Diffyg Calreticulin yn Amharu ar Fiogenesis Ribosom Ac yn Canlyniadau Gostyngiad mewn Datblygiad Embryonig Arennau

edmund.chen@wecistanche.com

Haniaethol

Mae nephrogenesis yn cael ei yrru gan lwybrau signalau cymhleth sy'n rheoli twf celloedd a gwahaniaethu. Mae'r caperone calreticulin reticwlwm endoplasmig (Calr) yn adnabyddus am ei swyddogaeth mewn storio calsiwm ac wrth blygu glycoproteinau. Ei rôl ynarennid yw datblygiad yn cael ei ddeall o hyd. Rydym yn darparu tystiolaeth ar gyfer rôl ganolog Calr yn nephrogenesis yn yr ymchwiliad hwn. Rydym yn dangos bod diffyg Calr yn arwain at darfu ar ffurfio parth neffrogenig cyfan ac at arafu nephrogenesis, fel y dangosir gan yr aflonyddwch wrth ffurfio cyrff siâp coma a siâp s. Gan ddefnyddio dulliau proteomeg a thrawsgrifomeg, fe wnaethom ddangos, yn ogystal â newid mewn proteinau allweddol signalau Wnt, bod embryonigarennauo Calr // dangosodd nam cyffredinol yn y mynegiant o broteinau ribosomal sy'n datgelu aflonyddwch mewn synthesis protein a nephrogenesis. Cadarnhaodd canlyniad cyfryngol CRISPR/cas9 fod diffyg Calr yn gysylltiedig â diffyg nifer o broteinau ribosomaidd a phroteinau allweddol mewn biogenesis ribosom. Mae ein data yn amlygu cysylltiad uniongyrchol rhwng mynegiant Calr a biogenesis ribosom.

Rhagymadrodd

Arennaunodweddir organogenesis gan gyfres o ddigwyddiadau morffogenetig sy'n cael eu gyrru gan dwf celloedd a gwahaniaethu. Yn ystod nephrogenesis, y trawsnewidiad mesenchymal-epithelial (MET) a'r canghennog blagur wreterig (UB), sy'n ganlyniad anwythiad cilyddol rhwng yr UB a'r mesenchyme metaneffrig (MM) [1], yw'r grymoedd gyrru ar gyfer ffurfio neffron. Yn ystod y broses hon, mae angen rhyngweithio cymhleth a dwyochrog o wahanol lwybrau signalau i drefnu gwahaniaethu epithelial a ffurfio'r neffron [1-3]. Ymhlith y llwybrau allweddol yn y broses hon, mae signalau ffactor niwrotroffig sy'n deillio o glia (Gdnf) trwy ei dderbynnydd Ret yn chwarae rhan ganolog yn ystod proses a elwir yn egin wreterig. Gall tarfu ar y signalau hwn achosi wreter ectopig neuarennolagenesis pan fo'r signalau yn gwbl absennol [4]. Ar wahân i'r signalau Gdnf/Ret, gwyddys bod y signalau canonaidd Wnt/ -catenin yn cydlynu agweddau lluosog ararennoldatblygiad o fewn yr MM ac UB [5] ac mae ataliad signalau Wnt canonaidd yn y llinach blaguryn wreterig ac epilyddion neffron yn arwain atarennolagenesis [6]. Mae cynnal yr ailraglennu trawsgrifiadol yn ystod nephrogenesis yn dibynnu ar hygyrchedd cromatin [7]. Gwnaethom ddangos bod proteinau heterochromatin, y gwyddys eu bod yn ymwneud â rheoleiddio epigenetig tawelu genynnau, yn anhepgor ar gyfer cynnal y cydbwysedd rhwng actifyddion canghennog ac atalyddion yng nghyfnod cynnar eu datblygiad [7].

BYDD CISTANCHE YN GWELLA SWYDDOGAETH YR AREN/ARRENAU

Mae Calreticulin (Calr) yn hebryngwr amrywiol o'r reticwlwm endoplasmig (ER) gyda chynhwysedd uchel o rwymo calsiwm ac affinedd isel, sy'n hanfodol ar gyfer Ca2 ynghyd â atafaeliad i'r ER a gwahanol brosesau cellog gan gynnwys trawsgludiad signal, mynegiant genynnau, a masnachu protein. [8,9]. Mae'r mecanweithiau sy'n mynd i'r afael â rôl Calr mewn clefydau yn seiliedig yn bennaf ar Ca2 plus chelation gan barth terfynell C-rwymol Ca2 plus-rhwymol Calr a'i rôl yn yr ymateb protein heb ei blygu (UPR) [10,11]. Gall UPR chwarae rôl sytoprotective yn ystod her gyda phroteinau wedi'u cam-blygu neu gall fod yn niweidiol i'r celloedd fel apoptosis a achosir gan signalau UPR parhaus. Er mai ychydig o astudiaethau a aeth i'r afael â rôl bosibl Calr mewn clefydau trwy reoleiddio trawsgrifio, mae swyddogaeth gwarchodwr ER Calr yn parhau i fod yn un o'r mecanweithiau hanfodol ar gyfer tynged y gell [9,12]. Mae straen ER hir a chamblygu protein yn amlwg mewn amrywiolafiechydon arennolmegis glomerulopathies, aciwtanaf i'r arennau, neffropathi diabetig,arennolffibrosis, a chronigclefyd yr arennau[13,14]. Nid yw rôl Calr yn natblygiad embryonig yn glir o hyd. Mae cnocio calr yn achosi angheuedd embryonig yn ystod y cam datblygiadol E14.5 oherwydd nam ar ddatblygiad cardiaidd [15]. Canlyniadau diffyg Calr ar fecanweithiau moleciwlaiddarenFodd bynnag, nid yw datblygiad embryonig wedi'i ddeall yn llawn eto. Yn yr astudiaeth bresennol fe wnaethom gynnal dadansoddiadau trawsgrifomig a phroteomig cymharol o'r embryonigareno'r tri genoteip Calr plus / plus , Calr plus // , a Calr// ac amlygodd effaith cnociad Calr ar nephrogenesis ac ar fynegiant proteinau ribosomaidd.

Geiriau allweddol:diffyg calreticulin; nephrogenesis; biogenesis ribosomaidd, Arennau, Arennol

2. Canlyniadau

2.1. Canlyniad Cnawd Calreticulin mewn Annormaleddau Morffolegol a Histolegol yn yr Arennau a Changhennau Arennol â Nam

Mae cnocio genetig o Calr mewn llygod yn achosi marwoldeb embryonig cynnar oherwydd namau septwm fentriglaidd [15]. Er mwyn ymchwilio i weld a yw canlyniad Calr yn effeithioarendatblygiad, paratowyd embryonau llygoden ar gam E13.5 o Calr plus // llygod beichiog (Ffigur 1A). Dangosodd yr embryonau Calr// newid twf sylweddol o gymharu â Calr plus / plus a Calr plus // a datgelodd nam sylweddol yn natblygiad yr embryonau. Morffoleg gros yr embryonau a'rarennauyn dangos gostyngiadau sylweddol mewn maint rhwng Calr plus / plus a Calr−// llygod gyda Calr// llygod yn dangos yr annormaledd mwyaf (Ffigur 1A). I ddangos effaith ergydio Calr ymlaenarendatblygiad a strwythur, aberthwyd embryonau ar dri cham datblygiad gwahanol (E13.5, E14.5, E16.5) ac o'r tri genoteip (Calr plus / plus , Calr plus // a Calr//) acarennaueu cael. Roedd yr adrannau meinwe yn dangos gwahanol gamau datblygu o'raren,sy'n datblygu trwy strwythurau morffolegol cymhleth fel y dangosir gan PAS ac HE-staenio darnau meinwe.Arennauo'r un cyfnod embryonig gyda genoteipiau gwahanol yn dangos lefelau gwahanol o ddatblygiad (Ffigur 1B). Ar ben hynny, mae gwahaniaethau sylweddol ynarensylwyd ar strwythurau yn arbennig wrth gymharu Calr // i Calr plus / plus a Calr plus //. Mae'r gwahaniaethau hyn hefyd yn parhau mewn cyfnodau datblygedig o nephrogenesis (Ffigur 1B). Calr //arennaudangos nam difrifol o gymharu â Calr plus / plus a Calr plus // (Ffigur 1B). Ar gam E13.5 maint y Calr//arenyn llai ac roedd nifer blagur yr wreter a changhennau blagur yr wreter yn sylweddol is. Gwnaed sylwadau tebyg yng nghamau E14.5 ac E16.5. Diwylliant organ yr embryonigarennauo'r tri genoteip embryo dadorchuddio anhwylder sylweddol mewn canghennog UB aarentwf. I ddelweddu'rarennolstrwythurau, elfennau diwylliedig wedi'u staenio â laminin fel marciwr ar gyfer y bilen waelodol a chyda Dolichos biflorus agglutinin (DBA) lectin i ddelweddu'r UB.

Mae fflworoleuedd FL cyfun staenio y diwylliedigarendangosodd elfennau nam canghennog sylweddol a oedd yn cyd-fynd â diffyg Calr ac yn arwain at arafwch cyffredinol ynarendatblygiad (Ffigur 2A, B). Ar adeg ynysu, mae'r Calr //arendangosodd elfennau 6-10 awgrymiadau UB, tra bod elfennau Calr plus / plus a Calr plus // yn arddangos awgrymiadau UB 20-30. Datblygodd elfennau diwylliedig Calr plus / plus a Calr plus // fel arfer yn ystod y cyfnod diwylliant (72 h) a dangosodd UB â changhennau da (85 ± 9, n=6 yr un) yn ogystal â strwythurau hysbys gwahanol o fewn aren sy'n datblygu vivo. Y diwylliedigarendangos agregau cyn-diwb,arennolfesiglau, a mesenchyme cap (Ffigur 2A,B). Mewn cyferbyniad, methodd yr elfennau Calr // â datblygu'n normal a dangosodd newid sylweddol yng nghanghennau UB (15 ± 3 n=6) (Ffigur 2B).

Ffigur 2. Llygoden galr−/−arenmae elfenau yn dangos newid difrifol mewn twf a changhennau UB. (A):Arennaucafodd elfennau o Calr plus / plus Calr plus /− a Calr−/− (E13.5) eu hynysu a'u meithrin ex vivo am dri diwrnod. Calr −/−arendangosodd elfennau newid cyffredinol mewn twf a newid sylweddol yng nghanghennau blagur wreterig. (B): Immunofluorescence staenio oarenelfennau ar ôl tri diwrnod o ddiwylliant. Perfformiwyd cyd-staeniad o laminin (coch) a DBA lectin (gwyrdd) i ddelweddu gwahanol strwythurau'r elfennau. Cyflawnwyd y meintioli canghennog trwy gyfrif nifer canghennau'r blaguryn wreterig. Cyflwynir y meintioliad ar ffurf siart bar gyda bariau gwall. Mae pob bar yn cynrychioli rhif y gangen yn golygu ±sd o chwe elfen ddiwylliedig. Gwahaniaethau sylweddol: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0.001.="" 2.5="" ×="" 2.5="" ×="" 2.5="" ×="" int.="" j.="" mol.="" sci.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" o="" 21="" ffigur="" 2.="" mae="" elfennau="" arennau="" calr悆="" llygoden="" yn="" dangos="" newid="" difrifol="" mewn="" twf="" a="" changhennau="" ub.="">Arennaucafodd elfennau o Calr plus / plus Calr plus // a Calr / (E13.5) eu hynysu a'u meithrin ex vivo am dri diwrnod. Calr /arendangosodd elfennau newid cyffredinol mewn twf a newid sylweddol yng nghanghennau blagur wreterig. (B): Immunoflfluorescence staenio oarenelfennau ar ôl tri diwrnod o ddiwylliant. Perfformiwyd cyd-staeniad o laminin (coch) a DBA lectin (gwyrdd) i ddelweddu gwahanol strwythurau'r elfennau. Cyflawnwyd y meintioli canghennog trwy gyfrif nifer canghennau'r blaguryn wreterig. Cyflwynir y meintioliad ar ffurf siart bar gyda bariau gwall. Mae pob bar yn cynrychioli rhif y gangen yn golygu ±sd o chwe elfen ddiwylliedig. Gwahaniaethau sylweddol: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. Mae Diffyg Calr yn Gysylltiedig â Newidiadau Trawsgrifiadol Mawr ac Arwyddocaol

Dangosodd yr ymchwiliadau morffolegol a histolegol nam ynarendatblygiad embryonau Calr/llygoden o gymharu â Calr plus / plus a Calr plus // . Er mwyn ymchwilio i weld a effeithiodd canlyniad Calr ar fynegiant proteinau a llwybrau allweddol nephrogenesis, mae dadansoddiadau trawsgrifiad cyfan o'rarenperfformiwyd elfennau o'r tri genoteip embryo. Er mwyn asesu'r genynnau wedi'u mynegi'n wahaniaethol rhwng Calr plus / plus , Calr plus // , a Calr/arensamplau, perfformiwyd profion meintiol yn seiliedig ar gyfrifon darllen gan ddefnyddio union brawf Fisher gydag addasiad Benjamini-Hochberg ar gyfer profion lluosog. Mae'r Ffigurau Atodol S1 a S2 yn dangos y map gwres o'r dadansoddiad cymharol rhwng mynegiadau genynnau yn yarenelfennau o Calr plus / plus , Calr plus // , a Calr / . Er mwyn cael trosolwg cynhwysfawr o'r newidiadau mynegiant genynnau rhwng Calr plus / plus a Calr / aren, crëwyd plot MA gyda'r newid plyg wedi'i drawsnewid (FC) mynegiant rhwng Calr plus / plus a Calr / i log2 wedi'i drawsnewid. lefel mynegiant cyfartalog ar gyfer pob genyn ar draws yr holl samplau (Ffigur 3A, Ffigur Atodol S1). Mae'r plot MA yn dangos genynnau a reoleiddir yn wahaniaethol yn Calr plus / plus o gymharu â Calr / . Datgelodd dosbarthiad swyddogaethol y genynnau a reoleiddir yn ôl proses fiolegol newid yn y broses ddatblygiadol yn Calr /arennau(Ffigur 3B, Tabl Atodol S1). Datgelodd ymchwiliad agosach i anodi llwybr y genynnau a reoleiddir aberiad o ddwy brif broses: y signalau Wnt a'r plygu protein oherwydd canfuwyd bod mwyafrif y proteinau a reoleiddir yn ymwneud â'r ddau brif lwybr hyn (Ffigur 3B). Cadarnhaodd clystyru hierarchaidd a chlystyru modd-k ar broffiliau mynegiant fod yr embryonigarenmae trawsgrifiadau o Calr plus / plus a Calr plus // yn debyg iawn ond yn wahanol iawn i drawsgrifiadau Calr / (Ffigur 3C, Ffigurau Atodol S1 ac S2).

BYDD CISTANCHE YN GWELLA HEINTIAD YR AREN/ARENAU

Dangosodd ein data dadansoddi trawsgrifiad fod newid yn y mynegiant o broteinau allweddol yn cyd-fynd â'r canlyniad o Calrarendatblygiad (Ffigurau 3C a 4A, Tabl Atodol S2) ochr yn ochr â'r proteinau allweddol yn signalau Wnt a nifer fawr o enynnau neffrogenig wedi'u is-reoleiddio neu heb eu canfod yn y Calr /arenelfennau (Ffigur 3C, Ffigur 4A). Ymhlith eraill, roedd ffactorau trawsgrifio, megis Six1 a Six2, yr adroddwyd yn flaenorol eu bod yn gweithredu mewn gwahanol gamau o nephrogenesis wedi'u his-reoleiddio'n sylweddol yn aren Calr // embryonig. Mae Osr1 yn un o'r genynnau y mae angen eu mynegiant ar gyfer Eya1, Pax2, Six2, Sall1, a GDNF ac roedd mynegiant y genyn hwn bron yn absennol yn Calr / . Er mwyn ymchwilio i effaith newid signalau Wnt a'r genynnau allweddol neffrogenig ararendatblygiad mewn llygod cnocio Calr, staenio imiwnfflworoleuedd gyda marcwyr y datblygiad embryonig ynarenadrannau o embryonau ar gam E14.5. Cadarnhaodd y staenio'n glir newid y genynnau a archwiliwyd yn Calr / (Ffigur 4B). Yn ogystal, o'i gymharu â Calr plus / plus a Calr plus // , mae'r Calr /arendiffyg parth neffrogenig clir (Ffigur 4B) fel y dangosir gan y staenio ac mae hyn yn cadarnhau aflonyddwch difrifol mewnarendatblygiad yn Calr/ embryonau.

2.3. Dadansoddiadau Proteomig Cymharol Newidiadau Sylweddol a Nodwyd yn Proteome yr Arennau Calr / Embryonig

Dangosodd dadansoddiadau morffolegol a histolegol fod cyfyngiad ar Calr yn broblemus i ddatblygiad embryonig yaren. Er mwyn deall ymhellach rôl Calr ynarendatblygiad embryonig, cynhaliwyd dadansoddiadau proteome eang ar embryonigarennaudefnyddio dwy strategaeth. Yn yr arbrofion cyntaf, defnyddiwyd yr electrofforesis gel 2D i gymharu'r embryonigarenproteomes o Calr plus / plus a Calr plus // embryonau llygoden o lwyfan E13.5. Roedd y patrwm 2D yn dangos newid sylweddol yn y proteome o Calr plus //arennau(p < 0.05)="" (ffigur="" atodol="" s3a).="" datgelodd="" adnabyddiaeth="" y="" proteinau="" gwahaniaethol="" niferus="" newid="" yn="" y="" mynegiant="" o="" broteinau="" sy'n="" ymwneud="" â="" llwybrau="" straen="" ac="" ym="" metaboledd="" rna="" yn="" calr="" plus="">aren(Ffigur Atodol S3B,C). Er mwyn archwilio'r newid proteome yn Calr plus // a Calr悆 / yn well o'i gymharu â'r Calr plus / plusaren, fe wnaethom berfformio proffilio proteome yn seiliedig ar sbectrometreg màs (Ffigur 5, Tablau Atodol S3-S8). Dangosodd dadansoddiad gorgyffwrdd atgynhyrchedd uchel o ganfod protein rhwng genoteipiau (Ffigur 5A). Dangosodd dadansoddiad ystadegol newidiadau sylweddol mewn mynegiant protein rhwng Calr plus / plus vs. Calr悆 / (Ffigur 5A, Tablau Atodol S3 a S4, Ffigur Atodol S4A.), Calr plus // vs. Calr/ (Ffigur 5A, Tablau Atodol S5 a S6, Ffigur Atodol S4B), a Calr plus / plus vs Calr plus // (Ffigur 5A, Tablau Atodol S7 ac S8, Ffigur Atodol S4C). Cadarnhaodd staen imiwnedd fflworoleuedd guro Calr yn Calr //arennau. Yn ogystal, gwnaethom gadarnhau'r canfyddiadau proteomeg ar gyfer dau brotein wedi'u is-reoleiddio yn Calr / : Calbindin 1(Calb-1) a Superoxide dismutase 1 (Sod1). Yn achos Sod1, datgelodd data proteomig a thrawsgrifiadomig guro Sod1 yn y Calr悆 // embryonigarena chadarnhaodd staenio immunofluorescence ddiffyg Sod1 yn y Calr / embryonigaren(Ffigur 5B). Mae Sod1 yn metalloenzyme gwrthocsidiol sy'n chwarae rhan bwysig wrth ddadwenwyno rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) trwy drosi radicalau superocsid rhydd yn hydrogen perocsid i'w dadwenwyno ymhellach gan gatalasau cellog, gan atal gwenwyndra. Calb-1 yw'r prif brotein mewngellol sy'n rhwymo calsiwm yn y tiwbyn troellog distal (DCT) ac mae'n chwarae rhan allweddol yn y Ca2 trawsgellog ynghyd ag adamsugniad. Fel protein mewngellol Ca2 plus -buffer a Ca2 plus -transit, mae Calb-1 yn cludo Ca2 plus o'r ochr apigol i'r ochr fasochrol heb ei addasu'n sylweddol yn y crynodiad mewngellol Ca2 plus -. Nid yw'r cysylltiad rhwng cnociad Calr a'r newid yn y mynegiant y ddau brotein yn glir ac mae angen ymchwilio ymhellach.

Ffigur 3. Dadansoddiad mynegiant genynnau cymharol o lygod taro calreticulin. (A): Plot MA yn dangos genynnau ar raddfa eang sydd wedi'u huwchreoleiddio a'u his-reoleiddio yn Calr plus / plws llygod yn erbyn Calr /. Perfformiwyd profion meintiol o'r newid plyg (yn seiliedig ar y cyfrif darllen wedi'i drawsnewid â log wedi'i normaleiddio) gan ddefnyddio union brawf Fisher gyda chywiriad Benjamini-Hochberg (p < 0.05)="" a="" chynrychiolir="" genynnau="" ansylweddol="" mewn="" llwyd.="" defnyddir="" plot="" ma="" ar="" gyfer="" arddangos="" y="" genynnau="" a="" fynegir="" yn="" wahaniaethol="" yn="" calr="" plus="" plus="" vs="" calr="" (b):="" dosbarthiad="" prosesau="" biolegol="" y="" genynnau="" wedi'u="" dadreoleiddio="" yn="" calr/o'u="" cymharu="" â="" calr="" plus="" plus="" -.="" dosbarthwyd="" y="" genynnau="" a="" nodwyd="" gan="" ddefnyddio="" offeryn="" biowybodeg="" david.="" defnyddiwyd="" y="" symbol="" genyn="" i="" gategoreiddio'r="" anodiadau="" ontoleg="" genynnau,="" ee="" prosesau="" biolegol.="" (c):="" dadansoddiad="" cyfoethogi="" o'r="" genynnau="" uchaf="" y="" canfuwyd="" eu="" bod="" wedi'u="" rheoleiddio'n="" sylweddol="" rhwng="" y="" tri="" genoteip="" (calr="" plus="" plus="" ,="" calr="" plus="" a="" calr/).="" cynrychiolir="" y="" dadansoddiad="" cymharol="" fel="" map="" gwres="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Dosbarthiad Ontoleg Genynnau a Dadansoddiadau Rhwydwaith Rhyngweithio Protein-Protein

Dangosodd y plotiau llosgfynydd a'r dadansoddiadau siart cylch fod newid mynegiant Calr yn arwain at newidiadau byd-eang yn yr embryonigarenproteome (Ffigur Atodol S4). Er mwyn cael mwy o wybodaeth am y mecanweithiau biolegol sy'n gysylltiedig â'r embryonigarennewid datblygiad yn Calr / llygod, fe wnaethom gyfuno biowybodeg DAVID â gwybodaeth am swyddogaeth dybiedig y proteinau a geir yng nghronfeydd data UniProt a GenBank. Arweiniodd dosbarthiad y proteinau a nodwyd yn ôl eu cyfranogiad mewn prosesau biolegol at ugain categori, gyda naw categori a gynrychiolir yn uchel (Ffigur Atodol S4D). Un o'r prif gategorïau oedd y broses ddatblygiadol, gyda mwy na 1000 o'r proteinau a nodwyd yn perthyn i'r grŵp hwn. Gan mai rhyngweithiadau protein-protein yw'r mecanweithiau allweddol ar gyfer bron pob proses fiolegol gan gynnwys datblygiad, echdynnu gwybodaeth am ryngweithiadau protein-protein posibl a'r rheoliad llwybr sy'n cysylltu'r proteinau a reoleiddir yn Calr plus // a Calr/ embryonigarengallai ddarparu gwybodaeth sylweddol am y prosesau sydd wedi'u amharu o dan amodau diffyg Calr. At y diben hwn, gwnaethom ymchwilio i'r rhwydweithiau rhyngweithio rhwng y proteinau a reoleiddir gan ddefnyddio STRING 11.0 (http://string.embl.de, cyrchwyd ar 24 Mawrth 2021). Datgelodd dadansoddiad pellach o broteinau a fynegir yn Calr plus / plus a Calr plus // yn unig ddau nod rhyngweithio cryf o broteinau sy'n ymwneud â dwy brif broses, sef RNA-metaboledd a ffosfforyleiddiad ocsideiddiol (Ffigur Atodol S5A). Mae hyn yn awgrymu bod y Calr / embryonigarenyn dioddef o annormaledd mewn RNA-metaboledd a phrinder egni. Mae'r ymchwiliad i'r rhwydweithiau rhyngweithio rhwng y proteinau sy'n cael eu gorfynegi yn Calr plus / plus a Calr plus // o gymharu â Calr/ yn cefnogi'n gryf ein rhagdybiaethau oherwydd bod y rhwydweithiau'n dangos tri nod rhyngweithio cryf. Roedd dau o'r nodau'n cronni proteinau sy'n ymwneud â RNA-metaboledd a ffosfforyleiddiad ocsideiddiol, tra bod y trydydd nod yn cynnwys proteinau ribosomaidd a datgelodd aflonyddwch mewn ffurfiant ribosom a throsiant protein (Ffigur Atodol S5B). Dangosodd archwiliad manwl o’r proteinau ribosomaidd y canfuwyd eu bod yn cael eu rheoleiddio newid sylweddol mewn proteinau o is-unedau ribosomaidd mawr a bach a datgelodd hyn yr aflonyddwch difrifol mewn biogenesis ribosomaidd a synthesis protein (Ffigur 6A–D).

2.5. Calr Knockout yn arwain at Newid yn y Mynegiant Protein Ribosomaidd 

Dangosodd y dadansoddiadau data trawsgrifomig a phroteomig newid sylweddol yn y mynegiant o broteinau ribosomaidd yn embryonig Calr/ llygodarennau. Dadansoddiad blot gorllewinol a meintioliad MS o embryonigarenCadarnhaodd detholiadau protein o'r tri genoteip yr is-reoleiddio sylweddol o Rps10, Rps19, a Rps26arennau(Ffigur 7A) a Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17, a Rps19 (Ffigur Atodol S6A,B) yn Calr/ . Ar ben hynny, mae staenio embryonigarenroedd adrannau'n cadarnhau maint y newid yn y mynegiant o'r proteinau ribosomaidd; ni ellid canfod unrhyw Rps10 neu Rps6 yn Calr/ embryonigarenadrannau (Ffigur 7B). Er mwyn ymchwilio i'r cysylltiad rhwng cnocio Calr a mynegiant protein ribosomaidd, fe wnaethom sefydlu model cnocio Calr in vitro yn MDCKarennolcelloedd tiwbyn gan ddefnyddio system endonuclease CRISPR/cas9. Cadarnhaodd y dadansoddiadau blot gorllewinol is-reoleiddio dos-ddibynnol ar fynegiant Calr mewn celloedd MDCK a dangosodd ddiswyddiad sylweddol o broteinau amgodio is-uned ribosomaidd 40S Rps10 a Rps19, a ddatgelodd aflonyddwch mewn biogenesis ribosom. Ar ben hynny, datgelodd mynegiant cydrannau hanfodol ar gyfer y synthesis protein, ee, elongation, fod y ffactor cychwyn eEIF5a wedi gostwng yn sylweddol yng nghelloedd MDCK Calr knockout (Ffigur 7C). Roedd newidiadau morffolegol, proteomig a thrawsgrifomig sylweddol yn cyd-fynd â'r ymgyrch Calr. Amlygodd ein hymchwiliadau in vivo ac in vitro ymhellach fod yr aberrations hyn yn cyd-fynd â gostyngiad sylweddol mewn biogenesis ribosom. Y gostyngiad mewn mynegiant protein ribosomaidd yng nghynhyrchiad Calrarennid oedd yn gyfyngedig i gamau embryonig ond gellid ei ddangos hefyd mewn celloedd sy'n deillio o oedolynarennau, gan ddatgelu rôl bosibl Calr mewn biogenesis ribosomaidd.

Ffigur 7. Mae diffyg calr yn gysylltiedig ag is-reoleiddio mynegiant protein ribosomaidd. (A): Dadansoddiadau blot gorllewinol o broteinau ribosomaidd Rps10, Rps19, a Rps26 mewn darnau protein o Calr plus / plus , Calr plus // , a Calr // embryonigarennau. Cynaeafwyd arennau embryonig o dri gwahanol lygod Calr plus /- beichiog. Ar ôl genoteipio, cafodd embryonau o'r un fam a genoteip eu grwpio gyda'i gilydd a'u embryonigarenechdynion protein yn cael eu cyfuno gyda'i gilydd. Ar ôl amcangyfrif protein, perfformiwyd dadansoddiadau blotiau Gorllewinol yn driphlyg ar gyfer pob protein yr ymchwiliwyd iddo. Ar gyfer y dadansoddiad cymharol o'r samplau, defnyddiwyd ANOVA unffordd. Cyflwynir y canlyniadau fel y cymedr ±sd o o leiaf dri arbrawf annibynnol. Ystyriwyd gwahaniaethau yn ystadegol arwyddocaol pan p < 0.05.="" (b):="" staenio="" imiwnoflfluoroleuedd="" yn="" erbyn="" rps10="" a="" rps6="" yn="" adrannau="" calr="" plus="" plus="" a="" calr悆="" meinwe="" arennau="" embryonig="" gyda="" chwyddhad="" o="" 20="" ×.="" (c):="" dadansoddiad="" blot="" gorllewinol="" o="" echdyniad="" protein="" o="" gelloedd="" mdck="" (chwith)="" a="" meintioli="" mrna="" ar="" ôl="" i="" calr="" ddod="" i="" ben="" yng="" nghelloedd="" mdck="" (dde).="" cafodd="" calr="" ei="" fwrw="" allan="" gan="" ddefnyddio'r="" system="" crispr/cas9="" gyda="" dau="" sgrna="" gwahanol.="" archwiliwyd="" blotiau="" gorllewinol="" gyda="" gwrthgyrff="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19,="" ac="" eif5a.="" cyflawnwyd="" meintoliadau="" mrna="" calr="" a="" rps10="" yn="" y="" sampl="" sgcalr-2="" gan="" ddefnyddio="" qpcr.="" datgelodd="" is-reoleiddio="" calr="" gan="" ddefnyddio="" system="" crispr/cas9="" gysylltiad="" rhwng="" diffyg="" calr="" a="" newid="" mynegiant="" protein="" ribosomaidd.="" gwahaniaethau="" sylweddol:="" (**)="" p="">< 0.01,="" (***)="" p="">< 0.001,="" (****)="" p=""><>

3. Trafodaeth

Mae'rarennaudatblygu trwy ganghennog morffogenesis sy'n broses sy'n cynnwys prosesau twf a gwahaniaethu cymhleth ac sy'n cael ei yrru gan y signalau sy'n dod o'r celloedd cyfagos yn y compartment mesenchymal eginol [16]. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae nifer o enynnau a llwybrau allweddol i mewnarendatblygiadau wedi'u nodi. Mae'r ffactorau troffig, yn enwedig GDNF, proteinau morffogenetig esgyrn (BMPs), a ffactorau twf ffibroblast (FGFs) yn ymwneud âarennoltwf a gwahaniaethu. Maent yn llywodraethu'r signalau sy'n gysylltiedig â morffogenesis canghennog UB yn ogystal â chynnal a gwahaniaethu'r mesenchyme neffrogenig yn yr embryonig.aren[17]. Mae knockout Calr yn achosi angheuoldeb embryonig oherwydd datblygiad cardiaidd camweithredol [15]. Mae angen cynnydd yn y cytoplasmig Ca2 ynghyd â chrynodiad mewn cardiomyocytes arferol i yrru myofibrillogenesis cardiaidd. Mae'r newid anhepgor hwn yn y crynodiad Ca2 plws yn dibynnu ar Calr ac mae'n absennol o dan amodau diffyg Calr [18]. Nid yw rôl swyddogaethol yr hebryngwr ER a'r protein sy'n rhwymo calsiwm Calr mewn nephrogenesis wedi'i archwilio eto. Er mwyn ymchwilio i rôl bosibl Calr mewn embryonigarendatblygiad ac effaith diffyg Calr ar nephrogenesis, cynhaliwyd dadansoddiad trawsgrifomig a phroteomig cymharol. Ar y cyfan, arweiniodd diffyg Calr at arafu datblygiad yr arennau a newidiadau di-nod i'r trawsgrifiad a'r proteome. At hynny, datgelodd ein data fod diffyg Calr wedi sbarduno anhwylderau difrifol mewn llwybrau nephrogenesis wrth i newidiadau mynegiant sylweddol i broteinau allweddol signalau Wnt (ee, Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq, a Kremen2) gael eu nodi. Mae'r signalau anwythol rhwng yr epitheliwm blagur wreterig a mesenchyme metaneffrig yn cael ei reoleiddio'n bennaf gan signalau adborth Wnt [19,20]. Er bod Calr yn rhan fawr o homeostasis calsiwm cellog, ar yr un pryd mae'n warchodwr ER hanfodol ar gyfer plygu a masnachu glycoproteinau a phroteinau sy'n ymwneud â signalau celloedd a mynegiant genynnau [21]. Gallai taro Calr arwain at darfu ar blygu protein a straen ER, sy'n achosi aflonyddwch mewn peiriannau trosiadol. Gall hyn esbonio'r arafwch a welwyd yn natblygiad yr arennau mewn llygod homosygaidd.

Un o'r agweddau syndod a diddorol a amlygwyd gan ein data yw'r newid yn y mynegiant o broteinau ribosomaidd. Fe wnaethom ddangos disbyddiad bron yn llwyr o sawl protein yn yr is-unedau ribosomaidd 40S a 60S. At hynny, cadarnhaodd ein harbrofion in vitro y gydberthynas rhwng is-reoleiddio Calr a nam ar fynegiant protein ribosomaidd. Mae biogenesis ribosome wedi'i drefnu'n dda ac mae'n cael ei reoleiddio'n llym. Mae astudiaethau sy'n dod i'r amlwg wedi dangos bod y ribosom yn chwarae rhan bwysig nid yn unig mewn ffisioleg celloedd arferol ond hefyd mewn adwaith i ysgogiadau ac yn pathogenesis afiechydon. Ar ben hynny, mae biogenesis ribosome yn rheoli twf celloedd, ac mae'r amlder a'r newidiadau mewn ribosomau yn cael eu hadlewyrchu yn aberiad amlhau celloedd, arestio cylchred celloedd, apoptosis, ac amlygiad patholegol [22,23].

Yn ogystal â'u rôl mewn biogenesis ribosom, canfuwyd bod proteinau ribosomaidd yn arfer swyddogaethau ribosomaidd ychwanegol amrywiol, ee, mewn twf celloedd ac amlhau, mewn atgyweirio DNA, ac mewn gwahaniaethu a datblygiad cellog [24-31]. Roedd nam ar swyddogaethau protein ribosomaidd yn gysylltiedig ag anhwylder hematolegol a metabolig a gallai arwain at glefydau cardiofasgwlaidd a chanser [32-36]. Mae mwtaniad mewn genynnau sy'n codio ar gyfer proteinau ribosomaidd yn gysylltiedig ag annormaledd erythropoiesis sy'n arwain at syndromau clinigol, ee, anemia Diamond-Blackfan (DBA) [37] a syndrom 5q [38]. Mae mwtaniadau yn yr RPS10 yn gysylltiedig ag anemia Diamond-Blackfan ac mae gan 30 y cant o'r cleifion hyn bedol neu sigmoidarennau[39]. Yn ddiddorol, mae gan gleifion Diamond-Blackfan siawns uwch o ddatblygu syndrom myelodysplastig, sy'n gysylltiedig â threiglad genyn exon 9 Calr [40-42]. Mae'r ailfodelu hwn o'r peiriannau trosiadol yn achosi aberrations enfawr yn y broses ddatblygiadol ac yn effeithio nid yn unig ar y systemau wrogenital ond hefyd y systemau cylchrediad gwaed ac atgenhedlu, gan achosi marwoldeb embryonig yn y pen draw ar ddiffyg calreticulin. Datgelodd ein data biogenesis ribosom annifyr yn y Calr/ embryonigarenac amlygodd rôl sylweddol Calr mewn biogenesis protein. Credwn y byddai gwell dealltwriaeth o'r berthynas rhwng diffyg Calr a newid mynegiant protein ribosomaidd yn darparu mewnwelediadau newydd ar gyfer deall sut mae Calr yn effeithio ar fiogenesis ribosom ac embryonig.arendatblygu a chaniatáu safbwyntiau newydd ar y prosesau sy'n rheoli datblygiad organau.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Anifeiliaid

Cafwyd llygod sbwriel calreticulin heterozygous (Calr plus // ) a wildtype (Calr plus / plus ) o gefndiroedd genetig C57BL/6J union yr un fath gan yr Athro Marek Michalak, Prifysgol Alberta, Edmonton, Alberta, Canada. Cafodd llygod eu bridio o dan amodau tai penodol heb bathogenau a'u genoteipio fel y disgrifiwyd yn flaenorol yn Michalak et al. [15]. Ar gyfer ein hastudiaeth, aberthwyd llygod beichiog Calr plus // ar wahanol gamau o ddatblygiad embryonig (diwrnodau embryonig 13.5: E13.5; 14,5: E14.5; a 16.5: E16.5), cynaeafwyd yr embryonau, a chynaeafwyd yr embryonau.arennaueu dyrannu. Ar gyfer genoteipio, defnyddiwyd darn o gynffon yr embryo. Mae'rarennaueu paratoi ymhellach ar gyfer naill ai staenio histocemegol neu drawsgrifomeg neu ddadansoddiad proteomeg. Perfformiwyd yr holl weithdrefnau arbrofol yn unol â deddfwriaeth gofal anifeiliaid a moeseg yr Almaen (safonau NIH) ac fe'u cymeradwywyd gan Bwyllgor Moeseg lleol Canolfan Feddygol y Brifysgol Göttingen, yr Almaen (33.14-42502-04-11/0598).

BYDD CISTANCHE YN GWELLA POEN YN YR AREN/ARENIAD

4.2. Staeniad histocemegol

Ar gyfer staenio'r embryonig histolegolarennau, y excisedarennaueu gosod dros nos mewn hydoddiant fformaldehyd byffer o 4 y cant a'u mewnosod wedyn mewn blociau paraffin. Cafodd yr adrannau mewnosodedig paraffin eu dadbaraffinio a'u hailhydradu a'u staenio â hydoddiant hematoxylin Gill III a datrysiad eosin Y (Merck, Darmstadt, yr Almaen) yn ôl protocol y gwneuthurwr.

4.3. Diwylliant yr Arennau Embryonig yn yr Organ Ex-Vivo

Cynhaliwyd y diwylliant organ ex vivo yn ôl Davies et.al [43]. Cafodd llygod beichiog eu haberthu yng nghyfnod E13.5 o ddatblygiad embryonig, cynaeafwyd embryonau, a chafodd yarennaueu dyrannu. Ar ôl genoteipio, 6arencafodd elfennau o bob genoteip (Calr plus / plus , Calr plus // , a Calr/ ) eu platio ar bilen PET dryloyw gyda 0.4 µM maint mandwll (24 wel, BD Falcon). Gosodwyd y bilen mewn un ffynnon o blât 24 ffynnon, yn cynnwys 400 µLarencyfrwng diwylliant (KCM, DMEM, 10 y cant FCS anweithredol). Galluogodd hyn yareni gysylltu â'r cyfrwng heb ei foddi. O dan yr amodau hyn, roedd modd cadw'rarendiwylliedig ar 37 ◦C a 5 y cant CO2 am o leiaf 144 h.

4.4. Lliwio Fflworoleuedd Imiwno'r Arennau Diwylliedig a Dadansoddiad Imiwnohistolegol o Adrannau'r Arennau

Yr embryonigarennaueu diwyllio ex vivo am 72 h, wedi hynny, yarengosodwyd elfennau mewn methanol oer ar t 20 ◦C am 30 munud. Dilynwyd y cam gosod gan 3 cham golchi, pob un ohonynt am 5 munud yn PBS. Gwanhawyd y prif wrthgorff gwrth-laminin monoclonaidd cwningen gwrth-lamin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, UDA) yn PBS a'i ddeor ar 4 ◦C dros nos. Y diwylliedigarengolchwyd elfennau PBS am 4 awr ac ychwanegwyd yr gwrthgorff eilaidd (Molecular Probes Alexa Fluor 555 IgG gwrth-gwningen gafr (1:500)) dros nos ar 4 ◦C. Cafodd yr UB ei staenio gan ddefnyddio lectin Dolichos biflflorus agglutinin (DBA) am o leiaf 3 h. Wedi deori, yarennaueu golchi mewn PBS am 3 h a'u hymgorffori ar gyfer dadansoddiad microsgopig. Imiwneiddio embryonig wedi'i ddad-hydradu a'i ailhydraduarenPerfformiwyd adrannau i ganfod mynegiant a dosbarthiad nifer o broteinau. Cafodd yr adrannau eu trin â hydoddiant adalw antigen (asid citrig 1.8 µM a 8.2 µM citrad sodiwm) wedi'i gynhesu ymlaen llaw mewn stemar bwyd am 25 munud. Cafodd yr adrannau eu rhwystro â serwm gafr 10 y cant yn PBS am 1 awr wedi'i ddeor dros nos ar 4 ◦C gyda'r gwrthgyrff cynradd (Defnyddiwyd y gwrthgyrff sylfaenol canlynol: gwrth-Calbindin monoclonaidd cwningen-1, gwrth-Wt1, gwrth- Chwe2, gwrth-Pax2, gwrth-Calr (Abcam, Caergrawnt, y DU), cwningen monoclonaidd gwrth-Rps6, antiRps10 (Invitrogen), a cwningen monoclonaidd gwrth-Sod1 gwrthgorff (Abnova, Taipei, Taiwan) Mae'r gwrthgyrff cynradd canfod gyda fflworoleuedd gwrthgyrff eilaidd wedi'u labelu (Gwrthgorff IgG gwrth-lygoden gafr Alexa Fluor 555 a Alexa Fluor 555 gwrth-cwningen) am 1 h ar dymheredd yr ystafell. Ar gyfer rheolaethau negyddol, dim ond gyda'r gwrthgorff eilaidd y deorwyd adrannau meinwe. Cafodd y sleidiau eu gosod gyda gorchuddion slip mewn cyfrwng mowntio Vectashield gyda DAPI i wrth-staenio'r cnewyllyn (Vector Laboratories, Burlingame, CA, UDA).

4.5. Diwylliant Cell

Madin - Darby cwnaren(MDCK) cafwyd celloedd o American Type Culture Collection (ATCC) a'u lluosogi yn Modifified Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco, 10 y cant o serwm buchol ffetws (FBS), 1 y cant Penisilin / Streptomycin, ac 1 y cant L-Glutamin ar 37 ◦C mewn awyrgylch CO 5 y cant. Mae celloedd wedi'u meithrin mewn fflasgiau T25 ac yn cael eu hollti ddwywaith yr wythnos. Ar gyfer trosglwyddo celloedd, cafodd celloedd MDCK eu trypsineiddio am gyfnod byr o amser er mwyn osgoi newid strwythur celloedd.

4.6. Cynhyrchu Celloedd Knockout

Dyluniwyd y dilyniannau sgRNA o Calr (XM8622117) ar gyfer y rhywogaeth canis lupus gan ddefnyddio'r offeryn ar-lein BlueHeronBio (Origene, Herford, yr Almaen). Mewnosodwyd y dilyniant sgRNA 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 yn y plasmid pLenti-Cas-Guide (Addgene plasmids #3931646) gydag ensymau cyfyngu BamHI a BsmBI i gynhyrchu'r plenti-Cas9-Cadarnhawyd llun calr yn ddiweddarach gan ddilyniant Sanger. Er mwyn cnocio Carl mewn celloedd MDCK, perfformiwyd trawsnewidiad dros dro pLenti-Cas9-Calr. Un diwrnod cyn y trawsnewidiad, cafodd 200,000 o gelloedd/mL eu hadu mewn 6 phlât ffynnon gyda chyfrwng MEM. Cyn y trawsnewidiad, newidiwyd y cyfrwng diwylliant i gyfrwng Opti-MEM di-FCS. Defnyddiwyd Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, UDA) i drawsnewid y celloedd. Paratowyd cymysgedd DNA plasmid lipofectamine gydag OptiMEM yn seiliedig ar brotocol yr hyfforddwr. Ar gyfer trawsgludiad 6 plât ffynnon, ychwanegwyd 4 µg DNA plasmid at 250 µL Opti-MEM cyfrwng ar wahân a'i ddeor am 10 munud ar dymheredd ystafell. Yn dilyn hynny, ychwanegwyd y cymysgedd DNA at gymysgedd Lipofectamine 2000 a'i ddeor am 30 munud cyn ei ychwanegu at y celloedd. Aseswyd llwyddiant y trawsnewid gan ddefnyddio blot gorllewinol.

4.7. Dadansoddiad Trawsgrifiadol

Ar gyfer ymchwiliadau trawsgrifio, defnyddiwyd 3 llygod beichiog Calr a //. Cynaeafwyd embryonau (8–10/llygod beichiog) a'rarennauyn ynysig. Ar ôl genoteipio,arennauo'r un genoteip a'r un fam yn cael eu cyfuno a'u prosesu ar gyfer echdynnu RNA. Cafodd cyfanswm yr RNAs eu hynysu oddi wrth Calr plus / plus , Calr plus // , a Calr / embryonigarennaudefnyddio'r dull Trizol (Invitrogen) yn unol ag argymhellion y gwneuthurwr. Yna cafodd y samplau eu trin â DNAse I (Sigma) i gael gwared ar yr halogiad DNA. Canfuwyd ansawdd RNA gan ddefnyddio electrofforesis micro-hylif Agilent 21{{10}0 Biodadansoddwr (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, UDA). Ar gyfer dilyniannu, paratowyd y samplau RNA gan ddefnyddio'r "TruSeq RNA Sample Prep Kit" yn ôl protocol y gwneuthurwr (Illumina, San Diego, CA, UDA). Cynhaliwyd dilyniant darllen sengl (50 bp) gan ddefnyddio HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, UDA). Roedd y dilyniannau wedi'u halinio â dilyniant cyfeirio genom Muscullus (cynulliad genom Ensembl 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly.html, a gyrchwyd ar 24 Mawrth 2021) gan ddefnyddio'r aliniad STAR meddalwedd (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbour, USA) (fersiwn 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, cyrchwyd ar 24 Mawrth 2021) [44] gan ganiatáu ar gyfer 2 ddiffyg cyfatebiaeth o fewn 50 sylfaen. Defnyddiwyd pecyn SAMtools (fersiwn 0.1.18) a HTSeq (fersiwn 0.6.1p1) ar gyfer hidlo trawiadau unigryw a chyfrif [45,46]. Cafodd genynnau ymgeiswyr eu hidlo i o leiaf 2-newid plyg a gwerth-p wedi'i gywiro gan FDR < 0.05.="" perfformiwyd="" anodi="" genynnau="" gan="" ddefnyddio="" mus="" muscullus="" o="" ensembl="" v78="" (www.ensembl.org,="" cyrchwyd="" ar="" 1="" mawrth="" 2019)="" trwy'r="" pecyn="" biomart="" (fersiwn="" 2.24.0)="" [47].="" cynhaliwyd="" dadansoddiad="" cyfoethogi="" go="" ar="" gyfer="" genynnau="" ymgeiswyr="" gyda'r="" pecyn="" goseq="" (fersiwn="" 1.2)="" [48]="" gan="" ddefnyddio="" paramedrau="">

4.8. Lysis yr Arennau, Echdynnu Protein ac Electrofforesis Gel Dau Ddimensiwn (2-DE)

Ar gyfer electrofforesis gel 2D, defnyddiwyd embryonau o 6 Calr beichiog a // benywod (8-10 embryo / benyw). Ar gyfer echdynnu protein ar gyfer electrofforesis gel 2D (2-DE), mae'rarennauo embryonau yn yr un cyfnod embryonig ac o'r un genoteip a benyw (8-10 embryonau/benyw feichiog) wedi'u cyfuno, wedi'u tarfu â byffer lysis (9.5 M wrea, 2 y cant CHAPS (w/v), 2 y cant amffolytes (w). /v), 1 y cant DTT), a fortecs. Ar ôl ychwanegu byffer thelysis, deorwyd y samplau ar 4 ◦C am 30 munud. I gael gwared ar y malurion cell, cynhaliwyd centrifugation ar 13,000× g a 4 ◦C am 30 munud. Cafodd y supernatant ei rewigu yn ddiweddar am 30 munud ychwanegol ar 13,000× g a 4 ◦C i gael y purdeb mwyaf posibl. Casglwyd y supernatants a chafodd y pelenni eu taflu a defnyddiwyd y samplau canlyniadol ar unwaith neu eu storio ar -80 ◦C nes eu defnyddio. Er mwyn lleihau'r halogiad halen ac i gyfoethogi'r proteinau, perfformiwyd dyddodiad methanol-clorofform yn ôl Wessel a Flügge [49]. Cafodd y pelen ei sychu a'i hydoddi yn y byffer lysis. Pennwyd cyfanswm y crynodiad protein gan ddefnyddio'r assay protein Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA) yn ôl Bradford. Defnyddiwyd BSA (Sigma, Steinheim, yr Almaen) fel safon. Er mwyn gwarantu atgynhyrchu arbrofol, fe wnaethom gynhyrchu geliau triphlyg o bob unarenpwll. Cynhaliwyd y gwahaniad protein 2D fel y disgrifiwyd yn flaenorol [50]. Cafodd y 2-geliau DE eu staenio â staen gel fflwroleuol Flamingo (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Ar ôl staenio, cafodd y geliau eu sganio ar gydraniad 50 µm ar sganiwr Fuji FLA{-5100. Dadansoddwyd y delweddau digidol gan ddefnyddio Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, yr Almaen). Ar gyfer delweddu protein, cafodd y geliau 2-DE eu staenio hefyd dros nos gyda Coomassie glas colloidal, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, yr Almaen).

4.9. Dadansoddiad Sbectrometrig Màs ac Adnabod Proteinau

Cafodd smotiau a reoleiddir yn sylweddol eu tynnu allan o'r geliau a pherfformiwyd treuliad mewn-gel tryptig ac echdynnu peptidau fel y disgrifiwyd yn flaenorol gan Dihazi et al. [51]. Yn gryno, cafodd smotiau gel eu rinsio ddwywaith mewn amoniwm bicarbonad 25 mM (amBic) ac unwaith mewn dŵr, eu crebachu ag 100 y cant acetonitrile (ACN) am 15 munud, a'u sychu mewn SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) am 20–30 munud. Deorwyd pob smotiau ecseis gyda trypsin gradd dilyniannu 12.5 ng/µL (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) mewn 25 mM amBic dros nos ar 37 ◦C. Cyflawnwyd echdynnu peptidau ddwywaith gan ddefnyddio 50 y cant ACN / 1 y cant asid trifluoroacetig (TFA) yn gyntaf ac yna 100 y cant ACN. Cafodd yr holl ddetholiadau eu cronni a lleihawyd y cyfaint gan ddefnyddio SpeedVac. Bu peptidau tryptig yn destun dilyniant sbectrometrig màs gan ddefnyddio sbectromedr màs Q-TOF Ultima Global (Micromass, Manceinion, DU) â chwistrell ESI Z nanoflflow. Cyflawnwyd adnabod protein gyda'r peiriant chwilio Mascot yn erbyn cronfeydd data MSDB a Swissprot trwy ddefnyddio goddefgarwch màs peptid a goddefgarwch darn o 0.5 Da.

BYDD CISTANCHE YN GWELLA METHIANT YR AREN/ARENAU

4.10. Echdynnu Protein, SDS-TUDALEN, mewn Treuliad Tryptig Gel, a Dadansoddiadau Sbectrometrig Màs

Ar gyfer meintioliad sbectrometrig màs o'r newid protein yn y Calr/aren, cafodd y samplau o'r un genoteip a'r un fam eu cronni gyda'i gilydd. Er mwyn cynhyrchu digon o byllau ac i sicrhau atgynhyrchu biolegol ac arbrofol, defnyddiwyd 6 gwahanol Cal plus // beichiog gyda 8-10 embryon/llygod. Yr embryonigarennauo'r tri genoteip eu cynaeafu o'r embryonau a'r echdynnu protein yn cael ei wneud gan ddefnyddio'r byffer lysis fel y disgrifir uchod. Gwahanwyd echdynion protein gan SDS-PAGE, cafodd y geliau eu staenio â Coomassie Blue, cafodd pob lôn ei thynnu allan a'i thorri'n 20 sleisen o faint cyfartal, a sleisys yn destun treuliad mewn-gel gyda trypsin. Ar gyfer dadansoddiad sbectrometrig màs, cyfoethogwyd samplau ar rag-golofn cam-C18 hunan-bacio wedi'i wrthdroi (0.15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11} }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, yr Almaen) a'i wahanu ar golofn cam-C18 dadansoddol wedi'i gwrthdroi (0.075 mm ID × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, Dr. Maisch) gan ddefnyddio graddiant llinol 30 munud o 5-35 y cant acetonitrile/0.1 y cant asid ffurfig (v:v) ar 300 nl munud-1). Dadansoddwyd yr eluent ar sbectromedr màs pedwarpol/orbitrap hybrid Q Exactive (ThermoFisher Scientific, Dreieich, yr Almaen) a oedd â ffynhonnell nanoSpray FlexIon ac a weithredwyd o dan feddalwedd Excalibur 2.4 gan ddefnyddio dull caffael sy'n dibynnu ar ddata. Roedd pob cylch arbrofol ar y ffurf ganlynol: cafwyd un sgan MS llawn ar draws yr ystod 350–1600 m/z ar osod cydraniad o 70,000 targed FWHM ac AGC o 106 ac uchafswm amser llenwi o 60 ms . Yna cafodd hyd at y 12 rhagflaenydd peptid mwyaf helaeth o daleithiau gwefr o 2 i 5 uwchlaw trothwy dwyster 2 × 104 eu hynysu'n ddilyniannol ar led ynysu 2.0 FWHM, wedi'i dameidio â nitrogen mewn gosodiad ynni gwrthdrawiad normaleiddio o 25 y cant a'r sbectra ïon cynnyrch canlyniadol. wedi'i gofnodi mewn gosodiad datrysiad o 17,500 FWHM ac roedd targed AGC o 2 × 105 ac uchafswm amser llenwi o 60 ms. Yna cafodd y gwerthoedd m/z rhagflaenol a ddewiswyd eu heithrio ar gyfer y 15 s canlynol. Cafwyd dau atgynhyrchiad technegol fesul sampl. Tynnwyd rhestrau brig o'r data crai gan ddefnyddio meddalwedd Raw2MSMS v1.17 (Max Planck Institute for Biochemistry, Martinsried, yr Almaen). Llwyddwyd i ganfod protein gan ddefnyddio meddalwedd MASCOT 2.5.1 (Matrixscience, London, UK). Nodwyd proteinau yn erbyn proteome cyfeirnod llygoden UniProtKB v2017.09 (16930 o gofnodion protein) ynghyd â set o 51 o halogion a nodir yn gyffredin yn ein labordy. Perfformiwyd y chwiliad gyda trypsin fel yr ensym ac iodoacetamid fel yr asiant blocio cystein. Caniatawyd hyd at ddau holltiad tryptig a fethwyd ac ocsidiad methionin fel addasiad amrywiol. Gosodwyd goddefiannau chwilio i 10 ppm ar gyfer y màs rhagflaenol a 0.05 Da ar gyfer y masau darnau a nodwyd ESI-QUAD-TOF fel y math o offeryn. Defnyddiwyd fersiwn meddalwedd sgaffald 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, UDA) i ddilysu dulliau adnabod peptid a phrotein yn seiliedig ar MS/MS. Derbyniwyd adnabyddiaeth peptid pe gellid eu sefydlu ar debygolrwydd o fwy na 95.0 y cant gan yr algorithm Percolator. Cafodd adnabyddiaeth protein ei gwtogi i gyfradd darganfod ffug o 1 y cant ar o leiaf 2 peptid a nodwyd yn hyderus. Cafodd trawiadau protein a oedd yn cynnwys peptidau tebyg ac, ymhellach, na ellid eu gwahaniaethu ar sail dadansoddiad MS/MS yn unig eu grwpio i fodloni egwyddorion parsimony. Cafodd proteinau sy'n rhannu tystiolaeth peptid sylweddol eu grwpio'n glystyrau. Amcangyfrifwyd helaethrwydd protein yn ôl eu Cyfrif Sbectrol yn dilyn normaleiddio cyfanswm symiau rhwng yr holl atgynhyrchiadau.

4.11. Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol

Perfformiwyd dadansoddiadau blot gorllewinol yn ôl Towbin et al. [52]. Cafodd symiau cyfartal o broteinau (50–75 µg) eu gwahanu gan electrofforesis gel polyacrylamid (SDS-PAGE) a'u trosglwyddo ar bilenni nitrocellulose (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Cafodd y pilenni eu rhwystro mewn 5 y cant o laeth sych di-fraster mewn byffer TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4 150 mM NaCl 0.1 y cant Tween 20) a'u deor â gwrthgyrff cynradd (gwrth-Calr, gwrth -Rps10, gwrth-Rps19, gwrth-Rps26, a gwrth-eIF5A) dros nos yn 4 ◦C. Er mwyn delweddu'r bandiau protein, defnyddiwyd gwrthgyrff eilaidd wedi'u labelu â fflworoleuedd. Er mwyn cadarnhau llwytho protein cyfartal, cafodd y blots eu trin â gwrthgyrff gwrth-Actb neu gwrth-GAPDH (Sigma, Taufkirchen, yr Almaen).

4.12. Biowybodeg

Dosbarthwyd y proteinau a nodwyd yn ôl eu swyddogaethau hysbys a rhagdybiedig yn bennaf gan ddefnyddio biowybodeg DAVID (http://david.abcc. ncifcrf.gov, a gyrchwyd ar 21 Chwefror 2019) [53,54]. Defnyddiwyd symbolau genynnau i ymchwilio a chategoreiddio'r anodiadau ontoleg genynnau (GO) (prosesau biolegol a ffwythiannau moleciwlaidd). Perfformiwyd dadansoddiad rhwydwaith o ryngweithiadau protein-protein hysbys a rhagfynegedig o'r proteinau a nodwyd gan ddefnyddio STRING (offeryn chwilio ar gyfer Adalw Genynnau / Proteinau Rhyngweithiol) [55].

4.13. Dadansoddiad Ystadegol

Ar gyfer {{0}}DE, dadansoddwyd y delweddau digidol a pherfformiwyd paru sbot ar draws geliau a normaleiddio gan ddefnyddio Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, yr Almaen). Mae Delta2D yn cyfrifo gwerth "ansawdd sbot" ar gyfer pob man a ganfyddir. Mae'r gwerth hwn yn dangos pa mor agos y mae smotyn yn cynrychioli siâp cloch Gaussian 3D "delfrydol". Yn seiliedig ar gymhareb gyfartalog sbot-gyfaint, ystyriwyd bod smotiau y newidiwyd eu mynegiant cymharol o leiaf 2-plyg (cynnydd neu ostyngiad) mewn triphlyg rhwng y samplau a gymharwyd yn arwyddocaol. Er mwyn dadansoddi arwyddocâd rheoleiddio protein, cynhaliwyd prawf-t Myfyriwr a thybiwyd arwyddocâd ystadegol ar gyfer gwerthoedd P llai na 0.05. Cafodd yr holl flotiau eu meintoli gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ. Casglwyd y data gyda'r pecyn meddalwedd GraphPad Prism, fersiwn 8 (San Diego, CA, UDA). Defnyddiwyd y feddalwedd ar gyfer cyflwyno a dadansoddi graffigol naill ai gan ddosbarthiad-t y Myfyriwr neu ANOVA unffordd. Cyflwynir y canlyniadau fel y cymedr ±sd o o leiaf dri arbrawf annibynnol. Ystyriwyd bod gwahaniaethau yn ystadegol arwyddocaol pan oedd p < 0.05.="" cafodd="" awgrymiadau="" blagur="" wreterig="" a="" neffronau="" eu="" cyfrif="" â="" llaw="" a="" chasglwyd="" y="" data="" gyda'r="" pecyn="" meddalwedd="" graphpad="" prism,="" fersiwn="">