Gweithgareddau Gwrthocsidiol A Gwrth-Melanogenig Licorice wedi'i Drin â Gwres (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis) Detholiad

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Ion 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* aHyung Don Kim 1,*

Crynodeb:Pigment brown neu ddu yw melanin sy'n amddiffyn croen rhag ymbelydredd uwchfioled a rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS). Fodd bynnag, mae gorgynhyrchu melanin yn gysylltiedig â lentiginau, melasma, brychni haul a chanser y croen.Licoricewedi dangosgwrthocsidiol, gweithgareddau gwrth-tiwmor, gwrth-blatennau, gwrthlidiol, ac imiwnofodwlaidd ac fe'i defnyddir fel triniaeth naturiol ar gyfer croengwynnuEin nod oedd cadarnhau potensial Wongam, cyltifar newydd o licorice a ddatblygwyd gan y Weinyddiaeth Datblygu Gwledig (RDA), felgwynnuasiant mewn colur. Yn ogystal, gwnaethom wirio effaith triniaeth wres ar fioactifedd licorice trwy gymharugwrthocsidiolagwrth-melanogeniggweithgareddau echdynnu licorice cyn ac ar ôl gwresogi (130 ◦C). Roedd y detholiad licorice wedi'i drin â gwres (WH-130)yn dangos mwy o weithgareddau radical-scavening yn ABTS plus (2,20-azino-bis-(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic). asid) halen diammoniwm) a DPPH (2,2-diffenyl-1-picrylhydrazyl). Yn ogystal, rhwystrodd WH-130 melanogenesis yn fwy effeithiol oherwydd dadreoleiddio tyrosinase mewn celloedd melanoma B16F10 na rhai nad ydynt wedi'u gwresogilicoricedyfyniad. At hynny, cynyddodd triniaeth wres gyfanswm ffenoliccontent. Yn benodol, isoliquiritigenin, angwrthocsidiolagwrth-melanogenigcyfansawdd o licorice, ei gynhyrchu gan driniaeth wres. I gloi, mae gan WH-130, gyda lefelau uwch o ffenolics bioactif fel isoliquiritigenin, botensial i ddatblygu'n groen newydd.gwynnudeunydd gyda chymwysiadau mewn colur.

Geiriau allweddol: gwrth-melanogeniggweithgaredd; triniaeth wres;licorice; celloedd melanoma murine (B16F10)

Mae Cistanche yn gwrthocsidydd

1. Rhagymadrodd

Licorice(rhywogaeth Glycyrrhiza), perlysieuyn lluosflwydd gyda defnyddiau meddyginiaethol yn y teulu Leguminosae, wedi'i ddosbarthu'n eang ar draws Canolbarth Asia, Tsieina, Rwsia, Manchuria, Mongolia ac Ewrop [1]. Fe'i defnyddiwyd ers amser maith fel asiant blasu a melysu. Mae gwreiddyn sych a stolon licorice wedi'u defnyddio i drin annwyd, peswch, asthma, blinder a heintiau'r llwybr anadlol oherwydd gweithgareddau biolegol licorice gan gynnwysgwrthocsidiol,gweithgareddau gwrth-ficrobaidd, gwrth-tiwmor, gwrth-blatennau, gwrthlidiol ac imiwnofodwlaidd [2,3]. Mae'r genws Glycyrrhiza yn cynnwys tua 22 o rywogaethau licorice, gan gynnwys G. uralensisFisch, G. glabra L. a G. inflata Batal.

Datblygwyd Wongam, cyltifar hybrid rhyng-benodol newydd o licorice, gan y Weinyddiaeth Datblygu Gwledig fel hybrid o Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Mae gan Wongam gynnyrch uwch a gwell ymwrthedd i glefydau na G. uralensis. Mae nifer o astudiaethau wedi'u cynnal ar weithgareddau biolegol G. uralensis, tra bod ymchwil presennol ar Wongam, cyltifar newydd, wedi'i gyfyngu i'w weithgareddau gwrth-alergaidd, imiwnofodwlaidd a gwrth-wlser [1,2]. Felly, mae angen ymchwilio i fioweithgarwch eangWongam.

Y prif gydrannau bioactif ynlicoricegwraidd yw flavonoids a saponins triterpene, gan gynnwys liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin (ISL) a glycyrrhizin (neu glycyrrhizicacid) [4,5]. Mae ISL yn flavonoid a geir mewn licorice sydd wedi dangos amrywiol weithgareddau fferyllol, gan gynnwys gwrthblatennau, gwrth-alergaidd, gwrth-diwmor, gwrthlidiol agwrthocsidiolgweithgareddau [6–8]. Mae ISL yn gynnyrch hydrolysis o isoliquiritin mewn gwreiddyn licorice. Gall atal melanogenesis trwy ddiraddio ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia (MITF) trwy actifadu'r llwybr signalau allgellog protein kinase (ERK) a reoleiddir gan signalau. O ganlyniad, roedd diraddiad MITF yn atal mynegiant tyrosinase(TYR) a phroteinau cysylltiedig â thyrosinase (TRP-1 a TRP-2) mewn genynnau SK-MEL-2 [9,10].ISL Gall atal gweithgareddau mono- a diphenolase madarch TYR yn ogystal â themelanogenesis mewn melanocytes [11].

Mae melanin, pigment mawr sy'n rhoi lliw croen, yn cael ei syntheseiddio mewn melanocytes epidermaidd a'i storio mewn organynnau mewngellol o'r enw melanosomau [12]. Mae pigmentau melanin yn cynnwys dau fath: eumelanin brown neu ddu a pheomelanin coch neu felyn [12]. Gall melanogenes gael ei achosi gan ysgogiadau allanol, gan gynnwys ymbelydredd uwchfioled (UV), rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) a chemegau fel hormon sy'n ysgogi melanocyte (-MSH) ac isobutylmethylxanthine (IBMX), sy'n codi lefelau monoffosffad adenosine cylchol (cAMP). Mae melanin yn amddiffyn y croen rhag yr ysgogiadau hyn, tra bod ei orgynhyrchu yn achosi gorbigmentu'r croen, a all arwain at afiechydon fel canser y croen [13-17]. CroengwynnuMae asiantau megis asid kojic, hydroquinone, arbutin ac asid ascorbig, sy'n atalyddion TYR, wedi'u defnyddio i drin hyperpigmentation mewn sawl cynnyrch cosmetig [13,18]. Mae melanogenesis yn cael ei reoleiddio trwy amrywiaeth o lwybrau signalau, ac mae'r signalau hyn yn gysylltiedig â dadreoleiddio MITF. Mae actifadu MITF yn hyrwyddo mynegiant TYR a TRPs (TRP-1, TRP-2). Yna, mae TYR yn cataleiddio ocsidiad L-tyrosine i3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), sydd wedyn yn cael ei ocsidio i DOPAquinone. Mae TRP-2 yn trosi dopacrom i 5,6-dihydroxyindole-2-asid carbocsilig (DHICA) neu 5,6-dihydroxyindole (DHI). Yn olaf, mae DHICA a DHI yn cael eu ocsidio gan TRP-1, gan arwain at inmelanogenesis [19].

Mae prosesau thermol yn effeithio ar briodweddau ffisiocemegol a biolegol echdynion planhigion. Maent yn dinistrio cellfuriau ac yn hollti bondiau cofalent, gan arwain at ryddhau cyfansoddion bioactif [20,21]. Treuliodd triniaeth wres bragwyr ddarnau grawn uwchlaw 130 ◦ Yn cynyddu cyfanswm y cynnwys ffenolig (TPC) a chyfanswm y cynnwys flavonoid (TFC), gyda chynnydd cyfatebol mewn gweithgareddau gwrthocsidiol [16,20,21]. Gall gwresogi peels sitrws arwain at ryddhau cyfansoddion ffenolig a chynyddugwrthocsidiolgweithgaredd [17].

Ein prif nod yw cadarnhau potensial Wongam fel croen naturiolgwynnudeunydd mewn colur. Yn ogystal, bwriad yr astudiaeth hon hefyd yw profi a all heattreatment wella gweithgareddau gwrthocsidiol a gwrth-melanogenig olicorice. Fe wnaethom ymchwiliogwrthocsidiolgweithgareddau, ynghyd â detholiadau TPC o Wongam.Gwrth-melanogeniggwiriwyd effeithiau detholiadau Wongam gan weithgaredd ataliad TYR a chelloedd inmelanoma cynnwys melanin.

Cistanche yn naturiolcroengwynnu llysieuyn

2. Defnyddiau a Dulliau

2.1. Paratoi Sampl

Paratowyd samplau yn unol â dull a adroddwyd yn flaenorol [22].Licorice(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, a nodwyd gan Yun Ji Lee o NIHHS, RDA ac sydd wedi'i gofrestru yn Llysieufa Adnoddau Meddyginiaethol Korea gyda rhif taleb MPS006326) ei drin a'i gynaeafu yn yr Adran Ymchwil Cnydau Llysieuol (Eumsung, Chungcheongbuk-do, Korea). ) yn 2018, a'i sychu ar 60 ◦C am 20 h. 10 kglicoricewedi'i gynaeafu ac roedd 1 kg yn ddaear. Ar ôl eu cymysgu, cafwyd 3 sampl o WC neu WH, yn y drefn honno. Rhoddwyd licorice daear (5 g) mewn cynhwysydd gwydr gyda 1 ml o ddŵr distyll a'i drin mewn awtoclaf (Jisico, Seoul, Korea) am 1 awr ar 130 ◦C (WH-130). Licorice rheoli heb ei drin (WC). , 5 g) a WH-130 eu tynnu ar wahân gan ddefnyddio 70 y cant ethanol (sampl: toddydd, 1:50, v:v) am 24 h ar dymheredd ystafell (RT). Ar ôl hidlo, anweddwyd y darnau o dan wactod, eu rhewi-sychu a'u storio ar −80 ◦C. Cafodd yr holl ddetholiadau eu hydoddi mewn dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, UDA) a methanol (Sigma, St. Louis, MO, UDA).

2.2. Penderfyniad Browning

Mae mynegai brownio olicoricecofnodwyd detholiadau (WC a WH-130) ar sail eu gwerth amsugnedd ar 420 nm (A420) wedi'i fesur gan ddefnyddio darllenydd microplate (BioTek, Winooski, VT, UDA). Mae gwerthoedd uwch amsugnedd ar 420 nm yn cyfateb i fynegai browning uwch [23,24].

2.3. Cyfanswm Cynnwys Ffenolig (TPC)

Yn ôl dull a adroddwyd yn flaenorol [25], mesurwyd TPC yn seiliedig ar yr egwyddor bod adweithydd Folin-Ciocalteu yn cael ei leihau i gromophore glas sy'n cynnwys cymhleth aphosphotungstic-phosphomolybdenum yn dibynnu ar amodau alcalïaidd ac ar grynodiad cyfansoddion ffenolig. Cymysgwyd pob sampl (10 µL) â 2 y cant o sodiwmcarbonad (200 µL) ac yna adweithydd Folin-Ciocalteu (10 µL). Cafodd y gymysgedd ei actifadu am 30 munud yn RT. Yna, mesurwyd yr amsugnedd ar 750 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate (BioTek, Winooski, VT, USA). Cyfrifwyd TPC o gromlin safonol asid galig a mynegwyd y canlyniadau fel gwerthoedd cyfwerth asid galig, mg GAE g−1extract.

2.4. Penderfynu Gallu Gwrthocsidiol

Mesurwyd y gweithgaredd chwilota radical gan ddefnyddio 2,20-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin6-asid sulfonic) halen diammonium (ABTS) yn unol â dull a ddisgrifiwyd yn flaenorol gydag ychydig o addasiad [19, 26]. Cynhyrchwyd hydoddiant cation radical ABTS trwy gymysgu 2.6 mM persulfate potasiwm a 7.4 mM ABTS a chaniatáu iddynt adweithio am 24 h atRT. Yna cafodd hydoddiant ABTS ei wanhau â dŵr distyll i addasu'r amsugnedd i'r ystod o 1.000–1.500. Nesaf, adweithiwyd 20 µL o'r sampl gyda 180 µL o ABTS ynghyd â hydoddiant, wedi'i ddiogelu rhag golau, a deorwyd y cymysgedd o sampl a hydoddiant am 30 munud atRT. Mesurwyd amsugnedd gan ddefnyddio darllenydd microplate (BioTek, Winooski, VT, UDA) ar 735 nm. O gromlin safonol Trolox, yr hyn sy'n cyfateb i Troloxgwrthocsidiolcyfrifwyd a mynegwyd cynhwysedd (TEAC) mewn mg o trolox cyfwerth (TE) fesul g o sampl sych.

Paratowyd hydoddiant radical 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) trwy hydoddi0.2 mM DPPH i 99 y cant ethanol. Gwanhawyd hydoddiant DPPH â dŵr distyll i anabsugniad ar 520 nm o 1000-1500. Yna, cymysgwyd 50 µL o'r sampl â hydoddiant 200 µL o DPPH a'i adweithio am 30 munud yn RT. Ar ôl yr adwaith, pennwyd amsugnedd y cymysgedd ar 520 nm. O gromlin safonol Trolox, cyfrifwyd a mynegwyd TEAC mewn mg TE fesul g o sampl sych.

2.5. Dadansoddiad Cromatograffaeth Hylif Perfformiad Uchel (HPLC).

Cymhwyswyd dull HPLC wedi'i addasu [22]. Mae cynnwys ISL olicoricedadansoddwyd detholiadau gan HPLC gyda synhwyrydd UV-weladwy (HPLC: cyfres 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, UDA; colofn: SynergiTM, 250 × 4.6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, UDA). Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys hydoddydd A (0.1 y cant o ddŵr asidin fformig) a hydoddydd B (0.1 y cant asid fformig mewn acetonitrile). Gweithredwyd y rhaglen graddiant ar gyfer y cyfnod symudol o dan y graddiant a ganlyn: 0–8 munud (20–20 y cant B), 8–30 munud (20–38 y cant B), 30–42 munud (38–50 y cant B), 42–47 munud (50–90 y cant B), 47–53 munud (90–90 y cant B), 53–54 mun (90–20 y cant B) a 54–60 munud (20–20 y cant B) . Gosodwyd y gyfradd llif, y donfedd canfod a chyfaint y pigiad i 1.0 mL/min, 360 nm a 10 µL, yn y drefn honno. Dadansoddwyd hydoddiannau safonol ISL gyda phedwar crynodiad gwahanol (0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL). Defnyddiwyd y gromlin raddnodi (y=echel plws b) i bennu cynnwys ISL. Yn yr hafaliad atchweliad, mae x yn cyfeirio at grynodiad yr ISL (mg mL−1) ac mae y yn golygu'r arwynebedd brig.

2.6. Assay Gweithgaredd Ataliol Madarch Tyrosinase

Cynhaliwyd assay gweithgaredd ataliol TYR gan ddefnyddio pecyn sgrinio atalydd TYR (BioVision, Milpitas, CA, UDA). Diddymwyd pob echdyniad (WC a WH-130) mewn DMSO i grynodiad terfynol o 250 µg/mL. Cafodd asid Kojic, a ddefnyddir fel rheolydd positif, ei wanhau hefyd i 250 µg/mL mewn DMSO. Yn gryno, cyfunwyd 20 µL o echdyniad neu asid kojic â 50 µL o hydoddiant ensymau TYR. Ar ôl deori yn RT am 10 munud, ychwanegwyd 30 µL o ddatrysiad swbstrad TYR at bob ffynnon. Crynodiad terfynol yr echdynion a'r asid kojic oedd 50 µg/mL. Yna mesurwyd dwysedd optegol y ffynhonnau ar 510 nm yn y modd cinetig am 1 h gyda darllenydd microplate (BioTek, Winooski, VT, UDA).

powdr cistanche: gwrth-ocsidiad

2.7. Diwylliant Cell

Cafwyd celloedd melanoma Murine B16F10 o'r Casgliad Diwylliant Math Americanaidd (ATCC, Manassas, VA, UDA). Cafodd celloedd B16F10 eu meithrin yng nghyfrwng addasedigEagle (DMEM) Dulbecco wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10 y cant (FBS), 100 uned / mLof penisilin a 100 µg / ml o streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, UDA) mewn awyrgylch llaith yn cynnwys 5 y cant CO2 ar 37 ◦C.

2.8. Assay Hyfywedd Celloedd

Mae sytowenwyndralicoricedaethpwyd o hyd i echdynion (WC a WH-130) i gelloedd B16F10 gan ddefnyddio'r MTT [3-(4,{5}}dimethylthiazol-2-yl)-2,{8 }}assay bromid diphenyltetrazolium].Cafodd celloedd B16F10 eu meithrin ar 4 × 103cells/wel mewn 96-plât ffynnon am 24 awr. Wedi hynny, ychwanegwyd darnau at y celloedd mewn crynodiadau o 50, 100 a 200 µg/mL a'u deor ar 37 ◦C am 48 h. Yna, ychwanegwyd hydoddiant MTT at bob ffynnon (500 µg/mL) a deorwyd y plât am 1 h ar 37 ◦C. Taflwyd y cyfrwng ym mhob ffynnon ac ychwanegwyd 100 µL o DMSO. Ar ôl ysgwyd am 30 munud, mesurwyd yr amsugnedd ar 540 nm gyda darllenydd microplate. Perfformiwyd yr holl brofion yn driphlyg.

2.9. Mesur Cynnwys Melanin Cellog

Mesurwyd cynnwys melanin mewngellol gan ddefnyddio fersiwn wedi'i addasu ychydig o amethod a ddisgrifiwyd yn flaenorol [27]. Cafodd celloedd melanoma B16F10 eu hadu mewn 6-blatiau ffynnon â dwysedd o 8 × 104 cell/ffynnon a'u deor am 24 h. Roedd y celloedd yn agored i'r echdynion (WC a WH-130, 100 µg/mL), asid kojic (100 µg/mL) neu ISL (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, Unol Daleithiau) am 48 h yn presenoldeb 100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX). Ar ôl y driniaeth, golchwyd y celloedd â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (DPBS) Dulbecco a'i ddiddymu mewn 200 µL o 1 N NaOH am 2 h ar 90 ◦C. Mesurwyd yr amsugnedd ar 405 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate.

2.10. Assay Gweithgaredd Tyrosinase Cellog

Mesurwyd gweithgaredd TYR mewngellol gan ddefnyddio fersiwn wedi'i addasu ychydig o ddull a ddisgrifiwyd yn flaenorol [27]. Cafodd celloedd melanoma B16F10 (8 × 104cells/ffynnon) eu trin â'r darnau (100 µg/mL) neu asid kojic (100 µg/mL) ym mhresenoldeb 100 µM IBMX am 48 h, eu casglu a'u golchi â DPBS. Cafodd y samplau protein eu gosod mewn 1 y cant TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, UDA) gyda byffer sodiwm ffosffad (pH 6.8) ac yna eu centrifugio ar 15,000 rpm am 10 munud. Casglwyd y ffracsiwn supernatant a phennwyd crynodiad y protein gan ddefnyddio'r pecyn assay asid bicinchoninic (BCA) (Waltham, MA, UDA). Ychwanegwyd cymysgedd adwaith yn cynnwys 30 µg o brotein (wedi'i addasu i 100 µL gydag 1 y cant Trion X-100) a 100 µL o 10 mM L-DOPA at bob ffynnon o 96-plât ffynnon. Ar ôl deori ar 37 ◦C am 1 h, cafodd dopacrom ei fonitro trwy fesur yr amsugnedd ar 490 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate. Cyfrifwyd gweithgaredd TYR gyda'r fformiwla ganlynol:

Gweithgaredd tyrosinase ( y cant )=(OD405 o sampl/OD405 o reolaeth) × 100

2.11. Adwaith Cadwyn Polymerase Amser Real (RT-PCR)

Penderfynwyd ar lefelau mynegiant mRNA genynnau sy'n gysylltiedig â melanogenesis gan gynnwys MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 gan ddefnyddio assay RT-PCR wedi'i addasu [28]. Yn gryno, cafodd celloedd B16F10 eu hadu mewn 6-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 8 × 104 cell y ffynnon a'u meithrin am 24 h. Yna, cafodd y celloedd eu trin â darnau (100 µg/mL), asid kojic (100 µg/mL) neu ISL(10 µM) am 48 h. Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu o'r celloedd gan ddefnyddio adweithydd TRIzol (Ambion, Austin, TX, UDA) ac yna mesurwyd crynodiad RNA gan ddefnyddio darllenydd microplate. Ar ôl paratoi cDNA (2 µg) gan ddefnyddio'r Reverse Transcriptase Premix Kit (ElpisBiotech, Daejeon, Korea) yn unol â phrotocolau'r gwneuthurwr, perfformiwyd PCR amser real gan ddefnyddio MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 a -actin preimio (Tabl 1, Bioneer, Daejeon, Korea) gyda phecyn Gwyrdd SYBR (ProGEN, Heidelberg, yr Almaen) mewn Offeryn PCR Amser Real CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA). Cafodd yr holl ddata ei normaleiddio i lefelau -actinmRNA fel genyn cadw tŷ cyfeirio.

2.12. Paratoi Lysadau Cell a Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol

Cafodd celloedd B16F10 eu hadu mewn 6-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 8 × 104 cell y ffynnon, eu deor am 24 h ac yna'n agored i echdynion (100 µg/mL), asid kojic (100 µg/mL). ) neu ISL(10 µM) am 48 h. Ar ôl golchi gyda DPBS, cafodd celloedd eu cynaeafu a'u gorchuddio mewn byffer Triton X (MilliporeSigma, Burlington, MA, UDA) yn cynnwys 1 y cant o broteas a choctel atal ffosffatasein. Mesurwyd crynodiadau protein lysates celloedd cyfan gan ddefnyddio pecyn assay aBCA (Waltham, MA, UDA). Llwythwyd symiau cyfartal o brotein (20 µg) ar geliau sodiwm dodecyl sylffad-polyacrylamid 10 y cant, a gafodd eu rhedeg am 4 h ar 70 V. Yna, trosglwyddwyd yproteinau i bilen fflworid polyvinylidene (PVDF). Golchwyd y bilen deirgwaith gyda halwynog wedi'i glustogi Tris [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl] yn cynnwys 0.1 y cant Tween 20 (TBST) a'i rwystro ag albwmin serwm buchol 2 y cant (GenDEPOT) am 1 h. Nesaf, deorwyd y pilenni dros nos ar 4 ◦C gyda'r gwrthgyrff cynradd (gwanedu 1:1000) am 4 h ar dymheredd ystafell. Canfuwyd MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 ac -actin â gwrthgorff gwrth-MITF polyclonaidd cwningen (Abcam, Caergrawnt, DU); gwrthgorff gwrth-TYR goatpolyclonal (Santa Cruz, Dallas, TX, UDA); a gwrthTRP monoclonaidd llygoden, gwrth-TRP-2 a gwrthgyrff gwrth{{- -actin (Santa Cruz, Dallas, TX, UDA), yn y drefn honno. Wedi hynny, golchwyd y pilenni sawl gwaith gyda TBST a deorwyd â gwrthgyrff eilaidd (gwanhau 1:2000) am 1 awr, sef IgG gwrth-lygoden cwningen, IgG gwrth-goat llygoden ac IgG gwrth-lygoden gafr (Santa Cruz, Dallas, TX, UDA), ac yna sawl golchiad gyda TBST. Canfuwyd proteinau targed gan ddefnyddio adweithydd cemiluminescence (ECL) gwell (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA) gyda System Ddelweddu ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA). Cynhaliwyd meintioli bandiau protein gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ (fersiwn 1.52a ar gyfer Windows; NIH, Rockville, MD, UDA) [28].

2.13. Dadansoddiad Ystadegol Dadansoddwyd y data gan ddefnyddio Microsoft Excel 2016 a chyflwynir yr holl ganlyniadau arbrofol fel y gwyriad ± safonol cymedrig (SD) o dri mesuriad annibynnol. Defnyddiwyd prawf-t dau sampl y myfyriwr i asesu gwahaniaethau rhwng y rheolaeth a'r samplau. Perfformiwyd dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) a phrawf Duncan gan ddefnyddio Rsoftware (Fersiwn 3.6.3) i bennu arwyddocâd pob cymhariaeth yn lefelau p < 0.05="" (*),="" p="">< 0.01="" (**)="" a="" p="">< 0.001="" (***).="" perfformiwyd="" dadansoddiad="" cydberthynas="" gan="" ddefnyddio="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

3. Canlyniadau

3.1. Mynegai Browning o Detholiad Licorice

Mae gradd brownio olicoricedangosir detholiadau yn Ffigur 1a. Cadarnhaodd y canlyniadau hyn fod dyfyniad wedi'i drin â gwres (WH-130, 0.965 ± 0.025 AU [unedau amsugno]) wedi cael gwerthoedd mynegai brownio llawer uwch na heb eu gwresogi echdynnu (WC, 0.758 ± 0.005 AU). Rydym yn disgwyl bod prosesu thermol yn cynyddu ffurfiant melanoidin yn WH-130 ac y gall y newid hwn fod yn gysylltiedig â gweithgareddau biolegol amrywiol.

3.2. Cyfanswm Cynnwys Ffenolig (TPC) Detholiad Licorice

Mae Ffigur 1b yn dangos TPC olicoricedetholiadau. Canfuom wahaniaeth mewn TPC rhwng WC a WH{{{0}}, gan fod gan WC TPC o 12.093 ± 0.061 mg GAE/g dyfyniad, tra bod WH-130wedi cael dyfyniad TPC o 14.098 ± 0.781 mg GAE/g dyfyniad. Cynyddodd triniaeth wres TPC o licoriceextracts.

3.3. Radical-Scavenging Gweithgarwch o Detholiad Licorice

Mae'rgwrthocsidiolgweithgaredd olicoricecyflwynir detholiadau yn Ffigur 1c,d. Roedd y gallu ABTS plws radical-scavening yn uwch ar gyfer dyfyniad WH-130 (6.{5}}86 ± 0.304 mg TEAC/gextract) na dyfyniad WC (3.542 ± 0.093 mg dyfyniad TEAC/g). Yn yr asesiad DPPH, gwelwyd tuedd debyg. Dangosodd detholiad WH-130 (7.442 ± 0.292 mg TEAC/g dyfyniad) fwy o weithgarwch chwilota radical DPPH na dyfyniad WC (4.033 ± 0.160 mg TEAC/gextract). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall gwresogi gynyddu gweithgaredd gwrthocsidiol darnau.

3.4. Isoliquiritigenin Cynnwys Detholiad Licorice

Dangosodd y canlyniadau fod cynnwys ISL toiled wedi cynyddu'n sylweddol ar ôl triniaeth wres (Tabl 2, Ffigur 2), sy'n nodi y gall prosesu thermol effeithio ar gynnwys hyn.gwrthocsidiolagwrth-melanogenigcyfansawdd.

tubolosa cistanche

3.5. Hyfywedd Cell

Fel y dangosir yn Ffigur 3,licoricenid oedd echdynion yn effeithio ar hyfywedd celloedd ar 50 neu 100 µg/mL mewn perthynas â'r rheolydd a driniwyd gan IBMX. Yn y triniaethau 50 a 100 µg/mL o'r holl echdynion, arhosodd hyfywedd celloedd yn fwy na 100 y cant. Felly, cynhaliwyd arbrofion pellach gan ddefnyddio crynodiadau echdynnu licorice o hyd at 100 µg/mL.

3.6. Effeithiau Detholiad Licorice ar Gynhyrchu Melanin mewn Celloedd Melanoma B16F10

Dangosir pigmentiad a chynnwys melanin celloedd B16F1{{10 yn Ffigur 4a, cynyddodd cynnwys melanin celloedd B16F1{0 hyd at 3.4-plygiad â thriniaeth IBMX mewn perthynas â'r rheolaeth heb ei drin. Dangosodd WC a WH-130 fod pigmentiad a chynnwys melanin wedi gostwng yn sylweddol o gymharu â'r grŵp a driniwyd gan IBMX (Ffigur 4a,b). Roedd WC aWH{{10}} yn dangos cynnwys melanin is na chelloedd wedi'u trin â KA. Roedd effaith ataliol synthesis melanin mewn celloedd B16F1{0 a gafodd eu trin â WH-130 yn fwy na WC. Gostyngwyd y symiau melanin a oedd yn bresennol ar ôl triniaeth â 100 µg/mL WC a WH-130 i tua 0.59-plyg a 0.{{51-plyg, yn y drefn honno, o'r lefel yn y lefel a driniwyd gan IBMX ataliodd group.ISL (10 µM) a KA (100 µg/mL) gynhyrchu melanin i 0.59-plyg a 0.{67-plyg, yn ôl y lefel mewn celloedd a drinnir gan IBMX.

Mae'r canlyniad hwn yn dangos bod trin â gwreslicoricegall echdyniad (WH-130) atal cynhyrchu melanin yn fwy effeithlon na detholiad heb ei gynhesu (WC). At hynny, gwelsom fod triniaeth â detholiad WH-130 ar 25, 50 a 100 µg/mL (Ffigur 4c) wedi arwain at ostyngiad yn dibynnu ar grynodiad yng nghynnwys melanin celloedd melanoma B16F10. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod gwresogi wedi gwella'rgwrth-melanogeniggweithgaredd dyfyniad licorice.

3.7. Effeithiau Detholiad Licorice ar Weithgaredd Tyrosinase

3.7.1. Gweithgaredd Tyrosinase Madarch

Mae effaithlicoricedangosir echdynion ar weithgaredd TYR madarch yn Ffigur 5a. Fe wnaethom gadarnhau bod effaith y darnau (WC a WH-130) ar ocsidiad swbstradau gan fadarch TYR wedi digwydd mewn amodau di-gell. Ar 50 µg/mL, roedd echdyniad WC yn atal gweithgaredd ensymau i 81.33 y cant, tra bod WH-130 yn atal gweithgaredd TYR i 65.95 y cant o'r lefel EC. Yn y cyfamser, achosodd asid kojic (KA), atalydd TYR, ataliad gweithgaredd ensymau i 47.09 y cant o lefel y CE. Roedd ataliad gweithgaredd TYR yn fwy mewn licorice wedi'i drin â gwres (WH-130) nag mewn licorice heb ei gynhesu (WC).

3.7.2. Gweithgaredd Tyrosinase Cellog

Fel y dangosir yn Ffigur 5b, cynyddodd gweithgaredd TYR celloedd a driniwyd gan IBMX i 233 y cant o'i gymharu â'r rheolaeth heb ei drin (100 y cant). Gostyngodd WC weithgaredd TYR i 82.17 y cant o'i gymharu â'r grŵp a driniwyd gan IBMX. Roedd echdyniad WH-130 yn atal gweithgaredd cellog TYR i 59.88 y cant o'i gymharu â chelloedd a driniwyd gan IBMX. Gostyngodd KA weithgaredd TYR cellog i 74.07 y cant o'r lefelau mewn celloedd a driniwyd gan IBMX. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod echdynion licorice (WC a WH-130) yn atal gweithgaredd TYR a bod gan WH-130 weithgarwch ataliol TYR mwy grymus na WC a KA.

Nesaf, fe wnaethom ymchwilio i'r cydberthynas rhwng TPC, cynnwys ISL,gwrthocsidiolgweithgaredd a gweithgaredd gwrth-melanogenig (Tabl 3). Roedd cydberthynas gadarnhaol rhwng TPC a chynnwys ISL (0.827), yn ogystal â gweithgareddau sborion radical ABTS plus a DPPH (0.886 a 0.896, yn y drefn honno), tra Roedd cydberthynas gwrthdro rhwng TPC a chynnwys melanin (–0.859). Roedd cydberthynas gadarnhaol rhwng cynnwys TheISL a gweithgareddau chwilota radical ABTS plus a DPPH (0.977 a 0.985, yn y drefn honno), tra bod cydberthynas gwrthdro rhwng cynnwys ISL a TYRactivity (–0. 834) a chynnwys melanin (–0.995). Roedd cydberthynas gwrthdro rhwng gweithgareddau gwrthocsidiol (ABTS plus a DPPH) â gweithgaredd TYR (–{{20}}.879 a –0.856, yn y drefn honno) a chynnwys melanint (–0). 974 a –0.984, yn y drefn honno). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod cyfansoddion ffenolig fel ISL mewn licorice yn gysylltiedig yn agos â'r gwrthocsidydd agwrth-melanogeniggweithgareddau echdynion licorice.

3.8. Effeithiau Detholiad Licorice ar Fynegiad Genynnau sy'n Gysylltiedig â Melanogenesis ar mRNA

Fe wnaethom archwilio mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â melanogenesis mewn celloedd B16F10 i egluro effeithiau echdynion licorice ar melanogenesis. Ataliodd WC a WH-130 fynegiad mRNA o MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 (Ffigur 6). Ataliodd WC fynegiant mRNA o MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 i lefelau 0.{{10}}plyg, 0.{ {12}}plyg, 0.71-plyg a 0.65-plyg, yn y drefn honno, o'r rhai mewn celloedd a drinnir gan IBMX. Ataliodd WH-130 fynegiant mRNA o MITF, TYR, TRP-1 a TRP{{20}} i 0.43-plyg, {{33} }}.60-plyg, 0.62-plyg a 0.49-plyg, yn y drefn honno, o'r lefelau grŵp a driniwyd gan IBMX. Cafodd dyfyniad WH{{30}} effaith ataliol gryfach ar fynegiad mRNA na dyfyniad WC. Mae ISL hefyd wedi atal mynegiant MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 (0.42-plyg, 0.59-plyg, 0.68-plyg a 0.44-plyg, yn y drefn honno, mewn perthynas â chelloedd a drinnir gan IBMX). Yn y grŵp a gafodd ei drin gan WH-130-, roedd graddau’r gostyngiad mewn mynegiant mRNA o enynnau sy’n gysylltiedig â melanogenesis yn fwy nag yn y grŵp a driniwyd â WC, sy’n dangos bodlicoricemae echdynion yn atal melanogenesis trwy atal trawsgrifiad genynnau sy'n gysylltiedig â melanogenesis a bod triniaeth wres yn gwella'rgwrth-melanogeniggweithgaredd dyfyniad licorice.

3.9. Effeithiau Detholiad Licorice ar Fynegiant Protein o Genynnau sy'n Gysylltiedig â Melanogenesis

Fel y dangosir yn Ffigur 7b, roedd triniaeth gyda WC a WH-130 wedi lleihau lefelau mynegiant protein MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 yn sylweddol. Cafodd lefelau mynegiant MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 eu hatal mewn celloedd a gafodd eu trin â WC (0.79-plyg, 0.{9) }}plyg, {{10}}.89-plyg a 0.67-plyg, yn ôl eu trefn, mewn perthynas â chelloedd a drinnir gan IBMX). Dangosodd WH-130 lefelau is o fynegiad protein o MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 ({{20}}.74-plyg, 0 }}.73-plyg, 0.80-plyg a {{30}}.48-plyg, yn ôl eu trefn, mewn perthynas â chelloedd a drinnir gan IBMX) . Gostyngodd ISL lefelau mynegiant protein MITF, TYR a TRP-2 (0.76-plyg, 0.83-plyg a 0.{41-plyg, yn y drefn honno, o'u cymharu â'r rhai a driniwyd gan IBMX). celloedd). Ataliodd WH-130 fynegiant protein genynnau sy'n gysylltiedig â melanogenesis yn gryfach na WC, gan ddangos hynnylicoricemae echdynion yn atal melanogenesis trwy ataliad cyfieithu genynnau sy'n gysylltiedig â melanogenesis a bod triniaeth wres yn gwella'rgwrth-melanogeniggweithgaredd dyfyniad licorice.

croen gwynnu powdr cistanche

4. Trafodaeth

Mae canlyniadau'r astudiaeth hon yn dangos bod triniaeth wres olicoriceyn effeithio ar TPC, gweithgaredd gwrthocsidiol, agwrth-melanogeniggweithgaredd. Roedd gan WH-130 fynegai brownio a gwerthoedd TPC uwch na WC. Mae amodau prosesu, gan gynnwys tymheredd a gwasgedd, yn effeithio ar gyfansoddion samplau. [29]. Gall gwresogi hyrwyddo adweithiau Maillard, sy'n gysylltiedig â chynhyrchu melanoidin [23]. Mae gan melanoidinau rai effeithiau biolegol, gan gynnwysgwrthocsidiol, antitumor, a gweithgareddau gwrthhypertensive, yn ogystal â modiwleiddio siwgr gwaed [30]. Mae'r cyfansoddion hyn yn macromoleciwlau lliw brown polymerig a ffurfiwyd trwy adwaith Maillard o ryngweithio rhwng siwgrau ac asidau amino ar dymheredd uchel [21]. Felly, po fwyaf o melanoidinau mewn echdyniad wedi'i gynhesu, yr uchaf yw'r mynegai brownio. Roedd lliw echdyniad licorice heb ei gynhesu (WC) yn dangos brown golau, ond roedd y lliw yn raddol yn dywyllach gyda thymheredd uchel (130 gradd). Gall y broses wresogi hefyd achosi rhai newidiadau yn strwythurau cemegol cyfansoddion ffenolig ac achosi torri waliau celloedd planhigion i lawr, gan ryddhau ffenoligau, gan arwain at weithgareddau gwrthocsidiol [31]. Felly, gall cynnwys ffenolig darnau licorice gynyddu gyda thriniaeth wres [21]. Dangosodd adroddiadau blaenorol fod triniaeth wres o fêl yn cynyddu ffurfiad melanoidin, ac roedd graddau'r brownio yn cyd-fynd â'r cynnydd mewn gweithgaredd gwrthocsidiol [24]. Felly, dangosodd WH-130 allu gwrthocsidiol uwch na WC yn y profion chwilota radical ABTS plus a DPPH, a ddefnyddiwyd yn helaeth i bennu gweithgareddau gwrthradical samplau yn seiliedig ar y gallu i drosglwyddo electronau neu atomau hydrogen [32].

Y naturiol mwyaf cyffredingwrthocsidiolac mae cyfansoddion gwrth-melanogenig yn ffenolig. Nodwyd tricin ac asid hydroxyoctadecadienoig fel y prif ffenolig yn Sorghum bicolor. Yn ogystal, dangosodd y cydrannau hyn effeithiau gwrthocsidiol a gwrth-melanogenig trwy atal gweithgaredd tyrosinase [19]. Yn ogystal, profwyd asid p-coumaric, cyfansawdd anactif o Sasa quelpaertensis Nakai, bod y cyfansoddyn hwn yn atal gweithgaredd tyrosinase yn gryf ac yn lleihau cynhyrchiant melanin mewn celloedd melanoma [27]. Yn ôl ymchwil flaenorol, mae ISL, cyfansoddyn flavonoid adnabyddus yn y cynnyrch hydrolysis o wreiddyn licorice [6-8], yn arddangos gweithgareddau gwrthocsidiol a gwrth-melanogenig trwy atal gweithgaredd TYR, cludiant melanosom ac anwythiad diraddio melanin [10,31] .Felly, fe wnaethom ganolbwyntio ar gynnwys ISL y detholiadau a gweithredu ISL mewn mecanweithiau cysylltiedig â melanogenesis. Mae ISL yn cael ei gymhwyso fel asiant therapiwtig ar gyfer llawer o afiechydon oherwydd ei weithgareddau biolegol niferus, gan gynnwys effeithiau gwrthlidiol, gwrth-ficrobaidd, gwrthocsidiol, gwrth-ganser, imiwnoleiddiol, hepatoprotective a cardioprotective [33]. Yn yr astudiaeth hon, mesurwyd cynnwys ISL uwch yn WH-130 nag yn WC. Mae hyperbigmentation croen yn gysylltiedig â straen ocsideiddiol. Adroddwyd bod sborionwyr radical rhad ac am ddim yn chwarae rhan bwysig wrth atal gorbigmentu [17,34]. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall triniaeth wres o licorice wella ei weithgareddau radical-scavenging agwrth-melanogeniggweithgareddau trwy lefelau cynyddol o gyfansoddion ffenolig gwrthocsidiol fel ISL. Yn ôl llenyddiaeth flaenorol, mae glabrene, glabridin, glabrol, liquiritigenin yn licorice (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra), yn arddangos ataliad tyrosinase. Felly, efallai y bydd y cyfansoddion hyn hefyd yn cael effaith ar weithgareddau gwrth-melanogenig [10,11,15,35]. Mae astudiaethau pellach arnynt yn bwysig i egluro effeithiau gwrth-melanogenig licorice.

Mae synthesis melanin yn cael ei reoleiddio gan TYR, TRP-1, TRP-2 (dopachrome tautomerase) a MITF (Ffigur 8). Mae TYR, glycoprotein sy'n cynnwys copr, yn gweithredu fel yr ensym sy'n cyfyngu ar gyfraddau ac yn chwarae rhan hanfodol wrth gynhyrchu melanin. Mae TYR yn cataleiddio hydroxylation tyrosin i 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA). Mae TYR hefyd yn cataleiddio ocsidiad DOPA i dopaquinone a throsi dopaquinone yn dopachrome. Yna, caiff dopacrom ei drawsnewid yn dihydro-indolizine (DHI) neu indole 5,6-quinone-2-carboxylicacid (DHICA) [36–38]. Yn y llwybr hwn, mae TRP-2 yn cataleiddio trosi dopachrome iDHICA, sy'n cael ei ocsidio gan TRP-1 i ffurfio eumelanin. Mae MITF yn ffactor trawsgrifio penodol sy'n chwarae rhan hanfodol mewn melanogenesis fel prif reoleiddiwr mynegiant TYR, TRP-1 a TRP-2 (Ffigur 8) [28,37]. Anwythydd cemegol melanogenesis yw 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), sy'n cynyddu gweithgaredd TYR trwy'r llwybr signalau cAMP [13]. Mae IBMX yn cynyddu'r crynodiad cAMP mewngellol trwy atal ffosffodiesterase cAMP. Mae'r cynnydd mewn lefelau cAMP yn actifadu protein kinase A (PKA) ac mae PKA wedi'i actifadu yn gwella gweithgaredd a mynegiant protein rhwymo cAMP (CREB) [39]. Mae CREB yn rhwymo hyrwyddwr MITF, gan arwain at ddadreoleiddio mynegiant genynnau MITF. Mae actifadu MITF yn hyrwyddo mynegiant TYR a TRPs [13,19]. Felly, mae is-reoleiddio MITF yn arwain at hypopigmentation.

Roedd echdyniad licorice wedi'i gynhesu (WH-130) yn atal gweithgaredd TYR madarch a TYR cellog yn fwy effeithiol na detholiad licorice heb ei gynhesu (WC). Gall ataliad TYRactifedd cellog mewn darnau licorice gael ei achosi gan is-reoleiddio TYR. Mae'r canlyniadau hyn yn gysylltiedig â chynnwys melanin celloedd melanoma B16F10. Mewn celloedd B16F10, roedd triniaethau WH-130 yn atal cynhyrchu melanin a achosir gan IBMX yn well na thriniaeth WC. At hynny, gwnaeth WH 130 is-reoleiddio trawsgrifio a chyfieithu marcwyr cysylltiedig â melanogenesis (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) mewn celloedd B16F10 i raddau mwy na WC. Gall y marcwyr hyn gyfrannu at ei gilydd gyda'i gilyddgwrth-melanogeniggweithgaredd [40].

Mae gwresogi olicoricecynyddodd y detholiad helaethrwydd cyfansoddion ffenolig gwrthocsidiol fel ISL, ac roedd y cynnydd hwn yn gysylltiedig â chynnyddgwrthocsidiolgweithgareddau (ABTS a mwy a DPPH). Roedd detholiad licorice wedi'i gynhesu (WH-130) hefyd yn dangos mwy o weithgaredd ataliol TYR a llai o synthesis melanin. Mae tueddiad newydd yn natblygiad deunyddiau naturiol oherwydd y potensial ar gyfer diogelwch. Mae Licorice wedi'i ddefnyddio mewn hufenau cosmeutical ar gyfer hyperpigmentation [41]. Fe wnaethom ddangos potensial Wongam fel rhywbeth newyddcroen-gwynoasiant i'w ddefnyddio mewn colur a gwirio y gall triniaeth wres wella ei botensial.

Mae gan Glycyrrhiza uralensis Fischer (licorice) weithgareddau gwrthocsidiol a ffotoprotective UV mewn ffibroblastau dermol dynol [22]. Fodd bynnag, mae angen cynnal yr astudiaethau o gymharu Wongam (licorice) a rhywogaethau brodorol eraill wedi hynny. Yn ogystal, dylid cynnal astudiaethau pellach ar y cydrannau anhysbys, megis glabrene, glabridin, o Wongam sy'n gysylltiedig â'i effaith gwrth-melanogenig gan ddefnyddio dulliau addas. Mae'n angenrheidiol ymchwilio i'r effeithiau synergaidd neu elyniaethus ymhlith cyfansoddion ffenolig ar ôl dadansoddi cyfansoddion mewn dyfyniad licorice [40]. Archwilio sut mae'r sylweddau hyn yn gweithredugwrthocsidiola dylid gwerthuso mecanweithiau gwrth-melanogenig, systemau trosglwyddo atom hydrogen neu drosglwyddo singleelectron a llwybrau signalau kinase protein-activated mitogen [32,37].

5. Casgliadau

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymchwilio i botensial detholiadau o Wongam, cyltifar newydd olicorice, felgwynnuasiant i'w ddefnyddio mewn colur ac effaith triniaeth wres ar eu bioactifedd. Dangosodd detholiadau Wongam (WC a WH-130) weithgareddau sborion radical uchel ac atal synthesis melanin mewn melanocytes a achosir gan IBMX trwy atal gweithgaredd TYR. Cynyddodd triniaeth wres ygwrthocsidiola gweithgareddau gwrth-melanogenig Wongam. O ganlyniad, dangosodd WH-130 gwrthocsidiol uwchraddol agwrth-melanogeniggweithgareddau na thoiled. Mae ein canlyniadau'n awgrymu bod echdyniad Wongam wedi'i drin â gwres (WH-130) yn gyfrwng galluog i leihau pigmentau gyda chymwysiadau posibl mewn amrywiol anhwylderau hyperpigmentation dermatolegol, gan gynnwys smotiau brown, brychni haul a melasma, ac yn dangos y gellir defnyddio prosesu thermol i wella'r gweithgaredd gwrth-melanogenig o licorice.

buddion cistanche tubolosa: gwynnu croen