Mae Hormon Twf An-bitwidol Lleol yn Cael Ei Achosi Gyda Heneiddio Ac Yn Hwyluso Difrod Epithelial
Jul 13, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
CRYNODEB
Mae ffactorau micro-amgylcheddol sy'n addasu difrod DINA sy'n gysylltiedig ag oedran yn aneglur. Mae hormon twf nad yw'n bitwidol (np) yn cael ei achosi yn y colon dynol, celloedd colon dynol heb eu trawsnewid, a ffibroblastau, ac mewn 3-organoidau berfeddol dimensiwn â niwed DNA sy'n gysylltiedig ag oedran. Mae autocrine/paracrine npGH yn atal p53 ac yn gwanhau ymateb difrod DNA (DDR) trwy gymell TRIM29 a lleihau ffosfforyleiddiad ATM, gan arwain at lai o atgyweirio DNA a chronni difrod DNA. Mae organoidau sydd wedi'u meithrin hyd at 4 mis yn arddangos marcwyr heneiddio, t16, a galactosidase SA a gostyngiad hyd telomere, yn ogystal â chroniad difrod DNA, gyda mwy o npGH, p53 wedi'i atal, a DDR gwanedig. Mae atal GH mewn organoidau oedrannus yn cynyddu p53 ac yn lleihau difrod DNA. Mae llygod WT yn arddangos croniad difrod DNA colon sy'n ddibynnol ar oedran, tra mewn llygod oedrannus heb signalau colon GH, mae difrod DNA yn parhau i fod yn isel, gyda th53 uchel. Gan fod sefydlu npGH sy'n gysylltiedig ag oedran yn galluogi micro-amgylchedd proliferative, gellid targedu ad-dalu signalau npGH fel therapi gwrth-heneiddio trwy rwystro difrod DNA a phatholegau sy'n gysylltiedig ag oedran.
RHAGARWEINIAD
Mae swyddogaethau biolegol yn dirywio wrth heneiddio ar yr un pryd â mwy o glefydau sy'n gysylltiedig ag oedran.flavonoidauMae patholegau sy'n gysylltiedig ag oedran yn cael eu gyrru gan ddifrod DNA cronedig a diffygion mewn atgyweirio DNA sy'n achosi mwtaniadau ac aberiadau cromosomaidd sy'n gysylltiedig ag oedran. Gall difrod DNA parhaus hefyd rwystro amlhau celloedd, gan arwain at heneiddedd ac apoptosis, a thrwy hynny ysgogi'r broses heneiddio ymhellach (Ou a Schumacher, 2018). Mae difrod DNA yn cronni gydag oedran mewn celloedd dynol a murineaidd math gwyllt (WT), heb eu trawsnewid, fel y dangosir gan amrywiad 2A cynyddol histone ffosfforyleiddio (yH2AX), marciwr o doriadau DNA llinyn dwbl (DSBs) (Sedelnikova et al., 2004) a difrod DNA heb ei atgyweirio (Dolle et al., 1997; Hasty et al., 2003; Lombard et al., 2005; Petr et al., 2020). Gall ansefydlogrwydd genomig o ganlyniad i atgyweirio difrod DNA diffygiol ffafrio trawsnewid cellog (Negrini et al., 2010). Mae difrod DNA yn sbarduno ffosfforyleiddiad genynnau ataxia-telangiectasia-mutated (ATM), sy'n gyfrifol am atgyweirio toriadau DNA un llinyn a DSBs. Mae ATM yn ffosfforyleiddio ac yn sefydlogi atalydd tiwmor p53, gan sicrhau atgyweirio difrod DNA trwy hwyluso sawl llwybr atgyweirio DNA. Felly, mae ATM yn chwarae rhan allweddol wrth actifadu'r ymateb difrod DNA (DDR) ac atgyweirio DNA (Ou a Schumacher, 2018).
Mae mynegiant a gweithgaredd ATM yn dirywio gydag oedran (Feng et al..2007; Gutierrez-Martinez et al., 2018), yn debygol o arwain at golled swyddogaethol p53 sy'n gysylltiedig ag oedran ac yn arwain at ddifrod DNA cronedig ac ansefydlogrwydd cromosomaidd (Simon et al, 2009) .t53 ymatebion i straenwyr fel ymbelydredd yn is mewn llygod hŷn (Feng et al., 2007) ac mewn ffibroblastau dermol dynol sy'n deillio o unigolion oedrannus (Goukassian et al., 2000). Felly, mae nodweddion heneiddio yn cynnwys llai o weithgaredd DDR ac ataliad p53 gyda difrod DNA cronedig heb ei atgyweirio, i gyd yn galluogi milieu ffafriol ar gyfer amlhau epithelial (Lopez-Otin et al., 2013).
Wrth i secretiad hormon twf pituitary (GH) leihau gydag oedran, mae signalau GH wedi'u newid yn gysylltiedig â'r broses heneiddio (Ho a Hoffman, 1993) Serch hynny, mae corff o dystiolaeth yn cefnogi effeithiau buddiol gwanhau GH ar heneiddio. Yn y gell, murine , a modelau clefydau dynol (Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al., 2013), mae manteision diffyg GH yn deillio'n bennaf o arsylwadau sy'n ffafrio ffactorau eilaidd sy'n ymestyn hyd oes, gan gynnwys sensitifrwydd inswlin gwell, llai o ocsidiad protein hepatig , gostwng nifer yr achosion o ganser, a llai o lid sy'n gysylltiedig ag oedran (Aguiar-Oliveira a Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016). Mae epil Leiden yn astudio teuluoedd â hirhoedledd teuluol a marwolaethau is mae lefelau GH cylchredol integredig is na rheolaethau amgylcheddol cyfatebol (van der Spoeletal., 2016), tra bod GHexcess yn lleihau hyd oes fel y gwelir mewn cleifion ag acromegali (Chesno-kova et al., 2019a; Melmed, 2020; Waters a Barclay,200 7) ac mewn modelau gwallgof trawsgenig yn gorfynegi GH (Bartke, 2003).defnyddiau hesperidinMae rhai wedi awgrymu cydberthynas negyddol rhwng uchder a hirhoedledd mewn bodau dynol (He et al., 2014; Samaras a Storms, 1992) ac mewn cŵn (Greer et al., 2007), Fe wnaethom ddamcaniaethu y gallai effeithiau andwyol GH ar heneiddio, o leiaf yn rhannol, gael ei briodoli i ddifrod DNA cronedig (Ches-nokova a Melmed, 2020). I gefnogi'r rhagosodiad hwn, mae lymffocytau sy'n deillio o gleifion acromegali yn arddangos difrod DNA gyda mwy o aberiadau cromosomaidd (Bayram et al, 2014), tra bod difrod DNA heb ei atgyweirio yn cronni yn iau model acromegaly pysgod sebra (Elbialy et al., 2018). Mae lefelau GH cylchredeg uchel yn gwanhau atgyweiriad DNA colon murine, gan sbarduno croniad difrod DNA, tra bod difrod DNA yn cael ei wanhau ar ôl blocio derbynnydd GH (GHR) mewn celloedd colon dynol ac mewn llygod â signalau GHR wedi'u diddymu (Chesnokova et al., 2019a).
Mae GH nad yw'n bitwidol (np) sy'n cael ei syntheseiddio'n lleol mewn meinweoedd ymylol yn union yr un fath â GH1 endocrin a gynhyrchir gan y pituitary ac yn gweithredu trwy fecanweithiau awtocrin/paracrine trwy'r GHR (Ballesteros et al., 2000) a fynegir yn eang sy'n cydnabod ligandau pituitary GH a npGH ( Waters a Barclay, 2007; Waters et al, 2006).cistanche ymerodraeth gollWrth i actifadu DDR ysgogi npGH (Chesnokova et al., 2013), fe wnaethom ddamcaniaethu bod difrod DNA colon cronedig sy'n gysylltiedig ag oedran yn achosi mynegiant npGH, a fyddai, yn ei dro, yn cyfyngu ymhellach ar atgyweirio difrod DNA.
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
Gan ddefnyddio modelau dynol in vitro ac ex vivo sy'n adlewyrchu heneiddio, rydym yn dangos yma fod npGH yn cael ei achosi a bod difrod DNA yn cronni mewn meinweoedd dynol oedrannus, fel y dangosir gan fwy o ffosfforyleiddiad H2AX (yH2AX). Ar ben hynny, mae difrod DNA y colon yn cynyddu'n sylweddol mewn llygod WT oedrannus, tra bod difrod DNA epithelial yn parhau i fod yn isel mewn llygod GHR sy'n cyfateb i oedran heb signalau GH ac mewn llygod taro GHR sy'n benodol i'r colon (GHRcolKO).
Cafodd npGH lleol ei ysgogi hefyd mewn organoidau mewn testinal 3-dimensional (3D) oed a gynhyrchwyd o fôn-gelloedd lluosog dynol anwythol (iPSCs)(Barrett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). Organoid npGH, yn ei dro, atal p53 a gwanhau atgyweirio difrod DNA.ffracsiwn flavonoid puro micronedig 1000 mg yn defnyddioRoedd effeithiau ofnpGH yn debygol o baracrine, wrth i gyd-ddiwyllio ffibroblastau sy'n mynegi GH gyda dyfeisiau microhylifol Coluddion-Sglodion wedi'u hymgorffori â cholonoidau dynol wedi'u hatgyfnerthu p53/p21 a difrod DNA gwell. Mewn cyferbyniad, roedd atal GH mewn organoidau oedrannus yn atal difrod DNA.
Felly, rydym yn dangos bod npGH epithelial yn cael ei ysgogi'n gryf yn ystod heneiddio a bod npGH yn lleihau atgyweirio DNA ac yn hwyluso cronni difrod DNA sy'n gysylltiedig ag oedran. Yn gyffredinol, mae'r canlyniadau'n awgrymu bod npGH epithelial colon lleol yn sbarduno newid maes mwcosaidd, gan greu amrywiaeth o ansefydlogrwydd cromosomaidd sy'n ffafriol ar gyfer datblygiad neoplastig mewn meinwe heneiddio.
Yn bwysig, er bod defnydd amhriodol eang o GH fel hormon "gwrth-heneiddio" er gwaethaf y diffyg effaith gymhellol ar y broses heneiddio (Blackman et al., 2002; Clemmons et al..2014; Lieut al., 2007; Melmed, 2019), mae ein canlyniadau'n dangos bod signalau GH lleol yn cyfrannu at y micro-amgylchedd meinwe, gan ffafrio datblygiad patholegau sy'n gysylltiedig ag oedran. Gall atal signalau npGH lleol i gyfyngu ar ddifrod DNA epithelial andwyol felly gynnig targed therapiwtig heneiddio anofyliaid. Mae canlyniadau'r astudiaethau hyn yn llywio dull arloesol o ymestyn hyd oes (hy, atal yn hytrach nag ymsefydlu signalau GH lleol). CANLYNIADAU
Mae difrod DNA y colon dynol ac npGH yn cronni wrth heneiddio
Aseswyd difrod DNA sy'n gysylltiedig ag oedran mewn samplau meinwe paraffin colon dynol nad yw'n diwmor a ddeilliodd o garfanau cleifion yn rhychwantu 3 grŵp oedran: ifanc (18-39 oed), canol oed (40-60 oed), ac oedran ( 61-88 mlynedd). Pan gawsant eu sgorio ar gyfer yH2AX, dangosodd 3 o 11 sampl (27 y cant) yn y garfan ifanc ddifrod DNA, dangosodd 8 o 16 (50 y cant) ddifrod DNA yn ystod canol oed, ac roedd 8 o samplau 18 (45 y cant) oed yn arddangos difrod DNA (Ffigurau 1A-1C ac 1J).
Gan i ni ddangos yn flaenorol bod difrod DNA yn achosi npGH (Chesnokova et al, 2013), fe wnaethom geisio pennu a oedd y croniad o ddifrod DNA sy’n ddibynnol ar oedran yn gysylltiedig â mynegiant GH mewn meinwe colon nad yw’n diwmor. Gan na fynegir na mewn celloedd colon niwroendocrin (Chesnokova et al, 2016), fe wnaethom eithrio'r celloedd hyn rhag dadansoddi.
Canfuwyd mynegiant GH epithelial mewn 16 y cant -17 y cant o samplau colon arferol yn deillio o garfanau canol oed ac oed (samplau 38 a 42, yn y drefn honno) ond mewn dim ond 2 y cant o'r garfan ifanc (37 sampl), tra bod y Cynyddwyd sgôr mynegiant GH yn y garfan ganol oed a chynyddodd ymhellach yn y samplau carfan oed (t<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflavonoidI grynhoi, mae'r canlyniadau hyn yn cyfeirio at groniad difrod DNA heb unrhyw anwythiad yn y colon sy'n heneiddio.
Mae actifadu DDR yn ysgogi murine npGHin lleol a cholon dynol
Gwnaethom ystyried nesaf a yw DDR wedi'i actifadu yn sbarduno mynegiant npGH colon lleol a llygod wedi'u trin â nutlin3 i sefydlogi p53 (Vassilev et al, 2004) ac arsylwi colon ysgogedig p53 ac i fyny (Ffigur 2A). Yn ogystal, mewn sbesimenau adenocarcinoma colon sy'n deillio o'r un cleifion cyn ac ar ôl therapïau niweidiol DNA (Tabl S1), gwelsom fynegiant npGH epithelial gwaelodlin cyn-driniaeth cymedrol a mynegiant npGH cynyddol ar ôl therapi ym mhob un o'r 6 sampl cleifion a astudiwyd (t<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">
Mae DDR yn actifadu mynegiant GH in vitro
Defnyddiwyd yr atalydd topoisomerase Il etoposide i gynhyrchu toriadau DNA un llinyn a DSBs (Walles et al,1996) ac i benderfynu a yw DDR yn actifadu GH in vitro. Yr npGH a achosir gan ddifrod gan DNA yng nghelloedd adenocarcinoma'r colon NCC, hNCF, a HCT116 dynol (Ffigurau 3A a S1A-S1C); mewn organo-ids, GH a achosir gan etoposide a GH mRNA (Ffigurau 3B a S1D), tra bod lefelau IGF1 a mRNA prolactin heb eu newid (Ffigur S1E). Cafodd ffosfforyleiddiad STAT5, signal GH i lawr yr afon (Waters, 2016), ei ysgogi ym mhob math o gelloedd (Ffigurau 3A-3C a S1A-S1C). Mewn cyferbyniad, roedd diddymu npGH ag RNA ymyriadol bach GH (siRNA) yn atal etoposide rhag ysgogi pSTAT5 (Ffigurau 3C ac S1F), gan ddarparu tystiolaeth bod colon a achosir gan ddifrod DNA npGH yn weithredol weithredol. Roedd delweddu NCC a gafodd ei drin ag etoposide am 24 h yn dangos cyd-fynegiant GH a yH2AX mewn celloedd lluosog (Ffigur 3D).
Mae celloedd epithelial sy'n cael difrod DNA yn secretu GH Er mwyn pennu a yw npGH mewngellol ysgogedig yn cael effeithiau awtocrin/paracrine, fe wnaethom asesu lefelau GH sy'n cael eu secretu i gyfrwng meithrin NCC a organoid ar ôl triniaeth etoposide. Canolig a gasglwyd gan ANCC yn 8 a 24 h ar ôl triniaeth ac o organoidau yn 4-48 h ar ôl triniaeth yn dangos cynnydd GH sy'n dibynnu ar amser ar ôl actifadu DDR (Ffigur 3E). Oherwydd bod NCC ac organoidau yn mynegi derbynyddion GH fel y mae meinwe'r colon dynol (Chesnokova et al., 2016), mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai GH lleol a achosir mewn ymateb i ddifrod DNA achosi gweithredoedd awtocrin/paracrine i feinwe heneiddio.
Autocrine/paracrine GH yn atal cell colon dynol t53
Wrth i GH endocrin atal colon murine p53 (Chesnokova et al, 2016), fe wnaethom benderfynu a yw GH lleol yn cael effeithiau awtocrine / paracrine tebyg mewn celloedd colon epithelial dynol. Dangosodd dadansoddiad o ddwy linell NCC ar wahân sy'n deillio o ddau glaf gwahanol ar ôl cnewyllolofection gyda hGH neu haint â GH mynegi lentivirus (lenti-GH) (Ffigurau 4A, 4B, a S2) yn ogystal ag organoidau sy'n mynegi hGH yn sefydlog (Ffigur 4C) wedi'u hatal. t53 a gorfynegiant cydredol. Roedd celloedd sy'n deillio o organo-ids wedi'u heintio â lenti-GH neu fector gwag (lenti-V) wedi'i guro â bromodeocsyridin (BrdU) yn dangos ataliad p53 ac yna corfforiad BrdU cymedrol ond wedi cynyddu'n sylweddol wedi'i asesu gan ddidoli celloedd wedi'i actifadu gan fflworoleuedd (FACS)(Ffigur). S3A). Mewn cyferbyniad, arweiniodd ataliad GH gyda lentivirus yn mynegi pigyn gwallt bach GH (GH) at ffurfiant cytrefi a maint cytrefi yn llai yn NCC (Ffigurau S3B ac S3C), gan nodi gweithredoedd npGH pro-pro-llenyddiaeth.
Effeithiau paracrinaidd GH mewn Sglodion Coluddion y Colon dynol Er mwyn asesu effeithiau paracrine npGH ar gelloedd epithelial mwcosol berfeddol, fe wnaethom gyd-ddiwyllio UNCF sydd wedi'i heintio â dyfeisiau microhylifol lenti-GH a Colon Intestine-Chip (Kasendra et al, 2020) wedi'u hadu â cholonig iach celloedd epithelial sy'n deillio o organoid am 8 diwrnod. Cadarnhawyd secretiad GH lleol o hNCF i'r cyfrwng gan ELISA(338ng/mL/1×10 degree cell).5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) (20 μM) wedi'i ychwanegu ar ddiwrnod 7 , gosodwyd sglodion 24 h yn ddiweddarach, a'u staenio ar gyfer EdU, a H2AX, ac EdU plus niwclysau eu cyfrif mewn celloedd epithelial. Set ar wahân o sglodion wedi'u hadu
gyda chelloedd epithelial yn cael ei ddefnyddio i asesu t53/p21 gan blot gorllewinol. Cynyddodd nifer y celloedd epithelial sglodion (t<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">
Mae Autocrine/paracrine GH yn atal DDR
Ysgogi ATM ar ffosfforyladau difrod DNA H2AX, sy'n nodi safleoedd DNA sydd wedi'u difrodi i actifadu DDR a hyrwyddo atgyweirio (Turinetto a Giachino, 2015). Mae ATM hefyd yn ffosfforylates p53, gan wella atgyweirio DNA ymhellach (Blackford a Jackson 2017). Yn hNCC yn ogystal ag mewn organoidau a heintiwyd naill ai â pIRES2-ZsGreen1hGH neu â ffacbys-GH, roedd gorfynegiant GH yn atal ffosfforyleiddiad ATM a DNA-protein kinase (PK)cs, y ddau yn ymwneud ag atgyweirio DNA (Blackford a Jackson). 2017), a llai o ffosfforyleiddiad o brotein targed p53 (Ffigurau 5A-5C).
Mae histone acetylase Tip60 yn actifadu ATM (Jackson a Bartek, 2009) ac yn cael ei reoleiddio'n negyddol gan TRIM29 (Sho et al., 2011; Sun et al, 2005). Gwelsom fod gorfynegiant GH yn NCC ac mewn organoidau hefyd wedi arwain at ymsefydlu TRIM29, a oedd yn ei dro yn atal Tip60 (Ffigurau 5A-5C). Gwelwyd canlyniadau tebyg yn ail linell NCC 48 h ar ôl niwcleofiad gyda phlasmid yn mynegi GH ac ar ôl 6 diwrnod ar ôl haint â lenti-GH (Ffigurau S4A a S4B).
Mae Autocrine/paracrine GH yn gwanhau atgyweiriad DNA
Nesaf buom yn mesur effeithiau ar fecanweithiau atgyweirio DSB, yn benodol uno pen anhomolog nad oedd yn dueddol o wallau (NHEJ)(Jackson a Bartek, 2009) ac ailgyfuno homologaidd atal gwall (HR)(Beucher et al., 2009). ; Blackford a Jackson, 2017; Chapman et al., 2012). Fe wnaethom niwcleofeiddio NCC gan fynegi'n sefydlog gasetiau gohebydd NHEJ ac AD gyda pcDNA3.1-plasmidau GH1 dynol (hGH1), ysgogwyd DSBs trwy gyd-drawsnewid ag endonuclease amgodio plasmid I-Excel, a mesurodd ailymuno gohebwyr atgyweirio DSB. Rheolwyd effeithlonrwydd trawsnewid trwy gyd-drawsnewid ag amgodio plasmid DsRed (Seluanov et al, 2010). Effeithlonrwydd NHEJ ar ôl pcDNA3.1-niwcleariad hGH1 oedd 0.77-0.83a gostwng ar 48h(p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">
Autocrine/paracrine GH yn cynyddu difrod DNA heb ei atgyweirio
Wrth archwilio a yw npGH yn cynyddu difrod DNA, gwelsom fod NCC ac organoidau a drawsnewidiwyd yn sefydlog â lenti-GH yn dangos mwy o ddifrod DNA mewndarddol heb ei atgyweirio fel y'i mesurwyd gan Comet assay (t.< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">
Mae GH yn cael ei ysgogi mewn organoidau berfeddol dynol 3D oed ac yn gwanhau DDR
Yn dilyn y mynegiant GH cynyddol a arsylwyd a difrod DNA mewn sbesimenau colon dynol oedrannus, fe wnaethom "heneiddio" organo-ids a gynhyrchwyd o dair llinell iPSC annibynnol i ailadrodd model o feinwe dynol sy'n heneiddio. Mae'r organoidau hyn yn cynnwys enterocytes, celloedd goblet, celloedd Paneth, a chelloedd enteroendocrine a homeobox math caudal 2 (CDX2)(Barrett et al..2014; Gao et al., 2009; Workman et al., 2017). Cafwyd dwy o dair llinell iPSC (llinellau 1 a 3) gan unigolion hŷn na 60 oed, ac roedd y drydedd llinell iPSC (llinell 2) yn deillio o ffibroblastau unigolyn 30-mlwydd-oed. Cafodd organoidau a gynhyrchwyd o linellau 1 a 3 eu meithrin am hyd at 2 fis, ac ar yr adeg honno arafodd ymlediad celloedd yn sylweddol. Mewn cyferbyniad, mae organoidau a gynhyrchwyd o linell 2 wedi cynyddu'n gadarn mewn diwylliant am hyd at 4 mis. Cadarnhawyd heneiddio cellog ym mhob un o'r 3 llinell gan gynnydd t16, yn ogystal â gostyngiad hyd telomere (t<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">
Gan ei bod yn ymddangos bod y nodweddion organoid in vitro hyn yn ailadrodd yn ffyddlon newidiadau cellog sy'n gyson â meinwe dynol sy'n heneiddio (Baker et al., 20 11; Lieut al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013), fe wnaethom ddefnyddio hyn model i astudio ymhellach fecanweithiau signalau sy'n sail i heneiddio epithelial y colon dynol. Yn llinell 1, ysgogwyd lefelau mRNA GH ar ôl 1 mis mewn diwylliant a chynyddodd ymhellach ar ôl 2 fis (p <0.05)(ffigur 6c),="" sy'n="" gyson="" â="" chynnydd="" sylweddol="" npgh="" a="" welwyd="" mewn="" organoidau="" oedrannus="" ar="" blot="" gorllewinol="" ac="" imiwn-histocemeg="" (ihc)="" (ffigurau="" 6d,="" 6e,="" a="" s5b).="" roedd="" yh2ax="" hefyd="" wedi'i="" ysgogi'n="" gryf="" gan="" ddiwylliant="" hirfaith,="" gan="" ddangos="" difrod="" dna="" mewndarddol="" cronedig="" gyda="" heneiddio="" in="" vitro.="" yn="" gyson="" â="" chanlyniadau="" yn="" dangos="" p53="" wedi'i="" atal="" yn="" ncc="" ac="" organoidau="" wedi'u="" trawsnewid="" â="" gh="" (ffigurau="" 4a-4c),="" gwelsom="" p53="" wedi'i="" atal="" ar="" 1="" a="" 2="" fis="" o="" ddiwylliant,="" yn="" cyd-fynd="" â="" npgh="" uwch="" (ffigurau="" 6e="" a="" s5b).="" canlyniadau="" tebyg="" (="" a="" a="" b)="" blot="" gorllewinol="" (a)="" ancc,="" hncf,="" a="" chelloedd="" hct116="" a="" (b)="" organoidau.="" cafodd="" celloedd="" eu="" trin="" â="" dosau="" penodol="" o="" etoposide="" a'u="" dadansoddi="" 24="" awr="" yn="" ddiweddarach.="" cafodd="" organoidau="" eu="" trin="" â="" 3="" um="" etoposide="">
(C) NCC nucleofected gyda GH siRNA (sIGH RNA) neu sgramblo RNA (Scr RNA) fel rheolydd ar gyfer 24 h ei drin gyda dosau a nodir o etoposide (Etop) a dadansoddi 24 h yn ddiweddarach. Dangosir meintioliad ImageJ o blotiau gorllewinol yn Ffigur S1.
（D） Delwedd gynrychioliadol o NCC wedi'i drin ag etoposide 20 μM am 24 h. GH, coch; yH2AX, gwyrdd; phalloidin, llwyd; DAPI, glas. Mae cnewyllyn gwyrdd llachar yn dynodi apoptosis. Bar graddfa, 20 um. Rheoli, celloedd heb eu trin.
(E) Blot gorllewinol GH yng nghyfrwng diwylliant ANCC ac organoidau wedi'u trin ag etoposide 20 neu 5 uM, yn y drefn honno. Casglwyd y cyfrwng o wres 8 a 24 h ac o organoidau ar 4-48 h ar ôl y driniaeth. Defnyddiwyd Ponceau fel rheolydd llwytho. Dangosir blotiau cynrychioliadol o 3 arbrawf annibynnol o leiaf.
a gafwyd trwy feithrin organoidau a gynhyrchwyd o linellau iPSC 2 a 3 am 4 a 2 fis, yn y drefn honno (Ffigurau S6A-S6D).
Ymhellach, roedd npGH cynyddol mewn organoidau oedrannus yn gysylltiedig â DDR gwanedig, gyda ffosfforyleiddiad wedi'i atal o ATM a DNA-PKcs a lefelau is o p53 ffosfforyleiddiad (Ffigurau 6E a S5B). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod gweithgaredd DDR wedi'i atal yn arwain at ddifrod DNA cronedig heb ei atgyweirio, fel y gwelir hefyd gan anwythiad yH2AX (Ffigurau 6E a S5B). Ar ôl 2 fis mewn diwylliant, dangosodd organoidau oedrannus sydd wedi'u heintio â GH shRNA gynnydd o p53 (Ffigurau 6F a S7A) a llai o ddifrod DNA a fesurwyd gan assay Comet (t.<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">
Mae diffyg signalau GH yn gwanhau difrod DNA colon in vivo mewn llygod sy'n heneiddio
I gadarnhau ein canlyniadau a gafwyd mewn organoidau oed, astudiwyd llygod WT a GHR-7 oed in vivo. Cynyddwyd difrod DNA y colon yn sylweddol mewn llygod WT hen (24-mis oed) yn erbyn ifanc (3-mis oed)(p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">
TRAFODAETH
Rydyn ni'n dangos yma bod npGH yn cynyddu gydag oedran ym meinwe'r colon dynol ac mewn organoidau coluddol dynol 3D. Rydym yn dangos sawl llinell o dystiolaeth sy'n awgrymu bod npGH, mewn meinwe colon dynol oedrannus, yn cael ei achosi gan ddifrod DNA, fel y gwelwyd mewn modelau dynol, gan gynnwys celloedd epithelial di-tumor, ffibroblastau colon arferol, organoidau, a meinwe canser y colon cleifion sy'n cael therapïau niweidiol DNA. ; rydym hefyd yn dangos canfyddiadau tebyg yn vivo yn y colons o lygod gyda DDR actifedig.
Gan ddefnyddio organoidau berfeddol dynol 3D, gwelsom gynnydd mewn p16, heneiddedd, a byrhau telomere, i gyd yn gyson â newidiadau cysylltiedig ag oedran mewn meinwe ddynol (Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013 ). Er gwaethaf cyfyngiadau’r model organoid, mae ein canlyniadau’n cefnogi organoidau berfeddol fel ailddangosiad dynol ffyddlon i astudio mecanweithiau signalau sy’n sail i newidiadau colon sy’n gysylltiedig ag oedran (Hu et al., 2018).
Canfuom fod npGH lleol, gan weithredu mewn modd awtocrin/paracrine, yn atal p53 ac yn cynyddu ymlediad celloedd cyfagos. Mae GH ysgogedig hefyd yn atal atgyweirio DDR a DNA, gan wella croniad difrod DNA ymhellach. Mae'r canlyniadau hefyd yn gyson â'r effeithiau a arsylwyd ar groniad difrod DNA o fewn tiwmorau pituitary dynol sy'n cuddio GH (Ben-Shlomo et al., 2020).
Mae gweithredoedd GH ym meinwe arferol y colon yn ffafrio datblygu milieu proliferative a allai fod yn sail i gyfraddau cynyddol polypau'r colon sy'n gysylltiedig ag oedran, a ddangosir gan ddifrod DNA sy'n gysylltiedig ag oedran ac ansefydlogrwydd cromosomaidd fel ysgogwyr mynychder canser y colon mewn cleifion hŷn na 50 mlynedd (Aunan et al., 2017). Mae'r difrod DNA cynyddol sy'n gysylltiedig ag oedran a ddangoswn yma hefyd yn gyson ag adroddiadau bod yH2AX yn cynyddu'n llinol gydag oedran mewn sbesimenau colon arferol (Risques et al., 2008). Mae ein huwchreoleiddiad amlwg o yH2AX mewn organoidau heneiddio yn arwydd o groniad difrod DNA, gan fod yH2AX yn nodi safleoedd difrod DNA i ddenu proteinau atgyweirio DNA (Turinetto a Giachino, 2015). Efallai bod y canlyniadau hyn yn ymddangos yn anghyson â'r ffaith bod GH a achosir mewn celloedd sy'n heneiddio yn atal ffosfforyleiddiad H2AX. Fodd bynnag, rydym yn dehongli'r arsylwadau hyn i ddangos bod GH yn lleihau gweithgaredd DDR trwy leihau ffosfforyleiddiad ATM, sydd, yn ei dro, yn lleihau (ond nid yn diddymu'n llwyr) ffosfforyleiddiad proteinau i lawr yr afon gan gynnwys H2AX. Pan nad yw DDR wedi'i actifadu'n briodol, mae atgyweiriad DNA yn cael ei newid, ond mae yH2AX yn dal i gronni gan ei fod yn nodi safleoedd difrod DNA heb eu trwsio. Felly, mae lefelau yH2AX a welwyd mewn meinwe dynol sy'n heneiddio ac organoidau yn adlewyrchu canlyniad net gweithgaredd DDR a faint o DNA heb ei atgyweirio.
Gall difrod DNA gronni mewn meinwe sy'n heneiddio oherwydd colli atgyweirio toriad gwaelod, yn debygol o golli ymateb t53 i ddifrod DNA (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). Yn ein harbrofion, gostyngodd t53 mewn celloedd colon ac organoidau a oedd yn cyn-wasgu npGH, yn gyson â chanfyddiadau cynharach bod GH yn atal p53 (Chesnokova et al., 2016). Mewn cyferbyniad, mae llygod GHR-/- oed, sy'n gallu gwrthsefyll canser ac sydd â hyd oes hirach (Basu et al., 2018), yn ogystal â llygod GHRcolKO sy'n benodol i'r colon yn arddangos mynegiant cynyddol o colon p53, gan wella atgyweirio DNA yn ôl pob tebyg. Wrth i GH atal p53 (Chesnokova et al., 2013), gall sefydlu npGH arwain at newidiadau yn y micro-amgylchedd lleol sy'n gyson â gostyngiad p53 sy'n gysylltiedig ag oedran (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). Mae hyrwyddwr GH yn cynnwys safle rhwymo p53 (Chesnokova et al., 2013), ac mae p53 a achosir gan ddifrod DNA yn actifadu mynegiant GH (Chesnokova et al. 2013,2019a). Felly, mae ein canlyniadau'n dangos bod croniad difrod DNA mewn organoidau oedrannus yn achosi npGH, sydd, yn ei dro, yn rheoleiddio p53 i lawr.
Yn bwysig, gan fod npGH yn cael ei gyfrinachu'n lleol o gelloedd sydd wedi'u difrodi gan DNA, gallai gweithred paracrine ar gyfer GH secretu ar gelloedd cyfagos fod yn weithredol. Wrth gyd-ddiwyllio hNCF sy'n mynegi GH gyda'r Colon Intestine-Chip, gwelsom fwy o ddifrod DNA ac amlhau a p53/p21 wedi'i is-reoleiddio mewn celloedd epithelial wedi'u mewnblannu â sglodion sy'n agored i effeithiau paracrinaidd sy'n deillio o ffibroblast. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod heneiddio anysgogedig lleol mewn meinwe dynol yn newid y micro-amgylchedd meinwe trwy atal proteinau atal tiwmor a gwella lledaeniad epithelial a difrod DNA.
Mae'r canlyniadau'n gyson ag arsylwadau bod triniaeth GH alldarddol yn cynyddu gallu lluosogi, ffurfio cytref, a metastasis mewn llygod KO DJ-1 (Chien et al., 2016), a chyda thystiolaeth bod anwythiad GH mewn celloedd tiwmor dynol yn gysylltiedig â dilyniant sawl math o ganser (Perry et al., 2017); mae'r rhain yn cymharu â'n canlyniadau yn dangos llai o ffurfiannau cytrefi a maint cytrefi llai gydag ataliad GH.
Mae llwybrau atgyweirio difrod DNA yn amddiffyn rhag ansefydlogrwydd cromosomaidd sy'n gyrru trawsnewid cellog (Negrini et al. 2010). Er enghraifft, mae Tip60 yn actifadu ATM (Jackson a Bartek, 2009), ac ATM, rheolydd canolog DDR, yn ffosfforyleiddio ac yn sefydlogi p53. Mae celloedd sy'n heneiddio yn dangos llai o ataliad ATM a p53, yn ogystal â dadreoleiddio atgyweirio DNA gyda difrod DNA heb ei atgyweirio dilynol (Lan et al., 2019). Felly, mewn celloedd colon, mae difrod DNA yn cronni gydag oedran (Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008), yn rhannol o leiaf oherwydd bod effeithlonrwydd DDR yn dirywio (Jackson a Bartek, 2009), ac wedi atal t53 yn priodolwyd ymateb i y-arbelydru mewn llygod sy'n heneiddio i ddirywiad cysylltiedig ag oedran mewn p53-sefydlu ATM(Feng et al,2007). Yn ein harbrofion, ni chafodd ei achosi mewn ymateb i ddifrod DNA hefyd atal Tip60, a arweiniodd yn ôl pob tebyg i lai o atgyweirio DNA fel y dangosir gan ATM gwanedig a ffosfforyleiddiad p53, yn y drefn honno. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall gorfynegiant npGH lleol gyfrannu at DDR wedi'i ddadreoleiddio sy'n gysylltiedig ag oedran ac atgyweirio DNA. Mewn organoidau oedrannus, roedd ymsefydlu GH yn gwanhau DDR, tra bod ataliad GH yn actifadu DDR, fel y dangosir gan ostyngiad mewn difrod DNA. Ategir y canlyniadau hyn gan ein harsylwadau cynharach bod blocio signalau GH yn ANCC wedi arwain at lai o ddifrod i DNA (Chesnokova et al., 2019a). Ymhellach, rydym yn dangos nad yw difrod DNA y colon yn cronni mewn llygod GHRcolKO a dargedwyd gan y colon gyda GHR ecseis, ond fe gronnodd yn y coluddyn bach, lle'r oedd GHR yn gyfan. Mae'r canlyniadau hyn, ynghyd â'n harddangosiad nad yw llygod oed GHR-7-yn cronni difrod DNA y colon, yn darparu cefnogaeth in vivo i'r ddamcaniaeth bod anwythiad npGH lleol gyda chelloedd agemayrender sy'n agored i drawsnewid ac efallai hefyd yn cyfrannu at ymwrthedd therapi canser, fel wedi'i awgrymu (Basu a Kopchick, 2019).
Mae'r canlyniadau a ddangosir yma hefyd yn codi'r posibilrwydd y gall effeithiau GH gael eu cyfryngu gan ffactor twf tebyg i inswlin 1 (IGF1). Yn wahanol i GH, mae signalau IGF1 yn actifadu atgyweirio DNA mewn celloedd di-diwmor a thiwmoraidd (Chesnokova a Melmed, 2020; Chitnis et al., 2014; Turney et al., 2012), ac rydym wedi dangos bod ataliad GH o p53 ac ymsefydlu DNA mae oedran argae yn digwydd yn annibynnol ar IGF1 mewn meinwe colon arferol (Ches-nokova et al., 2019a, 2019b). Fodd bynnag, mewn celloedd a meinweoedd lle mae GH yn actifadu IGF1, gall y ffactor twf olaf hefyd nodi mewn modd cell-benodol i wrthweithio gweithredu GH ar sefydlogrwydd genom.
Mae'r canfyddiadau'n awgrymu bod npGH a achosir gan feinwe'r colon sy'n heneiddio mewn ymateb i ddifrod DNA cronedig yn hwyluso difrod DNA pellach ac mae'n ymddangos ei fod yn benderfynydd anffafriol o atgyweirio difrod DNA. Mae allosod y canfyddiadau hyn yn darparu llwyfan ar gyfer nifer o gymwysiadau clinigol posibl. Gan fod croniad difrod DNA yn nodwedd nodweddiadol o glefydau sy'n gysylltiedig ag oedran, ni all targedu signalau GH i rwystro awtocrin / paracrine fod yn ddefnyddiol ar gyfer rhwystro difrod DNA epithelial sy'n gysylltiedig ag oedran ac yn y pen draw yn gwella dilyniant patholegau epithelial sy'n gysylltiedig ag oedran (Miman et al. ,2016) Gallai dull o’r fath fod o fudd hefyd i gleifion canser sy’n cael therapïau sy’n niweidio DNA, lle na all newidiadau maes epithelial a achosir gan awtocrin/paracrine niweidio meinwe arferol cyfagos. Yn hyn o beth, gallai amharu ar signalau GH gydag antagonist GHR cymeradwy (List et al., 2011; Trainer et al, 2000) arwain at fanteision clinigol. Yn bwysig, mae GH dynol wedi’i hyrwyddo’n amhriodol fel therapi gwrth-heneiddio a gwella cryfder anghymeradwy (Giordano et al., 2008; Holt a Ho, 2019; Medeiros a Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). O ystyried effeithiau paracrine niweidiol npGH yr ydym yn adrodd amdanynt yma, gall gweinyddu GH amhriodol yn y tymor hir fel elixir gwrth-heneiddio arwain at signalau GHR a pheryglu datblygiad difrod DNA celloedd epithelial, yn ogystal â'r posibilrwydd o actifadu briwiau amlhau'r ocwlt.
Daw'r erthygl hon o Cell Reports 37, 110068, Rhagfyr 14, 2021, ª 2021 Yr Awdur(on). 1 Erthygl mynediad agored yw hon o dan drwydded CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
