Effeithiau Gwrth-alergaidd A Gwrthlidiol Neferine ar RBL-2H3 Cells Plus
Jul 18, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
3. Trafodaeth
Nid yw pathogenesis dermatitis atopig (AD) yn cael ei ddeall yn llawn, ond caiff y clefyd ei gyfryngu gan ymateb imiwnedd globulin E (IgE) annormal mewn camweithrediad rhwystr croen. Yn eu plith, gall celloedd mast (MC) achosi clefydau alergaidd wedi'u cyfryngu gan IgE, gan gynnwys AD. Pan fydd celloedd mast yn cael eu hactifadu, maent yn rhyddhau eu gronynnau cytoplasmig wedi'u rhwymo â philen, gan arwain at ryddhau amrywiaeth o foleciwlau. Mae'r moleciwlau hyn yn chwarae rhan bwysig yn pathogenesis AD ac amddiffyniad gwesteiwr [27]. Oherwydd bod atal actifadu neu ddirywiad celloedd mast yn helpu i reoleiddio adweithiau gorsensitifrwydd amrywiol a gyfryngir gan IgE, mae celloedd mast yn un o'r targedau delfrydol ar gyfer archwilio cyffuriau gwrth-alergaidd. Yn ein hastudiaeth, mae mast-gelloedd yn cael eu digroenu mewn ymateb i gyfansoddyn 48/80 a'r ionoffor calsiwm A23187, a gwrth-DNP/IgE ynghyd â DNP/HSA. Canfuom fod cyfeirio i bob pwrpas yn atal effaith ddirywiad celloedd mast, gan ddangos ei adwaith gwrth-alergaidd. Ar ben hynny, rhwystrwyd y cynnydd mewn calsiwm mewngellol ac actifadu MAPK trwy gyfeirio. At hynny, gostyngwyd yr ymdreiddiad celloedd mast croen a achosir gan DNCB a'r ymddygiad crafu a achosir gan gyfansawdd 48/80 hefyd. Felly, mae mecanwaith dermatitis gwrth-atopig neferine yn cael effaith lluosydd ar keratinocytes a chelloedd mast.
La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria annormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, gan gynnwys EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a reacciones varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales for explorar fármacos antialérgicos. Yn yr estudio newydd, mae'r rhain yn cael eu dadansoddi ar sail cyfrifiadura 48/80 ac yn seiliedig ar galcio A23187, a gwrth-DNP/IgE ynghyd â DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracellular a activación de MAPK yn ataliadau i gyfeiriadau. Yn ôl pob tebyg, mae'n ymddangos bod y infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB a el compportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre queratinocitos a los mastocitos.
Mae cytoplasm celloedd mast a geir mewn meinweoedd wedi'i lenwi â gronynnau mawr, trwchus o gyfryngwyr llidiol a ffurfiwyd ymlaen llaw[28]. Gelwir y broses o ryddhau'r cyfryngwyr hyn o'r gronynnau cyfrinachol mewn celloedd mast yn ddirywiad. Gan y gall atal dirywiad celloedd mast reoli adweithiau gorsensitifrwydd amrywiol wedi'u cyfryngu gan IgE, mae celloedd mast yn un o'r targedau delfrydol ar gyfer archwilio cyffuriau gwrth-alergaidd [29,30]. Mae ein canlyniadau'n dangos bod cyfeirio yn cael effaith dda iawn ar ddirywiad celloedd mast waeth beth fo'r defnydd o antigen, symbylydd derbynnydd, neu ionoffor. Mae hyn yn dangos bod cyfeirnod yn asiant gwrth-alergedd posibl (Ffigur 2).
Gellir defnyddio'r holl ronynnau sydd wedi'u storio ymlaen llaw, cyfryngwyr sydd newydd eu syntheseiddio, a hyd yn oed gronynnau a'u cydrannau fel dangosyddion actifadu MC [31]. Yn ogystal, y dull safonol yw mesur crynodiad Ca4t mewngellol. Achosodd y rhan fwyaf o'r secretagogau MC (ee, antigen, cyfansawdd 48/80) a ddefnyddiwyd yn gyffredinol yn y labordy gynnydd yn y crynodiad mewngellol Ca2 ynghyd â chrynodiad. Mewn gwirionedd, gall y cynnydd mewn Ca2 mewngellol ynghyd â chrynodiad hefyd achosi dadgraniad MC. Fel arfer, mae'r cynnydd mewn Ca4t mewngellol yn cael ei achosi trwy actifadu MC gyda chyfansoddion, megis pympiau thapsigargin (yn benodol bloc Sarco / endoplasmic Ca2 ynghyd ag ATPase, SERCA) ac ionofforau (hy, ionomycin ac A23187) [32,33]. Felly, yn y activation MC Ca2t-ddibynnol, mae mesur mewnlifiad Ca2t hefyd yn cael ei ystyried yn ddull i bennu amodau activation MC. Mewn ymchwil MC, mae Fura-2 yn cael ei ddefnyddio'n eang ar gyfer pennu newidiadau Ca2 a mwy mewngellol. Yn ein harbrofion, canfuom fod dwyster fflworoleuedd celloedd mast actifedig wedi'i atal yn sylweddol ar ôl cael ei drin â chyfeirnod (Ffigur 3). Nododd adroddiadau blaenorol fod y cynnydd mewn crynodiad Ca4t mewngellol yn unol â rhyddhau histamin [34]. Felly, rydym yn casglu y bydd rhyddhau histamin hefyd yn cael ei atal gan y driniaeth cyfeirio. Mae angen arbrofion pellach i wirio'r ddamcaniaeth hon.
Mae gan gelloedd mast allbynnau swyddogaethol sylweddol wahanol.dos cistanche redditMae'r rhain yn cynnwys digroeniad, ffurfio rhagflaenwyr asid arachidonic, chemotaxis, a chynhyrchu cytocinau, ac maent i gyd yn dibynnu ar y signalau calsiwm i ryw raddau, waeth beth fo'r symbylyddion [32] Mae MC actifedig yn rhyddhau cytocinau, sef prif gyfryngwyr alergeddau a chlefydau llidiol [32] 35]. Mae cynhyrchu cytocinau gan gelloedd mast actifedig yn ganlyniad i sefydlu trawsgrifiad genynnau cytocin yn y celloedd hyn. Mae symbyliad celloedd mast yn arwain at actifadu NF-kB ac AP-1 a chynhyrchu llawer o cytocinau [36]. Mae llwybrau signalau rhaeadru MAPK yn chwarae rhan hanfodol wrth reoleiddio mynegiant cytocinau. Mae actifadu'r llwybrau hyn trwy actifadu PKC gan PI yn arwain at actifadu genynnau amrywiol, gan gynnwys genynnau cytocin llidiol megis IL-1 , IL-6, a TNF [37]. Mae ein hastudiaethau diweddar wedi dangos y gall cyfeirio atal y cytocinau a ryddheir trwy actifadu keratinocytes. Ar yr un pryd, canfuom hefyd y bydd gweithrediad llwybr MAPK hefyd yn cael ei atal gan drin cyfeirio [18]. Yn ein hastudiaeth gyfredol, gwnaethom ddangos y gallai cyfeirio hefyd leihau mynegiant cytocinau trwy atal actifadu MAPK mewn celloedd mast (Ffigurau 4 a 5). Mae actifadu NFkB hefyd yn cael ei leihau oherwydd ataliad actifadu MAPK (Ffigur 6).
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
Mae nifer o astudiaethau wedi nodi bod amrywiaeth o cytocinau mewn cleifion AD yn uchel, gan arwain at gamweithrediad rhwystr croen, gan gynnwys cytocinau wedi'u secretu gan keratinocytes a chytocinau sy'n deillio o Th2-[38,39]. Yn ogystal, adroddir y gall y cytocinau hyn sydd wedi'u secretu hefyd is-reoleiddio ymadroddion proteinau cyffordd dynn (T]) a genynnau gwahaniaethu terfynol, gan gynnwys filaggrin (FLG), loricrin (LOR), ac involucrin (IVL) [39,40 ](Pro)mae mynegiant filaggrin wedi'i leihau yn AD ac mae wedi'i gysylltu i'r gwrthwyneb â MC tryptase ac IL-6[41]. Mae IL-1 yn cyfryngu llid cronig mewn llygod â rhwystr croen â nam [35]. Mewn astudiaeth flaenorol, adroddwyd bod ymadroddion FLG, IVL, a LOR wedi'u dadreoleiddio ar ôl cymhwyso DNCB ar groen dorsal llygod NC/Nga[42,43]. Yn yr astudiaeth bresennol, gostyngwyd ymadroddion FLG, IVL, a LOR yn sylweddol yng nghroen dorsal y grŵp rheoli, a nododd fod nam ar y rhwystr epidermaidd. Adennillodd gweinyddu cyfeirio yn sylweddol fynegiadau gostyngol o FLG, IVL, a LOR ar ôl trin DNCB, tra bod gweinyddu cyfeirio wedi cynyddu mynegiadau IVL a LOR ychydig o gymharu â'r grŵp rheoli (Ffigur 8). Mae'n hysbys bod cyfansawdd 48/80 yn ysgogydd effeithiol o gelloedd mast croen. Gall ymateb y croen a ysgogwyd gan gyfansawdd 48/80 gymell ymddygiad crafu trwy ryddhau histamin o gelloedd mast [44]. Mae histamin sy'n cael ei ryddhau o gelloedd mast actifedig yn chwarae rhan bwysig yn y cynnydd mewn athreiddedd fasgwlaidd a achosir gan gyfansawdd 48/80. Yn ystod pruritus dynol, ystyrir hefyd histamin a ryddhawyd o gelloedd mast trwy wahanol ysgogiadau. ered i fod yn gyfryngwr pwysig. Felly, mae atal dirywiad celloedd mast yn gam pwysig wrth reoleiddio rhyddhau histamin yn ystod ymddygiad crafu. Yn y cyfansoddyn astudiaeth hwn, achosodd 48/80 actifadu celloedd mast croen yn effeithiol. Fodd bynnag, roedd rhag-driniaeth gyda chyfeiriad yn lleihau'n sylweddol lefel dadraniad celloedd mast (Ffigur 2).buddion echdynnu cistancheMae'r canlyniadau hyn yn dangos y gallai'r effaith ymddygiadol gwrth-crafu o gyfeirio fod oherwydd y gostyngiad mewn athreiddedd fasgwlaidd trwy reoleiddio dadraniad celloedd mast (Ffigur 9).
Fe'i sefydlir yn gyffredinol bod cleifion AD yn dioddef o gamweithrediad rhwystr croen, llid y croen, neu'r ddau, felly mae'n anodd dod o hyd i ddulliau triniaeth priodol. Felly, fel arfer argymhellir therapi cyfuniad. Mae ein hymchwil diweddar wedi profi nad oes ganddo erioed swyddogaeth imiwnofodwlaidd a gallu atgyweirio rhwystr. Felly, nodwedd gyfeirio bwysig mewn triniaeth AD yn y dyfodol yw cynnal swyddogaeth y croen a gwella hydradiad croen ac atgyweirio rhwystr. Gall cyfeirio hefyd leihau ymddygiad crafu a achosir gan alergenau a llidwyr. Ar ben hynny, mae'r orymdaith atopig yn glefyd sy'n gysylltiedig â ffenomen sy'n digwydd ac yn symud ymlaen gam wrth gam. Gwelir dermatitis atopig yn aml mewn babandod. Mae alergedd bwyd yn aml yn digwydd ar ôl 1-2mlwydd oed. Gall rhinitis alergaidd ddechrau cyn ac ar ôl ysgol yn aml. Mae symptomau asthma yn ymddangos ar wahanol adegau, ond mae'r rhan fwyaf ohonynt ar ôl rhinitis alergaidd. Ar ôl plentyndod, gall dermatitis atopig a rhai alergeddau bwyd wella neu ddiflannu. Nid yw'n hawdd gwella rhinitis alergaidd ac asthma[45,46]. Felly, maent yn ffenomenau comorbid mewn clefydau. Mae gan gynhyrchion naturiol, gan gynnwys cyfeiriadau, botensial therapiwtig comorbidrwydd, ac mae'n werth astudio eu heffeithiolrwydd mewn clefydau cysylltiedig yn y dyfodol.
4. Defnyddiau a Dulliau
4.1.Celloedd Lewcemia Basoffilig Llygoden Fawr
Roedd celloedd lewcemia basoffilig llygod mawr (RBL-2H3) yn anrheg gan TLHwang, Prifysgol Chang Gung, Taoyuan, Taiwan. Celloedd mast mwcosaidd yw celloedd RBL-2Celloedd H3 a ddefnyddir i astudio dirywiad a achosir gan antigen neu galsiwm, Ca4t mewngellol, a thrawsgludiad signal [29]. Cafodd y celloedd eu meithrin mewn EMEM sy'n cynnwys 10 y cant FBS, gyda phenisilin a streptomycin ar 37 gradd, 5 y cant CO2. Prynwyd Medium Medium (IM) Addasedig Iscove's Dulbecco a serwm buchol ffetws (FBS) gan Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, Efrog Newydd, NY, UDA).
4.2.MTT Assay
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{5}}diffenyl-2H-tetrazolium bromid (MTT) assay yn cael ei ddefnyddio i fesur gweithgaredd metabolig celloedd. RBL-2Cafodd celloedd H3 eu hadu mewn 24-plât meithrin yn dda ar 5 × 10 a mwy /wel. Ar ôl 24 h o driniaeth â chyffuriau, ychwanegwyd 30 μL MTI fesul ffynnon a'i osod mewn deorydd celloedd 37 gradd am2-4 h, yna diddymwyd crisialau formazan porffor â DMSO. Defnyddiwyd darllenydd ELISA i fesur dwyster yr amsugnedd ar donfedd o 550 nm fel prawf hyfywedd celloedd.
4.3.Mesur Lefel Ca2 a Mwy Mewngellol
[Ca2t] Cefais fy mesur gyda fura-2 fel y disgrifiwyd yn flaenorol[47].RBL-2Cafodd celloedd H3 eu hailddal yn IMDM yn cynnwys 5 uM Fura 2-AM a 1.2 mM CaClz ar 37 gradd ar gyfer 30 mun. Ar ôl llwytho Fura-2, cafodd keratinocytes eu pelennu a'u hailddarparu mewn DMEM ffres. Trosglwyddwyd aliquot (2 mL) i cuvette wedi'i droi yn cynnwys 1.2mM CaClz.Fura-2-Cafodd fflworoleuedd Ca ei assay ar donfeddi cyffro o 340 a 380 nm (tonfedd allyriadau, 505 nm) mewn PerkinElmer LS{{19 }} sbectrofflworomedr (PerkinElmer Bywyd a Gwyddorau Dadansoddol). Cofnodwyd data ar gyfnodau o 5s[47].
4.4. Adwaith Cadwyn Polymer Meintiol (qPCR)
RBL{{{{0}}Cafodd celloedd H3 eu plannu mewn dysgl feithrin 3.5 cm. Ar ôl i'r celloedd dyfu i 90 y cant yn llawn, tyfwyd y celloedd mewn cyflwr sefydlog am 24 h. Ar ôl i'r celloedd gael eu rhag-drin gan gyfeirio am 20 munud, cawsant eu hysgogi â TNF-a/IFN-y for1 neu 24h, yn y drefn honno. Cafodd y celloedd eu crafu i ffwrdd, eu centrifugio (16,000 × g, 10 munud, 4 gradd ), a chafodd y supernatant ei dynnu. Cafodd RNA ei buro gan ddefnyddio pecyn ynysu RNA cyfanswm (GeneDirex@, Vegas, NV, USA). Yn ôl gweithdrefn weithredol y sgript cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD), ychwanegwyd adweithyddion mewn trefn a'u gweithredu yn unol â'r amodau a nodir i drosi RNA yn cDNA.Furthermore, defnyddiwyd PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). Ychwanegwyd cyfanswm o 7.5 uL o ddH20,2 uL o cDNA, 0.25 μLof preimio ymlaen ac yn ôl, a 10 uL o SYBR GREEN a'u cymysgu'n unffurf. Dangosir y dilyniannau paent preimio yn Nhablau 1 a 2. Yna, cafodd RNA ei feintioli gan ddefnyddio System PCR Amser Real ABI StepOnePlusTM.
4.5. Assay Blotiau Gorllewinol
Defnyddir blotio gorllewinol i ddadansoddi newidiadau proteinau amrywiol mewn celloedd. RBL{{{0}}Cafodd celloedd H3 eu hadu mewn dysgl feithrin 3.5 cm. Ar ôl i'r celloedd dyfu i 90 y cant yn llawn a chael eu llwgu am 24 h, cawsant eu rhag-drin gyda chyfeiriad am 20 munud, ac yna eu hysgogi â TNF-a neu IFN-y am 30 munud neu 1 h, yn y drefn honno. Ar ôl crafu, cawsant eu malurio gan uwchsain a'u centrifugio (13,200 rpm, 10 munud, 4 gradd). Ar ôl centrifugio, cymerwyd y supernatant a mesurwyd y protein gyda phecyn assay protein Pierce (Pierce, Rockford, IL, UDA). Cafodd ei electrophoresed ar 10 y cant SDS-polyacrylamide gel ac yna electroporated gyda philen PVDF. Ar ôl i'r trosglwyddiad gael ei gwblhau, rhoddwyd y bilen PVDF mewn hydoddiant TBS-T (tris-buffered saline/0.05 percent tween 20) yn cynnwys 5 y cant o bowdr llaeth sgim a'i ysgwyd am 1 h i osgoi rhwymiad amhenodol. Yna, defnyddiwyd TBS-T i olchi 3 gwaith, 10 munud bob tro. Yna, ychwanegwyd gwrthgyrff cynradd (gwanhad 1:1000) a'u gosod ar 4 gradd dros nos ac yna eu golchi 3 gwaith gyda TBS-T bob 10 munud. Ar ôl ychwanegu gwrthgyrff eilaidd (wedi'i wanhau 1:1000) am 1 h, golchwyd y bilen PVDF 3 gwaith gyda TBS-T am 10 munud bob tro. Yn olaf, ychwanegwyd y datblygwr, a gosodwyd y bilen mewn system echdynnu luminescence cemegol (BIOSTEP Celvin") ar gyfer saethu.
4.6.Dinitrochlorobensen(2,4-Dinitrochloroben2ene, DNCB)Llid y Croen a achosir gan ddermatitis Atopig mewn Llygod
Yn gyntaf, rhannwyd y llygod yn bedwar grŵp: grŵp rheoli, grŵp DNCB (grŵp negyddol), cyfeiriad (3 mg / kg ac 10 mg / kg) gyda grŵp DNCB, a dexamethasone (0.2 mg / kg) gyda Grŵp DNCB (grŵp cadarnhaol). Mae dexamethasone yn hormon corticosteroid a all leihau chwyddo ac adweithiau alergaidd. Yn yr arbrawf in vivo hwn, diddymwyd y ddau gyfeiriad a dexamethasone yn DMSO, tra bod DNCB wedi'i ddiddymu mewn ethanol 75 y cant gan sioc ultrasonic. Rhoddwyd y cyntaf trwy chwistrelliad mewnperitoneol, ac ar gyfer yr olaf, rhoddwyd 100 uL ar y croen cefn a rhoddwyd 20 μL ar y glust dde. Tri diwrnod cyn yr arbrawf, cafodd y llygod eu anestheteiddio a chafodd y gwallt cefn ei dynnu, a gosodwyd magnet mesur bach (SCT-MAG-TF) ar gefn traed cefn y llygoden.cistanche genghis khanAr ôl gorffwys am dri diwrnod, cadarnhawyd bod y llygod mewn cyflwr corfforol da a bod y croen ar yr ardal diflewio dorsal yn normal, a dechreuwyd ar yr arbrawf. Yn ystod yr arbrawf, tynnwyd lluniau i gofnodi newidiadau ymddangosiad y croen. Y cam cyntaf ({{{0}} diwrnod) oedd y cyfnod o ddermatitis atopig alergaidd. Ar ôl mesur gwerthoedd sylfaenol llygod yn y grŵp DNCB, y cyfeiriad (3 a 10 mg / kg) a grŵp arbrofol DNCB, a'r grŵp arbrofol dexamethasone 0.2mg / kg a DNCB, cafodd DNCB 1 y cant ei gymhwyso'n gyfartal i'r croen cefn a glust dde. Ar y pumed diwrnod, chwistrellwyd y cyfeirnod cyffuriau a dexamethasone yn fewnberitoneol. Yr ail gam (diwrnod 5 i ddiwrnod 14) oedd ailsefydlu dermatitis atopig.estyniad bywyd cistancheYn y 3 grŵp arbrofol, roedd0.5 y cant DNCB wedi'i daeniadu'n gyfartal ar groen cefn a chlust dde'r llygod. Y diwrnod wedyn, cymerwyd a chofnodwyd gwerthoedd ffisiolegol y croen a lluniau. Ar ôl i'r llygod gael eu ewthaneiddio â gormod o garbon deuocsid (CO2) ar y 15fed diwrnod, tynnwyd meinwe'r croen dorsal ar gyfer dadansoddiad arbrofol dilynol.
4.7.Compound 48/80-Ymddygiad Crafu Anwythol mewn Llygod BALB/c
Torrwyd gwallt y croen ar gefn y llygoden, a chwistrellwyd 20 μL o hydoddiant cyfansawdd 48/80 yn fewngroenol. Derbyniodd y llygod rheoli chwistrelliadau halwynog yn lle hynny. Yn syth ar ôl y pigiad, gosodwyd yr anifail mewn cawell arsylwi (diamedr 11 cm, MicroAct, Niwrowyddoniaeth, Tokyo, Japan), a chafodd ymddygiad crafu'r llygoden ei ganfod a'i werthuso'n awtomatig ac yn wrthrychol. Mesurwyd yr ymddygiad crafu am 60 munud. Mae MicroAct yn defnyddio'r paramedrau dadansoddi canlynol i ganfod tonnau sy'n cyfateb i ymddygiad crafu parhaus llygod: trothwy, 0.05 V; bwlch digwyddiad,0.05 s; lleiafswm hyd,0.25 s; amledd uchaf, 30 Hz; amlder lleiaf, 5Hz. 4.8.Dadansoddiad Ystadegol
Defnyddiwyd meddalwedd Sigma-Plot (Fersiwn 10.0) ar gyfer y dadansoddiad ystadegol.cistanche nzMynegir data fel cymedr ± SEM, gyda(*) a(#) fel nodiadau. Dadansoddwyd arwyddocâd ystadegol y data gan werthoedd t-tests.p Myfyrwyr dwy gynffon di-bâr yn llai na 0.0 Ystyriwyd bod 5 a 0.01 yn arwyddocaol.
5. Casgliadau
Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom benderfynu bod cyfeiriad yn atal dirywiad celloedd mast yn effeithiol ac yn lleihau mynegiant cytocinau pro-llidiol, a all leihau symptomau tebyg i ddermatitis atopig, adfer rhwystr y croen, a lleihau crafu croen. Rydym wedi profi ymhellach y gall cyfeirio nid yn unig weithredu ar keratinocytes y croen ond hefyd effeithio ar actifadu celloedd mast. Mae ganddo fwy o botensial i'w gymhwyso mewn clefydau croen alergaidd ac ymfflamychol.
Mae'r erthygl hon wedi'i thynnu o Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms
