Atalydd ASK1 NQDI-1 Yn Lleihau Straen Ocsidiol A Niwroapoptosis Trwy'r Llwybr Signalau ASK1/p38 A JNK mewn Anafiadau Cynnar i'r Ymennydd Ar ôl Hemorrhage Subarachnoid mewn Llygod Mawr Rhan 1

Haniaethol. Mae straen ocsideiddiol a niwroapoptosis yn brosesau patholegol allweddol ar ôl hemorrhage subarachnoid (SAH). Gwerthusodd yr astudiaeth bresennol effeithiau niwro-amddiffynnol gwrth-ocsidiad a gwrth-apoptotig y signal apoptosis sy'n rheoleiddio kinase 1 (ASK1) atalydd ethyl-2,7-dioxo-2,7-dihydro-3H-naphtho(1,2, 3-de) quinoline1-carboxylate (NQDI-1) mewn anaf cynnar i'r ymennydd (EBI) yn dilyn SAH mewn model llygod mawr. Defnyddiwyd cyfanswm o 191 o lygod mawr a chymhellwyd y model SAH gan ddefnyddio trydylliad monofilament. Defnyddiwyd blotio gorllewinol wedyn i ganfod lefelau mynegiant mewndarddol proteinau. Yna defnyddiwyd imiwnofflworoleuedd i gadarnhau lleoliad cellog nerfol ASK1. Aseswyd swyddogaeth niwrolegol tymor byr gan ddefnyddio'r sgoriau Garcia wedi'u haddasu a'r prawf cydbwysedd trawst 24 awr ar ôl SAH, tra aseswyd swyddogaeth niwrolegol hirdymor gan ddefnyddio'r prawf rotarod a phrawf drysfa ddŵr Morris. Aseswyd apoptosis o niwronau gan staenio TUNEL ac aseswyd straen ocsideiddiol trwy staenio dihydroethidium 24 h ar ôl SAH. Cododd lefelau mynegiant protein ffosfforyleiddiad (p-)ASK1 ac ASK1 yn dilyn SAH. Chwistrellwyd NQDI-1 yn intracerebroventricular 1h ar ôl SAH a dangosodd welliannau sylweddol mewn swyddogaeth niwrolegol tymor byr a hirdymor a llai o straen ocsideiddiol ac apoptosis niwronaidd yn sylweddol. Achosodd chwistrellu NQDI-1 ostyngiad sylweddol mewn lefelau mynegiant protein o p-ASK1, p-p38, p-JNK, 4 hydroxynononenal, a Bax a chynyddodd lefelau mynegiant protein heme oxygenase 1 a Bcl-2 yn sylweddol. Arweiniodd y defnydd o'r atalydd p38 BMS-582949 neu'r atalydd JNK SP600125 at ostyngiadau sylweddol yn lefelau mynegiant protein p-p38 neu p-JNK, yn y drefn honno, a gostyngiad sylweddol mewn straen ocsideiddiol ac apoptosis niwronaidd; fodd bynnag, ni ddangosodd yr atalyddion hyn effaith ar lefelau mynegiant protein p-ASK1 neu ASK1. I gloi, fe wnaeth triniaeth gyda NQDI-1 wella swyddogaeth niwrolegol a lleihau straen ocsideiddiol ac apoptosis niwronaidd yn EBI yn dilyn SAH mewn llygod mawr, o bosibl trwy atal ffosfforyleiddiad ASK1 a llwybr signalau ASK1 / p38 a JNK. Gellir ystyried NQDI-1 yn asiant posibl ar gyfer trin cleifion â SAH.

Gall glycoside cistanche hefyd gynyddu gweithgaredd SOD ym meinweoedd y galon a'r afu, a lleihau'n sylweddol y cynnwys lipofuscin a MDA ym mhob meinwe, gan ysbeilio radicalau ocsigen adweithiol amrywiol (OH-, H₂O₂, ac ati) yn effeithiol a diogelu rhag difrod DNA a achosir. gan OH-radicaliaid. Mae gan glycosidau ffenylethanoid Cistanche allu chwilota cryf o radicalau rhydd, gallu lleihau uwch na fitamin C, gwella gweithgaredd SOD mewn ataliad sberm, lleihau cynnwys MDA, a chael effaith amddiffynnol benodol ar swyddogaeth pilen sberm. Gall polysacaridau cistanche wella gweithgaredd SOD a GSH-Px mewn erythrocytes a meinweoedd yr ysgyfaint llygod senescent arbrofol a achosir gan D-galactos, yn ogystal â lleihau cynnwys MDA a cholagen yn yr ysgyfaint a phlasma, a chynyddu cynnwys elastin, wedi effaith sborion dda ar DPPH, ymestyn amser hypocsia mewn llygod senescent, gwella gweithgaredd SOD mewn serwm, ac oedi dirywiad ffisiolegol yr ysgyfaint mewn llygod senescent arbrofol Gyda dirywiad morffolegol cellog, mae arbrofion wedi dangos bod gan Cistanche y gallu gwrthocsidiol da ac mae ganddo'r potensial i fod yn gyffur i atal a thrin clefydau heneiddio'r croen. Ar yr un pryd, mae gan echinacoside yn Cistanche allu sylweddol i ysbeilio radicalau rhydd DPPH a gallant ysbeilio rhywogaethau ocsigen adweithiol, atal diraddio colagen a achosir gan radical rhad ac am ddim, ac mae hefyd yn cael effaith atgyweirio da ar ddifrod anion radical rhydd thymin.

Cliciwch ar Gwrth-heneiddio Cistanche Para Que Serve

【Am ragor o wybodaeth: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Geiriau allweddol: hemorrhage subarachnoid, NQDI-1, apoptosis signal rheoleiddio kinase 1, straen ocsideiddiol, apoptosis, anaf cynnar i'r ymennydd

Rhagymadrodd

Mae hemorrhage subarachnoid (SAH) yn glefyd serebro-fasgwlaidd acíwt difrifol a achosir gan lif y gwaed i ofod isaracnoid yr ymennydd (1). Fodd bynnag, ar hyn o bryd, nid oes unrhyw gyffuriau effeithiol ar gael ar gyfer gwella niwed i feinwe'r ymennydd ar ôl SAH yn dilyn atal ail-wallt (2). Felly, mae angen astudiaethau pellach ar frys i fecanweithiau anaf i’r ymennydd yn dilyn SAH ac archwilio opsiynau triniaeth priodol ar gyfer gwella prognosis SAH.

Mae anaf cynnar i'r ymennydd (EBI) yn cyfeirio at niwed eilaidd i feinwe'r ymennydd a achosir gan aflonyddwch ffisiolegol lluosog ac ystod o newidiadau patholegol sy'n digwydd o fewn 72 h i ddechrau SAH (3). Yn y cyfnod ymateb acíwt yn dilyn SAH, mae'r anaf yn dechrau gyda mynediad llawer iawn o waed i'r gofod subarachnoid a dilynir hyn gan gyfres o anafiadau patholegol (4). Gan fod mitocondria yn arbennig o agored i hypocsia ac anaf isgemig, mae camweithrediad mitocondriaidd yn un o'r anafiadau patholegol sylfaenol a ddioddefir ar ôl SAH (5). Mae niferoedd mawr o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn cael eu rhyddhau, sy'n arwain at wella straen ocsideiddiol ac actifadu'r llwybr apoptotig mitocondriaidd, gan achosi anaf a chamweithrediad mitocondriaidd (6). Felly, mae dulliau therapiwtig sy'n lleihau straen ocsideiddiol ac apoptosis yn allweddol ar gyfer gwella prognosis SAH.

Mae apoptosis sy'n rheoleiddio signal kinase 1 (ASK1), aelod o'r teulu protein 3 kinase mitogen-activated (MAP3K), yn cael ei actifadu gan nifer o wahanol fathau o straen cellog ac mae ganddo rôl bwysig mewn straen ocsideiddiol ac apoptosis (7). Mewn diwylliannau sylfaenol niwronau hippocampal llygoden, mae'r atalydd Rho kinase fasudil yn gwrthdroi drychiad a achosir gan amyloid o ffosfforyleiddiad (p-)ASK1, sy'n lleihau apoptosis niwronaidd mewn clefyd Alzheimer (8). Hyd eithaf ein gwybodaeth, fodd bynnag, nid yw opsiynau therapiwtig sy'n targedu ASK1 yn dilyn SAH wedi'u gwerthuso.

Adroddwyd bod ethyl-2,7-dioxo-2,7-dihydro-3H-naphtho(1,2,3-de)quinoline1-carboxylate (NQDI-1) yn atalydd penodol o ASK1 ac mae wedi'i ddilysu gan ddefnyddio profion in vitro kinase (9,10). Mae astudiaethau blaenorol wedi nodi y gallai NQDI-1 fod yn effeithiol wrth drin clefydau niferus trwy atal gweithgaredd ASK1 (11,12). Mae NQDI-1 yn lleddfu difrod mitocondriaidd a achosir gan microcystin-LR ac apoptosis mewn celloedd granulosa ofarïaidd trwy atal actifadu ASK1 (13). Ar ben hynny, gall indomethacin gymell ymatebion rhaeadru apoptotig mewn celloedd glial trwy actifadu ASK1 o straen reticwlwm endoplasmig (14). Felly, gall yr atalydd ASK1-benodol NQDI-1 gael effeithiau niwro-amddiffynnol yn dilyn SAH trwy atal gweithgaredd ASK1. ystyrir bod t38 a JNK yn ffurfio llwybrau signalau i lawr yr afon yn ASK1; gall p38 wedi'i actifadu a JNK actifadu amrywiaeth o swbstradau ymhellach, gan gynnwys ffactorau trawsgrifio niwclear yn ogystal â kinases protein a phroteinau swyddogaethol eraill, sy'n arwain at ddechrau straen ocsideiddiol ac apoptosis (15).

Tybiwyd bod atalydd ASK1 NQDI-1 yn cael effeithiau niwro-amddiffynnol ac yn lleihau straen ocsideiddiol a niwroapoptosis trwy'r llwybr signalau ASK1 / p38 a JNK yn EBI yn dilyn SAH mewn llygod mawr.

Defnyddiau a dulliau

Anifeiliaid arbrofol.Cymeradwywyd yr arbrofion anifeiliaid gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Arbrofol Prifysgol Canolbarth y De (cymeradwyaeth rhif 2019sydw0104). Cafodd cyfanswm o 191 o lygod mawr Sprague-Dawley (SD) gwrywaidd yn pwyso 280-320 g eu cartrefu mewn amgylchedd tymheredd cyson (21-23˚C) a lleithder (45-50 y cant) gyda chylch golau / tywyll 12/12-h. ac roedd ganddo fynediad am ddim i ddŵr a bwyd. Perfformiwyd yr holl arbrofion anifeiliaid yn unol â chanllawiau Ymchwil Anifeiliaid: Adrodd Mewn Arbrofion Vivo (16) ac fe'u perfformiwyd gan Ganllawiau'r Sefydliad Cenedlaethol dros Iechyd (NIH) ar gyfer Gofal a Defnydd Anifeiliaid (17). Pan gyrhaeddodd llygod mawr y pwynt amser rhagosodedig ar gyfer yr arbrawf neu wedi bodloni meini prawf penodol ar gyfer ewthanasia [colli archwaeth llwyr am 24 awr neu archwaeth gwael (50 y cant yn is na'r arfer) am 3 diwrnod, anallu i fwyta neu yfed, neu aseswyd eu bod yn berthnasol. yn agos at farwolaeth (ymddygiad hunan-niweidiol, osgo annormal, trallod anadlol, ac ati)], gosodwyd y llygod mawr mewn dyfais ewthanasia carbon deuocsid gyda chyfradd dadleoli cyfaint CO2 wedi'i gosod ar 30 y cant / mun (18). Cadarnhawyd marwolaeth trwy roi'r gorau i anadlu a churiad y galon ac ymledu disgyblion. Cafodd carcasau'r holl lygod mawr eu rhoi mewn bagiau a'u rhewi i'w gwaredu'n amgylcheddol gadarn.

Model SAH. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >Ystyriwyd bod 8 asesiad o'r sgôr graddio SAH yn bodloni'r gofynion arbrofol ac yn fodel llwyddiannus. Roedd y weithdrefn ar gyfer y grŵp ffug yn debyg i weithdrefn y grŵp SAH, ac eithrio'r ffaith nad oedd y wifren proline 4-0 yn tyllu'r wal rhydwelïol. Cafodd yr anadliad, cyfradd curiad y galon, lliw'r croen, ac atgyrch pedal eu monitro bob 5 munud trwy gydol y camau adfer llawfeddygol ac anesthetig. O'r rhain, bu farw 23 o lygod mawr a chafodd 8 o lygod mawr eu heithrio, ac ategwyd y marwolaethau a'r gwaharddiadau hyn gan lygod mawr newydd wedi'u modelu gan SAH.

Difrifoldeb SAH.Aseswyd difrifoldeb SAH gan ddefnyddio sgôr graddio SAH 24 h ar ôl SAH (20). Rhannwyd ochr fentrol meinwe'r ymennydd yn 6 rhanbarth, pob un â sgôr o 0-3 yn dibynnu ar faint o glot gwaed a pha mor dda y cafodd y pibellau gwaed eu cuddio: Mae sgôr o 0 yn nodi dim clot, Mae 1 yn dynodi swm bach o glot, mae 2 yn dynodi swm cymedrol o glot ond mae cychod mawr ar waelod y benglog yn dal i fod yn adnabyddadwy, ac mae 3 yn nodi llawer iawn o geuladau a llestri anadnabyddadwy ar waelod y benglog. Crynhowyd y chwe sgôr rhanbarthol i gyfrifo cyfanswm sgôr (0-18), lle'r oedd sgorau uwch yn nodi gwaedlif mwy difrifol. Ystyriwyd bod gan lygod mawr â sgôr gradd SAH o Llai na neu'n hafal i 8 SAH ysgafn, wedi'u heithrio o arbrofion dilynol, a'u disodli â llygod mawr newydd eu modelu.

Gweinyddu cyffuriau.Er mwyn galluogi'r crynodiadau cyffuriau ym meinwe'r ymennydd i gael eu rheoleiddio'n fwy manwl gywir yn annibynnol ar yr afu a ffactorau eraill, gweinyddwyd y siRNAs a NQDI-1 gan chwistrelliad intracerebroventricularly (21). Yn dilyn anesthetization (anesthetization, isoflurane 3 y cant; cynnal a chadw, isoflurane 2 y cant), y llygod mawr yn sefydlog ar ddyfais stereotacsig ymennydd. Gosodwyd y micro-chwistrellydd i'r bregma ar 1.0 yn ddiweddarach, 1.5 i'r dde, a 3.3 mm o ddyfnder. Diddymwyd y siRNA ASK1 (cath. rhif. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) neu reolaeth Scr siRNA (cat. rhif 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) mewn dŵr di-ïoneiddiedig di-niwclease 5 µl mewn crynodiad o 500 pmol a gweinyddwyd 48 h cyn SAH. Roedd dilyniannau siRNA ASK1 fel a ganlyn: Sense 5'‑CGG CAGACAUUGUAUCAAtt‑3' ac antisense 5'‑UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc‑3'. Defnyddiwyd crynodiadau a dosau cyffuriau a adroddwyd mewn astudiaeth debyg (22) a hydoddedd NQDI-1 i bennu'r crynodiadau a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth bresennol. Chwistrellwyd tri dos o NQDI-1 (1, 3, a 10 µg/kg; Selleck Chemicals) neu hydoddiant cerbyd mewn cyfanswm cyfaint o 5 µl/llygoden fawr 1 h ar ôl SAH. Gallai'r BMS-582949 (100 mg / kg; Selleck Chemicals), SP600125 (30 mg / kg; Selleck Chemicals), a thoddiannau cerbyd groesi'r rhwystr gwaed-ymennydd a chawsant eu rhoi yn fewnperitoneol 1 h ar ôl SAH (23,24).

Swyddogaeth niwrolegol tymor byr.Defnyddiwyd sgôr Garcia wedi'i addasu a'r sgôr cydbwysedd trawst i asesu'r swyddogaeth niwrolegol tymor byr 24 h ar ôl SAH. Rhannwyd sgôr Garcia wedi'i addasu yn chwe chategori fel a ganlyn: Symudiad gwirfoddol, symudiad aelodau gwirfoddol, estyniad blaen epaw, gallu dringo, ymatebion somatosensory, ac ymateb tentacl, pob un wedi'i sgorio'n unigol a'i grynhoi i roi cyfanswm sgôr yn amrywio o 3-18 (25). Ystyriwyd bod sgorau uwch yn dangos gwell gweithrediad niwrolegol. Ar gyfer sgôr cydbwysedd y trawst, rhoddwyd llygod mawr ar drawst am 1 munud ac aseswyd sgôr yn amrywio o 0-4 ar sail y pellter a gerddwyd (26). Ystyriwyd bod sgorau uwch yn dangos gwell gweithrediad niwrolegol.

Swyddogaeth niwrolegol hirdymor.Perfformiwyd arbrofion cyn-addasu Rotarod ar lygod mawr gan ddefnyddio'r un cyflymder cychwynnol a chyflymiad cyn modelu SAH. Rhoddwyd y llygod mawr ar brofwr bar cylchdroi Rotamex (Columbus Instruments) ar gyfer y prawf Rotarod ar ddiwrnodau 7, 14, a 21 ar ôl SAH (27). Yn gyntaf, gosodwyd y cyflymder Rotarod cychwynnol i 5 chwyldro y funud a'r cyflymiad i 2 chwyldro fesul 5 eiliad. Ar ôl gwisgo'r llygod mawr, cofnodwyd hwyrni cwymp y llygod mawr. Yna caniatawyd i'r llygod mawr orffwys am 1 awr. Yn olaf, profwyd hwyrni cwymp y llygod mawr eto ar gyflymder cychwynnol o 5 chwyldro y munud a chyflymiad o 2 chwyldro fesul 5 eiliad. Ystyriwyd bod hwyrni cwympo hirach yn arwydd o gydlyniad modur gwell yn y llygoden fawr. Yn wythnos 4 ar ôl modelu SAH, defnyddiwyd prawf drysfa ddŵr Morris i asesu cof dysgu a chyfeiriadedd gofodol y llygod mawr (27). Perfformiwyd yr ymarfer dysgu nofio a dod o hyd i blatfform o dan wyneb y dŵr o ddiwrnod 1 i ddiwrnod 5 ar wythnos 4 (dyddiau 28-33 ar ôl SAH) a chofnodwyd y llwybr nofio, hwyrni dianc, a phellter nofio. Ar y diwrnod olaf, tynnwyd y platfform i'w brofi, a chofnodwyd taflwybr nofio, pellter nofio, a hyd cwadrant archwilio am 60 eiliad.

OS staenio.Ar ôl darlifiad dilyniannol o 4˚C saline a 4˚C, paraformaldehyd 4 y cant o'r galon i dynnu gwaed o feinwe'r ymennydd, cafwyd meinwe ymennydd cyfan. Ar ôl dadhydradu graddiant swcros, torrwyd meinwe'r ymennydd wedyn yn adrannau 10-µm mewn safle coronaidd a'i storio ar -20˚C. Defnyddiwyd staenio IF i asesu cydleoli ASK1 â chelloedd nerfol. Cafodd adrannau meinwe wedi'u rhewi eu rhwystro gan ddefnyddio serwm asyn 5 y cant (cat. rhif. G1217-5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) am 2 awr ar dymheredd ystafell a'u deor dros nos ar 4˚C gyda gwrthgyrff sylfaenol fel a ganlyn: Gwrth-ASK1 (llygoden; 1:200; cath. rhif. 67072-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.), gwrth-NeuN (cwningen; 1:200; cath. rhif. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) , moleciwl addasydd calsiwm-rhwymo gwrth-ionized-1 (Iba-1; cwningen; 1:200; cath. rhif 10904-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), a phrotein asidaidd ffibrilaidd gwrth-glial (GFAP; cyw iâr ; 1:200; cath. rhif. ab4674; Abcam). Yna cafodd y darnau meinwe eu deor am 2 h ar dymheredd ystafell gyda'r gwrthgyrff eilaidd fflwroleuol cyfatebol fel a ganlyn: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H plws L) (cat. rhif. 715-585-150; 1:500 ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plws L) (cat. rhif. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), a Alexa Fluor 488 IgY Gwrth-Chicken Asyn AffiniPure (IgG) (H ynghyd â L) (cath. rhif 703-545-155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Yn dilyn hynny, cawsant eu staenio ar gyfer cnewyllyn celloedd gan ddefnyddio 2 µg/ml DAPI (cat. rhif. G1012-100ML; Wuhan Service Technology Co, Ltd.) am 10 munud ar dymheredd ystafell. Aseswyd yr adrannau gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd Olympus BX53 (Olympus Corporation) a chafodd delweddau eu dal.

Dihydroethidium (DHE) staenio.Perfformiwyd staenio DHE i asesu straen ocsideiddiol yr ymennydd (28). Cafodd adrannau rhew o feinwe'r ymennydd eu deor gyda 2 µmol/l DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ar 37˚C am 30 munud yn y tywyllwch. Ar ôl staenio ar gyfer cnewyllyn celloedd gan ddefnyddio 2 µg/ml DAPI am 10 munud ar dymheredd ystafell, aseswyd yr adrannau gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd Olympus BX53. Dewiswyd cyfanswm o chwe adran o bob meinwe ymennydd ar hap a dewiswyd chwe ardal ym mhob adran ar hap ar gyfer delweddu. Cafodd nifer y celloedd DHE-positif ei gyfrif gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ 1.4 (Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol) a chafodd y cymedr ei gyfrifo a'i gymryd fel y canrannau terfynol ar gyfer pob adran o feinwe'r ymennydd.

staenio TUNEL.Defnyddiwyd staenio TUNEL i werthuso canran y niwronau apoptotig (29). Cafodd adrannau meinwe wedi'u rhewi eu rhwystro gan ddefnyddio serwm asyn 5 y cant am 2 h ar dymheredd yr ystafell a'u deor dros nos ar 4˚C gyda gwrthgyrff cynradd gwrth-NeuN (cwningen; 1:200; cath. rhif 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc. .). Yna cafodd yr adrannau meinwe eu deor gyda'r gwrthgorff eilaidd fflwroleuol Alexa Fluor 488 AffiniPure Asyn Gwrth-Cwningen IgG (H plws L) (cat. rhif. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) am 2 awr ar dymheredd ystafell. Perfformiwyd staenio TUNEL gan ddefnyddio pecyn Assay Apoptosis TUNEL One Step (cat. rhif C1090; Sefydliad Biotechnoleg Beyotime) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Yn olaf, cafodd yr adrannau meinwe eu staenio ar gyfer cnewyllyn celloedd gan ddefnyddio 2 µg/ml DAPI am 10 munud ar dymheredd ystafell. Perfformiwyd dewis hap o leoliadau cyfrif TUNEL a chyfrifo niwronau TUNEL-positif ar gyfer pob adran gan ddefnyddio'r dull a grybwyllwyd uchod ar gyfer cyfrif DHE.

Blotio gorllewinol (WB).Defnyddiwyd WB i fesur lefelau mynegiant protein yn rhannol. Ar ôl darlifiad o halwynog 4˚C o'r galon i dynnu gwaed o feinwe'r ymennydd, cafwyd meinwe ymennydd cyflawn. Mae astudiaethau blaenorol wedi nodi bod y model SAH, a achosir trwy dyllu endofasgwlaidd ar yr ochr chwith, yn arwain at rywfaint o ogwydd tuag at ddigwyddiadau gwaedu a gall fod yn gymharol ddifrifol o ran niwed i feinwe ymennydd ochr chwith (30). Felly, defnyddiwyd meinwe'r ymennydd ochr chwith i asesu'r difrod patholegol yn dilyn modelu SAH. Echdynnwyd proteinau meinwe ymennydd gan ddefnyddio datrysiad lysis RIPA (cat. rhif. P0013B; Sefydliad Biotechnoleg Beyotime) yn ôl protocol y gwneuthurwr. Pennwyd crynodiad protein y samplau gan yr assay BCA (cat. rhif. P0012; Sefydliad Biotechnoleg Beyotime) ac fe'i haddaswyd wedyn i 5 µg/µl trwy ychwanegu symiau gwahanol o ddŵr distyll dwbl. Ychwanegwyd y 5 µl o samplau protein 5 µg/µl at bob lôn a gwahanwyd y samplau protein hyn ar geliau 10 y cant gan electrofforesis SDS-PAGE a'u trosglwyddo i bilenni PVDF. Cafodd y pilenni eu rhwystro am 2 h ar dymheredd ystafell gan ddefnyddio 5 y cant o laeth powdr di-fraster (cat. rhif. P0216-300g; Beyotime Institute of Biotechnology). Deorwyd y pilenni dros nos ar 4˚C gyda gwrthgyrff cynradd fel a ganlyn: Anti-p-ASK1 (Ser-83; 1:1,000; cath. rhif MA5-28020; Thermo Fisher Scientific, Inc. .), gwrth-ASK1 (1:1,000; cath. rhif. 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), gwrth-p‑p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1) ,000; cath. rhif 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), gwrth-p38 MAPK (1:1,000; cath. rhif. 8690; Technoleg Signalau Cell, Inc.), kinase protein gwrth-ffosffo-straen-acti- vated/Jun-amino-terminal kinase (phospho-SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,000; cath. rhif 9255; Signaling Cell Technology, Inc.), gwrth-SAPK/JNK (JNK; 1:1,000; cath. rhif 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), gwrth-4 hydroxynononenal (4-HNE; 1:1 ,000; cath. rhif ab46545; Abcam), oxygenase gwrth-heme 1 (HO-1; 1:1,000; cath. rhif 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), gwrth-Bcl‑2 (1:1,000; cath. rhif 26593-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), gwrth-Bax (1,1000; cath. rhif. 60267-1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.) a gwrth- -actin (1:2,000; cath. no. 4970; Technoleg Signalau Cell, Inc.). Dilynwyd hyn gan ddeor gyda'r gwrthgyrff eilaidd cyfuniad perocsidas marchruddygl priodol am 2 awr ar dymheredd ystafell: Gwrth-lygoden gafr IgG-HRP (cat. rhif. sc‑2005; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology , Inc.) neu gafr gwrth-cwningen IgG-HRP (cat. rhif. sc‑2004; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), a delweddwyd y bandiau penodol gan ddefnyddio pecyn ECL (cat. rhif. P0018AS; Sefydliad Biotechnoleg Beyotime) a delweddwyd gan ddefnyddio system UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH). Perfformiwyd dadansoddiad densitometrig cymharol o fandiau WB gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ 1.4 (NIH) a normaleiddiwyd y lefelau mynegiant protein yn erbyn -actin.

Dyluniad arbrofol

Newidiadau mynegiant a lleoleiddio cellog ASK1 yn dilyn SAH. Neilltuwyd cyfanswm o 36 o lygod mawr ar hap i chwe grŵp (n=6/grŵp) fel a ganlyn: i) Sham-weithrediad (sham), ii) 3 h ar ôl SAH, iii) 6 h ar ôl SAH, iv ) 12 h ôl-SAH, v) 24 h ar ôl-SAH a vi) 72 h ôl-SAH. Defnyddiwyd WB i asesu newidiadau yn lefelau mynegiant protein ASK1 mewndarddol a p-ASK1. Rhannwyd cyfanswm o 4 llygoden fawr ychwanegol yn grwpiau ffug (n=2) a SAH 24 h (n=2) a defnyddiwyd staenio IF i werthuso cydleoliad ASK1.

Effeithiau therapiwtig atalydd ASK1 NQDI-1 ar swyddogaeth niwrolegol tymor byr a hirdymor yn dilyn SAH. Rhannwyd cyfanswm o 30 o lygod mawr yn 5 grŵp (n=6/group) fel a ganlyn: i) Sham, ii) SAH plws cerbyd, iii) SAH plws 1.0 µg /kg NQDI-1, iv) SAH plws 3.0 µg/kg NQDI-1 a v) SAH plws 10.0 µg/kg NQDI-1. Defnyddiwyd y sgoriau cydbwysedd Garcia a thrawst wedi'u haddasu i asesu swyddogaeth niwrolegol tymor byr 24 h yn dilyn SAH. Yn seiliedig ar faint y gwelliant niwrolegol tymor byr, aseswyd mai 3.0 µg/kg NQDI-1 oedd y grŵp dos mwyaf priodol a defnyddiwyd y dos hwn o NQDI-1 mewn arbrofion dilynol. Rhannwyd cyfanswm o 30 o lygod mawr yn 3 grŵp (n=10) fel a ganlyn: i) Sham, ii) SAH plws cerbyd, a iii) SAH ynghyd â NQDI-1. Defnyddiwyd arbrawf rotarod i asesu swyddogaeth niwrolegol hirdymor ar ddiwrnodau 7, 14, a 21 ar ôl SAH, a pherfformiwyd prawf drysfa ddŵr Morris yn wythnos 4 ar ôl SAH i asesu swyddogaeth niwrolegol hirdymor.

Effeithiau therapiwtig atalydd ASK1 NQDI-1 ar straen ocsideiddiol ac apoptosis. Rhannwyd cyfanswm o 12 o lygod mawr yn 3 grŵp (n=4/grŵp) fel a ganlyn: i) Sham, ii) SAH plws cerbyd, a iii) SAH ynghyd â NQDI-1. (THE) staenio i asesu straen ocsideiddiol a defnyddiwyd staenio TUNEL i asesu apoptosis niwronaidd 24 h ar ôl SAH.

Rôl llwybr signalau ASK1/t38 a JNK yn effeithiau therapiwtig NQDI-1. Rhannwyd cyfanswm o 48 o lygod mawr yn 8 grŵp (n{5}}/grŵp) fel a ganlyn: i) Sham, ii) SAH, iii) SAH ynghyd â cherbyd, iv) SAH ynghyd ag NQDI-1, v) SAH a sgramblo (Scr) ymyrraeth fer (si)RNA, vi) SAH plws siRNA ASK1, vii) SAH plws BMS-582949 a viii) SAH ynghyd â grwpiau SP600125. Chwistrellwyd y siRNA ASK1, yr atalydd p38 BMS-582949, a'r atalydd JNK SP600125 i asesu a oedd ASK1, p38, a JNK yn ymwneud ag effeithiau niwro-amddiffynnol NQDI-1.

Dadansoddiad ystadegol. Cyflwynwyd y data fel y gwyriad safonol cymedrig ± a chafwyd data arbrofol WB mewn 6 atgynhyrchiad annibynnol, tra perfformiwyd staenio DHE a staenio TUNEL fel 4 atgynhyrchiad annibynnol. Dadansoddwyd data gan ddefnyddio fersiwn SPSS 17 (SPSS, Inc.). Aseswyd data o brawf drysfa ddŵr Morris gan ddefnyddio ANOVA cymysg/mesurau dwyffordd a ailadroddwyd ANOVA, ac yna prawf post hoc LSD. Profwyd data o'r arbrofion sy'n weddill ar gyfer dosbarthiad arferol gan ddefnyddio prawf dosbarthu arferol Shapiro-Wilk ac yna ANOVA unffordd ac yna prawf cymharu lluosog post hoc Tukey. Cafodd graffiau eu plotio gan ddefnyddio GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.). P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Canlyniadau

Marwolaethau a difrifoldeb SAH. Defnyddiwyd cyfanswm o 191 o lygod mawr DC yn yr astudiaeth bresennol, ac o'r rhain cafodd 8 llygoden fawr eu heithrio oherwydd dim ond SAH ysgafn (sgôr graddio SAH Llai na neu'n hafal i 8). O'r llygod mawr DC a ddefnyddiwyd yn yr arbrofion, roedd 34 o lygod mawr yn y grŵp ffug a chafodd 149 o lygod mawr eu modelu gan SAH. Ni fu farw unrhyw lygod mawr yn y grŵp ffug; fodd bynnag, bu farw 23 o lygod mawr yn dilyn modelu SAH (cyfradd marwolaethau 15.4 y cant) (Tablau SI-V). O'i gymharu â'r grŵp ffug, roedd clotiau yn y gofod subarachnoid wedi'u lleoli'n bennaf ger cylch Willis ac ar ddwy ochr y rhydweli basilar yn dilyn modelu SAH (Ffig. 1 A). Ni ddangosodd y sgôr graddio SAH 24 h ar ôl modelu ar ôl SAH unrhyw wahaniaeth arwyddocaol yn nifrifoldeb gwaedlif rhwng yr holl grwpiau nad ydynt yn ffug a gwahaniaeth sylweddol rhwng ffug a phob grŵp di-sham (Ffig. 1B).

Newidiadau mynegiant protein a lleoleiddio cellog ASK1 yn dilyn SAH. Cynyddodd lefelau mynegiant protein ASK1 a chyrhaeddodd uchafbwynt ar 24 h yn yr ymennydd yn dilyn SAH (Ffig. 1C a D). Fodd bynnag, ni ddangosodd cymhareb mynegiant protein p-ASK1/ASK1 unrhyw wahaniaeth arwyddocaol (Ffig. 1C ac E). Dangoswyd lleoleiddio cellog o ASK1 gyda niwronau NeuN-positif, microglia Iba-1-positif, ac astrocytes GFAP-positif yn y grŵp ffug a SAH 24 h (Ffig. 1F-H).

Mae atalydd ASK1 NQDI-1 yn gwella swyddogaethau niwrolegol tymor byr 24 awr ar ôl SAH. Chwistrellwyd NQDI-1 (1, 3, ac 10 µg/kg) yn intracerebroventricular 1 h ar ôl SAH. Roedd gan lygod mawr a oedd yn cael eu modelu SAH sgorau cydbwysedd Garcia a thrawst wedi'u haddasu yn sylweddol is 24 h ar ôl modelu SAH; fodd bynnag, arweiniodd y tri dos o NQDI-1 at welliant rhannol sylweddol mewn swyddogaeth niwrolegol tymor byr (Ffig. 2A a B). Roedd y sgorau Garcia wedi'u haddasu yn sylweddol uwch yn y grŵp SAH ynghyd â NQDI-1 (3.0 µg/kg) o gymharu â'r grŵp SAH ynghyd â NQDI-1 (1.0 µg/kg); fodd bynnag, ni ddangoswyd unrhyw wahaniaethau ystadegol arwyddocaol o gymharu â'r grŵp SAH ynghyd â NQDI-1 (10.0 µg/kg) (Ffig. 2A a B), a awgrymodd fod cynyddu'r crynodiad o NQDI-1 ymhellach heb arwain at welliant pellach mewn gweithrediad niwrolegol tymor byr yn dilyn SAH. Felly, ystyriwyd mai NQDI-1 (3.0 µg/kg) oedd y crynodiad optimaidd effeithiol ac fe'i defnyddiwyd mewn arbrofion dilynol.

Mae atalydd ASK1 NQDI-1 yn gwella swyddogaethau niwrolegol hirdymor ar ôl SAH. Gan ddefnyddio cyflymderau cychwyn o 5 neu 10 rpm ar gyfer y prawf Rotarod, bu gostyngiad sylweddol yn hwyrni cwympiadau yn y grŵp cerbydau SAH a mwy o gymharu â’r grŵp ffug, tra bod hwyrni’r cwymp wedi’i ymestyn yn sylweddol yn dilyn chwistrelliad mewncerebrofentriglaidd o NQDI-1 o’i gymharu â’r cerbyd SAH plws. grŵp (Ffig. 2C a D). At hynny, yn ystod diwrnodau 1-5 o gyfnod hyfforddi prawf drysfa ddŵr Morris yn wythnos 4 ar ôl yr SAH, dangosodd y grŵp cerbydau SAH plus hwyrni dianc a phellter nofio llawer hwy o gymharu â’r grŵp ffug, tra dangosodd triniaeth NQDI-1 a gostyngiad sylweddol o gymharu â'r grŵp cerbydau SAH plws (Ffig. 2E-G). Yn y cyfnod profi gyda thynnu'r llwyfan cylchol tanddwr, ni welwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol mewn cyflymder nofio rhwng y tri grŵp (Ffig. 2H). Roedd hyd y cwadrant archwilio yn sylweddol fyrrach yn y grŵp cerbydau SAH plws o'i gymharu â'r grŵp ffug ac fe wnaeth triniaeth NQDI-1 ymestyn yr amser archwilio yn sylweddol o'i gymharu â'r grŵp cerbydau SAH plus (Ffig. 2I).

Mae atalydd ASK1 NQDI-1 yn lleihau straen ocsideiddiol ac apoptosis niwronaidd 24 h ar ôl SAH. Mesurwyd lefel y straen ocsideiddiol gan ddefnyddio staenio DHE ac aseswyd cyfran y niwronau apoptotig gan ddefnyddio canran y niwronau TUNEL-positif 24h ar ôl SAH. Roedd canran y celloedd DHE-positif yn sylweddol uwch yn y grŵp cerbydau SAH plws o'i gymharu â'r grŵp ffug, a gostyngodd triniaeth NQDI-1 hyn yn sylweddol o gymharu â grŵp cerbydau SAH plws (Ffig. 3A a). Roedd canran y niwronau TUNEL-positif yn sylweddol uwch yn y grŵp cerbydau SAH plws o gymharu â'r grŵp ffug. Fodd bynnag, gostyngodd canran y niwronau TUNEL-positif yn sylweddol yn dilyn triniaeth gyda NQDI-1 o'i gymharu â'r grŵp cerbydau SAH plus (Ffig. 3B a D).

Mae siRNA ASK1, BMS-582949, a SP600125 yn gwella swyddogaethau niwrolegol tymor byr 24 h ar ôl SAH. O'i gymharu â'r grŵp SAH plws Scr siRNA neu grŵp cerbydau SAH plus, dangosodd gweinyddiaeth ASK1 siRNA, BMS-582949 neu SP600125 welliant sylweddol yn y sgôr cydbwysedd Garcia a thrawst wedi'i addasu (Ffig. 4A a B).

Mae NQDI-1 yn gwanhau straen ocsideiddiol ac apoptosis ar ôl SAH trwy ffosfforyleiddiad gostyngol o ASK1, t38, a JNK. Roedd lefelau mynegiant protein ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE, HO-1, Bax, a Bcl-2 yn sylweddol uwch ar ôl SAH o gymharu â'r grŵp ffug; fodd bynnag, nid oedd y gymhareb p-ASK1/ASK1 yn arwyddocaol wahanol (Ffig. 5A-M). Ni wnaeth chwistrelliad cerbyd neu Scr siRNA achosi gwahaniaethau sylweddol yn y lefelau mynegiant protein o gymharu â'r grŵp SAH. O'i gymharu â'r grŵp cerbydau SAH plus, achosodd triniaeth gan ddefnyddio NQDI-1 ostyngiad sylweddol yn lefelau mynegiant protein p-ASK1 / ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE, a Bax, tra bod lefelau mynegiant protein o HO Cynyddwyd -1 a Bcl-2 yn sylweddol. O'i gymharu â'r grŵp SAH plws Scr siRNA, gostyngodd lefelau mynegiant protein ASK1 yn sylweddol ar ôl chwistrellu ASK1 siRNA. Arweiniodd triniaeth gyda siRNA ASK1 hefyd at ostyngiad sylweddol yn lefelau mynegiant protein p-p38, p-JNK, 4-HNE, a Bax a chynnydd sylweddol mewn mynegiant HO-1 a Bcl-2 o'i gymharu â'r SAH ynghyd â Scr siRNA grwp.

Mae atalydd p38 BMS-582949 yn lleihau lefelau mynegiant protein p-p38 ond nid yw'n effeithio ar lefelau mynegiant protein p-ASK1, ASK1, na p-JNK. Dangosodd triniaeth gyda'r atalydd p38 BMS-582949 ostyngiad sylweddol mewn lefelau mynegiant protein o p-p38, 4-HNE, a Bax a hefyd wedi cynyddu mynegiant protein HO-1 a Bcl-2 yn sylweddol o'i gymharu â'r grŵp cerbydau SAH plus; fodd bynnag, ni ddangosodd lefelau mynegiant protein ASK1, p-ASK1/ASK1 a p-JNK unrhyw wahaniaethau arwyddocaol (Ffig. 6A-M). Mae atalydd JNK SP600125 yn lleihau lefel mynegiant protein p-JNK ond nid yw'n effeithio ar lefelau mynegiant protein p-ASK1, ASK1, na p-p38. Achosodd triniaeth ag atalydd JNK SP600125 ostyngiad sylweddol yn lefelau mynegiant protein p-JNK, 4-HNE, a Bax a chynnydd sylweddol yn lefelau mynegiant protein HO-1 a Bcl-2 o gymharu â'r grŵp cerbydau SAH plus; fodd bynnag, ni chafodd lefelau mynegiant protein ASK1, p-ASK1/ASK1, a p-p38 eu newid yn sylweddol (Ffig. 7A-M).

【Am ragor o wybodaeth: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】