Effaith Gwrth-Melanogenig Detholiad Ethanolig Sorghum Deuliw Ar Felanogenesis a Achosir gan IBMX mewn Celloedd Melanoma B16/F10

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo, a Ho Jin Heo

Crynodeb:I werthuso posibilrwydd fel asiant gwynnu croen oSorghum deuliw(S. bicolor), eigwrthocsidiolgweithgaredd, ac effaith gwrth-melanogenig ar 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) a achosirmelanogenesisyn B16/F10 ymchwiliwyd i gelloedd melanoma. Mae canlyniad cyfanswm cynnwys ffenolig (TPC) yn dangos bod 60 y cant ethanol dyfyniad oS. deuliw(ESB) sydd â'r cynnwys uchaf na darnau ethanol eraill.Gwrthocsidyddgwerthuswyd y gweithgaredd gan ddefnyddio'r diammoniumsaltsalt 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-asid sulfonic) (ABTS)/1,1-diffenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) gweithgareddau sborionu radical ac effaith ataliol malondialdehyde (MDA). Dangosodd y canlyniadau hyn fod gan ESB arwyddocaolgwrthocsidiolgweithgareddau. Aseswyd effaith atal yn erbyn tyrosinase hefyd gan ddefnyddio L-tyrosine (gwerth IC50=89.25 µg/mL) a3,{5}}dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) fel swbstradau. Yn ogystal, roedd triniaeth ESB yn atal cynhyrchu melanin yn effeithiol mewn celloedd melanoma B16/F10 a achosir gan IBMX. I gadarnhau mecanwaith effaith gwrth-melanogenig ESB, archwiliwyd proteinau sy'n gysylltiedig â melanogenes. ESB wedi'i isreoleiddiomelanogenesistrwy leihau mynegiant ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia (MITF), tyrosinase, a phrotein sy'n gysylltiedig â thyrosinase (TRP)-1. Yn olaf, dadansoddwyd 9-asid hydroxyoctadecadienoig (9-HODE),1,3-O-dicaffeoylglycerol a tricin fel prif gyfansoddion ESB gan ddefnyddio polyn pedwarplyg symudedd cromatograffaeth hylif perfformiad theultra-perfformiad amser hedfan/sbectrometreg tandem (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gallai fod gan ESB y potensial ffisiolegol i'w ddefnyddio fel deunydd gwynnu croen.

Geiriau allweddol:gwrth-melanogenesis; cell melanoma B16/F10; asid hydroxyoctadecadienoig;Sorghumbicolor; 3-isobiwtyl-1-methylxanthine

Mae Cistanche yn atal ffurfio melanin.

1. Rhagymadrodd

Cynhyrchir melanin trwy broses o'r enwmelanogenesiso fewn melanosomau mewngellol melanocytes, ac mae cynhyrchu a dosbarthu melanin yn pennu lliw croen, llygaid a gwallt. Yn ogystal, mae melanin yn chwarae rhan hanfodol wrth amddiffyn croen rhag gwahanol foleciwlau ac ysgogiadau megis ymbelydredd uwchfioled (UV), rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), -melanocyte-stimulatinghormone (-MSH), ac asiantau dyrchafu adenosine monophosphate (cAMP) cylchol gan gynnwys forskolinand IBMX [1]. Yn benodol, mae ymbelydredd UV, yn uniongyrchol ac yn anuniongyrchol, yn niweidio celloedd croen trwy genedlaethau ROS fel radicalau hydroxyl, anionau superocsid, a hydrogen perocsid [2]. Mae'r ROS a gynhyrchir yn achosi DNA llinyn a dwbl yn torri ac yn ymosod ar foleciwlau strwythurol cellog pwysig fel proteinau a lipidau [2]. Felly, melanin agwrthocsidiolmae ensymau fel glutathione peroxidase, superoxide dismutase, a catalase yn cynnal lefel gyson trwy gael gwared ar y ROS a gynhyrchir. Fodd bynnag, mae cynhyrchu ROS gormodol o ganlyniad i ffactorau amrywiol yn actifadu melanogenesis yn y croen, ac mae'r cronni melanin annormal yn achosi effeithiau hyperpigmentation negyddol, gan achosi smotiau oedran neu afu, blotiau, a brychni haul [3,4]. Ar hyn o bryd, mae cyfansoddion naturiol fel asid kojic, hydroquinone, arbutin, asid andascorbig, a elwir yn atalyddion synthesis melanin, yn cael eu defnyddio fel ychwanegion croen gwynnu. Fodd bynnag, nid yn unig y mae gan y cynhwysion hyn dreiddiad gwael i'r croen ond hefyd achosicytowenwyndra a llid gyda gweinyddiaeth hirdymor [5]. Yn hyn o beth, mae angen datblygu asiant gwynnu nad yw'n llidus ac yn effeithiol i drin gorbigmentu croen dynol, yn ogystal ag astudio deunyddiau adnoddau naturiol ar gyfer hyn.

Mae celloedd croen dynol yn aml yn cynhyrchu melanin fel adwaith photoprotection. Mae Melanogenesis yn broses gymhleth sy'n cael ei rheoleiddio trwy amrywiaeth o lwybrau signalau, ac mae pob signal yn y pen draw yn uwch-reoleiddio MITF. Gan fod MITF wedi'i actifadu yn hyrwyddo mynegiant teulu genynnau tyrosinase (tyrosinase a TRPs),melanogenesisyn dechrau o ddifrif [6]. Yn gyffredinol, y cam cyntaf mewn melanogenesis yw bod tyrosinase yn cataleiddio ocsidiad L-tyrosine i 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), ac wedi hynny yn ocsideiddio L-DOPA yn DOPA quinone. Ac yna mae TRP-2 yn trosi DOPA chrome i 5,6-dihydroxyindole-2-asid carbocsilig (DHICA) neu 5,6-dihydroxyindole (DHI). Yn olaf, mae DHICA aDHI yn cael eu ocsidio gan TRP-1, gan arwain yn y pen draw at gynhyrchu melanin [6].

Mae IBMX a methylxanthines eraill yn ysgogi melanogenesis trwy atal ffosffodiesterase a thrwy hynny gynyddu lefelau cAMP [7]. cAMP wedi'i actifadu gan IBMX ffosfforyladau allgellog kinase allgellog a reoleiddir gan signal (ERK) a llwybrau signalau ffosffoinositide kinases / protein kinase B (PI3K / Akt) ac yn y pen draw yn arwain at actifadu MITF mewn prosesau melanogenesis [7]. Felly, gellir ystyried is-reoleiddio'r proteinau hyn yn ffactor pwysig ar gyfer yr effaith gwrth-gwyno.

Sorghum deuliw(S. bicolor), sy'n perthyn i'r teulu Poaceae, yn cael ei ystyried yn ranbarthau introfannol cnwd pwysig, gan gynnwys Affrica, Canolbarth America, a rhanbarthau cras, a dyma'r pedwerydd cnwd grawnfwyd pwysicaf yn y byd ar ôl gwenith, reis ac indrawn [8] ]. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod S. bicoloris o fudd i bobl oherwydd ei fod yn cynnwys ffytochemicals megis cyfansoddion ffenolig, tannin ac anthocyaninau [9]. Mae'r ffytogemegau hyn wedi ennill mwy o sylw oherwydd eugwrthocsidiol, gwrth-gordewdra, gwrth-diabetes, ac effeithiau gwrthlidiol [10-14]. Er bod canlyniadau ymchwil amrywiol, nid yw astudiaethau ar effaith gwynnu croen S. bicolor wedi'u cynnal eto. Felly, nod yr astudiaeth bresennol oedd ymchwilio i weithgaredd gwrthocsidiol ac effeithiau gwrth-melanogenigS. deuliwac i archwilio eu heffeithiau ar a achosir gan IBMXmelanogenesismewn celloedd melanoma B16/F10.

2. Defnyddiau a Dulliau

2.1. Cemegau

Folin - adweithydd Ciocalteu, L-DOPA, L-tyrosine, asid L-asgorbig, arbutin, acarbose, dimethylsulfoxide (DMSO), albwmin serwm buchol, -glucosidase, tyrosinase madarch, albwmin serwm buchol,3-(4,{ Prynwyd {6}}dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-bromid diphenyltetrazolium (MTT) ac IBMX oddi wrth Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, UDA). Prynwyd MITF (bsm-51339M) a tyrosinase (bs-0819R) gan Bioss (Beijing, Tsieina). Prynwyd TRP-1 (sc-166857) ac -actin (sc-69879) oddi wrth Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, UDA). Cafwyd gwrthgyrff eilaidd (gwrth-gwningen a gwrth-lygoden) gan Cell Signaling Technology (Danvers, MA, UDA).

2.2. Paratoi Sampl

S. deuliw(20 g) ei dynnu gyda chrynodiad ethanol amrywiol (0, 20, 40, 60, 80 a 95 y cant; 1L) ar 40 gradd am 2 h gan ddefnyddio cyddwysydd adlif. Hidlwyd y darnau gan ddefnyddio papur hidlo (WhatmanInternational Limited, Caint, UK), a'u crynhoi gan ddefnyddio anweddydd gwactod (N-1000; EYELA Co., Tokyo, Japan). Ar ôl i'r darnau gael eu lyoffileiddio gan ddefnyddio sychwr rhewi gwactod (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea), storiwyd y darnau sych ar -20 gradd nes eu defnyddio.

2.3. Gweithgaredd Gwrthocsidiol In Vitro

2.3.1. Cyfanswm Cynnwys Ffenolig (TPC)

Archwiliwyd cyfanswm y cynnwys ffenolig yn seiliedig ar yr egwyddor bod adweithydd Folin-Ciocalteu yn lleihau i gynnyrch adwaith glas o dan amodau alcalïaidd. Sampl (1 mL) wedi'i gymysgu ag adweithydd Folin-Ciocalteu a 7 y cant o sodiwm carbonad. Cafodd y cymysgedd ei actifadu am 2 h, ac yna mesurwyd yr amsugnedd ar 760 nm gan ddefnyddio sbectrophotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan). Cyfrifwyd TPC o gromlin safonol asid galig a mynegwyd y canlyniadau fel GAE g−1.

2.3.2. Gweithgaredd Sborion Radical

Cynhyrchwyd hydoddiant cation radical ABTS trwy gymysgu 2.45 mM persulfate potasiwm a 7 mMABTS gyda byffer potasiwm ffosffad 10{{10}} mM (pH 7.4) yn cynnwys 150 mM a chaniatáu maent yn ymateb am 24 awr ar dymheredd ystafell. Yna cafodd hydoddiant ABTS ei wanhau â dŵr distyll i gael amsugnedd o 0.700 ± 0.020 ar 734 nm. Caniatawyd i'r sampl adweithio â 980 µL o'r ABTSsolution am 10 munud ar 37 gradd ac yna mesurwyd amsugnedd ar 734 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan). Paratowyd hydoddiant radical DPPH gan hydoddi 0.1 mM DPPH mewn methanol 80 y cant. Gwanhawyd y DPPHsolution i amsugnedd o 1.000 ± 0.020 ar 517 nm. Cymysgwyd 50 µL o'r sampl ag 1.45 mL o'r hydoddiant DPPH a'i adweithio am 30 munud yn y tywyllwch. Ar ôl adweithio, penderfynwyd bod y gymysgedd yn 517 nm.

2.3.3. Effaith Ataliol ar Berocsidiad Lipid

Er mwyn mesur yr effaith ataliol ar berocsidiad lipid ym meinwe'r ymennydd, defnyddiwyd y dull sylwedd adweithiol asid thiobarbitwrig (TBA). Cafodd meinwe'r ymennydd ei homogeneiddio mewn byffer Tris-HCl 20 mM (pH7.4) a'i allgyrchu ar 6000 × g am 20 munud. Ychwanegwyd y supernatant at 0.1 mM asid L-asgorbig a 10 µM sylffad fferrus 37 gradd ar gyfer deor 1 h. Nesaf, ychwanegwyd 30 y cant o asid trichloroacetig ac 1 y cant i'w gadarnhau at y cymysgedd, a gafodd ei ddeor wedyn mewn baddon dŵr ar 80 gradd am 20 munud. Yna, mesurwyd y TBA-MDAcomplex gan ddefnyddio sbectrophotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) ar 532 nm.

2.4. Effaith Ataliol Tyrosinase

Penderfynwyd ar effaith ataliol tyrosinase gan ddefnyddio L-tyrosine fel swbstrad. Ychwanegwyd sampl at 96-blat ffynnon a'i gymysgu â 0.1 M byffer sodiwm ffosffad, tyrosinase a 0.1 mML-tyrosin swbstrad i adweithio ar 37 gradd . Ar ôl deori, mesurwyd gweithgaredd ensymau gan ddefnyddio darllenydd microplate (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, UDA) ar 490 nm. Hefyd, defnyddiwyd L-DOPA fel swbstrad i fesur gweithgaredd ataliol tyrosinase. Ychwanegwyd byffer sodiwm ffosffad 67 mM, tyrosinase a swbstrad 10 mML-DOPA at y sampl i adweithio ar 37 gradd am 10 munud. Mesurwyd gweithgaredd tyrosinase ar 415 nm.

Mae Cistanche yn atal ffurfio melanin

2.5. -Glucosidase Effaith Ataliol

Mesurwyd effaith ataliol -glucosidase trwy gymysgu 0.1 M sodiwm phosphatebuffer a -glucosidase ar 37 gradd am 10 munud. Ar ôl ei actifadu, ychwanegwyd y gymysgedd at 5 mM4-nitrophenyl- -D-glucopyranoside mewn byffer ar 37 gradd am 5 munud, ac yna mesurwyd yr amsugnedd ar 405 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, UDA).

2.6. Assay Hyfywedd Celloedd

Amcangyfrifwyd sytowenwyndra'r sampl gan ddefnyddio assay MTT. Cafodd celloedd melanoma B16/F10 eu meithrin ar 1×104cells/wel mewn 96-plât ffynnon am 24 awr. Wedi hynny, cafodd samplau eu trin i grynodiadau 1, 2, 5 a 10 µg/mL. Cafodd samplau eu trin am 48 h, ac ar ôl hynny cafodd y celloedd eu trin â 10 µg/mL o doddiant stoc MTT am 3 h. Yn olaf, tynnwyd cyfryngau, ac ychwanegwyd DMSO i ddatrys y formazan. Mesurwyd maint y formazan gan ddefnyddio darllenydd microplate (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, UDA) ar 570 nm (tonfedd cyffro) a 655 nm (tonfedd allyriadau).

2.7. Mesur Cynnwys Melanin Cellog

I fesur maint y melanin, cafodd celloedd melanoma B16/F10 eu meithrin mewn 24-plât ffynnon ar ddwysedd o 4×104cells/ymhell uwchlaw am 24 h. Yna, cafodd y celloedd eu trin â 100 mM IBMX a rheolaeth orpositive ESB (arbutin) am 48 h ychwanegol. Ar ôl y driniaeth, cafodd y celloedd eu golchi a'u cynaeafu gan ddefnyddio halwynog byffer ffosffad (PBS). Yna cafodd y celloedd a gynaeafwyd eu centrifugio ar 16,000 × g am 10 munud, a diddymwyd y belen a gafwyd â sodiwm hydrocsid 1 N yn cynnwys 10 y cant DMSO ar 90 gradd am 20 munud. Mesurwyd y cynnwys melanin ar 490 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, UDA).

2.8. Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol

Cafodd celloedd melanoma B16/F10 a oedd wedi'u trin ymlaen llaw eu golchi â PBS a'u gorchuddio â byffer RIPA sy'n cynnwys atalyddion proteas 1 y cant ar iâ. Pennwyd crynodiadau protein gan assay protein Bradford, a dadnaturiwyd y proteinau cyfartal â byffer Laemmli am 10 munud ar 95 gradd. Gwahanwyd y proteinau dadnatureiddio gan electrofforesis gel dodecyl sylffad-polyacrylamid 10 y cant (SDS-PAGE) ac yna fe'u trosglwyddwyd i bilenni polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, UDA). Nesaf, cafodd pilenni eu rhwystro â llaeth sgim 5 y cant mewn halwynog wedi'i glustogi gan Tris gyda 0.1 y cant Tween20 (TBST) am 1 h, ac yna adweithio â gwrthgyrff cynradd dros nos ar 4 gradd. Adweithiwyd y pilenni gyda'r gwrthgyrff eilaidd am 1 h a delweddwyd y cyfadeiladau imiwn gan ddefnyddio adweithydd cemiluminescence uwch (Bionote, Hwaseong, Korea). Cafodd delweddau'r bandiau eu canfod a'u dadansoddi gan Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA).

2.9. Dadansoddiad UPLC-IMS-QTOF/MS2

Y prif gyfansoddion yn y darnau ethanolig 60 y cant oS. deuliweu dadansoddi gan UPLC-IMS QTOF/MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, UDA). Gwahanwyd cromatograffig gan ddefnyddio colofn Acquity UPLC BEH C18 (2.1 × 10{{10}} mm, maint gronynnau 1.7 µm; Waters Corp.) ar gyfradd llif o 0.35 mL/munud. Roedd y cyfnodau symudol yn cynnwys hydoddydd A (0.1 y cant asid ffurfig mewn dŵr distyll) a B (acetonitrile), ac roedd amodau dadansoddi yn cynnwys y graddiant amser canlynol: 1 y cant B ar 0–1 munud, 1–100 y cant B ar 1–7 munud, 100 y cant B am 7–8 mun, 100–1 y cant B am 8–8.2 mun, 1 y cant B am 8.2–10 mun. Perfformiwyd sbectrometreg màs yn y modd negyddol ionization electrospray (ESI) o dan yr amodau canlynol: sourcetemperature, 100 ◦C; tymheredd llinell desolvation, 400 ◦C; egni gwrthdrawiad ramp, 10–30 V; foltedd capilari, 2.5 kV. Canfuwyd cyfansoddion ffenolig trwy sgan llawn yn amrywio o m/z 50 i 1500.

2.10. Dadansoddiad Ystadegol

Cyflwynwyd yr holl ganlyniadau fel y modd ± gwyriad safonol (SD). Penderfynwyd ar y gwahaniaeth ystadegol rhwng grwpiau gan Ddadansoddiad unffordd o amrywiant (ANOVA) gan ddefnyddio prawf amrediad lluosog newydd Duncan (p < 0.05)="" gyda="" meddalwedd="" sas="" fersiwn="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" usa)="" .a'r="" gydberthynas="" rhwng="">gwrthocsidioleffeithiau (gweithgaredd sborion radical ABTS/DPPH ac effaith ataliolMDA) ac effaith ataliolmelanogenesisensymau -mediated (tyrosinase a -glucosidase) ei werthuso dadansoddiad cydberthynas Pearson.

3. Canlyniadau

3.1. Cyfanswm Cynnwys Ffenolig

I gymharu ygwrthocsidiolgweithgaredd pob echdyniad ethanolig oS. deuliw, Ymchwiliwyd TPC.As a ddangosir yn Ffigur 1, roedd TPC yn wahanol ymhlith y darnau ethanolig; roedd y dyfyniad ethanolig 60 y cant(150.08 ± 1.13 mg GAE/g) yn sylweddol uwch na'r echdyniadau eraill (0 y cant; 70.83 ± 1.18, 20 y cant; 100.42 ± 0.72, 40 y cant; ; 114.67 ± 1.46, 80 y cant; 118.33 ± 3.17 a 95 y cant; 73.67 ± 1.46 mg GAE/g). Felly, defnyddiwyd y dyfyniad ethanolig 60 y cant ar gyfer dadansoddiadau arbrofol pellach.

3.2. Gweithgaredd Sborion Radical

Mae'rgwrthocsidiolgweithgaredd y dyfyniad ethanolig 60 y cant oS. deuliwMesurwyd (ESB) gan ddefnyddio assay ABTS/DPPH a assay MDA, a dangoswyd y canlyniadau yn Ffigur 2. Arddangoswyd gweithgaredd sborionu radical ABTS ESB ar 97.98 y cant ar grynodiad 1000 ug/mL, a fitamin C (99.82 y cant) , sy'n cael ei ddefnyddio fel y rheolaeth gadarnhaol ac roedd ganddo hefyd weithgaredd chwilota radical tebyg ar yr un crynodiad (Ffigur 2A). A dangosodd ESB effaith ataliad o 50 y cant (gwerth IC50) radical ABTS ar grynodiad 409.71 ug/mL. Fel y dangosir yn Ffigur 2B, dangoswyd gweithgaredd sborionu radical DPPH ESB 79.44 y cant ar grynodiad 1000 ug/mL, a nodwyd gwerth IC50 yn 612.53 ug/mL. Dangosodd effaith ataliol cynhyrchu MDA o ESB effaith ataliol o 89.54 y cant ar grynodiad 50 ug / mL a dangosodd effaith ataliol uwch na'r catechin (71.03 y cant), sef y rheolaeth gadarnhaol, ar yr un crynodiad (Ffigur 2C). Yn ogystal, gwelwyd gwerth IC50 MDA ar grynodiadau o 16.56 ug/mL o ESB.

3.3. Effaith Ataliol Ensymau Melanogenesis-Gyfryngol

Effaith ataliolmelanogenesisgwerthuswyd ensymau -mediated gan ddefnyddio tyrosinase a -glucosidase (Ffigur 3). I fesur gweithgaredd ataliol tyrosinase yn erbyn synthesis melanin, perfformiwyd arbrofion gan ddefnyddio L-tyrosine a L-DOPA fel swbstrad o dan amodau di-gell. O ganlyniad, gwerth IC50 oedd 89.25 µg/mL pan oedd L -tyrosine yn cael ei ddefnyddio fel swbstrad (Ffigur 3A), ond ni allai L-DOPA fod mwy na 50 y cant o'r effaith ataliol wedi'i arsylwi (Ffigur 3B). Ar yr adeg hon, gwerth IC50 y rheolaeth bositif (arbutin) ar gyfer L-tyrosine oedd 74.35 µg/mL, a oedd yn uwch nag ESB. Canfuwyd bod ESB yn cael effaith ataliol well ar tyrosinase gan ddefnyddio L-tyrosine na defnyddioL-DOPA fel swbstrad. Felly, yn seiliedig ar ganlyniadau'r assay gan ddefnyddio dau swbstrad, ystyrir bod effaith ataliol tyrosinasein ESB yn gysylltiedig ag ocsidiad L-tyrosine i L-DOPA yn hytrach nag ocsidiad L-DOPA i DOPA quinone mewn melanogenesis. Roedd effaith ataliol Tyrosinase gan ddefnyddioL-DOPA fel gweithgaredd sborionu swbstrad a radical (ABTS; 0.943, p <0.05, dpph;="" 0.952,="" p="">< 0.05)="" yn="" dangos="" y="" cydberthyniadau="" cryf="" cadarnhaol="" yn="" nhabl="">

I fesur effaith ataliol ymelanogenesis-mediated ensym, mesurwyd y gweithgaredd ataliol yn erbyn -glucosidase o ESB. Fel y dangosir yn Ffigur 3C, rhwystrodd ESB -glucosidase 33.72 y cant ar grynodiad200 µg/mL. Ac roedd IC50 ESB yn 46.29 µg/mL, sydd tua phum gwaith yn uwch nagacarbose (216.05 µg/mL). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod gan ESB well gweithgaredd ataliol -glucosidase nag acarbose fel rheolaeth gadarnhaol. Datgelodd effaith ataliol -glucosidase gydberthynas gadarnhaol gref ag effaith ataliol MDA (0.966, p <0.05) yn="" nhabl="">

3.4. Hyfywedd Cell a Synthesis Melanin Cellog

I gadarnhau sytowenwyndra ESB, cafodd celloedd melanoma B16/F10 eu trin ag ESB am grynodiadau 24 h ar 1, 2, 5, 10 ac 20 µg/mL. Dangosodd y canlyniadau nad oedd ESB yn effeithio ar hyfywedd celloedd yn y crynodiadau a nodwyd o gymharu â'r rheolaeth (Ffigur 4A). Felly, cynhaliwyd arbrofion trwy ddewis crynodiadau 2, 5 a 10 µg/mL. Yn dilyn hynny, cafodd celloedd melanoma B16/F10 eu trin ag IBMX i ddadansoddi effaith ESB ar gynhyrchu melanin. Fel y dangosir yn Ffigur 4B, cynyddodd lefel y cynnwys melanin i 316.85 y cant pan gafodd ei drin ag IBMX. Ar y llaw arall, dangosodd y grŵp a gafodd ei drin gan ESB (108.60 y cant) ar grynodiad 10 µg/mL fod cynnwys melanin wedi gostwng yn sylweddol o'i gymharu â'r grŵp a driniwyd gan IBMX, a chynnwys melanin tebyg o'i gymharu â'r grŵp arbutin (101.79 y cant) fel rheolaeth gadarnhaol.

3.5. Llwybr Melanogenesis mewn Celloedd Melanoma B16/F10

Melanogenesisyn broses hanfodol i amddiffyn croen dynol rhag ysgogiadau allanol, ac mae'r broses hon yn cael ei rheoleiddio gan amrywiol fecanweithiau. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom fesur lefel mynegiant moleciwlau sy'n rheoleiddio melanogenesis i gadarnhau'r mecanwaith ataliol posibl o gynhyrchu melanin a achosir gan ESB onIBMX mewn celloedd melanoma B16 / F10 (Ffigur 5). Dangosodd y canlyniadau fod ESB wedi lleihau mynegiant MITF a achosir gan IBMX yn effeithiol (Ffigur 5A, B). Felly, cafodd mynegiant tyrosinase (Ffigur 5A, C) a TRP-1 (Ffigur 5A, D) ei isreoleiddio gan lai o MITF gyda thriniaeth ESB. O ganlyniad, roedd triniaeth ESB yn is-reoleiddio mynegiant proteinau cysylltiedig mewn celloedd melanoma B16/F10 a achosir gan IBMX.

3.6. Dadansoddiad UPLC-IMS-QTOF/MS2

Cafodd proffil o brif gyfansoddion ESB ei sganio gan LC/MS mewn ystod o m/z 50–1500, a dangosir y cromatogramau brig sylfaenol yn Ffigur 6. Perfformiwyd adnabyddiaeth a nodweddiad pellach o'r cyfansoddion o gymharu â data llenyddiaeth gan ddefnyddio Data darnio MS2 (Tabl 2). Yn seiliedig ar y darnau mewn llenyddiaeth flaenorol, brig 2 oedd 1-O-caffeoylglycerol(m/z 253.07, 179.03, 161.02 a 135.04) [15]; brig 3, dicaffeoylglycerides (m/z 415.10, 253.07, 179.03a 135.04) [16]; brig 4, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (m/z 415.10, 253.07, 179.03, 161.02 a 135.04) [16]; brig 5, p-coumaroyl-caffeoylglycerol (m/z 415.10, 253.07, 179.03, 161.02 a 135.04) [16]; a 135.04) [17]; brig 6,feruloyl-caffeoylglycerol (m/z 429.12, 253.07, 193.05, 161.02 a 134.03) [18]; brig 7, tricin (m/z 329.23,314.04, 299.01 a 271.02) [19]; ac uchafbwynt 9, 9-asid hydroxyoctadecadienoig (9-HODE) (m/z 295.22, 277.21 a 171.10) [20], yn y drefn honno. Yn eu plith, nodwyd 1,3-O-dicaffeoylglycerol (Ffigur 6B), tricin (Ffigur 6C) a9-HODE (Ffigur 6D) fel prif gyfansoddion.

effeithiau cistanche:gwrth-ocsidiad

4. Trafodaeth

Melanogenesisadroddir ei fod yn cael ei achosi gan straen ocsideiddiol cynyddol o ysgogiad allanol. Mae straen ocsideiddiol yn achosi ocsidiad DNA a phroteinau, perocsidiad lipid, a mwy o asidau brasterog annirlawn. Mae'r straen hwn hefyd yn arwain at gynnydd mewn synthesis melanin yn ddiangen mewn melanocytes ar y croen. Felly, gall melanin gormodol a gynhyrchir achosi pigmentiad, a gall arwain at ganser y croen. Mae IBMX yn ysgogi melanogenesis trwy atal ffosffodiesterase a thrwy hynny gynyddu lefelau cAMP [7]. Wrth i lefel y cAMP mewn celloedd gynyddu, mae'n achosi actifadu'r llwybrau signalau ERK a PI3K/Akt sy'n hyrwyddo cynhyrchu proteinau sy'n gysylltiedig â melanogenesis. Felly, buom yn ymchwilio i effaith gwynnu ESB ar felanogenesis a achosir gan IBMX mewn celloedd melanoma B16/F10.

Mae gan gyfansoddion ffenolig fel metabolion eilaidd planhigion yr eiddo o gael eu sefydlogi gan strwythur cyseiniant pan fyddant yn adweithio â radicalau [21]. Hefyd, mae cyfansoddion ffenolig yn ffactorau pwysig ar gyfer y gweithgaredd gwrthocsidiol megis gweithgaredd sborionu radical ABTS/DPPH, ac atalyddion actas o ffurfio pigment oherwydd bod ganddynt strwythur cemegol tebyg i L-tyrosine [22,23]. Mae assay ABTS/DPPH yn y dull mwyaf cyffredin a symlaf ar gyfer amcangyfrif in vitrogwrthocsidiolgweithgaredd. Yn yr astudiaeth hon, mae ESB wedi dangos gweithgaredd sborionu radical TPC (Ffigur 1) ac ABTS/DPPH uchel (Ffigur 2A, B). Yn arbennig, roedd ESB yn uwch yng ngweithgaredd sborion radical ABTS na gweithgaredd sborion DPPHradical. Defnyddir y assay DPPH i fesur gweithgaredd sborionu radical cyfansoddion hydroffobig, tra bod assay ABTS yn ei gwneud hi'n bosibl mesur y gweithgaredd sborionu radical yn erbyn cyfansoddion hydroffobig yn ogystal â hydroffilig [24]. Felly, cadarnhawyd bod y cyfansoddyn hydroffilig yn effeithio'n fwy ar weithgarwch sborionu radical ESB.

Mae amlygiad i ymbelydredd UV yn achosi cynhyrchu ROS ac mae ganddo effeithiau uniongyrchol ac anuniongyrchol ar y croen.Yn benodol, mae ROS yn cymell perocsidiad lipid trwy ymosod ar asidau brasterog annirlawn, sy'n gydrannau o gellbilenni [2]. Mae cronni perocsidau lipid yn arwain at ddinistrio system gwrthocsidiol y croen, gan achosi pigmentiad, llid, a heneiddio [25]. Yn yr astudiaeth hon, dangosodd ESB perocsidiad lipid rhwystrol anrhagorol (Ffigur 2C). Adroddwyd bod y cyfansoddion ffenolig a gynhwysir mewn planhigion naturiol yn gysylltiedig â gweithgaredd sborionu radical [26]. Hefyd, mae Maresca et al. [27] adroddwyd bod cael gwared ar ROS â gwrthocsidyddion yn effeithiol wrth atal biosynthesis melanin. Dywedodd astudiaeth ddiweddar y gall ffracsiynau asetad ethyl ac aglycone o ddeilen Dendropanax morbifera weithredu fel amddiffynyddion celloedd croen a gwrthocsidyddion naturiol trwy amddiffyn celloedd HaCaT rhag straen ocsideiddiol [28]. Ar ben hynny, dangosodd triniaeth gyda'r un ffracsiynau effaith gwrth-melanogenig well nag arbutin, a ddefnyddir fel rheolaeth gadarnhaol, yn erbyn cynhyrchu melanin gormodol a achosir gan MSH mewn celloedd melanoma B16 / F10 [28].

Mae sawl mecanwaith yn gysylltiedig âmelanogenesis, a'r nod cyffredin ar gyfer asiantau gwynnu croen yw rheoleiddio tyrosinase, sy'n ensym pwysig mewn melanogenesis. Mae Tyrosinase, ensym sy'n cynnwys copr, yn cataleiddio dau adwaith yn y llwybr hwn: hydroxylation L-tyrosine toL-DOPA ac ocsidiad L-DOPA i DOPA quinone [6]. Pan fydd yn agored i lawer iawn o UV orROS, cynyddir gweithgaredd tyrosinase a chynyddir synthesis melanin hefyd. Felly, dangosodd canlyniadau mesur effaith ataliol tyrosinase mewn perthynas â synthesis melanin y canfuwyd bod ESB yn cael effaith ataliol well ar tyrosinase gan ddefnyddio L-tyrosine na defnyddio L-DOPA fel swbstrad (Ffigur 3A, B). Nododd astudiaeth ddiweddar y gydberthynas rhwng TPC ac ataliad tyrosinase oherwydd bod gan gyfansoddion ffenolig strwythur cemegol tebyg i un L-tyrosine, swbstrad tyrosinase. Yn ôl Choi et al. [29], sylwyd bod effeithlonrwydd gweithgaredd chwilota radical rhydd ac effaith ataliol tyrosinase yn cynyddu yn gymesur ag amser eplesu Cheonggukjang, a oedd oherwydd bod swm y TPC yn cynyddu gydag amser eplesu. Sylwodd Im & Lee [30] fod gan y ffracsiwn asetad ethyl o 75 y cant o echdyniad ethanolig o rif craidd Taraxacum lawer o weithgaredd gwrthocsidiol TPCand, ac roedd effaith ataliol tyrosinase yn well na ffracsiynau eraill (hecsan, clorofform, butanol, a dyfrllyd).

Mae Tyrosinase, un o'r glycoproteinau, yn cael ei glycosyleiddio pan fydd cadwyni polypeptid yn trawsleoli i reticwlwm theendoplasmig. Mae ensymau amrywiol yn rhan o'r broses hon, ac yn eu plith, gallai inhibitionof -glucosidase atal plygu tyrosinase i ffurfio strwythur anweithredol heb gopr. mewn planhigion yn gallu nid yn unig i leihau straen ocsideiddiol, ond hefyd yn atal scarbohydrate hydrolyzing ensymau megis -glucosidase gan rhwymo i broteinau [31]. Nododd astudiaeth flaenorol fod celloedd melanoma B16 / F10 ym mhresenoldeb atalyddion glycosylation yn arwain at leihau melanogenesis trwy leihau cyfanswm cynnwys tyrosinase [32]. Ac mae Choi et al. [33] yn adrodd bod deoxynojirimycin, un o'r atalyddion -glucosidase, wedi rhwystro glycosylation tyrosinase a rhwystro mudo tyrosinase i melanosomau. Mae Ando et al. [34] wedi dangos ei bod yn bosibl atal y synthesis melanin mewn celloedd melanoma trwy reoli glycosylation tyrosinase gan atalyddion -glucosidase fel glutathione, ferritin, a geldanamycin. Mae Kim et al. [35] adroddodd y cydberthyniadau da ar gyfer Paill Gwenyn fel rhywbeth naturiolgwrthocsidiolrhwng TPC ac effaith ataliol tyrosinase ({{0}}.973,p < 0.05),="" a="" hefyd="" rhoddodd="" tpc="" y="" gydberthynas="" gadarnhaol="" â="" gweithgarwch="" sborionu="" radical="" dpph="" (0.897,="" p="">< 0.05).="" ac="" mae'r="" canlyniadau'n="" awgrymu="" y="" gallai="" polyffenolau="" fel="" gwrthocsidyddion="" naturiol="" fod="" yn="" effeithiol="" o="" bosibl="" ar="" gyfer="" gwynnu="" croen="" yn="" seiliedig="" ar="" eu="" gweithgaredd="" gwrthocsidiol="" rhagorol.="" yn="" ein="" hastudiaeth,="" nodwyd="" bod="" cydberthynas="" uchel="" rhwng="" effaith="" gwrthocsidiol="" esbin="" y="" broses="" o="" atal="" gweithrediad="" tyrosinase="" trwy="" atal="" ocsidiad="" l-dopa="" i="" dopa="" quinone="" a="" glycosylation="" tyrosinase="" (tabl="" 1).="" am="" y="" rheswm="" hwn,="" y="" gwrthocsidydd="" effaith="" esb="" yn="" cael="" effaith="" ar="" croen="" gwynnu="" effaith="" drwy="" effeithio="" ar="" theinhibition="">melanogenesis- ensymau cyfryngol.

gwrthocsidiol naturiol: cistanche tubulosa

Llwybr signalau PKA yw'r brif broses sy'n ymwneud â melanogenesis, ac mae hyn yn cael ei actifadu ganIBMX, sef asiant dyrchafu cAMP. Gall llwybr signalau PKA reoleiddio ffactorau trawsgrifio fel MITF a phrotein sy'n rhwymo elfen ymatebol i cAMP, sy'n ymwneud â mynegiantmelanogenesisrheolyddion fel tyrosinase, TRP-1, a TRP-2. O ganlyniad, mae triniaeth IBMX yn cynyddu mynegiant MITF a'r teulu genynnau tyrosinase (tyrosinase a TRP-1) trwy actifadu cAMP [7]. Parc et al. [36] yn dangos bod swm y synthesis melanin o echdyniad ethanolig PapenfusiellaCuomo (65.17 ± 13.40 y cant) mewn crynodiad o 40 µg/mL yn debyg i asid kojic (72.30 ± 3.92 y cant) fel rheolaeth gadarnhaol, ac adroddodd ei fod yn dangos potensial fel deunydd gwynnu naturiol. Yn yr astudiaeth hon, dangosodd ESB effaith ataliol effeithiol ar synthesis melanin tebyg i'r rheolaeth gadarnhaol ar grynodiadau isel (Ffigur 4). Ar ôl hynny, i asesu effaith gwrth-melanogenig manwl ESB, cynhaliwyd dadansoddiad blot gorllewinol ar brotein wedi'i gyfryngu gan melanogenesis gan ddefnyddio celloedd B16 / F10melanoma.

Mae Akt, sy'n ymwneud â gwahanol fecanweithiau, yn chwarae rhan allweddol mewn prosesau cellog lluosog megis apoptosis, glwcos, a metaboledd croen. Yn benodol, mae'r cynnydd mewn cAMP trwy driniaeth IBMX yn lleihau ffosfforyleiddiad Akt a'i actifadu. Hefyd, mae Akt anweithredol yn ysgogi actifadu GSK-3 , sy'n golygu nad yw ffosfforyleiddiad yn cael ei gyflawni, hynny yw, mae lefel p-GSK-3 yn cael ei leihau [7]. Yn ôl llenyddiaeth flaenorol, mae rhan awyr Pueraria thunbergia yn israddioMITF trwy actifadu llwybr signalau Akt/GSK-3 mewn celloedd melanoma B16/F10 [37]. Hefyd, Huang etal. [38] yn dangos bod [6]-ysgol yn hyrwyddo mynegiant p-Akt ac yn atal signalau melanogenesis mewn celloedd melanoma B16 / F10. Mae GSK wedi'i actifadu-3 yn uwchreoleiddio'r teulu genynnau tyrosinase trwy ffosfforyleiddioSer289 o MITF, gan hyrwyddo melanogenesis o ganlyniad. Mae MITF yn ffactor trawsgrifio mawr sy'n rhwymo i hyrwyddwr genynnau tyrosinase, ac o ganlyniad mae'n cynyddu mynegiant ensymau sy'n gysylltiedig ag amlhau melanocyte amelanogenesis[7]. Pan fydd mynegiant tyrosinase yn cael ei hyrwyddo gan MITF, mae wedyn yn arwain at gynnydd yn y lefelau TRP-1 a TRP-2, ac o ganlyniad, mae'r ensymau melanogenig hyn yn cynhyrchu melanin [6]. Mae straen ocsideiddiol a achosir gan olau UV yn ysgogi pigmentiad melanin yn y croen. Felly, mae gweithgaredd sborionu radicalau neu ROS yn effeithiol i atal cynhyrchu melanin, a gall polyffenolau â gweithgaredd gwrthocsidiol gael effeithiau gwynnu rhagorol [38]. Mae Choi et al. [39] dangosodd fod coesynnau bambŵ Corea (henosis amrywiaeth Phyllostachys nigra) yn is-reoleiddio MITF wedi'i gyfryngu gan PKA/CREB trwy chwilota radicalau ABTS/DPPH. Ac roedd detholiad ethanolig 70 y cant o Nelumbo nucifera G. Leaf yn atal mynegiant MITF, tyrosinase a TRPs â gweithgareddau gwrthocsidiol megis gallu rhoi electronau ac ataliad o xanthine oxidase [40]. Yn yr arbrawf hwn, dangoswyd bod triniaeth ESB yn lleihau mynegiant y MITF a'r tyrosinase genefamily (tyrosinase a TRP-1), sy'n hyrwyddo ocsidiad DHICA i DHI yn y llwybr melanogenesis (Ffigur 5). Yn seiliedig ar y canlyniadau hyn, dangoswyd bod ESB yn is-reoleiddio melanogenesis IBMX-mediated yn seiliedig ar ei uwchraddolgwrthocsidioleffeithiau.

Yn seiliedig ar y llenyddiaeth flaenorol, nodwyd y prif gyfansoddion ffenolig yn ESB sef1, 3-Glyserol O-di-caffeoyl (Ffigur 6B), tricin (Ffigur 6C) a 9-HODE (Ffigur 6D) [16 ,19,20]. Yn eu plith, mae 9-HODE, sef y cyfansoddyn mwyaf helaeth yn ESB, yn un o fetabolion linoleicacid ac yn dangos effaith gwynnu ar groen llidiog trwy atal tyrosinase [41]. Hefyd, yn wahanol i gyfansoddion aliffatig eraill, dywedir bod 9-HODE yn sefydlog ym mhob arbrawf ocsideiddio ac yn cael effaith gwynnu ar ddifrod ROS [41]. Yn y cyfamser, mae tricin (5,7-dihydroxy- 2-(4-hydroxy-3,5-di-methoxyphenyl))-4H-chromene{{24) }}un) wedi'i gydnabod ers amser maith am ei effeithiau iechyd buddiol, megis gweithgareddau gwrthocsidiol, gwrthfeirysol, a gwrth-tiwmor / gwrthganser [42-44]. Mae Mu et al. [45] adroddodd bodtricin yn arddangos gwell effaith ataliol ar weithgaredd tyrosinase o'i gymharu ag arbutin fel rheolaeth gadarnhaol. Ar ben hynny, mae Meng et al. [46] adroddodd bod tricin wedi'i ynysu o echdyniad methanol haidd gwyrdd ifanc (Hordeum vulgare L.) yn atal biosynthesis melanin a gweithgaredd tyrosinase mewn celloedd B16/F10melanoma trwy'r grŵp hydrocsyl yn safle C{{-4) a grwpiau methocsi yn y C-3',5'safleoedd y sgerbwd tricin. Mae ffenylpropanoidau fel 1-O-caffeoylglycerol, dicaffeoylglycerides, ac 1,3-O-dicaffeoylglycerol yn gyfansoddion organig sy'n cael eu syntheseiddio gan blanhigion o ffenylalanin a thyrosin. Adroddwyd bod ffenylpropanoid a'u ffurfiau glycosylaidd yn gwrthocsidyddion cryf trwy chwilota ROS yn uniongyrchol neu drwy weithredu fel sborionwyr radical perocsyl sy'n torri cadwyn [47].

Mae asid p-Coumaric, sydd â strwythur cemegol tebyg i L-tyrosine, yn cystadlu â L-tyrosinefor safleoedd gweithredol ar tyrosinase [48]. Fe'i gelwir yn atalydd tyrosinase cryf, a dywedwyd bod ei effaith gwrth-melanogenesis yn gryfach na chyfansoddion strwythurol tebyg fel cinnamicacid [48]. Yn ogystal, mae An et al. [48] ​​adroddodd fod asid p-coumaric, cyfansoddyn o Sasa quelpaertensisNakai, yn atal gweithgaredd tyrosinase gan ddefnyddio L-DOPA fel swbstrad, ac yn lleihau cynhyrchiad melanin mewn celloedd melanoma B16 / F10. Felly, efallai yr ystyrir bod gan ESB effaith gwynnu ardderchog trwy asid p-coumarig. Ymhellach, dangosodd sbectra MS o 1-O-caffeoylglycerol ac 1-3-O-dicaffeoylglycerol batrymau darnio tebyg yn m/z 179, 161, a 135, a chafodd y darnau hyn eu hadrodd fel gweddillion asid caffeic. Mae ganddyn nhw sbectrwm UV tebyg i ddeilliad asid caffeic gydag λmax ar tua 326 nm, ac felly fe'u hystyrir yn ddeilliad asid caffeic [48]. Adroddwyd bod asid caffeic, sy'n deillio o gyfansoddion amrywiol, yn gwrthocsidydd cryf mewn vitro / in vivo, ac yn lleihau gweithgaredd styrosinase amelanogenesismewn celloedd melanoma B16/F10. O ganlyniad, efallai yr ystyrir bod effaith gwrth-melanogenig ESB yn ganlyniadgwrthocsidyddiona sylweddau gwynnu croen fel cyfansoddion aliffatig a ffenolig.

effeithiau cistanche: gwrth-ocsidiad

5. Casgliadau

Er mwyn gwerthuso'r posibilrwydd fel asiant gwynnu croen oSorghum deuliw, gwrthocsidiol, ac effeithiau gwrth-melanogenig ESB ar felanogenesis a achosir gan IBMX eu gwerthuso mewn melanomacells B16 / F10. Dangosodd ESB arwyddocaolgwrthocsidiolgweithgareddau mewn gweithgaredd sborionu radical ABTS/DPPH ac effaith ataliol MDA. ESB atal y cam cyntaf omelanogenesistrwy atal -glucosideasand tyrosinase gan ddefnyddio L-tyrosine a L-DOPA fel swbstradau. Effeithiau gwrth-melanogenig a achosir gan ESB arIBMXmelanogenesiseu gwerthuso mewn celloedd melanoma B16/F10, a dangosodd y canlyniadau fod ESB wedi atal melanogenesis a achosir gan IBMX mewn celloedd melanoma B16/F10. Cafodd cronni melanin ei rwystro gan is-reoleiddio mynegiant MITF a'r teulu genynnau tyrosinase (tyrosinaseand TRP-1) mewn melanogenesis a achosir gan IBMX. Dadansoddwyd prif gyfansoddion ESB fel1,3-O-di-caffeoyl glyserol, tricin, a 9-HODE. O ganlyniad, dangosodd ESB in vitrogwrthocsidiolgweithgaredd ac effaith gwrth-melanogenig mewn celloedd melanoma B16 / F10, ac felly, gellid ei ddefnyddio fel asiant gwynnu croen yn y farchnad colur.

gwrth-ocsidiadtabledi cistanche