Mae Cistanche Deserticola Polysacarid yn Ysgogi Melanogenesis mewn Melanocytes, Yn Lleihau Straen Ocsidiol Ac yn Hyrwyddo Gwyno

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yibo Hu1|Jinhua Huang1|Yixiao Li2|Ling Jiang1|Yujie Ouyang1|Lun Yang1|Xiaojiao Zhao1|Lihua Huang3|Hong Xiang3|Jing Chen1 Qinghai Zeng1

Haniaethol

Fel prif ran anhwylderau pigmentiad, mae clefydau depigmentation croen fel fitiligo a naevus achromig yn gyffredin iawn ac yn cael mwy o sylw nawr. Mae pathogenesis depigmentation yn cynnwys camweithrediad a cholled melanocyte, a achosir o bosibl gan etifeddiaeth, hunanimiwnedd, astraen ocsideiddiols. Yn eu plith, mae straen ocsideiddiol yn chwarae rhan allweddol; fodd bynnag, ychydig o driniaethau clinigol sy'n gallu delio â straen ocsideiddiol. Fel yr adroddwyd,Cistanche deserticola polysacarid(CDP) yn gwrthocsidiol effeithiol; yn seiliedig ar hynny, gwerthuswyd ei rôl mewn melanocytes a datgelwyd y mecanweithiau ymhellach. Yn yr astudiaeth hon, canfuom y gallai CDP hyrwyddomelanogenesismewn melanocytes epidermaidd dynol (HEMs) a chelloedd melanoma B16F10 llygoden, mae hefyd yn achosi pigmentiad mewn pysgod sebra. Ar ben hynny,CDPgallai actifadu llwybr signal kinase protein-activated mitogen (MAPK), yna uwch-reoleiddio mynegiant ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia (MITF) a genynnau i lawr yr afon TYR, TRP1, TRP2, a RAB27A. Fel arall, canfuom y gallai CDP wanhau sytowenwyndra a achosir gan H2O ac apoptosis mewn melanocytes. Datgelodd tystiolaeth bellach y gallai CDP wella llwybr gwrthocsidiol NRF2/HO-1 a chwilio am ROS mewngellol. I grynhoi, gall CDP hyrwyddomelanogenesisac atal melanocytes rhagocsidiolstraenanaf, sy'n awgrymu bod CDP yn helpu i gynnal statws arferol melanocytes. Felly,CDPgall fod yn gyffur newydd ar gyfer trin clefydau depigmentation.

GEIRIAU ALLWEDDOL

Cistanche deserticola polysacarid, clefyd depigmentation, melanocyte, melanogenesis, NRF2, straen ocsideiddiol

ffresCistanche

1|RHAGARWEINIAD

Nodweddir clefydau dadrithio'r croen, megis fitiligo a naevus achromig, gan ddadbigmentu croen anghyson neu helaeth.1 Er mai anaml y mae briwiau croen yn achosi anaf corfforol difrifol, maent yn effeithio ar olwg claf ac yn creu baich seicolegol difrifol, hyd yn oed anhwylderau iechyd meddwl.2 Y mae newidiadau patholegol mawr mewn debigmentiad yn cynnwys camweithrediad a cholled melanocyte, sy'n effeithio'n fawr ar synthesis a chludiant melanin,3 gan arwain at gronni melanin annigonol yn y croen.

Nid yw'r mecanweithiau sy'n ymwneud â debigmentu yn hysbys ar hyn o bryd, ond mae astudiaethau wedi nodi rhai ffactorau cysylltiedig. Ar y naill law, mae swyddogaeth melanocyte yn dibynnu'n rhannol ar ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia (MITF), sy'n adnabyddus am hyrwyddo mynegiantmelanogenesisgenynnau cysylltiedig gan gynnwys tyrosinase (TYR), protein sy'n gysylltiedig â thyrosinase 1 (TRP1), protein sy'n gysylltiedig â tyrosinase 2 (TRP2), protein sy'n gysylltiedig â ras Rab-27a (RAB27A) a phrotein bwndelu fascin actin 1 (FSCN1 ).4 Ymhlith y genynnau hyn, mae TYR yn chwarae rhan allweddol mewn synthesis melanin trwy ocsideiddio l-dopa yn dopaquinone.5 Ar y llaw arall, mae astudiaethau'n awgrymu cyfuniad o sawl ffactor a allai fod yn gyfrifol am golli melanocytes, gan gynnwys etifeddeg, amgylchedd, awtoimiwnedd , astraen ocsideiddiol.6-9 Ymysg y ffactorau hyn, straen ocsideiddiol sy'n cael ei ystyried fel y pwysicaf.

Mae'r mecanweithiau ostraen ocsideiddiolyn achosi debigmentation wedi cael eu datgelu yn rhannol; Mae gorlwytho rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn un ffactor allweddol.10 Mae gorlwytho ROS mewn debigmentu yn golygu diffyg cydbwysedd rhwng y systemau pro-a gwrthocsidiol.11 Mae un o'r elfennau sy'n cymryd rhan yn yr anghydbwysedd hwn yn ymwneud â ffactor niwclear erythroid 2- ffactor 2/elfen ymateb gwrthocsidiol (NRF2/ARE) nam ar y llwybr gwrthocsidiol.12 Mae'r llwybr yn cynnwys NRF2 ac ensymau gwrthocsidiol megis heme oxygenase-1 (HMOX-1, HO{-1) , catalase (CAT), glutathione peroxidase 1 (GPX1), a NAD(P) H quinone dehydrogenase 1 (NQO1).13 Pan fydd melanocytes yn agored i ROS gormodol, gall NRF2 drawsleoli i'r cnewyllyn a rhwymo i'r ARE cadw, yna hyrwyddo mynegiant ensymau gwrthocsidiol. Fodd bynnag, mewn rhai clefydau depigmentation, megis fitiligo, ni all llwybr gwrthocsidiol NRF2/ARE â nam yn effeithiol ysbeilio ROS.14

Mae therapïau clinigol a ddefnyddir yn gyffredin mewn debigmentu yn cynnwys corticosteroidau argroenol neu systemig, atalyddion calsinwrin, band cul uwchfioled B (NBUVB; 311 nm), golau excimer 308-nm, trawsblaniad epidermaidd awtologaidd, a therapi meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol (TCM). Gall atalyddion corticosteroidau ac atalyddion calsinwrin leihau actifadu imiwnedd annormal,15 tra bod ffototherapies yn cael eu defnyddio fel triniaeth llinell gyntaf; yn benodol, mae NBUVB yn ysgogi amlhau melanocyte a dinistrio celloedd T,16 tra bod golau excimer 308-nm yn achosi apoptosis celloedd T.17 Yn ogystal, mae effeithiau therapïau TCM yn gysylltiedig â hyrwyddomelanogenesis.18 I raddau, mae'r dulliau hyn yn ddefnyddiol ar gyfer gwella debigmentu, ond mae rheoli dilyniant clefydau yn parhau i fod yn heriol. Mae angen datblygu therapïau newydd, yn enwedig ar gyferstraen ocsideiddiol, a esgeuluswyd o'r blaen.

Gelwir Cistanche deserticola yn 'ginseng anialwch'.19 Mae ei gydrannau'n ddefnyddiol mewn anaf i'r afu a achosir gan ethanol a hyperplasia llid y coluddion; gellir ei ddefnyddio hefyd fel adweithydd gwrth-blinder, gwrthlidiol a gwrth-tiwmor.20-22 Yn ddiweddar, adroddodd Guo et al fodCistanche deserticola polysacarid(CDP), un o'i brif gydrannau, yn meddu ar weithgaredd gwrthocsidiol a hepatoprotective20; nododd dwy astudiaeth arall ei rôl o ran diogelu celloedd rhag astraen ocsideiddiolanaf mewn amddifadedd ocsigen-glwcos/atlifiad ac osteoporosis.23,24 Fodd bynnag, nid yw rôl CDP mewn clefydau debigmentu wedi'i egluro. Yma, ein nod oedd cadarnhau aCDPgallai effeithiomelanogenesisac amddiffyn melanocytes rhag straen ocsideiddiol.

2|DEUNYDD A DULLIAU

2.1|Cemegau a gwrthgyrff

Cistanche deserticola polysacarid(CDP) ac l-dopa eu prynu gan Yuanye Biotec (purdeb Mwy na neu'n hafal i 98 y cant; Shanghai, Tsieina). Hydrogen perocsid (H2O2), dimethyl sylffocsid (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-bromid deuphenyltetrazolium ( MTT), a Phecyn Canfod Apoptosis V-FITC Annexin eu prynu gan Sigma-Aldrich. Prynwyd paraformaldehyd 4 y cant o Biosharp (Hefei, Tsieina); a Phrynwyd Pecyn Lliwio Immunofluorescence (Alexa Fluor 488) a 2,7-dichlorofluorescein-diasetad (DCFH-DA) gan Beyotime Biotec (Shanghai, Tsieina). Prynwyd Pecyn Stain Fontana-Masson a Phecyn Echdynnu Protein Niwcleoplasmig gan Sloarbio (Beijing, Tsieina). Prynwyd atodiad twf melanocyte dynol (HMGS), cyfrwng Eagle addasedig Dulbecco (DMEM), a chyfrwng 254 gan Gibco. Prynwyd serwm buchol ffetws (FBS) gan BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). Prynwyd gwrthgyrff cynradd ar gyfer -actin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, t38, p-p38, NRF2, a HO-1 gan Cell Signaling Technology, sef prif prynwyd gwrthgorff ar gyfer MITF o Labordy St John's, prynwyd gwrthgorff sylfaenol ar gyfer p-MITF gan Affinity Biosciences, prynwyd gwrthgorff sylfaenol ar gyfer GAPDH gan Bioworld, a phrynwyd gwrthgorff sylfaenol ar gyfer TRP1 gan EMD Millipore.

2.2|Meithriniad celloedd a thriniaeth

Cafodd celloedd melanoma B16F10 y llygoden eu meithrin mewn DMEM canolig wedi'u hategu â chymysgedd gwrth-fiotig 10 y cant FBS ac 1 y cant penisilin-streptomycin. Cafodd melanocytes epidermaidd dynol (HEMs) eu gwahanu oddi wrth flaengroen dynol (cyfeiriwch at ein hastudiaeth flaenorol25) a'u meithrin mewn cyfrwng 254 wedi'u hategu gan HMGS, 5 y cant FBS, ac 1 y cant o gymysgedd gwrthfiotig penisilin-streptomycin. Cafodd yr holl gelloedd eu meithrin mewn deorydd gwlyb ar 37 gradd gyda 5 y cant o CO2. Diddymwyd CDP yn DMSO a'i wanhau gyda'r cyfrwng cyn ei ddefnyddio, roedd crynodiad terfynol DMSO yn is na 0.1 y cant. Cafodd H2O2 ei wanhau gyda'r cyfrwng cyn ei ddefnyddio.

2.3|Trin a thrin pysgod sebra

Prynwyd yr embryonau pysgod sebra a chyfrwng oddi wrth EzeRinka Biotech. Cymeradwywyd y protocol arbrofol gan Bwyllgor Moeseg Prifysgol Canolbarth y De. Cafodd y pysgod sebra eu meithrin mewn 12-blatiau ffynnon ar 37 gradd i ffwrdd o olau a'u trin â chrynodiadau gwahanol o CDP. Defnyddiwyd microsgop gwrthdro i arsylwi a chofnodi'r melaninau ym mhennau a chynffonau'r pysgod sebra bob dydd. Ar ôl arsylwi, fe wnaethom newid y cyfrwng ac ail-ychwanegu'rCDP. Mesurwyd y dwysedd melanin yng nghynffonau pysgod sebra gyda Delwedd J, a chyflwynir y gwerthoedd fel dwyseddau optegol integredig (IOD).

2.4|Hyfywedd cell

Mesurwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio assay MTT. Ymchwilio i sytowenwyndraCDPMewnblannwyd celloedd , HEMs a B16F10 i 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 2 × 103 o gelloedd/ffynnon a'u meithrin nes bod y celloedd wedi'u cysylltu â phlatiau. Yna cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol (0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 a 320 ug/mL) oCDPam 24, 48 neu 72 awr. Cyn y mesuriad, ychwanegwyd 20 μL o MTT at bob ffynnon a deorwyd y platiau ar 37 gradd am 4 awr. Ar ôl hynny, rydym yn taflu'r supernatant ac yn ychwanegu 160 μL o DMSO at bob ffynnon i hydoddi'r crisialau formazan. Mesurwyd y gwerth amsugnedd ar 490 nm gan ddarllenydd plât amlfodd (PerkinElmer). Er mwyn ymchwilio i effaith CDP yn y cyflwr sytowenwyndra a achosir gan H2O, gosodwyd celloedd HEM, a B16F10 mewn 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 4 × 103 o gelloedd/ffynnon. Cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol oCDP({{0}}, 20, 40, neu 80 ug/mL) am 24 awr, ac ar yr adeg honno fe wnaethom ychwanegu H2O2 (crynodiadau terfynol: 500 μm ar gyfer HEMs a 1.0 mm ar gyfer celloedd B16F10) at bob ffynnon a deor y celloedd am 24 awr arall. Fe wnaethom sefydlu grwpiau rheoli negyddol (NC) a driniwyd gan CDP. Roedd y camau canfod yr un fath â'r rhai a ddisgrifiwyd yn flaenorol.

2.5|Assay NaOH o gynnwys melanin

Cafodd y celloedd eu meithrin mewn 100-mm dysglau petri a'u trin â nhwCDPmewn crynodiadau gwahanol (0, 20, 40, ac 80 ug/mL) am 48 awr, yna'n cael eu treulio â trypsin a'u casglu mewn tiwbiau 1.5-mL. Fe wnaethon ni olchi'r celloedd ddwywaith gyda dŵr distyll dwbl, eu haildynnu mewn ethanol 1 ml a'u vortexio i ryddhau'r melanin. Yna fe wnaethom allgyrchu (200 g, 5 munud) y cymysgedd a thaflu'r supernatant, ychwanegu 1 ml o 10 y cant DMSO (wedi'i wanhau â hydoddiant 1 mm NaOH) i mewn i bob tiwb ac atal y gwaddod. Rydym yn deor yr ataliad mewn baddon dŵr ar 80 gradd am 1 awr i doddi'r melanin. Yn olaf, fe wnaethom drosglwyddo 200 μL o'r hylif i blât ffynnon 96- a defnyddio darllenydd plât amlfodd i fesur y gwerth amsugnedd ar 470 nm.

Cistancheadolygiadau: yn atalmelanincynhyrchu.

2.6|Mesuriadau gweithgaredd tyrosinase

Cafodd y celloedd eu meithrin mewn 100-mm dysglau Petri a'u trin â nhwCDPcyn ei fesur, ei dreulio â trypsin a'i gasglu mewn tiwbiau 1.5-ml, a'i olchi ddwywaith â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS). Fe symudon ni 106 cell o bob sampl i diwb newydd a thaflu'r uwchnatur ar ôl y centrifugio, yna ychwanegu 1 ml 0.5 y cant Triton X-100 i belen y gell a storio'r cymysgedd ar 0 gradd am 15 munud. Wedi hynny, fe wnaethom ychwanegu 1 mL o l-dopa (1 mm, wedi'i wanhau â 0.1 M byffer ffosffad) fel y swbstrad a chymysgu'r hydoddiant, symud 200 μL o'r cymysgedd i 5-. {16}}plât ffynnon ar unwaith, a mesurodd y gwerth amsugnedd (A0) ar 475 nm gan ddefnyddio darllenydd plât amlfodd, gan ailadrodd y mesuriad ar 10 munud (A10). Cyfrifwyd y gweithgaredd tyrosinase gan (A{10-A0)/105, a mynegir y canlyniadau fel canran (y cant ) yn erbyn y rheolaeth negyddol.

2.7|staenio melanin Fontana-Masson

Cafodd y celloedd eu meithrin mewn 12-platiau ffynnon nes cyrraedd dwysedd o 50 y cant. Ar ôl y driniaeth, gosodwyd y celloedd â 4 y cant o baraformaldehyde niwtral am 30 munud a'u golchi â dŵr distyll. Yna fe wnaethom ychwanegu 500 μL Fontana hydoddiant amonia-arian i bob ffynnon a storio'r platiau yn y tywyllwch am 16 awr i liwio'r melanin. Nesaf, rydym yn golchi'r celloedd â dŵr distyll bum gwaith (1 munud bob tro) a'u socian mewn 500 μL hyposulphite am 5 munud; yn olaf, rydym yn tynnu'r hyposulphite a rinsio'r celloedd eto gyda dŵr distyll am 1 munud. Yna defnyddiwyd microsgop gwrthdro i arsylwi a chofnodi'r melaninau.

2.8|Echdynnu RNA ac adwaith cadwynol trawsgrifio-polymerase meintiol

Cafodd y celloedd eu meithrin mewn 6-platiau ffynnon. Ar ôl y driniaeth, cafodd y celloedd eu treulio â thrypsin a'u casglu mewn tiwbiau 1.5-mL. Fe wnaethom olchi'r celloedd ddwywaith gyda PBS, yna ychwanegu 1 ml o glustogiad lysis i mewn, vortexed y cymysgedd, a gosod y tiwbiau ar rew am 5 munud i lyse'r celloedd yn gyfan gwbl. Echdynnwyd yr RNA gan ddefnyddio Total RNA Kit (Omega Bio-Tek) a'i drawsgrifio'n ôl (RT) gan ddefnyddio ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Perfformiwyd adwaith cadwynol trawsgrifio-polymerase meintiol (PCR) gan ddefnyddio KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Cyfaint adwaith y cymysgedd RT oedd 20 μL, tra bod cyfaint adwaith cymysgedd PCR yn 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, primer R 1 μL, ychwanegu DEPC H2O i 20 μL ). Cynhaliwyd yr arbrofion yn unol â'r protocolau. Rhestrir dilyniannau'r paent preimio yn Nhabl S1.

2.9|Echdynnu protein a blotio Gorllewinol/imiwn-fflworoleuedd

Cafodd y celloedd eu meithrin mewn dysglau Petri 100-mm. Ar ôl y driniaeth, cafodd y celloedd eu treulio â thrypsin a'u casglu mewn tiwbiau 1.5-mL. Fe wnaethom olchi'r celloedd ddwywaith gyda PBS, yna ychwanegu 500 μL o glustogfa lysis RIPA (Thermo Fisher) wedi'i ategu â fflworid ffenylmethylsulpho- nyl 1 mm (Thermo Fisher) a 1:100 coctel atalydd ffosffatas gwanedig (Roche). Echdynnwyd y protein niwclear a cytoplasm gan ddefnyddio'r Pecyn Echdynnu Protein Niwcleoplasmig yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Rhoesom y tiwbiau ar rew am 30 munud a'u vortexio bob 5 munud i lysio'r celloedd yn llwyr. Fe wnaethon ni allgyrchu'r celloedd (200 g, 4 gradd, 15 munud), symud y supernatant i diwb newydd, a mesur crynodiad cyfanswm y protein gan ddefnyddio pecyn profi protein BCA (KeyGEN Biotec). Fe wnaethon ni ferwi'r proteinau gyda byffer llwytho 5 × (Beyotime Biotec, Tsieina) ar 100 gradd am 10 munud, yna eu storio ar −80 gradd. Defnyddiwyd dull electrofforesis gel polyacrylamid (TUDALEN) yn blotio Gorllewinol, a gwahanwyd 20 ug o brotein pob grŵp a'i drosglwyddo i bilen fflworid polyvinylidene. Ar ôl blocio antigen, gwnaethom ddeor y bilen mewn gwrthgorff cynradd gwanedig 1:1000 am 16 awr ar 4 gradd, yna golchi'r bilen gyda PBST a'i deor mewn gwrthgorff eilaidd fflwroleuol gwanedig 1:{{10 000 am 1 awr ar 37 gradd. . Canfuwyd dwyster y fflworoleuedd gan ddefnyddio System Delweddu CLx Odyssey (LI-COR). Perfformiwyd Immunofluorescence gan ddefnyddio Pecyn Lliwio Immunofluorescence (Alexa Fluor 488) gyda gwanhad 1:100 o'r gwrthgorff cynradd.

cistanche reddit

2.10|Mesur apoptosis celloedd

Cafodd y celloedd eu meithrin mewn {{0}} dysglau Petri mm a'u trin â chrynodiadau gwahanol (0, 20, 40, a 80 ug/mL) oCDPam 24 awr, ac ychwanegwyd H2O2 (crynodiad terfynol: 500 μm ar gyfer HEMs, 1.0 mm ar gyfer celloedd B16F10) i bob ffynnon a'i ddeor am 24 awr arall. Fe wnaethom hefyd sefydlu grwpiau wedi'u trin gan CDP a grwpiau CC. Ar ôl triniaeth, fe wnaethom dreulio'r celloedd â thrypsin heb EDTA a'u casglu mewn tiwbiau, yna golchi'r celloedd ddwywaith gyda PBS a'u hailddarparu mewn 100 μL o PBS. Cafodd y celloedd eu staenio â Phecyn Canfod Apoptosis V-FITC Annexin yn unol â'r protocol a'i ganfod gan sytometreg llif (FCM). Defnyddiwyd meddalwedd FlowJo i ddadansoddi'r gyfradd apoptosis.

2.11|Mesur ROS mewngellol

Cafodd y celloedd eu meithrin mewn {{0}}blatiau ffynnon a'u trin â chrynodiadau gwahanol (0, 20, 40, ac 80 ug/mL) oCDPam 24 awr, ac fe wnaethom ychwanegu H2O2 (crynodiadau terfynol: 50 0 μm ar gyfer HEMs, 1.0 mm ar gyfer celloedd B16F10) at bob ffynnon, eu deor am 24 awr arall a sefydlu grwpiau CDP wedi'u trin a grwpiau NC. Ar ôl triniaeth, fe wnaethom olchi celloedd ddwywaith gyda PBS i gael gwared ar yr holl gyfrwng a FBS, yna gwanhau'r stiliwr DCFH-DA i 1:1000 gyda chyfrwng a'i ychwanegu at bob ffynnon. Fe wnaethon ni ddeor y celloedd ar 37 gradd am 30 munud a'u golchi deirgwaith gyda chyfrwng di-serwm. Defnyddiasom anmicrosgop fflworoleuedd gwrthdro i arsylwi a chofnodi'r fflworoleuedd, yna defnyddiwyd ImageJ i fesur dwyster fflworoleuedd.

2.12|Ystadegau a dadansoddi

Cyflwynir y data yn y gwaith hwn fel cymedrig ± gwyriad safonol (SD), a pherfformiwyd y dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio GraphPad Prism (fersiwn 7.0) neu SPSS (fersiwn 22.0), a Student's Defnyddiwyd prawf-t neu ddadansoddiad unffordd o amrywiant (ANOVA) ar gyfer cymariaethau grŵp lluosog. Cafodd gwerth llwyd y bandiau protein WB ei safoni gyda GAPDH neu -actin. Ystyriwyd gwerthoedd P < .05="" yn="" arwyddocaol.="" ailadroddwyd="" pob="" arbrawf="" o="" leiaf="" dair="">

3|CANLYNIADAU

3.1|Melanogenesis a achosir gan CDP mewn celloedd HEM a B16F10

Cyn i ni ddechrau, gwnaethom ddefnyddio'r assay MTT i ymchwilio i sytowenwyndra posibl CDP ar gelloedd HEM a melanoma llygoden B16F10. Cafodd y celloedd eu trin âCDPmewn crynodiadau gwahanol am 24, 48, neu 72 awr. Dangosodd profion hyfywedd HEM, pan oedd y crynodiadau yn is na 320 ug/mL, nad oedd gan CDP unrhyw ddylanwad ar hyfywedd celloedd; fodd bynnag, gostyngodd y hyfywedd yn sylweddol wrth i'r crynodiad gyrraedd 320 ug/mL ar 24, 48, a 72 awr (P < .05;="" ffigur="" 1a).="" gostyngodd="" hyfywedd="" celloedd="" b16f10="" hefyd="" ar="" 48="" a="" 72="" awr="">CDPcyrraedd 320 ug/mL (P < .01)="" ond="" ni="" welwyd="" unrhyw="" newid="" mewn="" crynodiadau="" is="" (ffigur="" 1b).="" yna="" fe="" wnaethom="" archwilio="" rôl="" cdp="" yn="">melanogenesisa chymharodd ei effeithiau â rhai hormon sy'n ysgogi -melanocyte ( -MSH; crynodiadau: 20, 100, a 400 nm) a DMSO (0.1 y cant) mewn HEMs. Awgrymodd canlyniadau'r staenio melanin, gweithgaredd tyrosinase, a phrofion cynnwys melanin fod CDP yn debyg i -MSH ar gyfer hyrwyddo melanogenesis, tra nad oedd triniaeth DMSO 0.1 y cant yn gwneud unrhyw wahaniaeth (Ffigur S1).

Fe wnaethom fireinio ein harchwiliad ymhellach yn unol â hynny. Cafodd yr HEMs eu trin âCDPmewn crynodiadau gwahanol (20, 40, ac 80 ug/mL) am 48 awr; cynhaliwyd y staenio melanin, cynnwys melanin, a phrofion gweithgaredd tyrosinase, a dangosodd pob un ohonynt gynnydd sylweddol ar ôl triniaeth CDP mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad a gyrhaeddodd uchafbwynt yn y grŵp 80 ug/mL (P < .05,="" ffigur="" 2a-c).="" yna="" fe="" fesuron="" ni="" lefelau="" mrna="" a="" phrotein="">melanogenesis-genynnau cysylltiedig (MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A, a FSCN1). Cynyddodd CDP yn sylweddol lefelau mRNA y genynnau hynny mewn HEMs (P < .05;="" ffigur="" s2a).="" yn="" ogystal,="" cynyddodd="" lefelau="" proteinau="" mitf,="" tyr,="" trp1,="" a="" rab27a,="" fel="" y="" gwnaeth="" y="" gymhareb="" o="" mitf="" ffosfforyleiddio="" i="" gyfanswm="" mitf="" (p="">< .05),="" ond="" ni="" ddangosodd="" trp2="" a="" fscn1="" unrhyw="" wahaniaeth="" (ffigur="" 2d,="" e).="" dangosodd="" y="" canlyniadau="" y="" gall="" cdp="" hyrwyddo="" melanogenesis="" ac="" uwch-reoleiddio="" mynegiant="" genynnau="" sy'n="" gysylltiedig="" â="" melanogenesis="" mewn="" melanocytes="">

Ar ben hynny, rydym yn ailwirio effeithiauCDPeto gyda chelloedd B16F10 a chanfuwyd bod cynnwys melanin celloedd B16F10 wedi cynyddu'n sylweddol (P < .01;="" ffigur="" s2b).="" yn="" ogystal,="" cynyddodd="" cdp="" lefelau="" mrna="" yn="">melanogenesis-genynnau cysylltiedig (P < .05; Ffigur S2C), a lefelau protein o MITF, TYR, TRP1, TRP2, a RAB27A hefyd yn cynyddu ar ôl triniaeth CDP (P < .05; Ffigur S2D-E).

FFIGUR 1 Sytowenwyndra CDP mewn celloedd HEM a B16F10.

3.2|Roedd CDP yn hyrwyddo melanogenesis mewn pysgod sebra

Ymchwilio i weld aCDPgallai hyrwyddomelanogenesisyn vivo, fe wnaethon ni ddefnyddio embryonau zebrafish. Rhannwyd yr embryonau zebrafish yn bedwar grŵp a'u trin yn barhaus â chanolig yn unig (NC) neu CDP mewn crynodiadau gwahanol (20, 40, ac 80 ug / mL); arsylwyd a chofnodwyd dwysedd a dosbarthiad gronynnau melanin bob dydd. Wrth i'r embryonau zebrafish dyfu, canfuom fod dwysedd melanin yn cynyddu'n raddol yn y pennau a'r cynffonau. Ar y 3ydd diwrnod, roedd y gwahaniaethau rhwng grwpiau yn amlwg, a pharhaodd y gwahaniaeth i gynyddu nes i ni ddod â'r arbrawf i ben ar y 6ed diwrnod (Ffigur 3A). Defnyddiwyd Delwedd J i fesur y dwysedd melanin yng nghynffonau pysgod sebra; roedd y dwysedd melanin yn y grwpiau a driniwyd gan CDP yn sylweddol uwch na'r un yn y grŵp rheoli (P < .05;="" ffigur="">

3.3|Llwybr signal MAPK wedi'i actifadu gan CDP mewn celloedd HEM a B16F10

I ddatgelu'r mecanweithiau ar gyferCDPhyrwyddirmelanogenesis, fe wnaethom drin HEMs gyda CDP mewn crynodiadau gwahanol (20, 40, ac 80 ug / mL) am 48 awr ac yna ymchwilio i lefelau ffosfforyleiddio a chyfanswm y proteinau ERK, JNK, a p38 yn y llwybr signalau MAPK. Fel y'i mesurwyd gan blotio Gorllewinol, cynyddwyd y lefelau p-ERK, p-JNK, a p-p38 ar ôl triniaeth CDP (P < .05),="" tra="" nad="" oedd="" cyfanswm="" y="" lefelau="" ohonynt="" yn="" newid="" (ffigur="" 4a,="" b).="" ailadroddwyd="" yr="" arbrofion="" gyda="" chelloedd="" b16f10="" a="" chynyddwyd="" lefelau="" ffosfforyleiddiad="" y="" proteinau="" erk,="" jnk,="" a="" p38="" (p="">< .05),="" ond="" ni="" newidiodd="" cyfanswm="" y="" lefelau="" mapk="" (ffigur="" 4c,="" d),="" yn="" gyson="" â'r="" canlyniadau="" mewn="">

3.4|Gwanhaodd CDP H2O{2-sytowenwyndra a achosir gan H2O ac apoptosis mewn celloedd HEMs a B16F10

Fe wnaethom ddefnyddio H2O2 i efelychu'r amgylchedd straen ocsideiddiol ac archwilio ymhellach rôl CDP mewn melanocytes o dan straen ocsideiddiol. Y crynodiad terfynol o H2O2 a ddefnyddiwyd yn yr HEMs oedd 500 μm, tra bod y crynodiad mewn celloedd B16F10 yn 1.0 mm. Er mwyn ymchwilio i effaith CDP ar sytowenwyndra a achosir gan H2O, gwnaethom rag-drin celloedd HEM a B16F10 âCDPmewn crynodiadau gwahanol (20, 40, a 80 ug/mL) am 24 awr, yna ychwanegu H2O2 a pharhau i'w trin am 24 awr cyn perfformio'r arsylwi a'r assay MTT.

Achosodd H2O2 blebbing bilen ymddangosiadol a chrebachu celloedd mewn HEMs, yn y grwpiau CDP-pretreated, mae'r sefyllfa yn lleddfu. Ni chafodd triniaeth gyda CDP yn unig unrhyw effaith (Ffigur 5A). Dangosodd yr assay MTT ganlyniad tebyg yn yr ystyr bod triniaeth H2O2 wedi lleihau hyfywedd HEM, tra bod CDP wedi lleddfu'r effaith niweidiol hon yn sylweddol (P < .01);="" triniaeth="">CDPni wnaeth unrhyw wahaniaeth ar ei ben ei hun (Ffigur 5C). Yna fe wnaethom wirio'r effaith amddiffynnol eto yn y celloedd B16F10. Arweiniodd triniaeth H2O2 at waedu bilen ymddangosiadol a chrebachu celloedd, tra bod y cyflwr anffafriol hefyd wedi'i leddfu gan CDP mewn celloedd B16F10 (Ffigur 5B). Yn y cyfamser, dangosodd yr assay MTT fod hyfywedd celloedd B16F10 wedi gostwng ar ôl triniaeth H2O2, ond fe wellodd y sefyllfa'n sylweddol yn y grwpiau CDP-pretreated (P <.05; ffigur="">

At hynny, defnyddiwyd FCM i fesur yr apoptosis a achosir gan H2O o gelloedd HEMs a B16F10. Dangosodd y canlyniadau fod H2O2 wedi achosi apoptosis sylweddol mewn celloedd HEM a B16F10, ond cyn-driniaeth gydaCDPgallai mewn crynodiadau gwahanol leihau'r apoptosis yn sylweddol; fel arall, ni wnaeth triniaeth CDP yn unig unrhyw wahaniaeth (Ffigur 5E, F). Cynyddodd y gyfradd apoptosis ar ôl triniaeth H2O2 ond gostyngodd yn y grwpiau a gafodd eu trin ymlaen llaw gan CDP, roedd y newid yn arwyddocaol yn y ddau gelloedd HEM a B16F10 (P <.05, ffigur="" 5g,="">

Mae CDP FFIGUR 2 yn hyrwyddo melanogenesis mewn HEMs.

3.5|Mae CDP wedi ysbwriel H2O2-wedi'i achosi ROS mewngellol mewn celloedd HEM a B16F10

Ymchwilio i fecanweithiauCDPar gyfer lleihau sytowenwyndra ac apoptosis a achosir gan H2O, gwnaethom ganfod ymhellach y ROS mewngellol mewn celloedd HEM a B16F10 gan ddefnyddio chwiliedydd fflworoleuedd DCFH-DA. Roedd y triniaethau yr un fath â'r rhai a ddisgrifiwyd uchod, mesurwyd dwyster fflworoleuedd i gynrychioli'r lefel ROS. Fel y gwelsom mewn HEMs, roedd triniaeth H2O2 yn effeithiol wrth ddyrchafu ROS, ond llwyddodd CDP i chwilota'n sylweddol o'r ROS mewngellol mewn grwpiau a gafodd eu trin â H2O2- (P < .01;="" ffigur="" 6a,="" c);="" ar="" ben="" hynny,="" nid="" oedd="" y="" defnydd="" o="" cdp="" yn="" unig="" yn="" gwneud="" unrhyw="" wahaniaeth.="" fe="" wnaethom="" ail-gadarnhau'r="" canlyniadau="" mewn="" celloedd="" b16f10.="" mewn="" celloedd="" b16f10,="" nid="" oedd="" triniaeth="" gyda="" cdp="" yn="" unig="" yn="" effeithio="" ar="" y="" lefel="" ros,="" tra="" cynyddodd="" triniaeth="" h2o2="" y="" lefel="" ros="" yn="" amlwg,="" ond="" gostyngwyd="" y="" newid="" hwn="" yn="" sylweddol="" hefyd="" gan="" rag-drin="" cdp="" (p=""><.05; ffigur="" 6b,="">

3.6|Llwybr gwrthocsidiol NRF2/HO{{-1) wedi'i uwchraddio gan CDP mewn melanocytes

Er mwyn datgelu ymhellach y mecanweithiau y mae CDP yn eu defnyddio i ysbeilio ROS, yn gyntaf fe wnaethom fesur lefelau protein llwybr gwrthocsidiol NRF2/HO-1 mewn celloedd B16F10. Canfuom nad oedd triniaeth gyda CDP yn unig yn effeithio’n sylweddol ar broteinau NRF2 a HO{{{{}}), ond mewn grwpiau a gafodd eu trin gan H2O, cynyddodd lefel y ddau brotein hyn yn sylweddol, aCDProedd rhag-driniaeth yn gwella'r drychiad ymhellach (t<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDPyn dangos rhai gwahaniaethau, gan y gallem weld bod y fflworoleuedd yn y cnewyllyn yn gryfach na'r un yn y cytoplasm, ac roedd y dosbarthiad yn agos ar dri chrynodiad CDP (Ffigur 7C).

FFIGUR 3 Mae CDP yn hyrwyddo melanogenesis mewn pysgod sebra.

4|TRAFODAETH A CHASGLIADAU

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymchwilio i rôlCDPmewn celloedd HEM a B16F10. Am y tro cyntaf, canfuom y gallai CDP hyrwyddo melanogenesis mewn melanocytes a hyrwyddo pigmentiad mewn pysgod sebra. Dangosodd arbrawf dilynol fod llwybr signalau MAPK wedi'i actifadu o dan driniaeth CDP. Gwnaethom ymchwilio ymhellach i'w rôl ynstraen ocsideiddiola chanfuwyd y gallai CDP wanhau sytowenwyndra a achosir gan H2O ac apoptosis mewn melanocytes; yn y cyfamser, gallai CDP actifadu llwybr gwrthocsidiol NRF2/HO-1 a chwilio am ROS mewngellol o dan amodau straen ocsideiddiol.

Mae kinase protein a weithredir gan mitogen yn llwybr hanfodol sy'n ymwneud â rheoleiddio MITF, ffactor trawsgrifio allweddol sy'n hyrwyddo mynegiantmelanogenesis-genynnau cysylltiedig ac wedi hynny yn effeithio ar synthesis a chludiant melanin.26,27 Yn ein hastudiaeth, cynyddwyd aactivation ERK, JNK, a p38 mewn melanocytes yn sylweddol ar ôl triniaeth CDP; yn y cyfamser, uwch-reoleiddiwyd ymadroddion MITF/p-MITF a TYR, TRP1, TRP2, a RAB27A a yrrir gan MITF yn unol â hynny. Felly, rydym yn awgrymu y gall CDP hyrwyddomelanogenesistrwy actifadu'r llwybr MAPK, ond sutCDPyn actifadu MAPKs yn parhau i fod yn anhysbys. Yn ôl astudiaethau diweddar, mae derbynnydd tebyg i doll 4 (TLR4) wedi'i fynegi'n fawr mewn melanocytes ac yn ymwneud âmelanogenesisMae .28,29 TLR4 yn brotein trawsbilen pwysig sy'n gallu rhwymo lipopolysacarid (LPS)30 yn benodol; adroddodd astudiaethau y gall LPS ysgogi melanogenesis.29 Yn ddiddorol, dywedir bod sawl polysacaridau a dynnwyd o blanhigion neu fadarch wedi gweithredu TLRs a llwybrau signalau i lawr yr afon megis MAPK a ffactor niwclear kappa beta (NF-κB).31,32 Felly, rydym yn amau ​​​​hynnyCDPgellir ei adnabod a'i rwymo gan TLRs, yna'n actifadu'r llwybr signal MAPK i lawr yr afon ac yn hyrwyddomelanogenesis. Ymhellach, gwyddys bod derbynyddion tebyg i barth oligomerization sy'n rhwymo niwcleotid (NLRs) yn adnabod ligandau mewngellol ac yn gyrru actifadu llwybrau signalau MAPK a NF-κB.33,34 Fel yr adroddwyd, gall poly-saccharides a dynnwyd o Ganoderma lucidum ac Astragalus fynd i mewn i gelloedd. ac effeithio ar NLRs.35,36 Felly, mae'n bosibl y gall CDP fynd i mewn i felanocytau a rheoleiddio llwybr signalau MAPK trwy NLRs. Fodd bynnag, mae angen astudiaethau pellach i wirio'r ddamcaniaeth hon.

Nododd rhai astudiaethau hyd yn hyn y defnydd o polysacaridau llysieuol mewn melanogenesis i atal cynhyrchu melanin.37,38 Fodd bynnag, yn yr astudiaeth hon,CDPhyrwyddirmelanogenesismewn melanocytes, a chadarnhawyd yr effaith hon ymhellach ar ôl cymharu â -MSH. Mae CDP hefyd yn fath o polysacarid a dynnwyd o berlysiau, rydym yn amau ​​​​y gallai effaith groes CDP fod yn gysylltiedig â'r gwahaniaethau strwythurol rhwng CDP a polysacaridau eraill. Mae polysacaridau'n cael eu ffurfio trwy bolymeriad monosacaridau ond maent yn amrywio o ran math monosacarid, cyfansoddiad mono-sacarid, bond glycosidig, strwythur cadwyn ochr, a phwysau moleciwlaidd39,40; credir mai'r ffactorau hyn sy'n pennu eu swyddogaethau biolegol.41 Mae astudiaethau presennol wedi cynnig strwythurCDPac awgrymodd fod strwythur CDP wedyn yn dylanwadu ar ei swyddogaeth.42 Felly, mae angen mwy o brawf i ddeall CDP yn llawn a chadarnhau ein rhagdybiaeth.

Melanogenesisyn fecanwaith amddiffynnol pwysig ar gyfer gwrthsefyll difrod uwchfioled a chynnal homeostasis y corff43; ar yr un pryd, mae melanocytes yn hawdd eu hamlygu i amgylcheddau anffafriol megis gorlwytho ROS.11 Mae'n hysbys bod ROS yn cymryd rhan mewn hyrwyddo melanogenesis, un o'r mecanweithiau yw actifadu MAPKs.44 Ond datgelodd astudiaethau hefyd mai dim ond o fewn ROS penodol y mae'r effaith hon yn bodoli. lefel, tra bod gorlwytho ROS yn amharumelanogenesisyn sylweddol.45Mae'r berthynas rhwng ROS, MAPK, a melanogenesis yn amrywiol o dan amodau gwahanol, felly, mae'r cydbwysedd rhwng systemau pro-a gwrth-ocsidydd yn amlwg yn bwysig. Mewn clefydau depigmentation megis fitiligo, bydd system gwrthocsidiol anghydbwysedd a gorlwytho ROS na ellir ei reoli yn niweidio melanocytes ac yn lleihau hyfywedd celloedd.11,46 Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd crynodiadau gwahanol o H2O2 gennym i efelychu gorlwytho ROS mewn celloedd, a dangosodd HEMs oddefgarwch tlotach i H2O2 na chelloedd B16F10. Pan gafodd melanocytes driniaeth H2O2, gwaethygodd eu hyfywedd a'u cyfradd apoptosis, ond gallai rhag-driniaeth CDP wyrdroi'r duedd yn rhannol. Ar yr un pryd, cafodd ROS ei chwilota. Fel yr adroddwyd, mae actifadu llwybr gwrthocsidiad NRF2/ARE yn brif ddull o chwilota ROS mewn celloedd croen.14 Yn ein harbrofion, cafodd lefelau protein NRF2 a HO{- mewn melanocytes eu huwchreoleiddio ar ôl triniaeth H2O2 heb CDP; mae hyn yn golygu bod H2O2-wedi'i ysgogistraen ocsideiddiolyn gallu actifadu'r llwybr NRF2/HO-1, ond mae'n annigonol ar gyfer cynnal cydbwysedd rhydocs ac amddiffyn y gell rhag anaf. Fodd bynnag, roedd rhag-driniaeth CDP wedi gwella llwybr gwrthocsidiad NRF2/HO-1 ac wedi adfer y cydbwysedd. Felly, rydym yn awgrymu y gall CDP amddiffyn melanocytes rhag anaf straen ocsideiddiol trwy actifadu llwybr gwrthocsidiad NRF2/HO-1 a chwilota ROS.

Dyma ein cynnyrch.

Am fwy o wybodaeth, cliciwch yma.

Daethom o hyd i hynnyCDPnid oes gan driniaeth yn unig unrhyw ddylanwad ar ROS neu NRF2/HO-1 mewn melanocytes. Mae'r canlyniad hwn yn awgrymu y gall CDP effeithio ar gydbwysedd rhydocs o danstraen ocsideiddiol, ond nid amodau arferol. Ar ben hynny, dywedir bod llwybr gwrthocsidiad NRF2/HO-1 yn cael ei reoleiddio gan y llwybrau signalau PI3K, NF-κB, a MAPK.47,48 Yn ein hastudiaeth, roedd CDP yn gallu actifadu llwybr signalau MAPK. Mae'n bosibl y gall CDP actifadu'r llwybr NRF2/HO{-1 trwy uwch-reoleiddio MAPKs. Fel yr adroddodd Slominski, mae melanocytes yn synwyryddion straen sy'n ymwneud â rhwydwaith rheoleiddio, a gall eu swyddogaethau newid yn gyflym mewn ymateb i'r amgylchedd.49 Awgrymwn fod rôl CDP yn cael ei ddylanwadu gan statws melanocytes, gall hyrwyddo motemelanogenesisheb effeithio ar y system gwrthocsidiol o dan amodau arferol ond adfer y cydbwysedd rhydocs o dan amodau straen ocsideiddiol. Felly, gellir cynnal swyddogaeth a goroesiad melanocyte mewn dwy ffordd wahanol gan CDP. Mae CDP yn helpu melanocytes i gynnal homeostasis, sydd hefyd yn swyddogaeth bwysig omelanogenesis.50,51

I gloi,CDPyn gallu hyrwyddo melanogenesis melanocytes trwy actifadu llwybr signalau MAPK. Gall CDP wella goroesiad melanocyte trwy actifadu llwybr gwrthocsidiol NRF2/HO-1 a chwilota ROS mewngellol o danstraen ocsideiddiolamodau. Mae ein canfyddiadau yn ystyrlon oherwydd eu bod yn dangos y gall CDP hyrwyddomelanogenesisac amddiffyn melanocytes rhag anaf straen ocsideiddiol, sydd o bosibl yn gyfrifol am gamweithrediad a cholled melanocyte. Mae canfyddiadau'r astudiaeth hon yn nodi y gallai CDP fod yn gyffur newydd wrth drin clefydau debigmentu.