Hybu Gweithgaredd Gwrthganser Aspergillus Favus "endophyte Of Jojoba" Taxol Trwy Gydgysylltiad Gyda Nanoronynnau Aur Wedi'u Cyfryngu Trwy -Arbelydru

Taxol Perlysiau Tseineaidd Amgen Cistanche

Geiriau allweddol:Aspergillus favus · Jojoba · Ffyngau endoffytig · Nanoronynnau aur · Taxol · -Arbelydru · Optimeiddio maethol

Rhagymadrodd

Taxol yw un o'r sbectrwm eang mwyaf masnacholcyffuriau gwrthganser[1]. Mae gweithgaredd Taxol yn ymhelaethu o'i benodolrwydd unigryw ar gyfer rhwymo gyda'r tubulin cellog -subunits heterodimer, hyrwyddo polymerization tubulin, a thrwy hynny amharu ar y rhaniad mitotig o gelloedd tiwmor [2]. Dangosodd Taxol weithgaredd cryf yn erbyn canser y fron, yr ysgyfaint, y pen a'r gwddf, canserau'r groth, a ffurfiau datblygedig o sarcoma Kaposi [3]. Cynhyrchwyd Taxol yn gyntaf o risgl coed yw Taxus brevifolia "teulu Taxaceae" [4, 5]; fodd bynnag, mae'r cynnyrch is o Taxol bod<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as asma,llid, acancr[32]. Felly, prif amcan y gwaith hwn oedd archwilio ynysiad ffwngaidd newydd o blanhigyn jojoba gyda sefydlogrwydd metabolaidd unigryw ar gyfer cynhyrchu Taxol, i werthuso'r gwahanol ddulliau o wneud y mwyaf o'u cynnyrch Taxol, yn ogystal â gwella gweithgaredd gwrth-ymledol cyfansoddion Taxol a echdynnwyd. trwy gyfuniad â nanoronynnau aur, wedi'i gyfryngu gan arbelydru gama.

Deunydd a Dulliau

Ynysu a Diwyllio'r Ffyngau Endoffytig

Casglwyd gwahanol rannau o jojoba (Simmondsia chinensis) fel dail, rhisgl, brigau a blagur o'r Gyfadran Amaethyddiaeth, Prifysgol Cairo, a'u defnyddio fel ffynhonnell ffyngau endoffytig. Cafodd y rhannau planhigion eu casglu a'u golchi o dan ddŵr tap rhedeg, eu sterileiddio ar yr wyneb gyda 70 y cant ethanol am 1 munud ac yna eu rinsio â dŵr di-haint [28]. Torrwyd y rhannau planhigion sterileiddio arwyneb yn ddarnau bach o dan amodau di-haint a'u gosod ar blatiau o gyfrwng agar dextrose tatws (PDA), Czapek's-Dox, a chyfrwng agar echdynnu brag [33-36], a deorwyd y platiau ar 30 gradd ar gyfer 10 diwrnod. Aseswyd effeithiolrwydd sterileiddio wyneb y rhannau planhigion trwy allgyrchu'r dŵr rinsio, yna ychwanegwyd 500 ul dŵr di-haint at y gwaddod a'i blatio i gyfrwng PDA [37]. Cafodd yr unigion ffwngaidd endoffytig puredig eu brechu ar ogwydd PDA am 7 diwrnod a'u storio ar 4 gradd

Sgrinio, Echdynnu, a Meintioli Trethol o'r Ffyngau Endoffytig

Cafodd y ffyngau endoffytig a adferwyd sy'n byw mewn jojoba eu sgrinio ar gyfer cynhyrchu Taxol trwy dyfu ar broth dextrose tatws (PDB) [38]. Cafodd un plwg o bob un o'r unigion gal hwyl 7 diwrnod oed ei frechu i mewn i 100 ml o dasgau PDB/250 ml Erlenmeyer, wedi'u deor am 15 diwrnod ar 30±1 gradd , dan amodau crynu (120 rpm). Ar ôl deori, cafodd y diwylliannau eu hidlo, a diwygiwyd yr hidlydd gyda 0.2 y cant o sodiwm bicarbonad i waddodi asidau brasterog. Mae Taxol wedi'i dynnu â dichloromethane, a chasglwyd y cyfnod organig a'i anweddu i sychder, ac ail-hydoddwyd y gweddillion mewn methanol [17, 39]. Cafodd Taxol ei wahanu a'i nodi gan TLC gan ddefnyddio platiau gel silica wedi'u gorchuddio ymlaen llaw Merck 1 mm (20 × 20 cm) (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, yr Almaen), a ganfuwyd gan olau UV ar 254 nm [39]. Cafodd smotiau tybiedig Taxol eu crafu o'r platiau gel silica TLC a'u hydoddi mewn methanol, ei vortexed yn egnïol am 10 munud, a'i allgyrchu ar 1000 rpm am 5 munud. Tynnwyd y gronynnau silica gwaddodol, a chymerwyd y supernatant ar gyfer meintioli Taxol a gwirio purdeb gan HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 a Quater nary Pump, Korea) o golofn cam cefn C18 (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3.5 μm, Cat.#959,963–902). Y cyfnod symudol a ddefnyddiwyd oedd methanol/acetonitrile/dŵr (25:35:40, v/v/v) ar gyfradd fow o 1.0 ml/min am 20 munud [40], a mesurwyd ffracsiynau Taxol ar 227 nm, a'u cadarnhawyd hunaniaeth a chrynodiadau cemegol o'r amser cadw a'r ardal brig amsugno o gymharu â sampl dilys.

Adnabod Morffolegol a Moleciwlaidd o'r Ffyngau Endoffytig a Adferwyd

Nodwyd yr unigion ffwngaidd endoffytig i'w lefelau rhywogaeth yn seiliedig ar eu nodweddion macro a micro-morffolegol trwy dyfu ar PDA, Czapek's-Dox, a chyfryngau echdynnu brag yn ôl allweddi'r cyfeiriad [33-36]. Cadarnhawyd yn foleciwlaidd ymhellach hunaniaeth yr unigion ffwngaidd mwyaf grymus sy'n cynhyrchu Taxol ar sail y dilyniant o ofodwr trawsgrifiedig mewnol (ITS) [41, 42]. Echdynnwyd DNA genomig ffwngaidd (gDNA) trwy falu'r mycelia (~0.2 g) mewn nitrogen hylifol, yna ei ddosbarthu mewn byffer echdynnu CTAB 1 ml (2 y cant CTAB, 2 y cant PVP40, { {21}}.2 y cant 2-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl mewn 100 mM Tris−HCl, pH 8.0). Y setiau preimio PCR oedd ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ ac ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. Mae'r adwaith PCR yn cynnwys 10 ul o gymysgedd meistr 2 × PCR (i-Taq™, Cat. No. 25027), 2 ul o gDNA, 1 ul o bob paent preimio (10 pmol/ul), ac wedi'i gwblhau i 20 ul gyda distylliad di-haint dwr. Cafodd y PCR ei raglennu i ddadnatureiddio cychwynnol ar 94 gradd am 2 funud, dadnatureiddio ar 94 gradd am 30 s, anelio ar 55 gradd am 10 s, estyniad ar 72 gradd am 30 s am 35 cylch, ac estyniad fnal ar 72 gradd am 2 eiliad. min. Dadansoddwyd yr amplicons PCR gan gel agarose 1.5 y cant mewn byfer 1 × TBE (Ambion Cat # AM9864), gan ddefnyddio ysgol DNA 1 kb (Cat. # PG010-55DI) a delweddwyd gan system dogfennaeth gel. Cafodd yr amplicons eu puro a'u dilyniannu gan Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Fersiwn 6.0 gyda'r un setiau paent preimio. Chwiliwyd y dilyniannau a gafwyd gan BLAST yn ddiangen ar gronfa ddata NCBI, eu mewnforio i feddalwedd MEGA 6.0, a'u halinio ag algorithm cyhyrau Clustal W [43] ac adeiladwyd y goeden ffylogenetig gyda'r dull ymuno â chymdogion o MEGA 6.0 [44].

Adeiledd Cemegol y Taxol Echdynedig

Cafodd smotiau tybiedig Taxol eu crafu o'r platiau gel silica TLC a'u puro, a phenderfynwyd ar y purdeb a'r crynodiad gan y dadansoddiadau UV-Vis ar λ 227 nm (Cyfres RIGOL, Ultra-3000) o'i gymharu â Taxol dilys [39]. Defnyddiwyd cyfryngau gwag o dan yr un amodau fel llinell sylfaen negyddol ar gyfer y dadansoddiadau sbectroffotometrig. Dadansoddwyd sbectrwm FT-IR o'r samplau Taxol wedi'u puro gan sbectroffotomedr JASCO FT-IR 3600. Roedd sampl Taxol wedi'i falu gyda phelenni KBr, wedi'i wasgu i ddisgiau o dan wactod, a mesurwyd yr amsugniad yn y rhanbarth 400 i 4000 cm−1 [3], o'i gymharu â'r un dilys. Cadarnhawyd strwythur cemegol Taxol wedi'i dynnu o'r sbectrosgopeg HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) o'i gymharu â Taxol dilys. Diddymwyd y samplau yn CDCl3, rhoddir sifftiau cemegol mewn ppm (graddfa δ), a mynegir y cysonion cyplu mewn hertz (Hz).

Effaith Gwahanol Fath o Gyfryngau ar Gynhyrchu Taxol

Cafodd dau blwg agar (9 mm) o ddiwylliannau 7 diwrnod oed o bob ynysiad ffwngaidd eu brechu yn driphlyg i fflasg Erlenmeyer o ddextrose tatws (PDB), Czapek’s-Dox (CZD), M1D, a brag (ME). ) cyfryngau cawl. Defnyddiwyd rheolyddion heb eu brechu o bob cyfrwng sy'n rhydd o sborau ffwngaidd fel rheolaeth negyddol, wedi'i ddeor ar 30 gradd am 15 diwrnod o dan yr un amodau. Ar ôl deori, cafodd diwylliannau ffwngaidd eu hidlo, a chafodd Taxol ei dynnu a'i bennu fel y crybwyllwyd uchod.

Bioprocess Optimization o'r Amodau Maethol i Mwyhau'r Cnwd Taxol

Cyflawnwyd optimeiddio'r cyfansoddiad canolig ar gyfer gwneud y mwyaf o'r cynnyrch Taxol gan yr unigedd gal hwyl cryf trwy fethodoleg arwyneb ymateb gan ddefnyddio dyluniad Placket-Burman ac yna dyluniad cyfansawdd canolog [17–20, 45]. O'r dyluniadau RSM, aseswyd y newidynnau cadarnhaol ac arwyddocaol sy'n effeithio ar gynhyrchu Taxol gan yr unigyn ffwngaidd cryf gan ddefnyddio'r pecyn meddalwedd ystadegol gan Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, UDA). Cynhaliwyd pob arbrawf mewn tri atgynhyrchiad biolegol ac ystyriwyd y gwerthoedd cymedrig. Ar ôl deori ar yr amodau dymunol, cafodd biomas ffwngaidd ei hidlo, a chafodd Taxol ei echdynnu a'i feintioli gan TLC a HPLC fel y disgrifir uchod.

Dyluniad Placket-Burman

Mae'r cynllun placket-Burman wedi'i ddefnyddio'n aml ar gyfer optimeiddio'r gydran cyfryngau ar gyfer twf ffwngaidd a chynhyrchu metabolion eilaidd bioactif, gan werthuso'r newidynnau sylweddol sy'n effeithio ar gynhyrchu Taxol [18, 20, 46]. Roedd y dewis o ffactor yn seiliedig ar gyfryngau a ddefnyddiwyd mewn sgrinio ansoddol a meintiol. Mae un ar ddeg o ffactorau wedi'u cynnwys; Roedd detholiad brag, peptone, swcros, soytone, glutamine, echdyniad cig eidion, a thymheredd, pH, amser deori, a gwerthoedd a ffactorau cyflymder ysgwyd yn amrywio dros ddwy lefel, a dewiswyd yr ystodau lefelau isaf ac uchaf. Defnyddiwyd yr Arbenigwr Dylunio ystadegol 7.0 i gynhyrchu set o 12 arbrawf. Ar gyfer pob arbrawf, penderfynwyd cynhyrchu Taxol mewn tri atgynhyrchiad biolegol, ac ystyriwyd cyfartaledd cynnyrch Taxol.

Cynhaliwyd dadansoddiad atchweliad o'r data gan ddefnyddio meddalwedd ystadegol. Cyfrifwyd effaith pob newidyn (Biometrika, 2020), gan ddefnyddio'r hafaliad canlynol:

lle, E yw effaith newidyn profi, M plws , ac M− yw'r crynodiad Taxol o dreialon lle'r oedd y paramedr ar ei lefelau uwch ac is yn y drefn honno, ac N yw nifer yr arbrofion a gynhaliwyd. Pennwyd effaith pob newidyn ar y cynhyrchiad trwy gyfrifo eu E-werthoedd priodol.

Lle Tot uchel yw cyfanswm yr ymatebion ar y lefel uchel, Tot isel yw cyfanswm yr ymatebion ar y lefel isel, a Na yw nifer y treialon.

Dyluniad Cyfansawdd Canolog a Rhyngweithiadau Rhwng Ffactorau sy'n Effeithio ar Gynhyrchu Taxol

Cafodd y ffactorau cadarnhaol mwyaf arwyddocaol sy'n effeithio ar gynhyrchu Taxol gan yr iso ffwngaidd a ddewiswyd yn hwyr eu optimeiddio gan ddefnyddio dyluniad arbrofol model CCD math arwyneb ymateb [47]. Trwy ddefnyddio CCD, cafodd crynodiadau'r cydrannau canolig eu hoptimeiddio, a defnyddiwyd eu rhyngweithiadau a astudiwyd i gynhyrchu cyfanswm o 20 arbrawf ar gyfer y tri newidyn. Er mwyn pennu lefelau optimaidd y newidynnau ar gyfer cynhyrchu Taxol o'r unigyn ffwngaidd cryf, plotiwyd cromliniau wyneb ymateb tri dimensiwn (3D) i astudio'r rhyngweithio rhwng y gwahanol ffactorau ac i bennu cyflwr amrywiol pob ffactor sy'n effeithio ar gynhyrchu Taxol. Cyflawnwyd y graffiau 3D trwy ddal cysonion tri ffactor mewn lefel ddelfrydol a phlotio'r ymateb a gafwyd o gynnyrch Taxol ar gyfer lefelau amrywiol y ddau ffactor arall.

Effaith Arbelydru Gama ar Gynnyrch Trethol

Roedd yr unigion endoffytig cryf sy'n cynhyrchu Taxol yn agored i -arbelydru gyda 60Ffynhonnell Cobalt (cell Gamma 4000-A-India) ar ddosau ymbelydredd gama gwahanol (0.25–3.0 kGy) o gymharu i reolaeth y diwylliant di-arbelydredig; cyfradd dos o 1.2 kGy/h ar adeg yr arbrofion. Cafodd y cyfryngau optimized eu brechu gan y diwylliant arbelydredig o dan amodau diwylliannol safonol, o'i gymharu ag inocwlwm y sbôr heb ei arbelydru fel rheolaeth. Deorwyd y diwylliannau ar 30±2 gradd am 15 diwrnod ar ysgydwr cylchdro (120 rpm). Ar ôl deori, cafodd y diwylliannau eu hidlo a chafodd Taxol ei dynnu, ei buro, a'i fesur gan TLC a HPLC fel y disgrifir uchod.

Synthesis a Nodweddu Nanoronynnau Aur (AuNPs); Conjugation â Taxol

Gweithgarwch Gwrthganser o Taxol

Pennwyd gweithgaredd y cyfuniadau Taxol a Taxol-PVP-AuNPs puredig yn erbyn carsinoma'r afu (HPG2), a charsinoma'r fron (MCF7) gan 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-assay deiphenyl tetrazolium bromid (MTT) [48]. Cafodd y 96-plât ffynnon ei hadu â 103 o gelloedd y ffynnon, a'i ddeor dros nos ar 37 gradd, yna ychwanegwyd crynodiadau gwahanol o'r cyffur, a chafodd y platiau eu hail-deor am 48 h. Ychwanegwyd yr adweithydd MTT (25 ul), a'i ddeor am 2 h, a mesurwyd lliw porffor y cymhleth formazan datblygedig yn λ570 nm. Mynegwyd y gwerth IC50 gan faint o gyffuriau lleihau twf o 50 y cant o nifer cychwynnol o gelloedd tiwmor normaleiddio i reolaeth gadarnhaol.

Gweithgarwch Gwrthficrobaidd Cyfuniadau Taxol a Taxol-AuNPs

Aseswyd gweithgaredd gwrthficrobaidd cyfuniadau Taxol a Taxol-AuNPs yn erbyn gwahanol ynysyddion bacteriol; Bacillus subtilis ATCC 6633 a Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, ac Enterobacter agglomerans, yn ogystal â Candida albicans. Ataliwyd y celloedd bacteriol a brofwyd mewn dŵr peptone di-haint i gael inocwlwm safonol o ~0.5 McFarland (1–1.5) × 1{{10}}8 CFU/ ml yn λ6{{18 }} 0 nm. Aseswyd ataliad twf (mm) twf pathogenau microbaidd gan y dull tryledu disg agar. Defnyddiwyd disgiau gwrthfiotig safonol di-haint gyda diamedr o 6.0 mm fel rheolaethau cadarnhaol. Llwythwyd disgiau gwrthfiotig di-haint (6.0 mm) â 20 ul o fethanol ac asid amoxicillin-clavulanig (AMC) fel rheolaeth negyddol a chadarnhaol. Llwythwyd disgiau gyda'r un crynodiad o Taxol, Taxol-PVP-AuNPs, ac AuNPs (1.0 ug/ml). Paratowyd tri atgynhyrchiad biolegol. Deorwyd y platiau ar 37 gradd am 24 h, a mesurwyd y parthau ataliad. Defnyddiwyd asid clavulanig amoxicillin (AMC) a nystatin i normaleiddio gweithgaredd gwrthficrobaidd Taxol. Pennwyd parth atal twf gan vernier caliper (mm).

Dadansoddiadau Ystadegol

Adnabod Morffolegol a Moleciwlaidd y Cynhyrchwyr Trethol Potensial

Archwiliwyd nodweddion morffolegol yr ynysig ffwngaidd grymus sy'n cynhyrchu Taxol yn ôl yr allweddi disgrifiadol macrosgopig a microsgopig, fel y disgrifir yn Deunyddiau a Dulliau, a datgelodd ei agosrwydd morffolegol ag A. favus (Ffig. 2). Tyfwyd yr unigyn ffwngaidd ar PDA ar 30 gradd am 10 diwrnod a datgelodd y nodweddion macrosgopig a microsgopaidd ei hunaniaeth i megis pennau conidial, dull canghennog, hunaniaeth stigma, ac ontoleg conidial, a ffurfiant cyrff hadol, yn ôl y cyffredinol. allweddi morffolegol [33], a chanfuwyd eu bod yn union yr un fath ag Aspergillus favus. Cafodd yr unigyn cryf A. favus sy'n cynhyrchu Trethol ei nodi ymhellach ar sail eu dilyniannau ITS, gan ddefnyddio gDNA fel templed. Mae'r amplicons PCR (~ 550 bp) o A. favus eu datrys, purifed, a dilyniannu (Ffig. 2). Roedd y dilyniant ITS o A. favus yn chwyth di-angen a chwiliwyd ar gronfa ddata NCBI, gan ddangos tebygrwydd o 99 y cant ag A. favus, gyda gwerthoedd E. sero, a chwmpas ymholiad o 95 y cant. Felly, o'r dadansoddiadau microsgopig a moleciwlaidd, cadarnhawyd yr ynysu targed fel A. favus a'i adneuo ar GenBank gyda rhif derbyn MW485934.1, yn ogystal â, mae'r unigedd wedi'i adneuo yng Nghanolfan Fycolegol Prifysgol Assiut (AUMC), yr Aifft gyda a rhif dyddodiad AUMC13892. Roedd gan yr unigyn presennol 99 y cant o debygrwydd ag ynysu A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Ffig. 1 Golygfa morffolegol o blanhigyn jojoba. B Diwylliannau platiau'r ffyngau endoffytig cryf sy'n cynhyrchu tacsol; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23), ac A. oryzae Bd (25) ar PDA ar ôl 8 diwrnod o deor ar 30 gradd. Tyfwyd yr unigion ffwngaidd ar PDB, a'u deor yn ôl yr amodau safonol, a chafodd Taxol ei dynnu a'i wirio gan TLC (C). Cromatogram D HPLC o Taxol o'r unigion ffwngaidd cryf. E Cynnyrch Trethol fel y'i mesurwyd gan HPLC. Dadansoddiad sbectrol F, UV-Vis o Taxol wedi'i dynnu o'r unigion ffwngaidd. Dadansoddiad G FT-IR o Taxol wedi'i dynnu o'i gymharu ag un dilys

Ffig. 2 A Nodweddion macromorffolegol A. favus endoffyt o jojoba ar ôl 3, 5, ac 8 diwrnod o dyfiant ar PDA. Nodweddion micro-morffolegol, pen conidial o A. favus gan chwyddo 400X. C PCR amplicon o ranbarth A. favus ITS o 500 bp, gan normaleiddio i ysgol 1 kb (Cat.#. SM0312). D Dadansoddiad ffylogenetig o ITS A. favus yn ôl y dull tebygolrwydd mwyaf [44]

Gofynnwch am fwy:

E-bost:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: ynghyd â 86 15292862950