Nanolibon Graphene Ocsid Gwrthocsid Gan fod Asiant Gwyno Newydd yn Atal Mecanwaith Melanogenesis

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang, a Chia-Liang Sun*

Abstract:Yn y broses synthesis melanin, mae adweithiau ocsideiddiol yn chwarae rhan hanfodol, ac mae'n strategaeth dda i atal cynhyrchu melanin trwy leihau straen ocsideiddiol. Ystyriwyd Ffwlerene a'i ddeilliadau, neu'r cyfadeiladau, fel sborionwyr radical rhydd cryf, a gwnaethom gymhwyso nanocarbonau sp2 amlhaenog ymhellach i ddarganfodmelaninmecanweithiau ataliol synthesis. Yn yr astudiaeth bresennol, fe wnaethom ddefnyddio nanoddeunyddiau newydd, megis nanotiwbiau carbon aml-wal (MWCNTs), MWCNTs math byr, nanoribonau graphene ocsid (GONRs), a GONRs math byr, fel cyfryngau gwrth-ocsidiol i reoleiddio cynhyrchu melanin. Dangosodd y canlyniadau fod gan GONRs alluoedd gwrth-ocsidiol gwell mewn llwyfannau dadansoddi straen ocsideiddiol mewngellol ac allgellog nag eraill. Cynigiom fod gan GONR grwpiau swyddogaethol sy'n cynnwys ocsigen. Yn yr assay diasetad 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein, fe wnaethom ddarganfod y gallai GONR gelu ïonau metel i chwilio am rywogaethau ocsigen adweithiol. Yn y farn mewnwelediad moleciwlaidd, gwelsom fod y nanomaterials hyn yn is-reoleiddio'r synthesis melanin trwy leihau mynegiadau genynnau sy'n gysylltiedig â ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia, ac roedd canlyniadau tebyg mewn mynegiadau protein. I grynhoi, mae GONRs yn asiant posibl fel deunydd cosmetoleg gwrthocsidiol a gwynnu croen newydd.

Mae Cistanche hefydasiant posibl fel nofelgwrthocsidiola gwynnu croendeunydd cosmetoleg.

1. RHAGARWEINIAD

Croen yw'r organ sy'n gorchuddio wyneb allanol y corff dynol. Gan fod y rhyngwyneb mewn cysylltiad â'r amgylchedd, mae haen y croen yn chwarae rhan bwysig wrth amddiffyn y corff rhag pathogenau, osgoi colli gormod o ddŵr, rheoleiddio tymheredd y corff, ac ati. Mae melanocytes yn tyfu ym philen waelodol epidermis y croen ac yn cyfrif am 5 y cant i 10 y cant o'r cynnwys cellog. Maent wedi'u nodweddu fel "chwarennau" ungellog gyda dendritau a changhennau tenau, hir, tebyg i ffrydiwr. Mae melanocytes yn symud trwy'r celloedd epidermaidd yn eu cyffiniau agos, gan greu cytser o gelloedd epidermaidd o amgylch pob melanocyt. Mae yna lawer o achosion mewnol ac allanol o heneiddio croen, ac un ffactor o'r fath yw ymbelydredd uwchfioled (UV) o olau'r haul.1 Yn ystod amlygiad UV, mae lefelau rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn y croen yn cynyddu'n ddramatig, a elwir yn straen ocsideiddiol. Mae nifer o ffactorau gwenwyndra amgylcheddol hefyd yn gwella straen ocsideiddiol i'r croen, megis plaladdwyr, carbon tetraclorid, metelau trwm, aminau aromatig, a mater gronynnol 2.5 (PM2.5).2 Yn y mecanwaith biocemegol, mae'r ocsidyddion mewngellol yn cael eu cynhyrchu o'r angellol. system ensymatig, gan eu trawsnewid yn ROS i sbarduno'r llwybr melanogenesis.3

Yn ogystal â ROS, mae yna lawer o ffactorau sy'n effeithiocynhyrchu melanin, gan gynnwys mynegiant genynnau, llid, newidiadau endocrin, a derbyniad pigment.1 Yn y camau cyntaf o gynhyrchu melanin, mae tyrosinase yn chwarae rhan wrth gataleiddio tyrosin i mewn i ffenomenonin ac eumelanin. Mae'r ddau fecanwaith gweithgynhyrchu pigmentau yn debyg, sy'n cynnwys hydroxylation L-tyrosine i 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) ac ocsidiad L-DOPA i dopaquinone. Yn y cam nesaf, mae dopamin yn cael ei ocsidio gan brotein sy'n gysylltiedig â tyrosinase 1 (TRP-1) a phrotein sy'n gysylltiedig â tyrosinase 2 (TRP-2) mewn melanosom, sy'n cael ei reoleiddio gan y ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia ( MITF) i ffurfio melanin. Yn olaf, mae melanin yn cael ei aeddfedu a'i waddodi o fewn y stratum corneum.4,5 Mae'r rhain yn treiddio i keratinocytes cyfagos yr haen waelodol ac yn amddiffyn eu DNA rhag unrhyw fwtaniadau neu addasiadau a achosir gan UV. Mae'r melanin aeddfed o fewn melanosomau yn cael ei drosglwyddo i keratinocytes6−9 ac yn olaf yn arwain at bigmentiad hirhoedlog. Mae ffacbys, brychni haul, a smotiau brown/du yn achosi problemau cymdeithasol weithiau i ddynion a merched. Mae rhwystro'r straen ocsideiddiol neu atal y gweithgaredd tyrosinase yn un strategaeth i ddadreoleiddio syndrom hyper-bigmentiad ac anhwylderau dermatolegol. Mae gwrthocsidyddion yn gwella hyper-bigmentiadau a achosir gan ROS a difrod cellog.10,11 Felly, mae gan gyfansoddion gwrth-ocsidiol wedi'u syntheseiddio lawer o gymwysiadau bioswyddogaethol mewn cymwysiadau gofal croen.

Mae Fullerene (C60), nanotiwb carbon (CNT), graphene, a graphene nanoribbon (GNR) yn bedwar math o nanocarbon sp2 a ymchwiliwyd yn eang ledled y byd.12 Mae Fullerene a'i ddeilliadau neu gyfadeiladau wedi'u hystyried yn gryfsborionwyr rhydd-radicalam amser hir. Roedd Yodh et al. defnyddio C60 sy'n hydoddi mewn dŵr fel asiant amddiffynnol rhag dirywiad catabolaidd a achosir gan straen. Chwistrellu et al. Daeth i'r casgliad bod C60(OH)24 yn gyfansoddyn gwrthocsidiol cryf pan fo'r straen ocsideiddiol yn rhy uchel. Mae Okuda et al. awgrymodd y gall cyfadeiladau C60 atal anaf cell NO-mediated.13,14 Tong et al. dangos y gallai C60complexes fod yn ymgeiswyr addawol ar gyfer trin clefydau sy'n gysylltiedig â'r ymennydd a achosir gan lefelau uwch o uwchocsid. Mewn gwirionedd, nododd cwmni Siapaneaidd fullerenes gyda gweithgaredd gwrthocsidiol cryf ar gyfer defnydd cosmetig yn 2006. Lucente- Schultz et al. dangos bod gallu sborion radical ocsigen CNTs un wal swyddogaethol (SWCNTs) bron i 40 gwaith yn fwy na gallu dendritig C60.15-19 Fenoglio et al. arsylwyd bod CNTs aml-furiau (MWCNTs) yn meddu ar allu sborion radical hynod mewn cysylltiad â ffynhonnell allanol o radicalau hydrocsyl neu uwchocsid.20 Datgelodd cyfrifiadau theori swyddogaethol dwysedd hefyd fodel o SWCNTs fel sborionwyr radical rhydd. Yn 2004, Novoselov et al. dangosodd yn gyntaf fod graphene yn arddangos effaith drydan ambipolar gref ac y gallai fod yn addawol ar gyfer cymwysiadau electronig.21 Yn dilyn hynny, maent yn parhau i ddangos bod gan graphene briodweddau electronig sy'n nodweddiadol ar gyfer nwy 2D o ronynnau a ddisgrifir gan yr hafaliad Dirac.22,23 Ers hynny y ddau bapur arloesol hyn, mae mwy a mwy o sylw wedi'i roi i ymchwil seiliedig ar graphene.24-30 Er enghraifft, mae Qiu et al. yn 2014 yn dangos bod graphene ocsid a graphene ychydig-haen yn arddangos gweithgarwch gwrthocsidiol sylweddol a gall amddiffyn moleciwlau biomoleciwlaidd amrywiol rhag ocsideiddio.31 Han et al. dangoswyd yn arbrofol yn 2007 y gellir rheoli bwlch ynni GNRs yn ystod y broses lithograffeg trwy newid lled y rhuban.32 Ymhlith y pedwar nanocarbonau, mae GNRs wedi cael y sylw lleiaf. Hyd y gwyddom, nid oes llawer o ymchwil ar briodweddau gwrthocsidiol nanoribbons graphene ocsid (GONRs).31,33 Felly, yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom baratoi MWCNTs, MWCNTs byr, GONRs, a GONRs byr yn ofalus gyda'r nod o gymharu eu priodweddau gwrthocsidiol a canlyniadau cysylltiedig yn systematig.

2. CANLYNIADAU A TRAFODAETH

2.1. Morffoleg MWCNTs a GONRs.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm i 2−3 μm. Ar yr un pryd, sylwyd bod y driniaeth asid nitrig yn garwhau arwynebau llyfn y tiwb. Mae rhai rhiciau a siapiau afreolaidd yn cael eu harddangos yn y llun chwyddiad uchel. Ymhellach, mae defnyddio MWCNTs a MWCNTs byr trwy adweithiau microdon yn cael GONR a GONR byr, yn y drefn honno. Gwnaethom hefyd ddarlunio'r lluniau TEM chwyddedig isel ac uchel o GONR a GONR byr. Oherwydd y dadsipio hydredol mawr a'r mân dorri llorweddol, mae'n ymddangos bod GONRs yn fyrrach na MWCNTs. Ar y llaw arall, dangosodd lluniau chwyddhad uchel ddiamedrau mwy, hynny yw, 0.11−0.18 μm, o GONRs na rhai MWCNTs, sy'n dangos bod y broses ddadsipio yn llwyddiannus. Yn yr un modd, roedd GONRs byr yn arddangos hyd byrrach a diamedr mwy na MWCNTs byr. Yng nghywasgydd aer ein proses ddadsipio newydd, roedd strwythurau haenog tenau y GONRs yn llai na'r hyn a gawsom yn yr adroddiad cynnar ar gyfer yr un pŵer microdon o 250 W tra'n cynnal y MWCNTs canolog mwy trwchus.12 Roedd hyn yn golygu MWCNT cragen graidd /Byddai heterostrwythur GONR yn fwy tebygol o ymddangos yn lle'r strwythur nanoribbon heb ei sipio'n llawn trwy'r holl bwerau microdon yn y broses newydd. I gymharu â'r GONR byr yn ein hastudiaethau blaenorol,34 cynhyrchodd y pŵer microdon uwch fwy o riciau ar ochr y rhubanau ac nid oedd yn ffurfio ymylon rhuban braf, llyfn. Sylwch ein bod wedi defnyddio dau fath gwahanol o gridiau Cu yn Ffigur 1a. Ar gyfer MWCNTs a GONRs â digon o hyd, defnyddiwyd y grid Gu gyda formvar lesiog wedi'i sefydlogi â charbon (cynnyrch rhif. 01881-F, Ted Pella, Inc., UDA). Roedd y tyllau agored mewn ffilm garbon lacey yn atal delwedd trawsyrru gorgyffwrdd rhwng nanocarbonau a'r ffilm garbon. Mae'r rhwydweithiau llwyd tywyll yn perthyn i'r ffilm garbon lacey. Fodd bynnag, roedd angen y grid Gu gyda formvar wedi'i sefydlogi â charbon (cynnyrch rhif. 01800-F, Ted Pella, Inc., UDA) ar gyfer MWCNT byr a GONR byr. Roedd hyn oherwydd bod y tyllau mawr yn y ffilm garbon lacey yn achosi problemau ar gyfer dal y MWCNT byr a'r GONR byr yn effeithlon. Fel y dangosir yn Ffigur 1, mae'r cyferbyniad llwyd golau o dan y MWCNTs byr a'r GONRs byr yn haen ysgafn o garbon. Fe wnaeth yr haen garbon hon sefydlogi'r ffilm formvar a oedd yn agored i'r trawst electron trwy ei nodweddion dargludo gwres a thrydanol.

2.2. Ffurfweddau Bondio MWCNTs a GONRs.

Cyflwynir sbectra Raman o'r pedwar nanocarbon yn Ffigur 1b; roedd band D o GONRs yn uwch na band MWCNTs ar ôl y broses ddadsipio. Priodolwyd hyn i lefel ocsidiad uwch a nifer uwch o strwythurau ymyl GONR o'i gymharu â MWCNTs. Mae'r ffenomen hon hefyd yn debyg i'r hyn a welsom yn 20 11.12 Oherwydd y lefel graffiteiddio uchel, band G MWCNTs oedd â'r uchafswm lled llawn isaf ar hanner. Cymarebau ID/IG y pedwar nanocarbon oedd {{10}}.076, 0.502, 0.483, a 0.700, yn y drefn honno. Yn fyr, cynyddodd y gostyngiad mewn hyd ac ocsidiad arwyneb lefel y diffygion ac felly gwnaeth y cymarebau ID/IG yn uwch. Mae brig D′ yn bresennol ym mhob graphene diffygiol ac fe'i hystyrir fel mesur o ansawdd.35 Fel y dangosir yn Ffigur 1b, daw brigau D′ yn y pedwar sbectra yn fwy amlwg ar ôl naill ai'r broses dorri neu ddadsipio, sy'n awgrymu eu bod yn ddinistriol. prosesau sy'n cyflwyno llawer o ddiffygion. Mae Ffigur 1c,d yn dangos sbectra sbectrosgopeg ffotoelectron pelydr-X o'r pedwar nanocarbon. Mae'n debyg mai brig D′ yw'r mwyaf amlwg ar gyfer GONRs byr. Fel y dangosir yn Ffigur 1c, cynyddodd y lefel O yn sylweddol o 7.6 y cant (MWCNTs) i 19.9 y cant (GONRs) oherwydd gallu ocsideiddio cryf KMnO4 mewn amgylchedd asidig. Ar y llaw arall, cynyddodd y lefel O ychydig 0.8 y cant o MWCNT i'r MWCNTs byr. Yn bwysig, y lefel O uchaf yw 38.3 y cant ar gyfer y GONR byr, sy'n awgrymu y byddai pennau'r nanoribbons yn haws atodi grwpiau swyddogaethol ocsigen na'r arwynebau sp2 planar. Mae Ffigur 1d yn dangos y nifer mwyaf lled-llawn-yn-hanner-uchafswm a'r symudiad i egni rhwymol uchel o gopaon C 1s ar ôl proses ddadsipio MWCNTs a MWCNT byr yn Ffigur 1d. Ar gyfer ocsidau graphene, gellid neilltuo'r copaon datgyfoledig yn yr ochr ynni uchel-rwymol i fondiau C−C(CC), C−O, CO, a COOH.36 Fe wnaethom nodweddu GONR (200 W) yn 2013 ,37 ac roedd y canlyniadau'n debyg i ganlyniadau'r astudiaeth hon. Daeth yr astudiaeth hon i gasgliad o ffenomenau sbectra Raman, sy'n golygu bod mwy o grwpiau swyddogaethol yn cynnwys ocsigen wedi'u cynhyrchu yn ystod y trawsnewid tiwb-i-rhuban (Ffigur 2).

2.3. Priodweddau Gwrthocsidiol MWCNTs a GONRs.

2.3.1. Pennu 1,1-Diffenyl-2-Picryhy-drazyl o Weithgaredd Sborion Radical Rhad ac Am Ddim.

1, 1- Diffenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) gweithgaredd sborionu radical rhad ac am ddim yn llwyfan gwrthocsidiol a ddefnyddir i ganfod y gallu gwrth-ocsidiol; disgrifir y canlyniadau ar gyfer y pedwar nanocarbon yn Nhabl 2. Yn y assay DPPH, defnyddiwyd fitamin C mewn crynodiad o 100 μM fel rheolydd positif. Er mwyn profi gweithgareddau gwrthocsidiol MWCNTs, MWCNTs byr, GONRs, a GONRs byr, cafodd dosau o 1, 5, ac 10 mg/L eu deor i'r hydoddiant adwaith i fesur y priodweddau. Roedd gan MWCNTs, MWCNTs byr, GONRs, a GONRs alluoedd ataliol cymedrol ar 10 mg/L (19.2 ± 0.3, 12.1 ± 0.3, 26.8 ± 0.3, a 30.0 ± 0.4 y cant ), tra bod gan fitamin C gyflwr tebyg ar 100 μM (93.4 ± 0.1 y cant ) ar gyfer yr ataliad.

2.3.2. Assay Gweithgaredd Ion-Chelating.

O fewn y sefyllfa straen ocsideiddiol, gall y ferrozine ddatblygu cymhleth gyda Fe2 plus i'w fesur yn feintiol. Ym mhresenoldeb cyfryngwyr chelating, mae'r cymhleth yn cael ei dorri, gan achosi'r ïonau fferrus i leihau o liw coch tywyll y cymhleth Fe2 plus. Fe wnaethom ddefnyddio EDTA fel y rheolaeth gadarnhaol. Mae Tabl 2 yn dangos bod MWCNTs, MWCNTs byr, GONRs, a GONRs byr wedi cael gweithgaredd chelating ar 10 mg/L (29.2 ± {{10}}.8, 28.7 ± 0 .7, 69.7 ± 0.6, a 68.9 ± 0.3 y cant ), tra bod gan y rheolaeth gadarnhaol gyflwr tebyg ar 100 μM (93.4 ± 0.1 y cant ).

2.3.3. Mesur Pŵer Gwrthocsid Ferric-Lleihau.

Mae'r assay potensial lleihau fferrig yn brawf syml a dibynadwy a ddefnyddir i feintioli synthesis cymhleth Fe(III)-ferricyanid. Yn y assay hwn, canfuwyd pŵer lleihäwr y pedwar nanocarbon sy'n cynhyrchu'r cymhlyg fferrus Fe(III) -TPTZ gan newidiadau yn lliw'r hydoddiant o felyn i wyrdd a glas. Mae Tabl 2 yn dangos mai pwerau lleihau MWCNT, MWCNT byr, GONR, a GONR byr oedd dwysedd optegol (OD) 1.11, 1.13, 1.15, a 1.11 ar 10 mg/L.

2.3.4. Mae MWCNTs a GONRs yn Atal Cronni ROS Mewngellol.

Mae llawer o adroddiadau wedi dangos bod ROS yn dinistrio cyfanrwydd adeileddol cellbilenni, gan gynnwys cellbilenni a philenni niwclear i arwain at ddifrod celloedd a cholli swyddogaeth arferol.38−40 Yn ogystal, mae ROS hefyd yn un o'r ffactorau pwysig i gataleiddio ffurfio tyrosinase melanin, ac mae atal cynhyrchu ROS yn strategaeth dda i ddadreoleiddio synthesis melanin. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddefnyddio'r assay staenio 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) i ddadansoddi lefel straen ocsideiddiol mewngellol mewn celloedd triniaeth MWCNT a GONR. Symbyliadau ocsideiddiol a achosir gan Phorbol 12-myristate 13- asetad (PMA) mewn grwpiau MWCNT a GONR ac fe'i defnyddiwyd fel rheolydd negyddol.41 Pan oedd crynodiad PMA yn 20 ng/mL, roedd yn achosi straen ocsideiddiol, gan gynyddu y gwerth i 38 y cant; ar ôl trin GONRs a MWCNTs, isreoleiddiwyd lefelau ROS i'r lefel arferol. Dangosodd y data fod y ddau ddeunydd yn atal lefelau straen ocsideiddiol, ac roedd effaith gwrth-ocsidiol GONRs yn uwch nag effaith MWCNTs (Ffigur 3). Mae Tabl 1 yn dangos rhestr canlyniadau tebyg. Roeddem yn dadlau bod tri rheswm dros ein canfyddiadau newydd: yn gyntaf, roedd trefn hydoddedd y deunyddiau hyn fel a ganlyn: GONRs byr > GONRs > MWCNTs byr > MWCNTs, sy’n golygu mai ardal gyswllt GONRs byr oedd y mwyaf, felly roedd yn well ar gyfer sborion ROS. Yn ail, roedd GONRs a MWCNTs yn strwythurau carbon sp2- a allai ddinistrio trydan ROS trwy ffurfio adwythiad neu drosglwyddo electronau.42 Canfuom fod effeithiau gwrthocsidiol y strwythurau nanoribbon yn well na rhai'r adeileddau nanotiwb, felly mae nanoribbons yn ei wneud haws trosglwyddo electronau na nanotiwbiau. Yn olaf, yn Ffigur 1b, rydym yn sylwi bod safle carbon GONR sp2-yn cynnwys mwy o grwpiau swyddogaethol ocsigen na MWCNTs, gallai'r grwpiau asid carbocsilig gelu ïonau metel, a gallai'r grwpiau hydrocsyl fod yn rhoddwr H i ysbori ROS a atal cynhyrchu melanin.

2.4. Sytowenwyndra MWCNTs a GONRs sy'n cael eu Trin mewn Celloedd Fibroblast Dermol Dynol.

Defnyddiwyd y dull {{0}}(4,5-Dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) i werthuso'r priodweddau sytotocsig GONRs ar gelloedd Hs68 (Ffigur 3), a chafodd celloedd eu meithrin ar ddosau gwahanol o 1, 5, a 10 ug/mL. Gwnaethom archwilio bod hyfywedd celloedd MWCNT yn 100.7 ± 3.7, 99.8 ± 4.9, a 94.1 ± 4.7 y cant mewn crynodiadau o 1, 5, a 10 mg/L, yn y drefn honno; cyfrifwyd hyfywedd ar gyfer y MWCNT byr yn yr un drefn a chanfuwyd eu bod yn 93.9 ± 2.2, 86.4 ± 3.0, a 98.9 ± 2.1 y cant . Gwelsom fod y celloedd B16-F10 wedi'u deor mewn crynodiadau uchel, ac roedd goroesiad celloedd celloedd Hs68 yn fwy nag 80 y cant, gan awgrymu nad oedd gan y MWCNT a'r MWCNT byr unrhyw effaith wenwynig ar gelloedd ffibroblastau dermol dynol. Hyfywedd cell GONR a GONR byr oedd 86.24 ± 2.1, 90.87 ± 3.5, 88.58 ± 2.5, 89.03 ± 3.6, 90.71 ± 2.8, a 90.64 ± 2.8 y cant. Nodir hefyd yn Ffigur 4a na chafodd GONR a GONR byr effaith sytotocsig canfyddadwy ar gelloedd HS68. Mewn adroddiadau blaenorol, gellid ystyried y defnydd o nanoddeunyddiau heb eu profi at ddibenion cosmetig yn amheus,43,44 ac fel arfer roedd yn ganlyniad i ymosodiad DNA ar ôl i'r nanoronynnau fynd i mewn i'r celloedd. Ar ôl prawf cytotoxicity, canfuom nad oedd ein deunyddiau yn achosi gwenwyndra i gelloedd croen arferol. Daethom i'r casgliad, ar ôl i nanoddeunyddiau fynd i mewn i'r celloedd, fod y nanomaterials yn atal cynhyrchu melanin trwy leihau'r straen ocsideiddiol a chelating ïonau metel ac nad ydynt yn niweidio'r mitocondria neu DNA, sy'n golygu bod MWCNTs a GONRs yn ddiogel i'w defnyddio.

2.5. Dau Fath o MWCNTs a GONRs mewn Gweithgaredd Tyrosinase Cellog B16 - F10 a Chynnwys Melanin.

Yn y llwybr synthesis melanin, mae tyrosinase yn chwarae rhan hanfodol. Mae Tyrosinase yn ocsideiddio ac yn ffurfio eumelanin a pheomelanin trwy gyfres o adweithiau biocemegol. Er mwyn penderfynu a yw GONRs a MWCNTs yn atal gweithgareddau tyrosinase ac yn achosi gostyngiad mewn cynhyrchiad melanin, dadansoddwyd gweithgaredd tyrosinase mewn celloedd B16 - F10. Canfuom fod MWCNTs a MWCNTs byr yn atal gweithgaredd tyrosinase tua 17.1 y cant a 23 y cant ar 10 mg / L. Cafodd GONRs a GONRs gwell effeithiau o ran atal y gweithgaredd tyrosinase ar yr un crynodiadau o gymharu â GONR arall. Roeddent hefyd mewn modd dos-ddibynnol ac yn atal 49.8 y cant a 44.7 y cant o'r gweithgaredd tyrosinase, fel y dangosir yn Ffigur 4b.

Mae melanin yn pigment anhepgor yn y corff dynol, ond mae gorfynegiant melanin yn aml yn sbarduno cyfres o afiechydon. Mewn astudiaethau blaenorol, mae Xiao et al. defnyddio deunydd tebyg, Radical Sponge, nanoparticle fullerene, fel asiant gwrth-melanin.45 Roedd rhai canlyniadau da; gallai tua 20 y cant o gynhyrchu melanin gael ei atal. Er mwyn gwella ei effeithlonrwydd, fe wnaethom wella'r deunydd profi ymhellach i fesur cyfradd ataliad melanin a'i fecanwaith moleciwlaidd, fel y dangosir yn Ffigurau 4c a 5. Gostyngodd MWCNTs a MWCNTs byr y cynnwys melanin gan 17.6 ± 5.5 a 13.2 ± {{{{} 16}}.2 y cant ar 10 mg/L ac mewn modd dos-ddibynnol. Fe wnaeth GONRs a GONRs fyr reoleiddio'r gwerthoedd yn bwerus i 32.0 ± 2.3 a 35.3 ± 3.4 y cant ar 10 mg/L. Awgrymodd y canlyniadau arbrofol y gallai pob un o'r pedwar math atal synthesis melanin a bod GONRs yn cael effaith gryfach. Ar y llaw arall, rydym hefyd wedi sylwi bod y GONR byr yn cael effaith well wrth atal cynhyrchu melanin. Rydym yn dod i'r casgliad bod gan y GONRs byr fwy o grwpiau swyddogaethol a gallant atal tyrosinase wedi'i gataleiddio ag ïonau metel yn effeithiol, gan atal cynhyrchu melanin ymhellach (Ffigur 2). Yn Nhabl 1, rydym yn arsylwi bod yr ymdrech o fetel ïon-chelating math byr yn uwch na'r math arferol; mae hyn yn golygu y gallai'r GONRs byr hyn gael eu defnyddio o bosibl yn y maes cosmetig fel cyfryngau gofal croen.

2.6. Fe wnaeth mecanwaith MWCNTs a GONRs rwystro Cynnwys Melanin Cellog B16 - F10.

Mae celloedd yn ymateb i'r straen ocsideiddiol allanol trwy reoleiddio'r mynegiant protein. Mae celloedd B16-F10 yn gwella mynegiant genynnau c-myc ac AMPK uwch-reoledig i leihau lefelau ocsideiddiol,46 ac yn y gwaith hwn, mae MITF yn ffactor trawsgrifio penodol o tyrosinase i reoleiddio llwybr signal synthesis melanin moleciwlaidd.47 - 49 Yn Ffigur Mae 5a, MWCNTs a GONRs yn is-reoleiddio'r ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia trwy leihau'r straen ocsideiddiol, ac yna, cafodd genyn i lawr yr afon TRP-1 a TRP-2 hefyd eu isreoleiddio. Ar gyfer y lefel protein, canfuwyd ffenomen debyg, lle roedd MWCNTs a GONRs yn is-reoleiddio'r llwybr melanogenesis cysylltiedig â MITF ac yna'n lleihau'r cynnwys melanin yn olaf (Ffigur 5b).

3. DULLIAU A DEUNYDDIAU ARBROFOL

3.1. Paratoi MWCNTs a GONRs.

Adroddwyd ar y broses berthnasol ar gyfer gwneud GONRs mewn papur blaenorol.12 MWCNT (0.{13}}5 g) ei atal yn 9:1 H2SO4/H3PO4 a'i drin ag adweithydd microdon (CEM-Discover) gyda'r pŵer wedi'i osod ar 250 W am 2 funud. Ar ôl ychwanegu KMnO4 (0.25 g) i'r toddiannau, cafodd yr hydoddiannau eu trin â'r un pŵer microdon ar 65 gradd am 4 mun12 Yna fe wnaethom addasu'r broses hon gan ddefnyddio amser microdon ail gam byrrach o 8 munud trwy ddefnyddio cywasgydd aer. Yma, defnyddir y cywasgydd aer i reoli tymheredd yr adweithydd microdon yn ystod y broses. Gosodwyd pŵer y microdon ar 250 W yn y profion rhagarweiniol.

3.2. Paratoi MWCNTs Byr a GONRs Byr.

Adroddwyd ar y broses berthnasol ar gyfer gwneud GONRs byr yn ein papur blaenorol.34 Dewiswyd yr amser triniaeth asidig fel 8 h. Gosodwyd y pŵer microdon ar 250 W, sydd yr un fath â'r pŵer ar gyfer cael GONRs.

3.3. Gweithgarwch Sborion Radical DPPH.

Defnyddiwyd DPPH yn aml i benderfynu ar gynhwysedd sborionu samplau a'r priodweddau gwrthocsidiad.50 Mae DPPH yn adweithydd porffor sy'n newid y lliw o borffor i felyn os trosglwyddir y radical rhydd i'r dadansoddwr. Ychwanegwyd samplau gwrth-ocsidiol positif gyda chrynodiadau addas at yr ateb, a dadansoddwyd y samplau ar 517 nm am 30 munud. Fe wnaethom ddefnyddio canrannau'r DPPH sy'n weddill ar wahân i'r samplau profi i fesur faint o wrthocsidydd sydd ei angen i leihau'r radicalau DPPH blaenorol. Defnyddiwyd fitamin C ar 100 μM fel rheolaeth gadarnhaol. Mesurwyd y gweithgaredd sborion ( y cant ) fel

Capasiti chwilota ( y cant )=(Asample − Abak) / (Acontrol − Abak) × 100 y cant (1)

3.4. Gweithgaredd Chelating Metel.

Ion metel yw'r ffactor sy'n achosi ocsidiad gormodol lipid, ac mae Fe2 plws yn un o'r ïonau mwyaf dylanwadol.50 Llwythwyd crynodiadau gwahanol o nanobiomaterial (1 μL) i mewn i blât ffynnon 96-, a oedd yn cynnwys 2 mM FeCl2·4H2O (10 μL), ac yna llwytho i mewn i ferrozine (5 mM, 20 μL). Cyfunwyd y cymysgedd yn llawn â 69 μL menthol a'i gadw ar dymheredd ystafell am 10 munud. Yna, arsylwyd yr ateb adwaith sampl yn 562 nm. Defnyddiwyd EDTA fel rheolydd positif ar 100 μM, ac roedd y fformiwla cyfrifo gweithgaredd chelating metel yn seiliedig ar eq 1.

3.5. Lleihau Grym.

Mae cyfrifo pŵer lleihau yn seiliedig ar astudiaeth flaenorol.50 Yn gyntaf, cymysgwyd deunyddiau graphene 2.5 μL â byffer PBS (67 mM, pH 6.8) a K3Fe(CN)6 (2.5 μL, 20 y cant) ac yna deorwyd ar 50 gradd am 20 munud. Yna, cymysgwyd asid asetig trichloro 10 y cant (160 μL) â'r adweithyddion ar 300g wedi'i allgyrchu am 20 munud. Pennwyd hyd yr amsugno ar 700 nm ar ôl cael ei gymysgu â 25 μL FeCl3 (2 y cant). Defnyddiwyd hydroxyanisole butylated (BHA) ar 100 μM.

3.6. Arholiadau Amlhau Celloedd.

Defnyddiwyd llinell gell ffibroblastau dermol dynol HS68 i ddadansoddi cymhareb amlhau celloedd. Deorwyd HS68 yng nghyfrwng Eagle wedi'i addasu ag Dulbecco (DMEM) sy'n cynnwys 10 y cant o serwm buchol ffetws ac 1 y cant penisilin a streptomycin cymysg.50,51 Ar ôl cael ein trin â chrynodiadau gwahanol o samplau, gwnaethom gymhwyso MTT i ganfod y gymhareb amlhau celloedd. Cafodd 8000 o gelloedd eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon a'u trin â samplau am 24 awr. Tynnwyd y toddiant supernatant, a defnyddiwyd yr ateb MTT i ddiwylliant am 2 awr ar 37 gradd. Ar ôl deori, fe wnaethom dynnu'r cyfryngau sy'n cynnwys MTT a'i doddi â dimethyl sulfoxide (DMSO). Darllenwyd yr ateb ar OD 590 nm a chyfrifwyd y gyfradd gan eq 1.

3.7. Asesiad o Gynnwys Melanin Cellog.

Fe wnaethom ddefnyddio dull gyda mân addasiadau yn seiliedig ar yr assay blaenorol.52,53 Diddymwyd pelenni celloedd B16−F10 o Ganolfan Casglu ac Ymchwil Bioadnoddau (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) mewn cymysgedd o 2.0 N NaOH a 10 y cant DMSO. Yna cynheswyd y sampl am 1 h ar 90 gradd a'i allgyrchu ar 10,000g am 10 munud arall i gael yr uwchnatydd clir. Pennwyd y cyfrif melanin trwy fonitro OD y supernatant ar 475 nm.

3.8. B16−F10 Gweithgaredd Tyrosinase Cellog.

Ar gyfer gweithgaredd tyrosinase cellog B16-F10, cyfeiriasom at y gwaith blaenorol gyda rhai addasiadau.50 Cafodd celloedd eu meithrin mewn 12-blatiau ffynnon mewn 105 o gelloedd yr un yn dda. Ar ôl triniaethau â samplau, cafodd celloedd eu gosod mewn 1 y cant Triton X-100/PBS a 2 mM L-tyrosine (50 μL) am 3 h. Ar ôl y deoriad, fe wnaethom dynnu'r cyfryngau a darllen yr amsugnedd yn OD 590 nm. Cyfrifwyd fformiwla gweithgaredd tyrosinase gan eq 1.

Mae Cistanche yn atalydd tyrosinase.

3.9. Canfod ROS gan DCFDA Staining.

Gan gyfeirio at yr astudiaeth flaenorol,54 1.2 1.105 Cafodd celloedd B16−F10 eu hadu mewn 6-blatiau ffynnon a'u trin â chrynodiadau amrywiol o samplau. Cafodd celloedd eu hatal yn PBS ac yna eu llwytho â DCFDA (5 μM) mewn DMEM coch di-ffenol am 30 munud ar 37 gradd. Defnyddiwyd y cytomedr llif (Guava, Merck, yr Almaen) i ganfod signal fflwroleuol DCFDA. Roedd tonfeddi cyffro ac allyriadau DCFDA yn 488 a 535 nm, yn y drefn honno.

3.10. Adwaith Cadwyn Polymerase Amser Real Meintiol.

Dilynwyd dulliau Lin et al. (2018).1 Roedd adwaith cadwynol meintiol trawsgrifio-polymeras gwrthdro amser real (qRT-PCR) yn cynnwys chwiliwr paent preimio unigryw i gynhyrchu fflworoleuedd. Defnyddiodd dechneg canfod fflworoleuedd sy'n synhwyro pob cylch gan ddefnyddio System qRT-PCR 7500 (Biosystemau Cymhwysol, UDA). Canfu'r cylch yn seiliedig ar faint o fflworoleuedd a ryddhawyd, ac yna cyfrifwyd cynnyrch pob cylch ar gyfer y cynnwys a gynhyrchir, a arweiniodd at gyflawni dibenion meintiol amser real. Defnyddiwyd Trizol (Invitrogen, UDA) i echdynnu RNA cyflawn o feinwe'r ysgyfaint, yn unol â'r cyfarwyddyd a roddwyd gan y gwneuthurwr. Yn dilyn hynny, defnyddiwyd pecyn trawsgrifio cefn (Takara, Japan) i gynhyrchu DNA. Yn y qRT-PCR gan ddefnyddio paent preimio, a restrir yn Nhabl 1, yn gyntaf, cynheswyd y sampl i ffurfio un llinyn o DNA; yna cynhaliwyd rhwymiad paent preimio i ffurfio DNA llinyn dwbl (dsDNA), ac ar ôl hynny cyfunwyd SYBR Green dsDNA, a defnyddiwyd pecyn adweithydd SYBR green plus (Roche, Basel, Swisaidd), a arweiniodd at ryddhau fflworoleuedd. Trosglwyddwyd y canlyniad trwy system canfod fflworoleuedd. Digwyddodd canfod signalau fflwroleuol yn ystod cyfnod ymestyn neu anelio pob cylch; ar ôl y darganfyddiad, cafodd cynnwys y sampl ei wthio'n ôl gan y dwyster fflworoleuedd a ganfuwyd.55 Cafodd lefelau mynegiant y genynnau targed eu normaleiddio i lefelau -tiwbwlin gan ddefnyddio'r dull 2−ΔΔCt.

myricetin

3.11. Prawf Blotiau Gorllewinol.

Cafodd celloedd B16-F10 eu gorchuddio ar 4 gradd dros nos gyda byffer assay radioimmunoprecipitation (Thermo Scientific Co., USA), sy'n cynnwys atalyddion proteas. Defnyddiwyd y pecyn assay protein asid bicinchoninic (BCA, Sigma-Aldrich Corp., UDA) i feintioli swm y protein. Gwahanwyd proteinau sampl ar gel sodiwm dodecyl sylffad-polyacrylamid 10 y cant a'u trosglwyddo i bilen polyvinylidene difluoride (PVDF) (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, UDA). Cafodd y bilen PVDF ei rhwystro â byffer blocio (Thermo Scientific) am 1 h a'i deor â'r gwrthgorff cynradd penodol dros nos ar 4 gradd . Nesaf, golchwyd y bilen â halwynog wedi'i glustogi gan Tris - byffer Tween 20 ddwywaith a'i ddeor â gwrthgyrff eilaidd am 1.5 h. Ar ôl hynny, trochwyd y bilen i adweithyddion canfod cemiluminescence (Thermo Scientific) a'i dadansoddi gan ddelweddwr MiniChemi Chemiluminescence (Beijing Sage Creation Science, Tsieina). Roedd ffynonellau gwrthgyrff yn cynnwys gwrth-MITF cwningen, gwrth-TRP cwningen-1, gwrth-TRP cwningen-2, ac -actin (Thermo Scientific).

3.12. Dadansoddi Deunydd.

Defnyddiwyd TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) i arsylwi morffoleg y nanocarbonau. Cymhwyswyd micro sbectromedr Raman (PTT, RAMaker) i wirio moddau cyseiniant y nanocarbonau. Cynhaliwyd mesuriadau sbectrosgopeg ffotoelectron pelydr-X (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) hefyd ar gyfer pennu'r dadansoddiad cyfansoddiadol.12,34

3.13. Dadansoddiad Ystadegol.

Ailadroddwyd yr holl samplau ac arbrofion safonol o leiaf dair gwaith. Fe wnaethom gymhwyso prawf-t y Myfyriwr i gymharu a mynegi cyfartaledd y gwerthoedd cymedrig ± gwyriad safonol yn ystadegol.

4. CASGLIADAU

I grynhoi, gwelsom fod y GONR byr yn ddeunydd posibl ar gyfer cynhyrchion gofal croen oherwydd ei briodweddau bioswyddogaethol lluosog (Ffigur 6). Dangosodd y canlyniadau fod y nanocarbonau yn chwarae rhan fel gwrthocsidydd allgellog ac mewngellol. Yn y cyfamser, roedd y nanocarbon yn atal y gweithgaredd tyrosinase a'r cynnwys melanin ac nid oedd yn achosi unrhyw anaf difrifol i gelloedd pigment. Sefydlodd y gwaith hwn swyddogaethau gwrth-melanogenesis pedwar math o nanocarbonau; bydd astudiaethau yn y dyfodol yn cael eu harchwilio ar fecanwaith y cyfansoddion hyn ar fynegiadau genynnau a phrotein penodol sy'n gysylltiedig ag aeddfedu, cludo a chronni melanin.

Mae Cistanche yn gwella gwynnu.

Cliciwch ar y llun a chael mwy o fanylion.