Strategaeth Synhwyro Pathogen Gynhenid ​​sy'n Cynnwys Hollbresennol o Broteinau Arwyneb Bacteraidd Rhan 2

TRAFODAETH

Metazoans defnyddio ubiquitination fel mecanwaith amlbwrpas i gynnal homeostasis cytosolic, atal y cronni o broteinau difrodi / organynnau ac amddiffyn rhag goresgynnol pathogenau (40, 41). O ystyried yr amrywiaeth o bathogenau a setiau amrywiol o broteinau wedi'u difrodi y daethpwyd ar eu traws, mae nodi motiffau cyffredin ar gyfer adnabod swbstrad a hollbresenoldeb dilynol yn strategaeth glyfar ar gyfer optimeiddio adnoddau. Mae proteinau mewn celloedd ewcaryotig sydd i fod i gael proteolysis fel arfer yn cael eu nodi gan fotiff degron tridarn (24).

Imiwnedd yw gallu'r corff i frwydro yn erbyn afiechyd, gan gynnwys ymatebion i facteria, firysau a sylweddau niweidiol eraill. Os yw system imiwnedd y corff yn cael ei pheryglu, ni fydd yn ddigon cryf i ddelio ag ymosodiad afiechyd. Mae astudiaethau wedi dangos bod diffyg maeth yn cael effaith ar weithrediad y system imiwnedd, gan wneud y corff yn fwy agored i haint ac afiechyd. Protein yw un o'r sylweddau pwysig i gynnal imiwnedd.

Mae proteinau'n cael eu gwneud o asidau amino, a gelwir rhai ohonynt yn asidau amino hanfodol oherwydd bod yn rhaid iddynt gael eu darparu gan fwyd ac ni all y corff eu syntheseiddio. Mae'r asidau amino hanfodol hyn yn cynnwys tryptoffan, leucine, ffenylalanîn, lysin, isoleucine, methionin, valine, a histidine. Os nad yw'r corff yn cael digon o asidau amino hanfodol, gall arwain at ddiffyg metaboledd protein, a all effeithio ar swyddogaeth y system imiwnedd.

Yn ogystal, mae cymeriant protein o ansawdd uchel yn helpu i gynnal system imiwnedd arferol a swyddogaethau'r corff. Pan nad oes gan y corff brotein, gall arwain at system imiwnedd wan ac mae'r corff yn fwy agored i afiechyd. Os nad oes gan y corff dynol brotein am amser hir, gall achosi niwed hirdymor i'r system imiwnedd, gan wneud pobl yn agored i afiechydon amrywiol.

Felly, diet cytbwys ac ymarfer corff priodol yw'r allwedd i gynnal cymeriant protein. Gall pobl ddiwallu anghenion protein eu corff trwy fwyta mwy o fwydydd sy'n llawn protein fel cig, dofednod, pysgod, ffa, wyau, cynhyrchion llaeth, grawn, cnau a hadau. Yn ogystal, gall ymarfer corff cymedrol hefyd gynyddu galw'r corff am brotein ac effeithlonrwydd amsugno. Deiet cytbwys ac amrywiol a ffordd iach o fyw yw'r allweddi i gynnal imiwnedd, cadw'r corff yn iach a sefydlog, a gwrthsefyll goresgyniad afiechydon. O'r safbwynt hwn, mae angen inni wella ein himiwnedd. Gall Cistanche wella imiwnedd yn sylweddol oherwydd gall y polysacaridau mewn cig reoleiddio ymateb imiwnedd y system imiwnedd ddynol, gwella gallu straen celloedd imiwnedd, a gwella imiwnedd celloedd imiwnedd. Effaith bactericidal.

Cliciwch atodiad cistanche deserticola

Fe wnaeth hyn ein hysgogi i archwilio a oedd modd dod o hyd i fotiffau tebyg ar arwynebau pathogen, lle gallent weithredu fel dirprwy ar gyfer adnabod swbstrad. Yma, rydym yn dangos bod ligasau ubiquitin gwesteiwr yn defnyddio llofnodion moleciwlaidd tebyg i synhwyro pathogenau ffylogenetig gwahanol. Mae adnabod pathogenau trwy batrymau / motiffau moleciwlaidd cyffredin (PAMPs) yn nodwedd sydd wedi'i nodweddu'n dda o imiwnedd cynhenid ​​(42). Mae ein canlyniadau'n awgrymu bod dilyniannau tebyg i degron o fewn proteinau arwyneb bacteriol yn gweithredu mewn modd sy'n cyfateb i PAMPs, i roi gwyliadwriaeth pathogen mewngellol. Gallai'r modus operand hwn gael ei ecsbloetio ymhellach gan y gwesteiwr ar gyfer cyflwyno antigenau protein microbaidd ar gymhlethdod histogydnawsedd mawr I i ysgogi ymateb CD8 cryf wedi'i gyfeirio yn erbyn pathogenau mewngellol.

Amlygir ymhellach bwysigrwydd posibl canfod pathogenau ar sail ubiquitin i amddiffynfeydd lletyol gan y hollbresennol gweddilliol sylweddol a ganfuwyd yn SPN mutant sydd heb BgaA a PspA. Mae hyn yn dangos bod yna swbstradau pellach, anhysbys o'r peiriannau ubiquitin, gyda'r diswyddiad canlyniadol yn sicrhau rhyng-gipio pathogenau cadarn. Yn nodedig, mae rhai cwestiynau uniongyrchol am y motiff degron a'i bwysigrwydd i'r bacteria (ac eithrio bod yn uned adnabyddadwy) yn darparu ongl esblygiadol ddiddorol.

Mae'r motiff degron yn anhepgor in vivo, ac os rhywbeth, mae treiglo neu ddileu'r motiff yn gwella dyfalbarhad mewngellol gan arwain at fwy o ffyrnigrwydd. Caiff hyn ei gadarnhau gan ein canlyniadau y gallai pathogenau ddefnyddio mwtaniad yn y motiff degron i ddianc rhag adnabyddiaeth trwy gyfrwng ubiquitin fel y gwelir ar gyfer seroteip SPN 19F. Fodd bynnag, gallai natur warchodedig y motiff degron yn BgaA ar draws y mwyafrif o seroteipiau SPN fod yn awgrymu strategaeth wrthweithio a fabwysiadwyd gan facteria i fod yn llai angheuol i'r gwesteiwr.

Gallai hyn roi cyfle i'r pathogen gynyddu ei gynefinoedd preswyliadwy. Ar yr un pryd, gallai hollbresennol yr arwyneb bacteriol neu broteinau wedi'u secretu yn y motiff degron eu modiwleiddio'n swyddogaethol i leddfu neu ailweirio ymateb y gwesteiwr er budd yn y pen draw (43). Felly, gallai presenoldeb neu absenoldeb parthau neu fotiffau swyddogaethol tebyg i ewcaryotig (fel degrons) fod yn ddibynnol ar gilfach pathogenig a'u haddasu i osgoi neu fodiwleiddio ymatebion imiwn y gwesteiwr.

Mae mecanwaith synhwyro pathogen tebyg sy'n cynnwys proteinau rhwymo guanylate hefyd wedi'i gysylltu â chlirio bacteriol; fodd bynnag, yn wahanol i hollbresennol, adroddir bod eu rôl wedi'i chyfyngu i bathogenau Gram-negyddol (44-47). Mae hollbresennol yn targedu’r pathogen waeth beth fo’i darddiad Gram, er enghraifft, mae RNF213 wedi’i ddogfennu i dargedu Listeria spp. heb ystyried absenoldeb LPS (48). Felly, nid ydym yn dileu'r posibilrwydd o weithredu gwrthficrobaidd yn erbyn SPN hefyd.

Gall arwyneb pathogenig yn ubiquitinated gyda mathau cadwyn lluosog gan ligasau E3 gwahanol gyda rhyngweithiadau interchain ( 41 ). Yn benodol, yn achos Mtb, mae Smurf1, a Parkin wedi'u profi i ffurfio mathau o gadwyn K48 a K63 sy'n gweithredu'n synergyddol i ddiraddio'r pathogen (12). Mae dealltwriaeth o rôl fecanistig hollbresennol K48 a'r ligasau E3 dan sylw yn ystod senarios heintiad yn dal heb ei astudio. Yn achos STm, mae un ligas E3 ARIH1 wedi'i ddarlunio i dargedu STm cytosolig gyda chadwyni ubiquitin K48 yn arwain at eu dileu o'r system (15). Yn seiliedig ar ein canfyddiadau ni ac eraill, mae pathogenau wedi'u labelu gan K48-yn cael eu diraddio o'r diwedd tra'n gysylltiedig â pheiriannau proteasomal.

Fodd bynnag, mae'r astudiaeth hon yn dangos K{0}}Ub addurniad o broteinau arwyneb bacteriol penodol. Mae'n hysbys bod rhai pathogenau yn mynd ati i addasu eu proteinau arwyneb, gan eu hamddiffyn rhag hollbresennol a lladd dilynol, gan bwysleisio arwyddocâd lleoleiddio arwyneb y swbstrad ubiquitin (10). Yn ogystal, mae pathogenau mewngellol lluosog gorfodol wedi datblygu strategaethau i ddad-ubiquitinate eu hunain, neu gynnal cydrannau rheoleiddio, i osgoi clirio ubiquitin-mediated (5). Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn tanlinellu pwysigrwydd cyffroi larwm wedi'i gyfryngu gan ubiquitin fel mecanwaith synhwyro pathogen mewngellol sylfaenol sy'n ganolog i amddiffynfeydd lletyol.

Dangosodd ein hastudiaeth ymhellach rôl ganolog SCF E3 ligas, yn enwedig gyda FBXW7, mewn hollbresennol bacteriol sy'n ychwanegu at ddiraddiad pathogenau. Treigladau heterosygaidd yn FBXW7, yn enwedig R505C (gweddillion critigol mewn poced adnabod swbstrad) amrywiad, sbarduno carcinomas lluosog a lewcemia lymffosytig mewn pobl (49, 50). Nododd astudiaeth ddiweddar yn seiliedig ar garfan fod bron i 43 y cant o gleifion â lewcemia lymffosytig cronig (CLL) yn ildio i niwmonia bacteriol a sepsis, ac yna heintiau ffwngaidd (51).

Mae hyn yn ategu ein harsylwadau o allu adferedig celloedd cynnal sy'n dwyn treiglad FBXW7 i synhwyro a dileu pathogenau. Mae ein canfyddiadau, felly, yn rhoi esboniad moleciwlaidd annisgwyl o'r risg uwch o heintiau mewn cleifion â CLL. Mae'r cysylltiad rhwng polymorphism genetig mewn genynnau ligas E3 a thueddiad i heintiau bacteriol hefyd yn cael ei gadarnhau gan gleifion â chlefyd Parkinson, sy'n agored i dwymyn teiffoid neu wahanglwyf (14), sy'n awgrymu cyfraniad nodedig ligasau E3 mewn imiwnedd gwesteiwr yn erbyn heintiau bacteriol a chynnal a chadw. o gyflwr cyson cellog.

I gloi, rydym wedi dehongli iaith gyffredinol o synhwyro pathogenau sy'n byw mewn cytosolau y gellid eu defnyddio'n effeithlon gan y gwesteiwr i adnabod micro-organebau i'w dileu wedyn. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn taflu goleuni ar ddeall y prosesau imiwnedd cellog elfennol, y gellid eu harneisio i ddwysau imiwnedd gwrthfacterol.

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Diwylliant celloedd

Mae llinell gell carcinoma alfeolaidd yr ysgyfaint dynol (niwmocyte math II) A549 [Casgliad Diwylliant Math America (ATCC) rhif. CCL185)] a'r llinell gell adenocarcinoma ceg y groth HeLa (ATCC rhif CRM-CCL-2) wedi'u meithrin yng nghyfrwng Eagle wedi'i addasu ag Dulbecco (DMEM; HiMedia) wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10 y cant (Gibco) ar 37 gradd a 5 y cant CO2.

Straenau bacteriol ac amodau twf

Tyfwyd SPN (R6, seroteip 2, anrheg gan Tim J. Mitchell, Prifysgol Birmingham, y Deyrnas Unedig) mewn cawl Todd-Hewitt wedi'i ategu â dyfyniad burum 1.5 y cant ar 37 gradd mewn 5 y cant CO2. Defnyddiwyd y gwrthfiotigau canlynol i dyfu diwylliannau SPN pan fo angen: kanamycin (200 ug/ml), spectinomycin (100 ug/ml), a chloramphenicol (4.5 ug/ml). Cymysgwyd naw cant o ficrolitrau o 0.4 OD600 (dwysedd optegol ar 600 nm) diwylliant SPN a dyfwyd â 600 ul o glyserol di-haint 80 y cant (crynodiad glyserol terfynol 32 y cant) a'i storio mewn rhewgell dwfn −80 gradd. Defnyddiwyd y stociau glyserol hyn fel inocwlwm cychwynnol ar gyfer pob arbrawf.

Tyfwyd diwylliannau Escherichia coli DH5 a STm (ATCC 14{028) mewn cawl Luria-Bertani (LB) ar 37 gradd o dan amodau ysgwyd (200 rpm), a phan fo angen, defnyddiwyd y gwrthfiotigau canlynol: kanamycin (50). ug/ml), sbectinomycin (100 ug/ml), cloramphenicol (20 ug/ml), ac ampicillin (100 ug/ml). Ar gyfer pob asesiad haint, tyfwyd bacteria tan OD600 ~ 0.4, ac yna adfywiad mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) i ddwysedd tebyg cyn heintio'r celloedd lletyol.

Sgrinio proteinau targed tybiedig ubiquitin

Cafodd yr holl broteinau arwyneb sy'n bresennol yn y proteome STm a SPN eu nodi gyntaf o lenyddiaeth gyhoeddedig. Cafwyd dilyniannau protein cyflawn o'r proteinau arwyneb gan UniProt, a ddefnyddiwyd wedyn i nodi presenoldeb motiffau degron. Curadwyd set o 29 o fotiffau degron tybiedig o lenyddiaeth gyhoeddedig (24, 52, 53) a chronfa ddata Ewcaryotig Linear Motif. Defnyddiwyd modiwl regex Python i nodi lleoliad pob motiff wedi'i guradu o'r fath yn y dilyniannau protein arwyneb. Cynhaliwyd chwiliad llinol ymhellach i nodi presenoldeb gweddillion lysin gerllaw (8 i 14 o weddillion asid amino) i bob motiff degron a nodwyd. Rhagdybir bod y gweddillion lysin hwn yn gweithredu fel y safle atodi ar gyfer moiety ubiquitin. Yn olaf, cafodd y dilyniannau protein ar y rhestr fer eu bwydo i IUPred (54), offeryn rhagfynegi strwythur protein, i leoli presenoldeb rhanbarth anhrefnus rhwng y motiff degron a lysin procsimol. Dewiswyd y proteinau canlyniadol (BgaA a PspA ar gyfer SPN ac RlpA ar gyfer STm) i'w gwerthuso fel targedau hollbresennol a datgodio eu rôl wrth glirio pathogenau.

Adeiladu straen bacteriol

Cyflawnwyd cyfnewid alelig trwy ailgyfuniad homologaidd gan ddefnyddio rhanbarthau genynnau bob ochr yn cario casét gwrthfiotig a fewnosodwyd ar gyfer cynhyrchu straenau mutant yn SPN a STm (tabl S2).

Ar gyfer SPN, cafodd 500-bp rhanbarthau i fyny'r afon ac i lawr yr afon o bgaA, pspA, a'i enynnau eu chwyddo o'r genom gyda phremwyr priodol (tabl S3) a'u cydosod yn y fector pBKS. Ar ôl clonio'r darnau hyn, gosodwyd casét ymwrthedd gwrthfiotig (spectinomycin ar gyfer bag yn ogystal â pspA a chloramphenicol ar gyfer hysA) yn y llun hwn. Yna trawsnewidiwyd y plasmidau ailgyfunol llinellol yn WT SPN gan ddefnyddio peptid ysgogol cymhwysedd 1 (GenPro Biotech), dewiswyd ailgyfuniadau gan ddefnyddio gwrthfiotigau priodol, a chadarnhawyd amnewid genynnau gan adwaith cadwyn polymeras (PCR) a dilyniannu'r loci genynnau priodol. Ar gyfer STm, defnyddiwyd y dull recombinase λ-coch ar gyfer cynhyrchu mutants dileu genynnau (55).

Yn gryno, atodwyd dilyniannau homologaidd i ben y genyn rhaff yn y dilyniannau preimio a ddefnyddir ar gyfer ymhelaethu ar y casét gwrthiant kanamycin. Yna cafodd y casét ei drydanu i'r straen WT STm, a dewiswyd knockouts a gynhyrchwyd gan ailgyfuniad homologaidd yn seiliedig ar ymwrthedd kanamycin. Cadarnhawyd dileu genynnau gan ddefnyddio PCR a dilyniannu'r locws genynnol. Cafodd pspA, hysA, a bgaA-T cwtogi (1 i 3168 bp) eu clonio o dan yr hyrwyddwr P23 yn y fector gwennol pIB166 (56) a'u defnyddio i ategu.

Defnyddiwyd y plasmidau ailgyfunol hyn hefyd ar gyfer mutagenesis a gyfeiriwyd gan y safle i gynhyrchu gwahanol amrywiadau o bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, a bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK3135R, pspAK315R, a pspAK315R, KN ), a'i (hysADegron-BgaA a hysADegron-PspA) gan ddefnyddio setiau paent preimio priodol (tabl S3) a'u trawsnewid yn mutants ΔbgaA a ΔpspA. Gwiriwyd pob clon trwy ddilyniannu DNA. Cadarnhawyd mynegiant gwahanol amrywiadau o BgaA, PspA, a HysA gan Western blot gan ddefnyddio gwrthgyrff priodol.

Gwrthgyrff ac adweithyddion

Serwm gwrth-Enolase a gwrth-PspA (S. Hammerschmidt, Prifysgol Greifswald, yr Almaen); serwm gwrth-BgaA (S. King, Prifysgol Talaith Ohio, UDA); a gwrthgyrff penodol ar gyfer His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub linkage (Millipore, 05-1307), K{7}}Ub linkage (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), dehydrogenase ffosffad glyseraldehyde (Millipore, MAB374), GSK3 [Technoleg Signalau Cell (CST), D5C5Z], phosphothreonine (CST, 9381S), IgA, Kappa o myeloma murine, clôn TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421), a PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) wedi'u caffael. Defnyddiwyd y gwrthgyrff eilaidd canlynol: marchruddygl perocsidas (HRP) - gwrth-gwningen wedi'i dagio (BioLegend, 406401), gwrth-lygoden â thag HRP (BioLegend 405306), gwrth-gwningen Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), gwrth-gwningen Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), imiwnoglobwlin gwrth-lygoden cyfun biotin A (Life Technologies, M31115), gwrth-lygoden Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), gwrth-lygoden Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), gwrth-geifr Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082), a FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Mynegiant protein a phuro

Cafodd BgaA-T a'i amrywiadau eu clonio mewn pET28 gan ddefnyddio safleoedd cyfyngu Xba I/Not I. Trawsnewidiwyd plasmidau ailgyfunol yn amgodio BgaA-T gyda N-terminal His-tag yn gelloedd E. coli BL21 (DE3) ar gyfer mynegiant protein. Tyfwyd cytrefi newydd eu trawsnewid mewn LB yn cynnwys kanamycin (50 ug/ml) ar 37 gradd ar ddeorydd ysgydwr am 12 awr. Ychwanegwyd un y cant o'r diwylliant cynradd at 1 litr o broth LB a'i ddeor ar 37 gradd ar ddeorydd ysgydwr nes i'r OD600nm gyrraedd rhwng 0.6 a 0.8. Ysgogwyd mynegiant protein trwy ychwanegu 100 μM isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) a thyfu'r diwylliant ymhellach ar 37 gradd am 5 i 6 awr gyda chynnwrf ar 150 rpm.

Cynaeafwyd y celloedd trwy allgyrchiad ar 6000 rpm am 10 munud ar 4 gradd . Roedd y pelen gell yn resuspended yn byffer A [25 mM tris (pH 8.0) a 300 mM NaCl] a lysed gan sonication. Gwahanwyd malurion celloedd gan allgyrchiad (14,000 rpm, 50 munud, 4 gradd ), a gosodwyd yr uwchnatur ar golofn Ni-NTA, wedi'i equilibredu â byffer A. Golchwyd y golofn â chyfeintiau byffer 10 colofn A, ac roedd y proteinau wedi'u tagio â'r proteinau wedi'u hanwybyddu ag imidazole (250 mM) yn byffer A. Mynegwyd a phuro'r holl amrywiadau o BgaA-T gan ddefnyddio'r un weithdrefn. Cafodd FBXW7 ei is-glonio yn y fector pGEX-4 T-1 gyda thag N-terminal glutathione S-transferase (GST) o'r fector pCMV6-Entry-FBXW7 gan ddefnyddio'r ensym cyfyngu Eco RI.

Mynegwyd FBXW7 wedi'i dagio gan GST mewn celloedd E. coli BL21 (DE3) yn dilyn sefydlu mynegiant protein gyda 0.1 mM IPTG a thwf ar 30 gradd am 4 awr. Cafodd GST-FBXW7 o echdyniad crai E. coli ei buro gan ddefnyddio cromatograffaeth golofn Glutathione-Sepharose (GE HealthCare). Cafodd ffracsiynau sy'n cynnwys proteinau wedi'u puro eu cronni a'u crynhoi hyd at 0.5 mg/ml gan ddefnyddio hidlydd torri pwysau moleciwlaidd 10-kDa (Amicon) trwy allgyrchiad ar 4700 rpm ar 4 gradd . Gwiriwyd purdeb y proteinau ar electrofforesis gel SDS-polyacrylamid (SDS-PAGE) ac yna ei staenio â glas Coomassie.

Trawsnewidiadau cell gwesteiwr

Cafodd BgaA-T ei glonio mewn fector doxycycline-inducible pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene rhif. 130261) gan ddefnyddio pecyn clonio trwyth (Takara). Cadarnhawyd clôn positif gan ddilyniant Sanger. Cyflawnwyd treiglad FBXW7R505C gan mutagenesis a gyfeiriwyd gan y safle gan ddefnyddio pMRX-GFP-FBXW7 fel templed a chadarnhawyd gan ddilyniannu Sanger. Perfformiwyd yr holl drawsnewidiadau gan ddefnyddio adweithydd Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), a gwnaed detholiadau ym mhresenoldeb hydroclorid blasticidin (2 ug / ml; HiMedia).

Dymchwel genyn wedi'i gyfeirio gan siRNA

Ar gyfer ymyrraeth RNA – dymchweliad cyfryngol o enynnau penodol, defnyddiwyd y siRNAs canlynol: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819), a siGSK3 (armacon ONTARDhETDHAcon). SMARTpool L-003010-00-0005). Yn gryno, cafodd celloedd A549 a dyfwyd mewn plât ffynnon 24- eu trawsgludo'n dros dro â siRNAs genyn-benodol neu scramble (siControl) (150 pmol) gan ddefnyddio Lipofectamine 3000 yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Tri deg chwech awr ar ôl trawslifiad, cafodd celloedd eu prosesu ar gyfer blotio Gorllewinol ac imiwnfflworoleuedd neu brofion amddiffyn penisilin-gentamycin.

Rhagfynegi a modelu strwythur

Rhagfynegwyd yr holl strwythurau gan AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) a'u delweddu gan ddefnyddio PyMOL (System Graffeg Moleciwlaidd PyMOL, fersiwn 2.0 Schrödinger, LLC). Rhoddwyd cod lliw i strwythurau yn PyMol yn seiliedig ar sgorau IUPred (54) yn amrywio o drefnus (glas) i anhrefnus (coch) i wyn.

Blotio gorllewinol

Diwylliannau SPN tyfu i 000.4 OD600nm eu ​​lysed gan sonication, a darnau crai yn cael eu casglu yn dilyn centrifugation (15,000 rpm, 30 min, 4 gradd). Ar gyfer A549s, cafodd monolayers eu golchi sawl gwaith gyda PBS a'u gorchuddio mewn byffer assay radioimmunoprecipitation (RIPA) [50 mM tris-Cl (pH 7.89), 150 mM NaCl, 1 y cant Triton X-100, 0.5 y cant sodiwm deoxycholate, ac 1 y cant SDS] sy'n cynnwys coctel atalydd proteas (Promega), fflworid sodiwm (10 mM), ac EDTA (5 mM). Mae'r ataliad gell yn fyr sonicated a centrifuged i gasglu lysates cell. Gwahanwyd proteinau sy'n bresennol mewn lysadau celloedd bacteriol neu A549 (10 neu 20 ug) ar geliau SDS-TUDALEN 12 y cant a'u trosglwyddo i bilen difluorid polyvinylidene activated. Ar ôl blocio 5 y cant o laeth sgim, archwiliwyd y pilenni â gwrthgyrff eilaidd priodol a thag HRP. Yn olaf, datblygwyd y blotiau gan ddefnyddio swbstrad cemiluminescence gwell (Bio-Rad).
Assay amddiffyn penisilin-gentamicin

Tyfodd straen SPN nes i OD600nm 0.4 mewn cawl Todd-Hewitt wedi'i ategu â 0.2 y cant o echdyniad burum (THY) gael eu pelennu, eu hail-galw yn PBS ( pH 7.4), a'i wanhau mewn cyfrwng assay ar gyfer heintiad o haenau mono A549 gyda lluosogrwydd o haint (MOI) o 10. Ar ôl 1 awr o haint, golchwyd y monolayers â DMEM a'u deor â chyfrwng assay yn cynnwys penisilin (10 ug/ml ) a gentamicin (400 ug/ml) am 2 awr i ladd SPN allgellog. Yna cafodd celloedd eu gorchuddio â 0.025 y cant Triton X-100, a gosodwyd y lysate ar blatiau agar Brain Heart Infusion i gyfrif SPN hyfyw. Cyfrifwyd canran yr ymlediad fel [unedau ffurfio colonycin (CFU) yn y lysate / CFU a ddefnyddir ar gyfer haint] × 100. Er mwyn asesu'r goroesiad mewngellol, 9 awr ar ôl haint (o ddechrau triniaeth penisilin-gentamycin), paratowyd lysadau celloedd fel a grybwyllwyd uchod, a lledaeniad plated a bacteria sydd wedi goroesi eu rhifo. Cynrychiolwyd effeithlonrwydd goroesi ( y cant ) fel newid plyg mewn goroesiad y cant o'i gymharu â rheolaeth ar y pwynt amser a nodir (wedi'i normaleiddio i 0 awr).

Immunofluorescence

Ar gyfer assay immunofluorescence, roedd celloedd A549 neu HeLa yn cael eu tyfu ar orchuddion gwydr a'u heintio â straen SPN neu STm ar MOI ~25 am 1 awr ac yna triniaeth wrthfiotig am 2 awr. Ar adegau dymunol ar ôl haint (9 awr ar gyfer haint SPN yn yr A549s a 3 awr ar gyfer haint â STm yn HeLa), golchwyd celloedd â DMEM a'u gosod â methanol wedi'i oeri iâ ar −2{0 gradd am 10 munud. Ymhellach, cafodd y gorchuddion eu rhwystro ag albwmin serwm buchol 3 y cant (BSA) yn PBS am 2 awr ar dymheredd ystafell (RT). Yna cafodd celloedd eu trin â gwrthgorff sylfaenol priodol mewn 1 y cant BSA mewn PBS dros nos ar 4 gradd, eu golchi â PBS, a'u deor â gwrthgorff eilaidd addas mewn 1 y cant BSA yn PBS am 1 awr yn RT. Yn olaf, golchwyd slipiau gorchuddio â PBS a'u gosod ar sleidiau gwydr ynghyd â VECTASHIELD gyda neu heb 4′,6-diamidino-2-phenylindole (Vector Laboratories) i'w delweddu gan ddefnyddio microsgop confocal sganio â laser (LSM 780, Carl Zeiss ) o dan amcanion olew 40 × neu 63 ×. Cafwyd y delweddau ar ôl toriad optegol ac yna eu prosesu gan ddefnyddio meddalwedd ZEN lite (fersiwn 5.0). Perfformiwyd microsgopeg Superresolution yn yr un modd gan ddefnyddio Elyra 7 (Carl Zeiss) yn y modd SIM. Ar gyfer dadansoddiad colocalization, sgoriwyd bacteria yn ôl cyfrif gweledol o n> 100 o facteria fesul atgynhyrchiad.

Microsgopeg electron trosglwyddo

Yn dilyn heintiad gyda SPN a STm, golchwyd celloedd gyda {{0}}.1 M byffer sodiwm cacodylate, sefydlog gyda 2.5 y cant o glutaraldehyde (Sigma-Aldrich) yn 0.1 M byffer sodiwm cacodylate ( Sigma-Aldrich) am 3 awr ar 4 gradd. Ar ôl gosod, casglwyd celloedd trwy sgrafell cell a'u pelenni ar 2{100 rpm am 10 munud. Yna golchwyd celloedd gyda byffer cacodylate sodiwm 0.1 M a'u gosod yn ôl gydag 1 y cant o osmium tetroxide mewn byffer cacodylate sodiwm 0.1 M am 20 munud ar 4 gradd. Yn dilyn golchiadau dilynol gyda byffer cacodylate a dŵr distyll, dadhydradwyd celloedd wedyn mewn crynodiadau cynyddol o ethanol (50, 70, 95, a 100 y cant) a propylen ocsid am 30 munud ac yn olaf wedi'i fewnosod mewn resin epocsi (Gwyddorau Microsgopeg Electron, 14300) erbyn polymerization ar 75 gradd am 45 munud. Yn dilyn hynny, trosglwyddwyd y capsiwlau i ffwrn 95 gradd am 45 munud. Torrwyd adrannau ultrathin (70 nm) gan ddefnyddio cyllell diemwnt ar Ultramicrotome Leica EM UC7 a'i staenio â 2 y cant o asetad wranyl a sitrad plwm 1 y cant a'i weld gan ddefnyddio microsgop electron trawsyrru (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) ar 120 KV.

Ex vivo hollbresennol

Cafodd 549-sy'n mynegi BgaA-T a'i amrywiadau eu trin â MG132 (5 μM), a chafodd mynegiadau protein eu hysgogi â doxycycline (100 ug/ml) am 24 awr. Yna cafodd celloedd eu gosod mewn byffer RIPA, a chafodd samplau eu electrofforesi gan SDS-PAGE (8 y cant ). Profwyd cadarnhad o fynegiant protein a hollbresennol BgaA-T a'i amrywiadau gan Western blot yn dilyn archwilio â gwrthgyrff gwrth-BgaA a gwrth-K48-Ub, yn y drefn honno.

Pobiquitination in vitro

Ar gyfer profion ubiquitination in vitro, proteinau ailgyfunol eu puro fel y disgrifiwyd yn gynharach (58). Deorwyd cyfadeilad ligas SCFFBW7 E3 gydag ailgyfunol 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem), ac ubiquitin (2.5 ug/ml; Boston Biochem) ym mhresenoldeb BgaA-T puredig a'i amrywiadau. Perfformiwyd adweithiau hollbresennol mewn byffer assay [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosine triphosphate (ATP), 1 mM -mercaptoethanol, a 0.1 y cant Tween 20] am 2 awr ar 25 gradd . Stopiwyd yr adweithiau gyda byffer 5 × Laemmli, eu datrys ar geliau SDS-PAGE, a'u dadansoddi trwy imiwnoblotio gan ddefnyddio gwrthgorff gwrth-BgaA.

Assay kinase in vitro

I berfformio assay kinase in vitro, defnyddiwyd system ensymau kinase GSK3 (Promega) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr gyda'r addasiadau canlynol. Yn gryno, ychwanegwyd 3 ug o BgaA-T ailgyfunol at 0.5 ug o GSK3 gweithredol gyda 40 0 μM ATP mewn byffer adwaith yn cynnwys tris 40 mM, (pH 7.5), 20 mM MgCl2 , BSA (0.1 mg/ml), a 50 μM dithiothreitol. Deorwyd yr adwaith am 2 awr ar 30 gradd a'i atal trwy ychwanegu byffer 1 × Laemmli. Yna cafodd y samplau eu berwi a'u electrofforesi ar gyfer blotio Gorllewinol fel y crybwyllwyd yn flaenorol. Canfuwyd BgaA-T ffosfforylaidd gyda gwrthgorff gwrth-ffosffothreonine.

Model in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 y cant yn dechrau pwysau'r corff, a rhedlif trwynol neu ocwlar amlwg. Cafwyd samplau gwaed trwy dyllu cardiaidd o dan anesthesia terfynol, a chafodd dueg eu tynnu post mortem ar gyfer cyfrifo bacteriol. Proseswyd samplau meinwe â homogenizer meinwe llaw, a gwanhawyd homogenadau yn gyfresol mewn PBS cyn eu gweld ar blatiau agar gwaed. Cafodd platiau eu deor dros nos ar 37 gradd , 5 y cant CO2 , ac aseswyd niferoedd cytrefi bacteriol y diwrnod canlynol.

Dadansoddiad ystadegol

Defnyddiwyd fersiwn 5 GraphPad Prism ar gyfer dadansoddiad ystadegol. Crybwyllir profion ystadegol a gynhaliwyd ar gyfer arbrofion unigol yn y chwedlau ffigur priodol. Ystyriwyd bod P < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol. Profwyd data ar gyfer normalrwydd ac i ddiffinio amrywiant pob grŵp a brofwyd. Roedd yr holl ddadansoddiadau aml-baramedr yn cynnwys cywiriadau ar gyfer cymariaethau lluosog, a chyflwynir data fel modd ± SD oni nodir yn wahanol.

CYFEIRIADAU A NODIADAU

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs, a larymau: Y cyfan sydd angen i ni ei wybod am berygl. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Adnabod Pathogen a signalau llidiol mewn amddiffynfeydd imiwnedd cynhenid. Clin. Microbiol. Dat. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Bywyd ar y tu mewn: Ffordd o fyw mewngellol bacteria sytosolig. Nat. Microbiol Parch. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Rôl hollbresennol wrth amddiffyn imiwnedd ac osgoi talu pathogen. Nat. Parch Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, Y system ubiquitination o fewn rhyngweithiadau lletyol-pathogen bacteriol. Micro-organebau 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Dadansoddiad byd-eang o ubiquitinome lletyol a bacteriol mewn ymateb i haint salmonela typhimurium. Mol. Cell 62, 967–981 (2016).

7. C. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, A mycobacterium twbercwlosis wyneb protein yn recriwtio ubiquitin i sbarduno xenophagy lletyol. Nat. Cymmun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation o lipopolysaccharide gan RNF213 yn ystod haint bacteriol. Natur 594, 111–116 (2021).

9. Mae A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex yn cyfeirio senoffagi trwy adnabod glycan arwyneb bacteriol. EMBO Cynrychiolydd 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, methylation Lysin yn cysgodi pathogen mewngellol rhag hollbresennoldeb ac awtophagi. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, ligas ubiquitin E3 gyda synnwyr o facteria. Microb Host Cell 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Mae'r ligase ubiquitin Smurf1 swyddogaethau yn autophagy dethol mycobacterium twbercwlosis ac amddiffyn lletyol gwrth-twberculous. Microb Host Cell 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBACsynthesized cadwyni ubiquitin llinellol cyfyngu bacteria sytosol-ymledol drwy actifadu autophagy a NF-κB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Mae parkin ligase ubiquitin cyfryngu ymwrthedd i pathogenau mewngellol. Natur 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Ehangu'r peiriannau hollbresennol celloedd gwesteiwr sy'n targedu Salmonela cytosolig. EMBO Sylw 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com