Effeithiau Gwrth-Heneiddio Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Detholiad Diwylliant Callus Trwy Broffilio Trawsgrifiadol
May 05, 2022
Cliciwch os gwelwch yn ddaoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Crynodeb:Edelweiss (Leontopodium Alpinum) yn y teulu Mae Asteraceae yn flodyn gwyllt sy'n tyfu mewn mannau calchfaen creigiog. Yma, gwnaethom ymchwilio i effeithiolrwydd dyfyniad diwylliant edelweiss callus (dyfyniad diwylliant Leontopodium Alpinum callus; LACCE) gan ddefnyddio profion lluosog o in vitro i in vivo yn ogystal â phroffilio trawsgrifio. Dangosodd nifer o ganlyniadau assay in vitro weithgaredd gwrthocsidiol cryf LACCE mewn ymateb i driniaeth UVB. Ar ben hynny, roedd LACCE yn atal llid a chrychni; fodd bynnag, cynyddwyd gweithgaredd lleithio gan LACCE. Dangosodd y prawf clinigol in vivo fod cymhwyso LACCE yn gyson ar feinweoedd yr wyneb a'r croen yn gwella crychau gwrth-periorbitol, elastigedd croen, dwysedd croen, a thrwch croen o'i gymharu â'r plasebo. Dangosodd canlyniadau Dilyniannu RNA fod o leiaf 16.56 y cant o enynnau dynol wedi'u mynegi mewn celloedd keratinocyte. Genynnau wedi'u huwchreoleiddio LACCE yn amgodio nifer o broteinau KRT; Roedd DDIT4, BNIP3, ac IGFBP3 yn ymwneud â rheoleiddio cadarnhaol y broses ddatblygiadol, marwolaeth celloedd wedi'i raglennu, keratinization, a chorneiddiad yn ffurfio rhwystrau croen, sy'n darparu llawer o fanteision i'r croen dynol. Mewn cyferbyniad, roedd genynnau wedi'u rheoleiddio i lawr yn enynnau ymatebol i straen, gan gynnwys metel, ocsidiad, clwyfo, hypocsia, a haint firws, gan awgrymu nad oedd LACCE yn achosi unrhyw straen niweidiol ar y croen. Dangosodd ein hastudiaeth gynhwysfawr fod LACCE yn asiant addawol ar gyfer colur gwrth-heneiddio.
Geiriau allweddol:wrth heneiddio; callws; edelweiss;celloedd croen; trawsgrifiad
1. Rhagymadrodd
Edelweiss (Leontopodium noble sub sp. Alpinum (Cass.) Greuter) yn y teulu Mae Asteraceae yn flodyn gwyllt sy'n tyfu mewn lleoedd calchfaen creigiog ar uchderau uchel, megis Alpau'r Swistir [1,2]. Oherwydd prinder ei flodau gwyn byrhoedlog, mae edelweiss yn cynrychioli harddwch a phurdeb sy'n gysylltiedig â'r Alpau a'r Carpathiaid. Yn ogystal, mae llawer o wledydd, gan gynnwys Awstria, Bwlgaria, Romania, Slofenia, a'r Swistir, yn ystyried edelweiss fel symbol cenedlaethol.
Am gyfnod hir, mae edelweiss wedi cael ei ddefnyddio fel meddygaeth draddodiadol yn erbyn poenau yn yr abdomen, broncitis, dolur rhydd, dysentri, a thwymyn [3, A]. Yn ddiweddar, mae sawl astudiaeth wedi dangos effeithiolrwydd darnau edelweiss ar gyfer gwrth-llid mewn llygod a llygod mawr [3] a keratinocytes dynol a chelloedd endothelaidd [4]. Yn ogystal, mae darnau gwreiddiau edelweiss yn cynnwys cyfansoddion sy'n gwella niwrodrosglwyddiad colinergig, gan nodi ei botensial ar gyfer asiantau gwrth-ddementia [5] a gwrthocsidyddion, megis
asid leontopodig A ac 35-asid caffeoylquinic, y gellir ei ddefnyddio fel cyfryngau gwrth-heneiddio [6]. Ar ben hynny, dangosodd y darnau edelweiss weithgaredd gwrthfacterol yn erbyn Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus niwmonia, a Streptococcus pyogenes, gan awgrymu eu defnydd ethnomedicinal posibl ar gyfer anhwylderau anadlol ac abdomenol [7].
Mae sawl astudiaeth flaenorol wedi dadansoddi cyfansoddion edelweiss. Er enghraifft, datgelodd y dull cromatograffaeth capilari 12 cyfansoddyn ffarmacolegol-bwysig, gan gynnwys flavonoidau, asidau caffeic, ac asid leontopodig, o rannau awyr edelweiss [8]. Er mwyn echdynnu gwrthocsidyddion o blanhigion edelweiss, mae dulliau cromatograffaeth rhaniad allgyrchol (CPC) a chromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC) wedi'u datblygu [6]. Mae'n hysbys bod cyfansoddion gweithredol darnau edelweiss rhwng y rhannau o'r awyr a'r gwreiddiau yn amrywiol[3]. Er enghraifft, mae gwreiddiau blewog edelweiss yn cynhyrchu lignans sy'n weithredol yn ffarmacolegol, megis mewngofnodi a 5-methoxy-login, y gellir eu hysgogi gan nifer o gydrannau eraill, megis arian nitrad, swcros, methyl jasmonate, a dyfyniad burum [ 9].buddion echdynnu cistancheAt hynny, mae patrymau metabolaidd 11 o wahanol rywogaethau Leontopodium wedi'u datgelu gan sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear (1H NMR) a sbectrometreg màs cromatograffaeth hylif (LC-MS) yn eu perthynas tacsonomeg [10].
Gallai Cistanche gwrth-heneiddio
Gellir diffinio callws planhigion fel masau celloedd di-drefn neu ddiwahaniaeth, sy'n hawdd eu hysgogi gan glwyfo i orchuddio clwyf planhigyn neu drwy gynnal system in vitro yn artiffisial. Mae callus planhigion yn cael ei feithrin yn artiffisial trwy ychwanegu maetholion a rheolyddion twf planhigion mewn amodau twf antiseptig. Ar hyn o bryd, mae'n bosibl cynhyrchu nifer uchel o gelloedd planhigion penodol gydag ansawdd cyfartal mewn bio-adweithydd. Ar ben hynny, mae gan gell planhigyn allu y cyfeirir ato fel totipotency, sef potensial genetig cell planhigyn i gynhyrchu'r planhigyn aeddfed cyfan [11]. Felly, mae'n bosibl cynhyrchu planhigyn aeddfed o'r callus planhigyn penodol. Ar ben hynny, gellir defnyddio callus yn eang ar gyfer adfywio planhigion i warchod planhigion prin ac mewn perygl [12,13].
Fel celloedd anifeiliaid, mae gan gelloedd planhigion alluoedd i hwyluso ysgogi ac adfywio planhigion ar ôl anaf [14]. Er bod bôn-gelloedd planhigion yn cael eu hystyried yn ddeunyddiau sy'n dod i'r amlwg yn y diwydiant cosmetig, mae'r deunyddiau sydd ar gael yn gyfyngedig. Mae'n bwysig nodi ffynonellau planhigion newydd a gwerthuso eu cydrannau swyddogaethol sy'n gysylltiedig â cholur.
Mae detholiadau Edelweiss yn adnabyddus am eu defnydd mewn asiantau fferyllol; fodd bynnag, anaml y caiff effeithiau dyfyniad edelweiss fel ffynhonnell cosmetig naturiol eu hadrodd. Yma, gwnaethom ymchwilio i effeithiolrwydd dyfyniad edelweiss callus (detholiad diwylliant Leontopodium Alpinum callus; LACCE) sy'n deillio o ddail edelweiss gan ddefnyddio profion lluosog o in vitro i in vivo a datgelwyd y mecanwaith moleciwlaidd a achosir gan LACCE gan ddefnyddio proffilio trawsgrifiad.
2. Defnyddiau a Dulliau
2.1. Cynhyrchiad o Edelweiss Callus
Prynwyd hadau Edelweiss yn fasnachol. Cafodd yr hadau edelweiss eu socian mewn 70 y cant o ethanol am y 3{5}}au ac yna eu golchi â dŵr distyll. Unwaith eto, ysgwyd yr hadau mewn 0.3 y cant sodiwm hypochlorit (Waco, Osaka, Japan) am 230 munud a golchi â dŵr distyll. Eginwyd yr hadau wedi'u sterileiddio ar gyfrwng Murashige a Skoog(MS) sylfaenol (Duchefa Biochemie, Haarlem, Yr Iseldiroedd). Torrwyd y dail edelweiss yn y cyflwr aseptig yn ddarnau bach (0.5 i 1 cm). Fe wnaethom ysgogi cam cynnar celloedd planhigion ar gyfrwng MS sy'n cynnwys 0.5-3 mg/mL o 6-Benzylaminopurine (6-BAP)(Duchefa Biochemie) a 0.3-1 mg/mL o 2,4-Asid dichlorophenoxyacetig (2,4-D)(Duchefa Biochemie) mewn tywyllwch ar 25 ± 2 gradd [15]. Addaswyd pH y cyfrwng MS i 5.8 gan ddefnyddio 1N o NaOH (Duchefa Biochemie). Roedd y callws anwythol yn cael ei luosogi yn y ddysgl petri. Diwylliwyd y llinell callus a ddewiswyd mewn bio-adweithydd yn Sefydliad Ymchwil Gwrth-Heneiddio BIO-FD&C Co., Ltd., Incheon, Korea. Roedd y callws diwylliedig yn cael ei gynaeafu a'i olchi deirgwaith â dŵr distyll.cistanche genghis khanCafodd y callus ei ddadhydradu gan ddefnyddio'r sychwr rhewi (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Korea) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Trowyd y callus edelweiss sych mewn dŵr distyll ar 50 gradd am 8 h. Cafwyd darnau Callus trwy echdynnu gwres ar 98 gradd am 10 munud.
2.2. Diwylliant Celloedd Croen Dynol
Cafodd effeithiau gwerthusol darnau edelweiss ar gelloedd croen dynol, celloedd keratinocyte(HaCaT), a ffibroblast arferol Detroit 551 (ATCC, Manassas, VA, UDA) eu meithrin yn Eryr Addasedig Canolig Dulbecco (DMEM)(Welgene, Gyeongsan-si, Korea). ) wedi'i ategu gan serwm buchol ffetws 10 y cant (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) ac 1 y cant gwrthfiotig-antimycotig (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) ar 37 gradd gyda chyflwr CO2 o 5 y cant.
2.3. Asesiad o Weithgarwch Metabolaidd Cell trwy Assay MTT
I asesu sytowenwyndra LACCE ar dwf cellog, ymlediad, a goroesiad celloedd croen dynol, mae MTT({{{{0}}(45-dimethylthiazol-2-yl){{3} },5-assay diphenyltetrazolium bromid) fel y disgrifiwyd yn flaenorol[16,17]. Yn gryno, deorwyd celloedd HaCaT a Detroit 551 ar ddwysedd o 5×10* celloedd fesul ffynnon, yn y drefn honno, mewn plât ffynnon 96- am 24 awr. Wedi hynny, cafwyd crynodiadau terfynol o 0.1 y cant , 0.5 y cant, ac 1 y cant LACCE eu trin am 24 awr. Defnyddiwyd dŵr distyll fel rheolydd. Ar ôl trin LACCE, tynnwyd y cyfrwng ac yna ychwanegu 4 μLof 5 mg/mL MTT （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA） a'i ddeor am 4 awr. Ar ôl tynnu'r cyfrwng, ychwanegwyd 100 μL o dimethylsulfoxide (DMSO)(Sigma) a'i ddiddymu am 10 munud.estyniad bywyd cistancheMesurwyd amsugnedd tonfedd ar 570 nm gan ddefnyddio Sbectrophotometer Microplate Thermo Scientific Multiskan GO (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, y Ffindir). Cafwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol. Hyfywedd celloedd ( y cant )=(swm yr amsugnedd ar gyfer celloedd wedi'u trin / faint o amsugnedd celloedd rheoli) × 100.
2.4. Asesiad o Weithgaredd Gwrthocsidiol gan Assay DPPH
Mesurwyd actifedd gwrthocsidiol LACCE mewn asesiad DPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazine-hydrate) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [18].Yn gryno, 0.1 mL o crynodiadau terfynol o 0.1 y cant , {{10}}.5 y cant , ac 1 y cant LACCE yn cael ei drin mewn 0.1 mL o 0.1 mM o DPPH (Sigma-Aldrich) ym mhresenoldeb 0.4 mL o ethanol. Fe wnaethon ni ddefnyddio 0.001 y cant o asid asgorbig (fitamin C)(Sigma-Aldrich) fel rheolaeth gadarnhaol. Cymysgwyd y samplau'n dda am 10s a'u deor ar dymheredd ystafell mewn amodau tywyll am 30 munud. Mesurwyd amsugnedd tonfedd ar 517 nm gan ddefnyddio Sbectrophotometer Microplate Thermo Scientific Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA). Cyfrifwyd y gweithgaredd sborionu radical gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol. Gweithgarwch chwilota ( y cant )=[1-(amsugno sampl prawf/amsugno rheolaeth)]×100.
2.5. Asesiad o Weithgaredd Gwrthocsidiol trwy Assay Hydrogen Perocsid(H2O2).
Mae hydrogen perocsid yn cynhyrchu radicalau di-ocsigen mewn celloedd, gan arwain at farwolaeth celloedd. Fe wnaethon ni brofi'r gyfradd marwolaethau celloedd a achosir gan hydrogen perocsid mewn samplau wedi'u trin â LACCE. Cafodd celloedd HaCaT ar ddwysedd o 5×105 cell y ffynnon eu deor mewn 24-plât ffynnon am 24 awr. Ar ôl hynny, cafodd crynodiadau terfynol o 0.1 y cant , 0.5 y cant , ac 1 y cant LACCE eu trin ym mhresenoldeb 1 mM o H, O, am 8 awr. Fel rheolaeth gadarnhaol, defnyddiwyd 0.033 y cant NAC (Sigma-Aldrich). Defnyddiwyd assay MTT i fesur cyfradd goroesi celloedd samplau wedi'u trin â LACCE a achosir gan HO2. Yn ogystal, rydym yn arsylwi morffoleg celloedd gan methylene staenio glas (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA).
2.6. Trawsgrifiad Gwrthdroi Amser Real (RT) -PCR
Er mwyn archwilio effaith LACCE ar wrth-wrinkle, moisturizing, a gwrth-llid, fe wnaethom gynnal RT-PCR amser real gyda preimwyr hysbys yn chwyddo genynnau marcio gan ddefnyddio QuantiTect Primer Assays (Qiagen, Hilden, yr Almaen) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafodd celloedd Detroit 551 ar ddwysedd o 5×104 cell y ffynnon eu deor mewn 96-plât ffynnon am 24 h. Ar ôl hynny, cafodd crynodiadau terfynol o 0.1 y cant , 0.5 y cant , ac 1 y cant LACCE eu trin am 24 h. Cafodd cDNA ei syntheseiddio o'r celloedd Detroit 551 priodol a gafodd eu trin â chrynodiadau LACCE gwahanol gan ddefnyddio Pecyn SuperPrep Cell Lysis & RT ar gyfer qPCR (Toyobo, Osaka, Japan) sy'n cynnwys adweithyddion lysis ac adweithyddion RT yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Ar gyfer yr effaith gwrth-wrinkle ar driniaeth LACCE, cafodd mynegiant yr amgodiad genyn Matrix Metalloproteinase-2(MMP-2) ei feintioli gan RT-PCR amser real gan ddefnyddio pecyn Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo) yn seiliedig ar gyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Ar gyfer gwerthuso lleithio trwy driniaeth LACCE, archwiliwyd mynegiant yr amgodiad genyn Aquaporin 3(AOP3) gan RT-PCR amser real. Yn achos yr assay gwrthlidiol, cafodd celloedd HaCaT ar ddwysedd o 5×104 cell y ffynnon eu deor mewn 96-plât ffynnon am 24h. Ar ôl tynnu'r cyfrwng, cafodd UVB ei arbelydru ar y celloedd HaCaT. Ar gyfer arbelydru UVB, defnyddiwyd 5 mJ/cm' gan flwch UV CL-1000 (Analytik Jena AG, Jena, yr Almaen). Ar ôl hynny, cafodd crynodiadau terfynol o 0.1 y cant, 0.5 y cant, ac 1 y cant LACCE eu trin am 4 awr. Fe wnaethon ni ddefnyddio dexamethasone(Dex)(Sigma-Aldrich) fel rheolydd positif. Ar gyfer effaith gwrthlidiol triniaeth LACCE, cafodd mynegiant genynnau sy'n amgodio COX2 ac iNOS, yn y drefn honno, eu mesur gan RT-PCR amser real. Cafodd mynegiant genynnau unigol ei normaleiddio i fynegiant genynnau GAPDH. 2.7. Gwerthusiad Clinigol o LACCE fel Asiant ar gyfer Cosmetics yn Vioo
Cynhaliwyd astudiaeth glinigol ar gyfer gwerthuso effeithiolrwydd LACCE ar godi wynebau a gwella crychau periorbitol, elastigedd croen, dwysedd croen, a thrwch croen gan gwmni Ellead ar ôl y gymeradwyaeth yn seiliedig ar weithdrefnau gweithredu safonol (Ver. 3.{{1}) }) (Ellead, Seongnam, Korea) o Ellead IRB yn unol â chanllaw Arferion Clinigol Da Korea (B1-2015-4-002) a ddisgrifir gan y Weinyddiaeth Diogelwch Bwyd a Chyffuriau (MFDS) a Gweithdrefnau Gweithredu Safonol Ellead (EL-P{ {4}}).
I archwilio effaith LACCE in vivo, fe wnaethom gynnal gwerthusiad clinigol o LACCE ar gyfer pedwar ffactor gwahanol: codi wyneb a gwella crychau periorbital, elastigedd croen, dwysedd croen, a thrwch croen. Ar gyfer hyn, cymerodd cyfanswm o 21 o wirfoddolwyr benywaidd gyda chyfartaledd o 48.04 ± 4.28 oed a rannwyd ymhellach yn 12 gwirfoddolwr yn eu 40au a naw gwirfoddolwr yn eu 50au, ran yn y gwerthusiad clinigol dros bedair wythnos.
Cynhaliwyd y prawf clinigol ar dri phwynt amser gwahanol, y llinell sylfaen, 2 wythnos, a 4 wythnos, ar gyfer yr holl wirfoddolwyr. O wythnos cyn dechrau'r astudiaeth tan y diwedd, ni chafodd yr holl wirfoddolwyr driniaethau ychwanegol i wella croen, colur a chymorth glanweithiol, a allai fod wedi effeithio ar y canlyniadau. Ar ôl golchi wynebau'r gwirfoddolwyr gan ddefnyddio'r ewyn glanhau, safodd y gwirfoddolwyr am o leiaf 30 munud mewn ystafell reoledig gyda thymheredd cyson (20-24 gradd ) a lleithder (40 y cant -60 y cant o leithder cymharol) . Fe wnaethom berfformio'r mesuriad ar hap ar ochr chwith neu ochr dde wynebau'r gwirfoddolwyr. Roedd ein prawf yn brawf dwbl-ddall lle nad oedd y pynciau na'r ymchwilwyr yn gwybod pa gynnyrch oedd yn sampl prawf. Disgrifiwyd fformwleiddiadau i gyfrifo’r cyfraddau gostyngol a chynyddol yn Nhabl 1.
2.8. Mesur Codi Wyneb a Gwella Crychau Periorbital
Ar y gwaelodlin, mesurwyd crychau periorbital, elastigedd croen, dwysedd dermol, trwch croen ar y boch, a chodi wyneb ar gornel y geg ar gyfer pob gwirfoddolwr. Ar ôl hynny, rhoddwyd dau sampl gwahanol, LACCE, a plasebo (rheolaeth), i'r rhan ddynodedig o'r wyneb ddwywaith y dydd (bore a nos). Rhannwyd gwirfoddolwyr yn ddau grŵp gwahanol, grŵp I (cafodd LACCE ei gymhwyso i'r ardal wyneb chwith tra rhoddwyd y plasebo ar yr wyneb dde) a grŵp II (gosodwyd y plasebo ar yr ardal wyneb chwith tra rhoddwyd LACCE ar y ardal wyneb dde). Dwy a phedair wythnos ar ôl y driniaeth, cynhaliwyd yr un mesuriadau i werthuso effaith LACCE o'i gymharu ag effaith y plasebo.
Dadansoddwyd crychau periorbitol gan ddefnyddio system optegol mesur croen 3D (dimensiwn) PRIMOS Cydraniad Uchel (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, USA), sy'n ddelfrydol ar gyfer ymchwilio i ficrostrwythur y croen a'r crychau. Dau baramedr garwedd gwahanol, Ra (garwedd cyfartalog), sef cyfartaledd gwerthoedd absoliwt uchder proffil y proffil garwedd, ac Rg (garwedd sgwâr cymedrig gwraidd), sef cyfartaledd sgwâr cymedrig gwraidd uchder proffil y proffil garwedd, eu mesur.
Daw'r erthygl hon o Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes