg) ei buro ymhellach gan HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (5:95, v/v)] i roi salidroside (19,13.7 mg, {{340}}.0{{409}}27 y cant ). Gwahanwyd y ffracsiwn 4 (10.69 g) gan gel silica ail-gyfnod CC [500 g, MeOH–H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?acetone] i roi pedwar ffracsiwn [Fr. 4–1 (878.2 mg), 4–2 (7.06 g), 4–3 (1.57 g), a 4–4 (792.8 mg)]. Roedd y ffracsiwn 4–2(1.5{{560}} g) yn destun HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 y cant AcOH dyfrllyd (2{{57{{586}) }}}:80, v/v)] i roi pum ffracsiwn {Fr. 4–2–1(42.9 mg), 4–2–2 [= campneoside I (17, 67.0 mg, 0.014 y cant)], 4–2– 3 [= acteosid (5, 1.21 g, 0.26 y cant)], 4-2-4 (41.6 mg), a 4-2-5(181.3 mg)}. Cafodd y ffracsiwn 4-2-4 (41.6 mg) ei buro ymhellach ganHPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (18:82, v / v)] i roi isoacteoside (6, 19.1 mg, 0.0040 y cant) a cis-acteoside (7,3.4 mg, 0.0007 y cant). Cafodd y ffracsiwn 4-3 (1.57 g) ei buro gan HPLC[Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (20:80, v/v)] i roi 11 ffracsiynau [Fr. 4–3–1 (30.4 mg), 4–3–2 (55.2 mg), 4-3-3 (= 17,22.1 mg, 0.0010 y cant), 4-3-4 ({{{= 5) , 224.6 mg, 0.010 y cant ), 4–3–5 (27.4 mg), 4–3–6 (43.6 mg), 4–3–7 (= 6, 825.0 mg, 0.037 y cant), 4-3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-rhamnopyranoside (16, 37.6 mg, 0.0017 y cant )], 4–3–9(39.8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetylacteoside (8, 85.4 mg, 0.0038 y cant )], a4-3-11 (64.6 mg)]. Cafodd y ffracsiwn 4-3-6 (43.6 mg) ei puri ymhellach gan HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (18:82,v / v)] i roi cancanosidau H1 (1, 17.0 mg, 0.0008 y cant ) a H2 (2,3.3 mg, 0.0001 y cant). Cafodd y ffracsiwn 4-3-9 (39.8 mg) ei buro ymhellach gan HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (18:82, v / v)] i roi kkanoside I (3, 15.4 mg, 0.0007 y cant) a 6 ( 3.1 mg, 0.0001 y cant). Gwahanwyd y ffracsiwn 5 (8.84 g) gan gelCC silica cyfnod gwrthdroi [400 g, MeOH-H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?acetone] togive saith ffracsiynau [Fr. 5–1 (870.2 mg), 5–2 (478.9 mg), 5–3(3.72 g), 5–4 (979.9 mg), 5–5 (1.19 g), 5–6 (1.27 g), a 5 –7(130.1 mg)]. Cafodd y ffracsiwn 5-1 (870.2 mg) ei buro gan HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN-1 y cant dyfrllyd AcOH (5:95, v/v)] i roi lacteoside decaffeoy (9, 5.1 mg, 0.0002 y cant) a cistanoside F ( 20, 8.1 mg,0.0004 y cant). Cafodd y ffracsiwn 5-3 (3.72 g) ei buro gan HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (15:85, v/v)] i roi chwe ffracsiynau [Fr. 5–3–1 (128.6 mg), 5–3–2 [= kankanose (21, 9.4 mg,0.0004 y cant )], 5-3-3 (64.6 mg), 5-3-4 (72.3 mg), 5-3-5 [= ochr echinaco (4, 2.54 g, 0.11 y cant ), a 5-3-6 (318.5 mg)]. Mae'r ffracsiwn 5-3-4 (72.3 mg) ei buro ymhellach gan HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 y cant dyfrllyd AcOH (10:90, v / v)] i roi campneoside II (18,10.6 mg, 0.0005 y cant ). Cafodd y ffracsiwn 5-4 (979.9 mg) ei buro gan HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (15:85, v / v)] i ffracsiynau givenine [Fr. 5–4–1 (28.6 mg), 5–4–2 (90.5 mg), 5–4–3(99.7 mg), 5–4–4 (= 4, 25.7 mg, 0.0012 y cant), 5 –4-5 (16.4 mg), 5-4-6(318.5 mg), 5-4-7 (21.6 mg), 5-4-8 (= 5, 204.4 mg, 0.0091 y cant), a5- 4–9 (134.7 mg)]. Cafodd y ffracsiwn 5-4-6 (318.5 mg) ei buro ganHPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (15:85, v / v)] i roi cistantubulosides B1 (11, 44.9 mg, 0.0020 y cant), B2 (12) , 7.6 mg, 0.0003 y cant ), ac A (15, 21.1 mg, 0.0009 y cant ) a wiedemanninoside C (14, 17.2 mg, 0.0008 y cant ). Cafodd y ffracsiwn 5-5 (1.19 g) ei buro gan HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (18:82, v/v)] i roi tubuloside A (10, 300.3 mg, 0.013 y cant ) ac arenarioside (13,5.8 mg, 0.0006 y cant ). Gwahanwyd y ffracsiwn 6 (12.52 g) gan gel silica cyfnod gwrthdro CC [600 g, MeOH-H2O (20:80?30:70,v/v)?MeOH?aseton] i roi pedwar ffracsiwn [Fr. 6–1 (553.8 mg), 6–2 (10.69 g), 6–3 (1.40 g), a 6–4 (17.8 mg)]. Cafodd y ffracsiwn 6-2 (500.0 mg) ei buro gan HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 y cant AcOH dyfrllyd (25:75, v/v)] i roi 4 (353.1 mg, 0.34 y cant) ).
3.3.1. Kankanoside H1 (1)
Powdr gwyn, ½a- 24D -45.3 (c 1.06, MeOH). Cydraniad uchel FABMS positif-ion: Calcd ar gyfer C37H48O20Na (M plws Na) ynghyd â : 835.2637.Found: 835.2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4.33), 293 (sh,4.36), 317 (4.52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: a roddir yn Nhabl 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: a roddir yn Nhabl 3. Positif-ion FABMS:m/z 835 (M plws Na) plws . FABMS ïon negyddol: m/z 811 (MH)-.
3.3.2. Kankanoside
H2 (2)Powdwr gwyn, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). Cydraniad uchel FABMS positif-ion: Calcd ar gyfer C37H48O20Na (M plws Na) ynghyd â: 835.2637. Wedi dod o hyd: 835. 2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4.26), 290 (sh, 4.22), 316(4.37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: a roddir yn Nhabl 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: a roddir yn Nhabl 3. FABMS positif-ion: m/z 835 (M plws Na) ynghyd â .Negative-ion FABMS : m/z 811 (MH)-.
3.3.3. Kankanoside I (3)
Powdr gwyn, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). Cydraniad uchel FABMS positif-ion: Calcd ar gyfer C35H46O18Na (M plws Na) ynghyd â : 777.2581.Found: 777.2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3.97), 295 (sh,4.04), 334 (4.23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: a roddir yn Nhabl 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: a roddir yn Nhabl 3. Positif-ion FABMS:m/z 777 (M plws Na) plws . FABMS ïon negyddol: m/z 753 (MH)-.
3.4. Hydrolysis alcalïaidd ac asid o 1–3
Trodd atebion o 1, 2, a 3 (pob un 1.5 mg) mewn 5 y cant o potasiwm hydrocsid dyfrllyd (KOH, 0.5 mL) ar 40 gradd am 1 h. Cafodd pob hydoddiant ei niwtraleiddio â Dowex HCR W2 (ffurflen H plws), a chafodd y resins eu tynnu trwy hidlo. Arweiniodd anweddiad y toddydd o dan bwysau llai at y cynhyrchion dadacyladwy cyfatebol, a oedd yn destun dadansoddiad HPLC [colofn: Cosmosil pNAP,250 - 4.6 mm id; cyfnod symudol: CH3CN-1 y cant dyfrllyd AcOH(15:85, v/v); canfod: UV (254 nm); cyfradd llif: 1.0 mL/munud] i'w nodi fel asid traws-gaffeig (tR 9.9 munud o 3), asid traws-p-coumarig (tR 17.1 munud o 1), ac asid cis-p-coumeric (tR17.8 mun o 2), yn y drefn honno. Yna cafodd pob un ei hydoddi mewn 1.0 MHCl (1.0 mL) a'i gynhesu ar 80 C am 3 h. Ar ôl cael ei oeri, cafodd y cymysgedd gweithredu ei niwtraleiddio ag Amberlite IRA-400 (ffurflen OH), a chafodd y resinau eu tynnu trwy hidlo. Ar ôl tynnu'r toddydd o dan bwysau llai, gwahanwyd y gweddillion gan golofn cetris Sep-Pak C18 (H2O?MeOH). Bu'r ffrithiant H2O-eluted yn destun dadansoddiad HPLC o dan yr amodau a ganlyn: colofn HPLC, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4.6 mm id - 250 mm(Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Japan); canfod, cylchdroi optegol[Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokyo, Japan); cyfnod symudol,CH3CN–H2O (85:15, v/v); cyfradd llif 0.8 mL/munud]. Cyflawnwyd adnabod L-rhamnose (i) a D-glwcos (ii) a ryddhawyd o 1, 2, neu 3 yn y ffracsiwn H2O-eluted trwy gymharu eu hamseroedd cadw a chylchdroi optegol â rhai samplau dilys [i,tR 9.9 mun (negyddol)] a [ii, tR 17.9 mun (cadarnhaol)].
3.5. Bio-assay
3.5.1. Adweithyddion
Prynwyd LPS (gan Salmonela enteritidis), cyfrwng hanfodol lleiaf (MEM), a chyfrwng E William gan Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, UDA); serwm buchol ffetws (FBS) yn dod o Invitrogen (Carlsbad, CA, UDA); a chemegau eraill yn dod o Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japan). 96-Wel prynwyd microblatiau oddi wrth Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Tokyo, Japan).
3.5.2. Anifeiliaid
Prynwyd llygod dDY gwrywaidd gan Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Japan). Cafodd yr anifeiliaid eu cartrefu ar dymheredd cyson o 23 ± 2 C a chawsant eu bwydo â chow labordy safonol (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japan). Perfformiwyd pob un o'r arbrofion gyda llygod ymwybodol oni nodir yn wahanol. Cymeradwywyd y protocol arbrofol gan Bwyllgor Ymchwil Anifeiliaid Arbrofol Prifysgol Kinki.
3.5.3. Effeithiau amddiffynnol ar lygod anaf i'r afu a achosir gan D-GalN/LPS
Cafodd y dull a ddisgrifiwyd gan Tiegs et al.51 ei addasu a'i ddefnyddio ar gyfer yr arbrawf hwn. Yn gryno, roedd llygod dDY gwrywaidd yn pwyso tua 25-30 gfast am 20 awr cyn yr arbrawf. Chwistrellwyd D-GalN (350 mg/kg) a LPS (10 lg/kg) wedi'u toddi mewn halwynog yn fewnberitoneol i gynhyrchu anaf i'r afu. Rhoddwyd pob sampl prawf ar lafar 1 h cyn y pigiad D-GalN/LPS. Casglwyd samplau gwaed o'r plecsws gwythiennol is-orbitol 10 awr ar ôl pigiad D-GalN/LPS. Penderfynwyd ar lefelau sAST andsALT gan ddefnyddio dull Reitman-Frankel (pecyn masnachol, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Defnyddiwyd hydrocortisone fel com punt cyfeirio. Ataliwyd samplau prawf gyda hydoddiant gwm Arabaidd 5 y cant, a rhoddwyd yr hydoddiant ar lafar ar 10 mL/kg ym mhob arbrawf, tra rhoddwyd y cerbyd ar lafar ar 10 mL/kg yn y grŵp rheoli sponding cywir.
3.5.4. Effeithiau amddiffynnol ar sytowenwyndra a achosir gan hepatocytes llygoden meithrinedig sylfaenol D-GalN
Pennwyd effaith hepatoprotective y cyfansoddion gan y {{{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) ) assay colorimetrig gan ddefnyddio hepatocytes diwylliedig cynradd. Cafodd ataliad cell mewn 4 - 104 o gelloedd mewn cyfrwng 100 lL William's E yn cynnwys FBS (10 y cant ), penisilin G (100 uned/mL), a streptomycin (100lg/mL) ei frechu mewn 96-microplaten ffynnon a wedi'i feithrin ymlaen llaw am 4 awr ar 37 gradd o dan awyrgylch CO2 5 y cant. Ychwanegwyd y cyfrwng â 100 lL o'r cyfrwng ffres sy'n cynnwys D-GalN(2 mM) gyda'r sampl prawf neu hebddo a chafodd yr hepatocytes eu meithrin am 44 h. Cyfnewidiwyd y cyfrwng â 100 lL o'r cyfrwng ffres, ac ychwanegwyd 10 lL o MTT [5 mg / mL mewn toddiant ffosffad-bufferedsaline (PBS)] at y cyfrwng. Ar ôl 4 h o ddeori, tynnwyd y cyfrwng, ac yna ychwanegwyd 100 lL o isopropanol yn cynnwys 0.04 M HCl i doddi'r formazan a gynhyrchir yn y celloedd. Mesurwyd dwysedd optegol (OD) y formazansolution gan ddarllenydd microplate ar 570 nm (cyfeirnod: 655 nm). Cafwyd ataliad ( y cant ) gan y fformiwla ganlynol.
Gwaharddiad ( y cant )= [(OD(sampl) - OD(rheolaeth))/(OD(normal)-OD(rheolaeth))] x 100
3.5.5. Effeithiau ar gynhyrchu NO mewn macroffagau llygoden peritoneol a ysgogir gan LPS
Perfformiwyd prawf sgrinio ar gyfer cynhyrchu NO gan ddefnyddio macroffagau peritoneol llygoden a achosir gan TGC fel y disgrifiwyd yn flaenorol.43,46,
3.5.6. Effeithiau ar gynhyrchu TNF-a mewn macroffagau llygoden peritoneol a ysgogir gan LPS
Pennwyd TNF-a a ryddhawyd yn y cyfrwng fel y disgrifiwyd yn flaenorol28 gydag ychydig o addasiad. Yn gryno, casglwyd macroffagau peritoneol a achosir gan TGC (5 - 105 celloedd/ffynnon) o geudodau peritoneol llygod dDY gwrywaidd, wedi'u hatal yn 100 lLof RPMI 1640 wedi'i ategu â 5 y cant FBS, penisilin (100 uned/ mL), a streptomycin (100 lg/mL), ac wedi'u rhag-ddiwyllio mewn 96-microblatiau ffynnon ar 37 gradd mewn 5 y cant o CO2 yn yr awyr am 1 h. Tynnwyd celloedd nonnadherent trwy olchi gyda PBS, a ychwanegwyd 100 lL o gyfrwng ffres yn cynnwys crynodiadau amrywiol o gyfansawdd prawf. Pennwyd TNF - cynhyrchiad ym mhob ffynnon gan ddefnyddio cit ELISA (Llygoden TNF - pecyn ELISA, Invitrogen). Diddymwyd pob cyfansoddyn prawf yn DMSO, ac ychwanegwyd yr ateb at y cyfrwng (crynodiad DMSO terfynol 0.5 y cant)
3.5.7. Effeithiau ataliol ar farwolaeth celloedd a achosir gan TNF mewn celloedd L929
Cafodd celloedd L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japan) eu cynnal yn Isafswm Eryr Canolig Hanfodol (MEM, Sigma-Aldrich) yn cynnwys 10 y cant FBS, 1 y cant MEM Asidau Amino An-hanfodol (Invitrogen), penisilin G (100 uned /mL), a streptomycin (100 lg/mL) ar 37 C o dan atmosffer 5 y cant CO2. Cafodd y celloedd eu brechu mewn 96-plât meithrin meinwe iach [3 -104 celloedd/wel mewn 100 lL/wel mewn MEM]. Ar ôl 44 h o ddeori yn y cyfrwngTNF-a (20 ng/mL) gyda'r sampl prawf neu hebddo, aseswyd hyfywedd y celloedd gan assay colorimetrig MTT (videante).49,50 Diddymwyd pob cyfansoddyn prawf yn DMSO, a thesolution ei ychwanegu at y cyfrwng ( crynhoad terfynol yn DMSO0.5 y cant ).
3.6. Ystadegau
Mynegir gwerthoedd fel modd ± SEM Defnyddiwyd dadansoddiad unffordd o amrywiant (ANOVA) ac yna prawf Dunnett ar gyfer dadansoddiad ystadegol. Ystyriwyd gwerthoedd tebygolrwydd (p) llai na 0.05 yn arwyddocaol.
Diolchiadau
Cefnogwyd TM, KN, ac OM gan Brosiect Cymorth Grant ar gyfer Ymchwil Wyddonol gan 'Ganolfan Ymchwil Uwch-dechnoleg' ar gyfer Prifysgolion Preifat: cymhorthdal cronfa gyfatebol o Gymorth Grant ar gyfer Ymchwil Gwyddonol gan y Weinyddiaeth Addysg, Diwylliant , Chwaraeon, Gwyddoniaeth a Thechnoleg (MEXT) o Japan, 2007–2011 a hefyd wedi'i gefnogi gan Gymorth Grant ar gyfer Ymchwil Gwyddonol gan MEXT. Cefnogwyd MY ac HM gan yr 21ain Rhaglen COE, Prosiect Ffiniau Academaidd, a Chymorth Grant ar gyfer Ymchwil Gwyddonol gan MEX
Oddi wrth: ' Acylatedffenylethanoidoligoglycosidau gyda gweithgaredd hepatoprotective o'r planhigyn anialwchCistanche tubulosa' ganMae Toshiba Morikawa et al
---Cemeg Bioorganig a Meddyginiaethol 18 (2010) 1882–1890.
