Mae Ymwrthedd Celloedd Senescent Apoptosis Yn Rhwystr Cynhenid ​​ar gyfer Senolysis a Achosir gan Glycosidau Cardiaidd Rhan 2

Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth

Mae tarfu ar homeostasis K*/Nat a achosir gan ouabain yn arwain at wahanol adweithiau ffisiolegol mewn rheolaeth a senescent A549 a END-MSCs

Ar ôl sefydlu'r ffaith bod effaith senolytig ouabain yn ddibynnol ar fath gell, fe wnaethom geisio egluro ymhellach yr hyn a allai fod wrth wraidd y gwahaniaethau a ddatgelwyd yn ymatebion hMSCs ac A549. -heneiddedd a achosir gan yr A549 yn fwy manwl gywir.manteision cynomoriumPrif fecanwaith moleciwlaidd gweithredu gwahanol glycosidau cardiaidd yw ataliad o Nat/K plws -ATPase [44]. Mae Nat/K plus -ATPase yn ensym pilen plasma sy'n pwmpio sodiwm allan o'r gell tra'n pwmpio potasiwm i'r gell yn erbyn graddiannau crynodiad ac felly'n cymryd rhan yn y gwaith o gynnal a chadw K plus a Na plus homeostasis. Felly, fe wnaethom ofyn a allai fod unrhyw wahaniaethau mewn homeostasis ïon gwaelodol a ouabain a achosir gan ïon rhwng celloedd rheoli a senescent o ddau fath.

Cliciwch yma i wybod mwy

Dylai'r aflonyddwch yn K plus a Na plus homeostasis a achosir gan ouabain yn y pen draw arwain at wasgaru potensial y bilen plasma. Felly, ymhellach, fe wnaethom ddefnyddio chwiliwr fflwroleuol penodol DiBAC4(3) i fesur potensial trawsbilen celloedd nad ydynt yn gyffrous. Mae fflworoleuedd cynyddol y llifyn hwn yn adlewyrchu dadbolariad pilen.hyacinth anialwchYm mhob math o gell a brofwyd ouabain ysgogwyd depolarization bilen rhagweladwy, gan gadarnhau anghydbwysedd ïonig (Ffig. 10a). Yn nodedig, gwelsom lefelau tebyg o ddadbolariad pilen mewn rheolaeth a END-MSCs senescent, tra nodweddwyd senescent A549 gan bilen dadbolaredig llawer mwy o gymharu â rheoli celloedd A549.

Canlyniadau pwysig eraill dadreoleiddio ïonig yw newidiadau ym mhotensial pilen mitocondriaidd (MP).

Felly, gan ddefnyddio stiliwr fflwroleuol JC-1 fe wnaethom asesu MMP mewn celloedd rheoli a senescent ar driniaeth ouabain. Dylid tynnu sylw’n benodol at y ffaith bod llai o MMP yn nodweddiadol o gelloedd senescent sy’n adlewyrchu camweithio mitocondria, newidiadau mewn metaboledd egni, a lefelau cynyddol o rywogaethau ocsigen adweithiol mewngellol[45]. Yn ôl y disgwyl, roedd MMP mewn celloedd END-MSCs ac A549 yn is nag yn y rhai rheoli,

er nad oedd y gostyngiad hwn yn effeithio ar hyfywedd celloedd senescent (Ffig. id, 6a,10b).dull echdynnu flavonoid pdfYn debyg i'r canlyniadau uchod, ysgogodd ouabain ddadbolariad MMP amlwg yn y senes-cent A549 o'i gymharu â'u cymheiriaid cynyddol, tra bod yr effaith ar MMP o reolaeth a END-MSCs senescent yn fach iawn (Ffig.10b). Wrth grynhoi'r canlyniadau a ddisgrifir yn y rhan hon, gallwn ddod i'r casgliad bod blocio Na plus /K plus -ATPase gan ouabain yn arwain at ddadbolaru'r bilen plasma yn ddramatig a gostyngiad mewn MMP rhag ofn y bydd senescent A549, yn groes i senescent END-MSCS.

Newidiadau i fecanweithiau K ynghyd ag ouabain cyfryngol mewnforio - ymwrthedd i END-MSCs senescent

Er mwyn egluro mecanweithiau sy'n cyfryngu newidiadau a achosir gan ouabain mewn polareiddio pilen a MMP rhwng senescent A549 a END-MSCs, ymhellach, fe wnaethom ddefnyddio dull bio-wybodus datblygedig. Nod y dadansoddiad oedd datgelu nodweddion trawsgrifio posibl sy'n cyfryngu math o gell dibyniaeth-ent ouabain-gwrthedd neu -sensitifrwydd celloedd senescent. Mewn geiriau eraill, gofynnwyd y cwestiwn: sut mae heneiddedd END-MSCs (celloedd sy'n gwrthsefyll ouabain) yn wahanol i heneiddedd A549 (celloedd sy'n sensitif i ouabain)? I ateb y cwestiwn hwn, gwnaethom ddefnyddio tair set ddata dilyniannu RNA annibynnol (RNA-Seq). Yr un cyntaf oedd dadansoddiad RNA-Seq

Ffig.6 Dilysu model heneiddedd A549 a achosir gan etoposide. Mae celloedd Senescent A549 yn dangos colled o ymlediad, b yn caffael maint celloedd uchel, c lefel awtofflworoleuedd, a d gweithgaredd SA-b-Gal o'i gymharu â'r rhai rheoli. d Lefelau ffosfforyleiddiad p53 a Rb a lefelau mynegiant p21 a phroteinau HMGBI mewn rheolaeth a senescent A549. Y gwerthoedd a gyflwynir yw cymedrig ±SD. Ar gyfer grwpiau lluosog defnyddiwyd cymariaethau ar ANOVA un ffordd, n=3, n ddim yn arwyddocaol, ***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonoidauBariau graddfa ar gyfer delweddau yw 500 μm. Defnyddiwyd GAPDH fel rheolaeth llwytho rheolaeth a END-MSCs senescent a berfformiwyd gennym ni. Yr ail un oedd y set ddata ar gyfer rheoli a senescent A549 a lawrlwythwyd o GEO [43]. Mae'n werth nodi, roedd amodau a achosir gan heneiddedd yn cyd-daro â'r rhai a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth bresennol ac yn yr astudiaethau peilot o senolysis a achosir gan glycosidau cardiaidd. Ac roedd y drydedd set ddata ar gyfer IMR rheoli a senescent-90 a gafwyd yn uniongyrchol o'r astudiaeth ar glycosidau cardiaidd fel cyfansoddion senolytig [25]. Yn bwysig, profwyd bod IMR-90 yn dueddol o gael dadansoddiad a achosir gan ouabain. Dylid nodi y byddai cymharu dwy set ddata yn unig sy’n berthnasol ar gyfer END-MSCs a’r A549 yn y pen draw yn arwain at ganlyniadau amhriodol, oherwydd mewn dadansoddiad o’r fath byddai’r gwahaniaeth y gofynnir amdano rhwng y broses henebrwydd mewn END-MSCs a’r A549 yn anwahanadwy oddi wrth yr amrywiadau a gyfryngir gan effeithiau swp technegol amrywiol (hy math o beiriant dilyniannu, rhedodd amodau'r sampl). Er mwyn lleihau unrhyw effeithiau swp, gwnaethom gymharu un set ddata ar gyfer celloedd sy'n gwrthsefyll ouabain (END-MSCs) a dwy ar gyfer celloedd sy'n sensitif i ouabain (A549, IMR-90). Er mwyn dilysu perthnasedd y dadansoddiad cymharol pellach, gwnaethom gynnal Dadansoddiad Prif Gydran ar gyfer yr is-set o enynnau sy'n gysylltiedig â'r term GO "heneiddedd cellog" (GO 0090398) yn seiliedig ar y set ddata gryno sy'n cynnwys samplau o'r tri arbrawf a ddisgrifiwyd. Yn wir, ar gyfer pob math o gelloedd mae samplau wedi'u clystyru'n ddau grŵp ar wahân - y rhai rheoli a'r rhai synhwyro (Ffig.10d).

gall cistanche gwrth-heneiddio

Er mwyn cynnal dadansoddiad o enynnau wedi'u mynegi'n wahaniaethol (DEGs) yn ystod heneiddedd celloedd sy'n gwrthsefyll ouabain ac sy'n sensitif, fe wnaethom gynhyrchu'r model ystadegol a oedd yn crynhoi dau ragfynegydd a'u rhyngweithio. Mae cyflwyniad sgematig y dadansoddiad yn cael ei arddangos yn Ffig. 10c.Yn gryno, rhannodd y rhagfynegydd cyntaf yn y model yr holl samplau yn ôl is-grwpiau rheoli a heneiddedd, yr ail - trwy wrthiant ouabain neu sensitifrwydd ouabain, ac roedd y gydran olaf yn y model yn adlewyrchu'r rhyngweithiad y ddau ragfynegydd. Cyflwynir canlyniad profion mynegiant gwahaniaethol ar gyfer y newidyn olaf yn Nhabl Atodol 1.

Yna fe wnaethom gynnal dadansoddiad cyfoethogi set genynnau (GSEA) yn nhermau Ontoleg Genynnau (GO) ar gyfer Prosesau Biolegol (BP) (Tabl Atodol 2). Yn nodedig, ymhlith y prosesau sydd wedi'u cyfoethogi'n sylweddol, canfuom fod 'Mewnforio ïon potasiwm' a 'Rheoliad cadarnhaol o gludiant trawsbilen cation yn cael ei uwch-reoleiddio yn ystod heneiddedd END-MSCs sy'n gwrthsefyll ouabain o'i gymharu â heneiddedd celloedd sy'n sensitif i ouabain (Ffig. 10e). ). Roedd y rhestrau genynnau cyfoethogi craidd yn ymwneud â'r prosesau hyn yn cynnwys KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4 a gafodd eu huwchreoleiddio'n sylweddol mewn END-MSCs senescent (Ffig. 10f). Mae'r proteinau sydd wedi'u hamgodio gan enynnau KCNJ yn sianeli potasiwm tebyg i unionydd mewnol, sydd â mwy o dueddiad i ganiatáu i botasiwm lifo i mewn i gell yn hytrach nag allan o gell.defnyddiau hesperidinSLC12 teulu o gludwyr clorid cation-you-pled. Mae genyn WNK4 yn amgodio ar gyfer serine / threonine kinase sy'n gweithredu fel ysgogydd cyd-drosglwyddwyr clorid wedi'u cyplysu â sodiwm ac atalydd cotransporters clorid cypledig potasiwm. Gyda'i gilydd, roedd y canfyddiadau hyn yn caniatáu awgrymu y gall END-MSCs senes-cent adfer lefelau K mewngellol wedi'u disbyddu yn fwy effeithiol na chelloedd senescent A549 ac felly gallant ymdopi ag anghydbwysedd ïonig a achosir gan ouabain.

Arddangosfa END-MSC Senescent uchel

apoptosis-ymwrthedd o'i gymharu â'r rhai rheoli, tra nad yw senescent A549 yn gwneud hynny

Mae rôl K mewngellol yn ogystal â rheoleiddio marwolaeth celloedd wedi'i hen sefydlu [46]. Fe wnaeth gwahaniaethau a ddatgelwyd rhwng END-MSCs senes-cent a chelloedd A549 yn y gallu i gynnal K mewngellol ynghyd â homeostasis ein hysgogi i gymharu'r ymwrthedd straen cyffredinol a gafwyd yn ystod henebrwydd y ddau fath o gell. Mae'n hysbys bod straen alldarddol yn cyd-fynd â'r aflonyddwch mewn homeostasis ïonig, gan arwain at gyfnewid ïonau amrywiol yn gyflym, gan gynnwys K plus rhwng y gell a'i hamgylchedd [46]. Mae canlyniadau dylanwadau dirdynnol yn dibynnu i raddau helaeth ar allu celloedd i adfer y cydbwysedd ïonig mewngellol priodol. Fel y dangosir yn Ffig.10e,f, roedd heneiddio END-MSCs yn cyd-fynd â dadreoleiddio K ynghyd â mewnforio sy'n awgrymu yn ystod

Ffig.10 Mae END-MSCs senescent sy'n gwrthsefyll Ouabain yn gallu adfer aflonyddiad ar homeostasis K plus/Nat a achosir gan ouabain trwy fewnforio K plus effeithiol, tra nad oes gan gelloedd senescent sensitif ouabain y gallu hwn. a Pennu potensial bilen o reolaeth a senescent END-MSCs a chelloedd A549 cyn a 24 awr ar ôl triniaeth ouabain, gan ddefnyddio chwiliwr fflwroleuol DiBAC4(3). b Gwerthusiad potensial pilen mitocondriaidd o gelloedd END-MSC rheolaeth a senescent a A549 cyn a 24 awr ar ôl triniaeth ouabain, gan ddefnyddio stiliwr fflwroleuol JC-1. c Dyluniad y dadansoddiad biowybodus cymharol o dair set ddata RNA-Seq annibynnol.d Dadansoddiad Prif Gydran ar gyfer yr is-set o enynnau sy'n gysylltiedig â'r term GO "heneiddedd cellog" (GO 0090398) yn seiliedig ar ddata cyfunol o dair set ddata RNA-Seq annibynnol . e Canlyniadau GSEA ar gyfer y genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol rhwng y celloedd sy'n ymwrthol i ddadansoddiad wedi'i gyfryngu gan ouabain (END-MSCs) a'r rhai sy'n sensitif i ddadansoddiad wedi'i gyfryngu gan ouabain (A549 ac IMR-90) ar gyfer 'Rheoliad cadarnhaol o gludo trawsbilennau catïo' a 'Mewngludo ïon potasiwm prosesau biolegol. dd Map gwres yn adlewyrchu'r genynnau cyfoethogi craidd ar gyfer prosesau biolegol 'Rheoliad cadarnhaol o gludiant trawsbilen catïo' a 'Mewnforio ïon potasiwm'. Mae gwerthoedd yn gymedrig±SD. Aseswyd arwyddocâd ystadegol gan brawf-t y Myfyriwr: n ddim yn arwyddocaol,*t<><><>

datblygu heneiddedd Mae END-MSCs yn gwella eu gallu i adfer lefelau K plus. Yn ddiddorol, nid oeddem yn gallu datgelu tueddiad tebyg ar gyfer heneiddedd yr A549, felly, nid oedd yn ymddangos bod yr A549 wedi cael unrhyw nodweddion penodol yn ymwneud â mewnforio K* yn ystod dilyniant heneb. Yn ôl y data llenyddol, mae gostyngiad a achosir gan straen mewn K * mewngellol ac anallu i adfer ei lefel yn ffafrio actifadu caspasau a chnewyllyn ac felly cynigir eu bod yn ffactor pro-apoptotig [46].

Yn unol â'r awgrym hwn, gan ddefnyddio dadansoddiad biowybodus o'r setiau data RNA-seq uchod, fe wnaethom ddatgelu dirywiad sylweddol o'r prosesau sy'n ymwneud ag apoptosis yn ystod heneiddedd END-MSCs o'i gymharu ag A549 ac IMR-90 (Ffig. lla) . Ar ben hynny, nodweddir heneiddedd A549 ac IMR-90 gan uwch-reoleiddio genynnau pro-apoptotig yn sylweddol, gan gynnwys BAD, BAX, BOK, BAK-1, a NOXA (Ffig.11b). Mae'r data hyn yn dangos bod END-MSCs yn caffael ffenoteip sy'n gwrthsefyll apoptosis yn ystod heneiddedd, tra bod IMR -90 ac A549 yn mynd yn dueddol o apoptosis (Ffig.11b). Er mwyn cryfhau'r arsylwi hwn, fe wnaethom hefyd ddadansoddi set ddata micro-arae ar gyfer rheoli ac atgynhyrchu AD-MSCs senescent a oedd hefyd yn rhag-wasanaethu ymwrthedd ouabain yn ystod henebrwydd fel y nodir uchod (Ffig.4g). Wrth ddadansoddi ar gyfer lefelau mynegiant y genynnau sy'n gysylltiedig â apoptosis, gwelsom ffenoteip amlwg sy'n gwrthsefyll apoptosis o AD-MSCs senescent tebyg i END-MSCs senescent (Ffig.S8a Atodol, b).

Er mwyn gwirio canlyniadau dadansoddiad trawsgrifio, rydym yn amcangyfrif lefelau mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â apoptosis a K ynghyd â mewnforio yn y ddau fath o gelloedd senescent-DIWEDD-MSCs a A549 gan RT-PCR (Atodol Ffig. S9). Yn ogystal, dadansoddwyd mynegiant yr un rhestr genynnau gennym gan ddefnyddio modelau cellog eraill sy'n gwrthsefyll ouabain ac sy'n sensitif i ouabain, DP-MSCs senescent wedi'i drin â doxorubicin, a SK-Help senescent wedi'i drin etoposide, yn y drefn honno (Ffig Atodol. S9). Fel y dangosir yn Ffig Atodol S9, roedd y ddau fath o END-MSCs END-MSCs sy'n gwrthsefyll ouabain-gwrthsefyll celloedd-senescent a DP-MSCs yn arddangos patrymau mynegiant genynnau tebyg, yn benodol KCNJ2, SLC12A a WNK4 yn cymryd rhan yn K ynghyd ag adferiad wedi'u huwchreoleiddio, roedd BAX proapoptotic wedi'i isreoleiddio, tra antiapoptotic MCL-I yn upregulated. Ar ben hynny, roedd patrwm mynegiant yr un genynnau yn wahanol i'r rhai a welwyd ar gyfer A549 sy'n sensitif i ouabain a SK-Hep1. Mae'r canlyniadau hyn yn cadarnhau ein data trawsgrifiadol ac yn atgyfnerthu'r casgliad ynghylch proffiliau apoptosis amrywiol a gafwyd yn ystod henebrwydd gwahanol fathau o gelloedd.

Gwnaethom brofi nesaf a allai'r gwahaniaethau a welwyd mewn cefndir apoptosis yn ystod heneiddedd END-MSCs a'r A549 gael effaith ar ymwrthedd straen cyffredinol celloedd senescent. I wneud hynny, fe wnaethom asesu hyfywedd celloedd ar straen ocsideiddiol a staurosporine, a ddefnyddir yn nodweddiadol i gymell apoptosis. Yn wir, roedd END-MSCs senescent yn sylweddol fwy ymwrthol i'r ddau straen o gymharu â'u cymheiriaid rheoli (Ffig. 1lc). I'r gwrthwyneb, roedd celloedd A549 yn dangos sefyllfa i'r gwrthwyneb, gan fod celloedd senescent yn dangos tuedd i fod yn fwy sensitif i farwolaeth celloedd a achosir gan straen (Ffig. 11d). Mae'r arsylwi hwn yn symud y patrwm presennol bod ymwrthedd marwolaeth uwch yn nodwedd gyffredin o unrhyw fath o gelloedd synhwyro, gan ddangos ei benodolrwydd celloedd amlwg.

Yn seiliedig ar y data uchod, rydym yn rhagdybio y dylai lleihau "amddiffyniad" apoptosis o END-MSCs senescent greu amodau ffafriol ar gyfer dadansoddiad pellach. Yn hyn o beth, fe wnaethom ganolbwyntio ar aelod antiapoptotig adnabyddus o broteinau teulu BCL-2—MCL-1, gan fod ei fynegiant wedi'i uwchreoleiddio mewn END-MSCs senescent sy'n gwrthsefyll apoptosis (Ffig. 1 pwys a Ffig Atodol .S9a). I'r perwyl hwn, fe wnaethom rag-drin rheolaeth a END-MSCs senescent gydag A-1210477 yr atalydd MCL{-1 penodol, ac yna defnyddio glycosidau cardiaidd i ysgogi dadansoddiad. O bwys, ni chafodd A-1210477 ei hun unrhyw effaith ar allu amlhau celloedd rheoli ac ar hyfywedd rhai senescent fel y nodir ar y cromliniau twf (Ffig. 1le). Arweiniodd defnydd dilynol o glycosidau cardiaidd at ostyngiad yn nifer y celloedd hyfyw, ond roedd yr effaith yn fwy amlwg mewn ESCs senescent (Ffig.11f). Felly, roedd atal MCL-1 ag A{-1210477 yn rhagdueddol o ESCs senescent tuag at farwolaeth a achosir gan ouabain yn arwydd ar gyfer dadansoddiad. Mae'r dystiolaeth olaf ar gyfer apoptosis-ymwrthedd a gafwyd yn ystod heneiddedd END-MSCs i fod yn rhwystr cynhenid ​​ar gyfer dadansoddiad effeithiol a ysgogwyd gan glycosides cardiaidd.

Trafodaeth

O fewn yr astudiaeth bresennol, gwnaethom brofi effeithiau senolytig glycosidau cardiaidd, sef ouabain a byfalin, ar hMSCs. Nodwyd yn ddiweddar bod gan y ddau gyfansoddyn effaith sytotocsig ddetholus ar gelloedd senescent (modelau heneiddedd a achosir gan oncogene-/ther-apy) o wahanol darddiad, gan gynnwys celloedd cynradd IMR-90,HUVEC, ARPE-19, T/ C-28 a chelloedd canser SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26].Yn annisgwyl, rydym yn nid oeddent yn gallu datgelu unrhyw effeithiau sytotocsig ffafriol nid ouabain na byfalin ar END-MSCs senescent o gymharu â'r rhai rheoli. Yn bwysig, dilyswyd absenoldeb dadansoddiad gan ddefnyddio hMSCs a gafwyd o feinwe adipose, mwydion deintyddol a jeli Warton, a modelau henebrwydd amrywiol. Arweiniodd yr olaf ni at yr awgrym y gallai ymwrthedd i ddadansoddiad a achosir gan glycoside cardiaidd fod yn nodwedd gyffredin mewn hMSCs. Ar yr un pryd, roeddem yn gallu cymell apoptosis yn ffafriol yn senescent A549 a SK-Help, gan atgynhyrchu effaith senolytig glycosidau cardiaidd a ddisgrifir yn yr erthyglau perthnasol [25,26]. Gyda chelloedd yn gallu gwrthsefyll a sensitif i ddadansoddiad a achosir gan ouabain (sy'n gwrthsefyll ouabain/sensitif ouabain) ar gael, fe wnaethom geisio egluro'r achosion sylfaenol sy'n sail i'r gwahaniaeth hwn. Mae'r mecanwaith moleciwlaidd cyffredin o weithredu glycosidau cardiaidd yn rhwymo'r Nat/K plus -ATPase ac yn rhwystro ei weithgaredd. Trwy hydroleiddio ATP mae'r ensym hwn yn sicrhau pwmpio Na plus allan o'r gell a mewnforio K plus i'r celloedd a thrwy hynny gynnal graddiant electrocemegol ffisiolegol, homeostasis ïonig, pH cellog, a chyfaint celloedd sy'n hanfodol ar gyfer goroesiad a gweithrediad celloedd [47]. Felly, fe wnaethom ddyfalu y gallai gallu senolytig ouabain ddibynnu ar ddifrifoldeb anghydbwysedd K plus/Nat yn y celloedd wedi'u trin. Yn unol â'r awgrym hwn, fe wnaethom ddatgelu bod ouabain wedi achosi dadbolaru pilen plasma yn fwy amlwg a gostyngiad mewn MMP yn senescent A549 sy'n sensitif i ouabain.

Yn gyffredinol, dangoswyd bod effaith ataliad Nat/K plus -ATPase ar oroesiad celloedd yn benodol i fath gell. Er enghraifft, dangoswyd bod ouabain yn cryfhau apoptosis mewn lymffocytau, celloedd Jurkat, a chelloedd epithelial cwn, tra methodd â chymell marwolaeth mewn celloedd epithelial o aorta llygod mawr, celloedd gronynnau cerebrol llygod mawr, a lymffocytau tiwbaidd LLC-PK1 procsimol arennol mochyn er gwaethaf modiwleiddio tebyg. o'r gymhareb cationig [48-54]. Un o'r mecanweithiau arfaethedig ar gyfer gweithredu ouabain proapoptotic yw disbyddu mewngellol sy'n ffafrio crebachu apoptotig, actifadu caspasau, a chychwyn rhaglennu apoptotig [46, 47]. O ystyried colled K plws tebyg ond effaith groes ar sefydlu marwolaeth a gafwyd ar gyfer modelau sy'n gwrthsefyll ouabain a modelau sy'n sensitif i ouabain, gwnaethom awgrymu'r gwahaniaethau yn systemau cydadfer catation. Dylai'r gostyngiad yn lefel K mewngellog a mwy arwain yn y bôn at actifadu'r K ynghyd â mewnforio o'r gofod allgellog i wneud iawn am ddiffyg y catation hwn. Felly, gallai effeithiolrwydd K plus adferiad fod yn sail i ragdueddiad apoptosis ar driniaeth ouabain. I brofi'r awgrym hwn, cymhwyswyd dadansoddiad biowybodeg cymhleth gennym yn cymharu newidiadau mewn llofnodion trawsgrifio yn ystod heneiddedd celloedd sy'n gwrthsefyll ouabain (END-MSCs) a chelloedd sy'n sensitif i ouabain (A549 ac IMR-90). Gwelsom upregulation cryf o'r prosesau sy'n ymwneud â mewnforio ïon potasiwm yn ystod heneiddedd END-MSCs, tra yn ystod heneiddio oua-bain-sensitif A549 ac IMR-90 roedd y prosesau hyn yn parhau heb eu newid neu hyd yn oed wedi gostwng. Yn seiliedig ar hynny, gallwn ddyfalu y gall END-MSCs senescent ymdopi'n effeithiol â disbyddiad K plws a achosir gan ouabain trwy systemau mewnforio catation gweithredol, sy'n atal ymsefydlu apoptosis. I'r gwrthwyneb, mae ein-bain-sensitif senescent A549 ac IMR{-90 yn ymddangos yn llai abl i oresgyn K a cholled, ac felly maent yn dueddol o apoptosis. celloedd senescent A549, sy'n dangos anghydbwysedd ïonig amlwg sy'n nodweddiadol ar gyfer celloedd sy'n marw.

Yn hytrach na bod yn nodwedd unigryw o apoptosis a achosir gan ouabain, mae'n debyg mai gostyngiad mewn cynnwys mewngellol K plus yw'r nodwedd gyffredin o farwolaeth apoptotig a ysgogir gan straen amrywiol, ee triniaeth staurosporine a straen ocsideiddiol [46]. Yn unol â hynny, dylai gallu gostyngol yr A549 i adfer cytoplasmig K plus arwain yn y pen draw at ddirywiad yn yr ymwrthedd straen cyffredinol. Fodd bynnag, mae'r syniad hwn yn gwrth-ddweud y diffiniad modern o heneiddedd celloedd, sy'n nodi bod celloedd senescent yn gallu gwrthsefyll apoptosis yn fawr [16]. Dylid tynnu sylw'n benodol at y ffaith bod ymwrthedd apoptosis gwell yn sail i ddatblygiad dadansoddeg [16, 17].

Mae'r sôn cyntaf am ymwrthedd straen cynyddol celloedd senescent yn dyddio'n ôl i 1995 pan ganfuwyd bod ffibroblastau senescent atgynhyrchu yn fwy ymwrthol i dynnu serwm yn ôl o gymharu â'r rhai rheoli [55]. Dilynwyd yr astudiaeth gychwynnol hon gan nifer gyfyngedig o ymchwiliadau yn nodi bod celloedd senescent yn fwy ymwrthol i olau UV, staurosporine, thapsigargin, a straenau eraill na'u cymheiriaid cynyddol [56, 57]. Fodd bynnag, rydym ymhell o fod y cyntaf i godi cwestiwn ynghylch y gwrthiant apoptosis gwell fel nodwedd gyffredinol celloedd senescent. Felly, yn yr adolygiad a gyhoeddwyd yn 2003, adroddwyd "... nad yw ymwrthedd apoptosis yn nodwedd gyffredinol o gelloedd senescent, a all hefyd fod yn dueddol o apoptotig yn dibynnu ar y math o gell ac ysgogiadau apoptotig..."[58]. Yn wir, dangosodd sawl data sensitifrwydd uwch o gelloedd senescent i apoptosis a achosir gan straen nag o gelloedd rheoli [59-61]. Er enghraifft, roedd HUVECs senescent yn fwy tueddol o gael apoptosis a achosir gan LDL neu TNFa ocsidiedig o gymharu â chelloedd rheoli[61]. Er gwaethaf y ddadl amlwg, ymddangosodd yr amheuaeth olaf yn 2015 ac roedd yn swnio fel a ganlyn: "Mae'n ymddangos yn amheus bod ymwrthedd apoptosis byd-eang yn nodwedd gyffredinol o gelloedd henebrwydd"[62]. Yn yr un flwyddyn, cyhoeddwyd yr astudiaeth gyntaf yn datgelu dadansoddiad [16] ]. Yn yr astudiaeth hon, tynnodd yr awduron sylw at fynegiant cynyddol rhwydweithiau genynnau o blaid goroesi mewn celloedd senescent a gyfrannodd at eu hymwrthedd gwell i apoptosis. Felly, i ddechrau, roedd senolitics yn cynrychioli'r cyffuriau i dargedu proteinau a oedd yn amddiffyn celloedd senescent rhag apoptosis. Fe wnaeth darganfod dadansoddeg ynghyd â chanlyniadau trawiadol tynnu celloedd senes-cent gan ddefnyddio llygod trawsenynnol INK-ATTAC ysgogi llu o astudiaethau yn chwilio am y com-punnoedd newydd â gweithgaredd hemolytig [16-26,63]. Dros y ddwy flynedd diwethaf, cyhoeddwyd digon o adolygiadau ar ddadansoddeg [13-15,64-66]. Fodd bynnag, ers 2015 nid oedd ymwrthedd apoptosis gwell o gelloedd senescent yn destun dadl, er, mewn gwirionedd, ni chafodd ei brofi yn yr astudiaethau hyn.

Yn ddiddorol, wrth gymharu llofnodion trawsgrifio o gelloedd sy'n gwrthsefyll ouabain (END-MSCs) a chelloedd sy'n sensitif i ouabain (A549 ac IMR-90), canfuwyd mai dim ond heneiddedd END-MSCs oedd yn cyd-fynd â chaffaeliad y gellir ei weld. proffil gwrth-apoptotig. I'r gwrthwyneb, nodweddir heneiddedd A549 ac IMR-90 gan uwch-reoleiddio genynnau pro-apoptotig yn sylweddol, gan gynnwys BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA, ac ati. Yn bwysig, estynnwyd y canlyniadau hyn gan ddefnyddio celloedd DP-MSC eraill sy'n gwrthsefyll ouabatin. Ar y naill law, mae'r canlyniadau hyn yn rhoi esboniad moleciwlaidd ychwanegol am absenoldeb dadansoddiad a achosir gan ouabain mewn hMSCs, ac, ar y llaw arall, yn dangos yn glir bod A459 ac IMR-90 yn dod yn dueddol o apoptosis yn ystod henaint. Mae’n werth nodi, roedd ein data ynghylch newidiadau trawsgrifomig mewn genynnau sy’n ymwneud ag apoptosis mewn IMR senescent-90 yn cyd-daro â’r canlyniadau a gyflwynwyd, ond heb eu trafod, yn yr erthygl a gyhoeddwyd gan Guerrero et al., fel y setiau data ar gyfer rheoli ac IMR senescent{ Tarddodd {19}} o gelloedd o'r astudiaeth hon [25]. Datgelodd yr union ddadansoddiad o'r map gwres a ddarparwyd yn yr astudiaeth hon ddadreoleiddio BAX, BAD, BAD, BAKI, a NOXA mewn IMR senes-cent-90 o gymharu â'r celloedd rheoli. Ar ben hynny, mae Baar et al. datgelodd hefyd upregulation "annisgwyl" o proapoptotig a is-reoleiddio genynnau antiapoptotig mewn IMR senescent-90, gan grybwyll y dylai IMR senescent-90 gael ei preimio i gael apoptosis [21].

Er mwyn cryfhau ein harsylwadau, gwnaethom gymharu ymwrthedd rheolaeth a END-MSCs senescent ac A459 â'r straen symbylol-ocsidiol mwyaf cyffredin a achosir gan apoptosis a staurosporine. Yn ôl canlyniadau ein dadansoddiad bio-wybodus, daeth END-MSCs senscent i fod yn llawer mwy gwrthsefyll straen na chelloedd rheoli. Ar yr un pryd, dangosodd senescent A549 fod yr adwaith i'r gwrthwyneb ychydig yn fwy agored na chelloedd rheoli i'r ddau fath o ysgogiadau dirdynnol. Felly, gallai gweithredu senolytig glycosidau cardiaidd, o leiaf ar gyfer A549, gael ei gyfryngu gan ragdueddiad celloedd senescent o'r tarddiad hwn i apoptosis o'u cymharu â'u cymheiriaid rheoli, tra gallai absenoldeb senolysis a achosir gan ouabain mewn hMSCs gael ei esbonio gan y cynnydd mewn ymwrthedd apoptotig cyffredinol yn ystod heneiddedd y celloedd hyn. Ar ben hynny, roedd gwanhau "amddiffyniad gwrthiapoptotig" gan ataliad MCL-1 yn rhagdueddiad END-MSCs i senolysis a achosir gan glycosidau cardiaidd. Er ein bod wedi gallu cyflawni'r senolysis dymunol o END-MSCs trwy atal MCL-1, nid yw'r strategaeth i fodiwleiddio mynegiant y genynnau gwrth-apoptotig concrit i ragdueddu hMSCs senescent i senolysis yn ymddangos yn addawol iawn, gan fod y mynegiant gallai deinameg y genynnau gwrth-neu pro-apoptotig fod yn wahanol rhwng celloedd o darddiad amrywiol. Credwn mai caffael y proffil "gwrth-apoptotig" fel y'i gelwir yn ystod heneiddedd celloedd, yn hytrach na newidiadau yn y genynnau gwrth-neu pro-apoptotig concrit, sy'n gyfrifol am wrthwynebiad ouabain, yn hyn o beth efallai y bydd y posibilrwydd o newid y proffil cyfan. ymddangos yn fwy rhesymol.

Mae'n bosibl y bydd ein casgliadau sy'n tynnu sylw at ymwrthedd apoptosis a gafwyd yn ystod henebiad hMSC yn rhwystr cynhenid ​​​​ar gyfer dadansoddiad effeithiol yn cael ei ymestyn ymhell y tu hwnt i glycosidau cardiaidd. Yn nodedig, canfuwyd bod hMSCs senescent yn gallu gwrthsefyll cyfansoddion senolytig eraill. Yn wir, trwy ddadansoddi'r dystiolaeth bresennol canfuwyd bod cyfansoddion amrywiol gyda'r gweithgaredd senolytig a nodwyd, gan gynnwys navitoclax, nicotinamid riboside, danazol geldanamycin, ganetespib, fisetin, atalyddion BCL-XL, quercetin, etomoxir, antimycin A, FOXO4-DRI ,17-Trodd DMAG i fod yn aneffeithiol ar gyfer cael gwared wedi'i dargedu o preadipocytes dynol senescent (celloedd rhagflaenol tebyg i ffibroblast sy'n deillio o feinwe adipose dynol) a hMSCs o fêr esgyrn [17-19, 36, 40]. Mae'r data ynghylch absenoldeb dadansoddiadau mewn hMSCs rhywfaint yn gwrth-ddweud y canlyniadau ysbrydoledig a gafwyd gan ddefnyddio modelau llygod in vivo, gan ddangos canlyniadau cadarnhaol wrth gymhwyso dadansoddeg yn systemig [37, 38]. Er enghraifft, dangoswyd y gallai clirio bôn-gelloedd chwarren salivary senescent gan ddefnyddio ABT263 atal xerostomia a achosir gan radiotherapi [38]. Ar ben hynny, roedd cael gwared ar MSCs mêr esgyrn senescent trwy quercetin yn gwella ffurfiant mêr esgyrn [37]. Yn bwysig, dangoswyd bod llygod mawr synhwyro a llygod mawr MSC yn wahanol i hMSCs yn ymateb i ddadansoddeg. Er enghraifft, fe wnaeth quercetin, quercetin-tin＋dasatinib, ac ABT263 dynnu MSCs llygoden senescent yn sylweddol [16]. Hefyd, dangoswyd bod 17-DMAG yn lleihau bmMSCs senescent yn sylweddol mewn model llygoden progeroid [19]. Felly, dyfalir bod y gwelliannau yng ngweithrediad yr organau a'r systemau amrywiol a ddisgrifir yn yr astudiaethau hyn yn ganlyniad i'r targed o gael gwared ar fôn-gelloedd llygoden hynafol. Fodd bynnag, nid yw'r dadansoddiadau hyn wedi dangos unrhyw adfywiad swyddogaethol o hMSCs eto. Mae gwahaniaeth mor amlwg rhwng ymatebolrwydd llygod a MSCs dynol tuag at ddadansoddiad yn awgrymu efallai na fydd gwelliannau o therapïau senolytig yn cael eu cadw ar draws y rhywogaeth. Gellir ystyried y canlyniadau a gafwyd ar gyfer y cyfansoddyn seno-lytig UBX0101 yn enghraifft dda sy'n cadarnhau'r datganiad diwethaf. Dangoswyd bod yr asiant hwn yn clirio celloedd senescent mewn model llygoden o osteoarthritis, a oedd yn lleihau poen yn sylweddol ac yn hyrwyddo atgyweirio'r cartilag a ddifrodwyd [20]. Yn anffodus, methodd UBX0101 â gwanhau dilyniant clefyd a phoen mewn cleifion ag osteoarthritis poenus cymedrol-i-wasanaeth yn ystod treialon clinigol cam II [{67-69]. Mae pryderon tebyg yn cael eu codi am gyfuniad senolytig dasatinib＋querce-tin[68].

I grynhoi, mae dau gasgliad pwysig yn llifo allan o'r data a gafwyd. Dangosodd y cyntaf nad yw glycosidau cardiaidd yn gallu clirio hMSC senescent. Gallai absenoldeb dadansoddiad gael ei gyfryngu gan fewnforion cellog K a mwy effeithiol a mwy o ymwrthedd apoptosis mewn hMSCs senescent. Mae'r olaf yn fwy sylfaenol ac yn datgelu nad yw ymwrthedd apoptosis yn nodwedd gyffredinol o gelloedd senescent, oherwydd yn ystod heneiddedd mae rhai celloedd yn caffael ffenoteip 'gwrthsefyll apoptosis', tra nad yw eraill yn ei gael. Yn bwysig, dim ond celloedd A549 sy'n dueddol o apoptosis sy'n heneiddio y gellid eu clirio'n effeithiol gan glycosidau cardiaidd. Yn seiliedig ar hynny, gallwn ddyfalu y gallai effeithiolrwydd dulliau senolytig eraill ddibynnu ar a yw celloedd senescent yn wir yn gwrthsefyll apoptosis o gymharu â'u cymheiriaid cynyddol. Yn olaf, er bod 'dadansoddeg' yn bwnc llosg a bod llawer o ddata ysbrydoledig yn cael ei gyhoeddi, dylid bod yn ofalus wrth ddod i gasgliadau ynghylch effeithiolrwydd dadansoddi gan fod heterogeneity henebredd celloedd yn parhau i fod yn 'bos'.

Daw'r erthygl hon o Gwyddorau Bywyd Cellog a Moleciwlaidd (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x