Mae Glycosidau Ffenylethanoid Cistanche Tubulosa yn Cymell Apoptosis mewn Celloedd Eca-109 Trwy'r Llwybr Dibynnol Mitocondria
Mar 06, 2022
Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com
FU CHANGSHUANG , JINYU LI , ADILA AIPIRE , LIJIE XIA , YI Yang , QIUYAN Chen , JIE LV , XINHUI WANG a JINYAO LI
Haniaethol
Cistanche tubulosamae ganddo swyddogaethau biolegol amrywiol. Yn yr astudiaeth bresennol, ymchwiliwyd i effaith antitumor glycosidau ffenylethanoid sy'n hydoddi mewn dŵr o C. tubulosa (CTPG-W) ar ganser esoffagaidd. Cafodd celloedd eca-109 eu trin â CTPG-W a mesurwyd hyfywedd celloedd gan assay MTT. Dadansoddwyd yr apoptosis, cylchred celloedd, potensial pilen mitocondriaidd (Δψm), a rhywogaethau ocsigen adweithiol yn ôl cytometreg llif. Canfuwyd lefelau proteinau mewn llwybrau apoptotig gan ddadansoddiad blotiau gorllewinol. Penderfynwyd bod CTPG-W yn lleihau hyfywedd celloedd Eca-109 yn sylweddol trwy sefydlu apoptosis ac arestiad cylchred celloedd. Yn dilyn triniaeth CTPG-W, gostyngwyd Δψm Eca-109 yn sylweddol, sy'n gysylltiedig â lefelau uwch-reoledig o lymffoma B-cell-2 (Bcl-2) sy'n gysylltiedig â X a lefelau is-reoledig o Bcl-2. O ganlyniad, cynyddwyd lefelau cytochrome c ac c-Mehefin NH2-kinase terfynell, a oedd yn uwchreoleiddio lefelau polymeras hollt-poly (ADP-ribose) a hollt-caspase-3, {{18} } a -9, ond nid caspase-8. Yn gyfatebol, dangosodd lefelau'r rhywogaethau ocsigen adweithiol yng nghelloedd Eca{-109 newidiadau nodedig. Roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod CTPG-W wedi achosi apoptosis o gelloedd Eca-109 trwy lwybr dibynnol mitocondriaidd.
Rhagymadrodd
Canser esoffagaidd yw un o'r mathau mwyaf cyffredin o ganser gyda'r 11eg gyfradd afiachusrwydd uchaf a'r 6ed gyfradd marwolaethau uchaf yn fyd-eang ac achosodd ~439,{3}} o farwolaethau yn 2015 (1). Mae nifer yr achosion o ganser esophageal yn amrywio'n fawr rhwng gwahanol ranbarthau, gyda dwyrain Asia a dwyrain a de Affrica yn arddangos y cyfraddau uchaf o achosion a gorllewin Affrica yn arddangos y cyfraddau isaf yn 2012 (1,2). Yn Tsieina, amcangyfrifwyd bod 477,000 a 375,000 o achosion o ganser esoffagaidd a marwolaethau yn 2015 (3). Er bod cyfradd afiachusrwydd canser esophageal wedi gostwng mewn gwledydd mynegai sociodemograffig canol ac uchel-canol rhwng 2005 a 2015, mae'r gyfradd marwolaethau yn parhau i fod yn uchel oherwydd y prognosis gwael (1,4). Mae'r cyfuniad o echdoriad llawfeddygol gyda chemotherapi neu radiotherapi wedi'i ddefnyddio i drin canser yr oesoffagws, fodd bynnag, adroddwyd rhwng 2003 a 2014 bod y 5-gyfradd goroesi blwyddyn wedi aros.<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Mae meddygaeth lysieuol Tsieineaidd draddodiadol (CHM) wedi'i defnyddio i drin gwahanol fathau o ganser, gan gynnwys canser yr ysgyfaint celloedd nad ydynt yn fach (6), canser y colon a'r rhefr (7), carsinoma hepatogellog (8). Yn ddiweddar, nododd y treialon clinigol fod y cyfuniad o CHM â chemotherapi neu radiotherapi nid yn unig yn dangos nifer o fanteision i ansawdd bywyd a lliniaru sgîl-effeithiau a achosir gan gemotherapi neu radiotherapi (9,10), ond hefyd wedi gwella cyfradd goroesi cleifion. gyda chanser yr ysgyfaint celloedd nad ydynt yn fach, yr afu, y stumog a'r rhefr, y colon a'r rhefr, y trwyn-faryngol neu ganser ceg y groth (9). Fodd bynnag, mae tystiolaeth anghyson ynghylch effeithiolrwydd triniaeth CHM ar ganser yr oesoffagws (10,11). Penderfynodd nifer o astudiaethau y gallai nifer o feddyginiaethau neu gydrannau llysieuol atal twf celloedd canser esophageal in vitro ac in vivo, gan gynnwys Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt, a Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (nofel ent-kaurene diterpenoid) (19), Qigesan (20) a decoction Tonglian (21). Mae Cistanche yn fath o CHM ac mae'n cyflawni amryw o swyddogaethau biolegol, gan gynnwys gwrth-ocsidiad, gwrth-llid, a niwroamddiffyniad (22,23). Dangosodd ein hastudiaeth flaenorol hynnyCistanche tubulosa glycosidau phenylethanoid(CTPG) atal twf celloedd melanoma B16-F10 in vitro ac in vivo (24). Fodd bynnag, mae hydoddedd dŵr gwael CTPG a ddefnyddiwyd yn flaenorol yn cyfyngu ar ddatblygiad cyffuriau (24). Felly, defnyddiwyd CTPG sy'n hydoddi mewn dŵr (CTPG-W) ac ymchwiliwyd i'r effaith antitumor ar gelloedd canser esophageal (Eca-109). Penderfynwyd y gallai CTPG-W atal hyfywedd celloedd Eca-109 yn ddibynnol ar ddos trwy sefydlu apoptosis trwy lwybr dibynnol ar mitocondriaidd.
Defnyddiau a dulliau Anifeiliaid.
Prynwyd llygod benyw C57BL/6 (6-8 wythnos, ~25 g) o Ganolfan Ymchwil Anifeiliaid Labordy Beijing (Beijing, Tsieina) a'u cadw yn yr uned a reolir gan dymheredd (25˚C), â chylchred golau (12/). 12) Cyfleuster Anifeiliaid Prifysgol Xinjiang (Urumqi, Tsieina). Roedd pob anifail yn derbyn dŵr a bwyd heb bathogen.
Llinell gell a diwylliant. Cadwyd y llinell gell carcinoma oesoffagaidd dynol (Eca-109) gan Labordy Allweddol Adnoddau Biolegol a Pheirianneg Genetig Xinjiang (Coleg Gwyddor Bywyd a Thechnoleg, Prifysgol Xinjiang, Urumqi, Tsieina) a'i meithrin yn RPMI{{1} } canolig (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, UDA) wedi'i ategu â 10 y cant o serwm buchol ffetws anweithredol gwres (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co, Ltd, Jiangsu, Tsieina), 1 y cant L -glutamin (100 mM), penisilin 100 U/ml a streptomycin 100 µg/ml ar 37˚C mewn awyrgylch llaith sy'n cynnwys 5 y cant o CO2.
Cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC). Prynwyd CTPG-W (cath. rhif. SGJG20170410) oddi wrth Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Tsieina). Cafodd prif gyfansoddion CTPG eu cymhwyso a'u mesur gan HPLC yn ôl ein hastudiaeth flaenorol (24). Yn fyr, cynhaliwyd HPLC ar Golofn ZORBAX SB-C18 (250x4.6 mm; 5 µm) ar 30˚C a'i ddiystyru â hydoddiant asid fformig 0.2 y cant a graddiant o fethanol gan ddechrau ar 23 y cant, wrth i 1 ml gael ei ychwanegu bob munud am 45 munud nes cyrraedd 31 y cant . Chwistrellwyd cyfanswm o 10 µl sampl a'i ganfod ar 330 nm. Prynwyd y safon echinacoside gan Shanghai Baoban Biotech Co, Ltd (Shanghai, Tsieina), a phrynwyd y safon acteoside gan Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, yr Almaen). Defnyddiwyd y safonau i ddadansoddi cydrannau CTPG-W.
Assay MTT. Mesurwyd amlhau celloedd gyda assay MTT. Cafodd celloedd eca{{0}} eu brechu i 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 5x103 cell mewn 100 µl RPMI{{5 }} canolig/yn dda ac wedi'i feithrin ar 37˚C am 24 h, yna'n cael ei drin â chrynodiadau gwahanol (0, 200, 400, 600, a 800 µg/ml) o CTPG-W neu 0.4 y cant deumethyl sylfocsid (DMSO) ar gyfer 24, 48 a 72 h. Defnyddiwyd DMSO fel rheolydd toddyddion (800 µg/ml CTPG-W yn cynnwys 0.4 y cant DMSO). Defnyddiwyd cisplatin (20 µg/ml) fel y rheolaeth gadarnhaol. Yn dilyn hynny, cafodd y supernatant ei daflu ar ôl centrifugio ar 225 xg am 5 munud ar dymheredd ystafell, ac ychwanegwyd hydoddiant MTT 100 µl (0.5 mg/ml mewn cyfrwng RPMI-1640 heb FBS) at bob ffynnon a'i ddeor ar 37˚C am 3 h. Hydoddwyd y crisialau formazan ffurfiedig mewn 200 µl DMSO. Mesurwyd y gwerthoedd dwysedd optegol (OD) ar donfedd o 490 nm gan ddarllenydd microplate ffynnon 96- (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Cyfrifwyd hyfywedd celloedd cymharol yn ôl y fformiwla: Hyfywedd cell ( y cant ) { { 36 }} ( ODtreated / ODuntreated ) x100 y cant . Gwelwyd morffoleg celloedd Eca-109 gyda microsgop fflworoleuedd gwrthdro (chwyddiad, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan).
Ar gyfer yr ymlediad o splenocytes, cafodd llygod C57BL/6 eu lladd gan ddadleoliad ceg y groth, a chafodd dueg eu hynysu. Gwnaethpwyd yr ataliad un-gell a hedynwyd splenocytes i 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 1x105 cell/ffynnon mewn 100 µl RPMI-1640 canolig, ac yna eu trin â chrynodiadau gwahanol (0, 200, 400, 600, a 800 µg/ml) o CTPG-W am 24, 48 a 72 h ar 37˚C gyda 5 y cant o CO2. Mesurwyd amlder splenocytes gan assay MTT, yn ôl y protocol a grybwyllwyd uchod. Mynegai ysgogol=ODtreated/OD heb ei drin.
Mesur apoptosis a'r gylchred gell. Cafodd celloedd eca{{0}} eu meithrin mewn dysglau 60 mm ar ddwysedd o 2.5x105 cell/dysg am 24 awr a'u trin â chrynodiadau gwahanol ({{31} }, 200, 400, 600, a 800 µg/ml) o CTPG-W neu 0.4 y cant DMSO am 24 h ar 37˚C gyda 5 y cant CO2. Cafodd celloedd eu casglu a'u staenio â phecyn Canfod Apoptosis isothiocyanate V-fluorescein Annexin (FITC) / Propidium iodid (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), yn ôl protocolau'r gwneuthurwr. Casglwyd samplau yn ôl cytometreg llif (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, UDA) a'u dadansoddi gan FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). I ddadansoddi effaith CTPG-W ar y gylchred gell, cafodd celloedd 2.5x105 Eca-109 eu hadu mewn dysglau meithrin 60 mm a'u trin â CTPG-W (0, 100, 200, a 400 µg/ml) neu 0.4 y cant DMSO am 24 h ar 37˚C gyda 5 y cant CO2. Cafodd pob cell ei chynaeafu a'i golchi ddwywaith gyda PBS oer iâ (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), yna ei osod mewn ethanol oer-iâ 70 y cant ar 4˚C am 30 munud. Ar ôl golchi ddwywaith â PBS oerfel iâ, cafodd celloedd eu hailddarlledu mewn byffer staenio 300 µl PI/RNase (BD Biosciences, San Jose, CA, UDA) am 10 munud ar dymheredd ystafell. Dadansoddwyd y dosbarthiad cylchred celloedd gyda meddalwedd ModFit LT 3.0 yn ôl cytometreg llif (BD FACSCalibur).
Dadansoddiad o botensial pilen mitocondriaidd (Δψm) a rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS). I ddadansoddi'r Δψm, cafodd celloedd Eca{{{0}} eu trin â CTPG-W (0, 400, 600 a 800 µg/ml) neu 0.4 y cant DMSO ar gyfer 24 h ar 37˚C gyda 5 y cant o CO2, a'i staenio â phecyn assay potensial pilen mitocondriaidd gyda JC-1 (Sefydliad Biotechnoleg Beyotime, Shanghai, Tsieina), yn ôl protocol y gwneuthurwr, am 20 munud ar 37˚C . Yn dilyn golchi ddwywaith gyda byffer golchi JC{-1 (Sefydliad Biotechnoleg Beyotime), cafodd samplau eu hailddarlledu gyda byffer golchi 300 µl JC-1 a'u dadansoddi yn ôl cytometreg llif (BD FACSCalibur). Gwelwyd fflworoleuedd llifyn JC-1 mewn celloedd Eca-109 hefyd gyda microsgop fflworoleuedd gwrthdro (chwyddiad, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Ar gyfer dadansoddi ROS, cafodd celloedd Eca-109 eu trin â CTPG-W (0, 400, 600, a 800 µg/ml) ar gyfer 2, 4, 6, 12, a 24 h, a'u staenio â Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol Assay Kit (Sefydliad Biotechnoleg Beyotime), yn ôl protocol y gwneuthurwr, am 20 munud ar 37˚C. Ar ôl golchi tair gwaith gyda PBS oerfel iâ, casglwyd samplau gan sytometreg llif (BD FACSCalibur) a'u dadansoddi gan feddalwedd FlowJo 7.6.
Gweithgaredd sborion radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Penderfynwyd ar weithgaredd chwilota radical rhad ac am ddim CTPG-W gyda assay radical rhad ac am ddim DPPH yn ôl y protocol cyhoeddedig gyda mân addasiad, oherwydd amnewidiwyd methanol ag ethanol i ddiddymu DPPH (25,26). Ar gyfer mesuriadau cyflwr cyson, cymysgwyd 150 µl DPPH (100 mmol/l) mewn ethanol â chrynodiadau gwahanol o CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500, a 600 µg/ml) mewn 50 µl PBS, a'u deor yn y tywyllwch am 30 munud ar dymheredd ystafell. Canfuwyd yr amsugnedd ar 517 nm ym mhresenoldeb ac absenoldeb CTPG-W. Defnyddiwyd cyfanswm o 50 µl o Fitamin C fel rheolaeth bositif. Cyfrifwyd y gweithgaredd sborionu radical DPPH gan ddefnyddio'r fformiwla: Scavenging ( y cant )=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100, lle mae Ablank yn amsugnedd y rheolydd (heb DPPH), Sampl yw amsugnedd y sampl ac A0 yw amsugnedd PBS â DPPH.
Dadansoddiad o blotiau gorllewinol. Cafodd celloedd eca{{0}} eu trin â CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) neu 0.4 y cant DMSO am 24 h ar 37˚C gyda 5 y cant o CO2. Mae golchi canlynol ddwywaith gyda PBS, celloedd eu lysed yn Radioimmunoprecipitation Assay Lysis byffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Tsieina) am 20 munud ar rew. Ar ôl centrifugio ar 10,000 xg am 10 munud ar 4˚C, casglwyd y supernatants, a chanfuwyd crynodiadau protein gyda phecyn asid bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) yn unol â phrotocolau'r gwneuthurwr. Cynhaliwyd dadansoddiad o blotiau gorllewinol yn ôl ein disgrifiad blaenorol (24). Yr gwrthgyrff yn erbyn caspase-7 (cath. rhif. D120077), caspase-8 (cat. rhif. D155240), caspase-9 (cat. rhif. D220078), lymffoma B-cell{ {24}} (Bcl-2)-gysylltiedig X (Bax) (cat. rhif. D220073) a Bcl-2 (cat. rhif. D260117), a gwrth-lygoden IgG-marchnad peroxidase (HRP ) (cath. rhif. D111050) a gwrth-gwningen IgG-HRP (cat. rhif. D110058) eu prynu gan BBI Life Sciences (Shanghai, Tsieina). Prynwyd y gwrthgyrff yn erbyn caspase-3 (cat. no. E-AB-10050) a caspase gweithredol-3 (cath. rhif. E-AB-22115) gan Elabscience ( Wuhan, Tsieina). Gwrthgyrff eraill yn erbyn caspase-7 (cath. rhif 9492), poly (ADP-ribose) polymeras (PARP) (cath. rhif 9542), cytochrome c (cath. rhif. AC909), c-Mehefin NH{ {48}}cafwyd kinase terfynell (JNK) (cat. rhif 9252S), a -actin (cath. rhif 58169) gan Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, UDA). Cafodd yr holl wrthgyrff cynradd ac eilaidd eu gwanhau ar 1:1,000. Deorwyd y gwrthgyrff cynradd ar 4˚C dros nos a deorwyd yr gwrthgyrff eilaidd ar 37˚C am 1 awr.
Canfuwyd y proteinau targed gan ddefnyddio pecyn profi cemiluminescence gwell (Sefydliad Biotechnoleg Beyotime), yn ôl protocol y gwneuthurwr.
Dadansoddiad ystadegol. Cyfrifwyd arwyddocâd ystadegol trwy ddadansoddiad un ffordd o amrywiant â phrawf post hoc Tukey a dadansoddwyd y canlyniadau gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) ymhlith y grwpiau trin a rheoli. Cyflwynwyd yr holl ddata fel y gwyriad ± safonol cymedrig. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa glycosidau phenylethanoid(CTPG)
Canlyniadau
Mae CTPG-W yn atal twf celloedd Eca-109. Cafodd cydrannau CTPG-W eu cymhwyso a'u meintioli gan HPLC (Ffig. 1), a gafodd eu cymharu â safonau echinacoside ac acteoside. Yn ôl yr amseroedd cadw brig a'r ardaloedd brig, roedd CTPG-W yn cynnwys 39.16 y cant o echinacoside a 2.44 y cant o acteoside. Yn gyntaf, penderfynwyd effaith CTPG-W ar hyfywedd celloedd Eca-109 gyda assay MTT. Diddymwyd CTPG-W mewn DMSO ar 200 mg/ml a'i wanhau â chyfrwng RPMI-1640 sy'n cynnwys 10 y cant o FBS anweithredol â gwres i grynodiadau a nodwyd. Cafodd celloedd eca-109 eu trin â CTPG-W a dadansoddwyd hyfywedd celloedd gyda assay MTT ar y pwyntiau amser a nodwyd. Fe wnaeth triniaeth CTPG-W leihau hyfywedd celloedd Eca-109 yn sylweddol mewn modd dos ac amser-ddibynnol (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
Mae CTPG-W yn cymell apoptosis mewn celloedd Eca-109. Er mwyn ymchwilio i weld a oedd CTPG-W yn atal twf celloedd Eca-109 trwy anwythiad apoptosis neu necrosis, cafodd celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol o CTPG-W. Ar ôl 24 h, canfuwyd apoptosis a necrosis celloedd Eca-109 gyda staen V/PI Annexin. Fel y dangosir yn Ffig. 3 A, Annexin V-/PI plws celloedd yn giât fel celloedd necrotic, ac Annexin V plws / PI plws ac Annexin V plws / PI- celloedd yn giât fel celloedd apoptotig. Roedd CTPG-W yn bennaf gyfrifol am apoptosis celloedd Eca-109 mewn modd a oedd yn dibynnu ar ddos, er bod y celloedd Eca-109 necrotig hefyd wedi cynyddu'n sylweddol o dan driniaeth 600 a 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
Mae CTPG-W yn cymell arestiad cylchred celloedd yn y cyfnod S yng nghelloedd Eca-109. Bydd tarfu ar y cylch celloedd canser yn atal twf celloedd ac yn hyrwyddo apoptosis (27). Canfuwyd dosbarthiad y gylchred gell yng nghelloedd Eca-109 gyda staen PI yn dilyn triniaeth CTPG-W am 24 h. Gwelwyd bod celloedd yn y cyfnod S wedi cynyddu a bod celloedd yn y cyfnodau G0 / G1 yn nodi gostyngiad sylweddol cyffredinol ar driniaeth CTPG-W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
Mae CTPG-W yn lleihau Δψm ac yn achosi rhyddhau cytochrome c. Gall llwybr dibynnol mitocondriaidd achosi apoptosis (28,29). Mae aelodau pro-a gwrth-apoptotig y teulu protein BCL-2 yn cyflawni rolau pwysig wrth reoleiddio cyfanrwydd pilen mitocondriaidd (30,31). Yn dilyn triniaeth CTPG-W am 24 h, aseswyd yr Δψm gan ddefnyddio staenio JC-1. Bydd agreg JC-1 (fflworoleuedd coch a ganfyddir yn FL-2) yn dadelfennu i fonomer (fflworoleuedd gwyrdd wedi'i ganfod yn FL-1) pan fydd Δψm yn lleihau (32). Fel y dangosir yn Ffig. 5A, cynyddodd amlder celloedd FL-1 ynghyd â FL-2-/ ynghyd â chelloedd yn sylweddol mewn modd a oedd yn dibynnu ar ddos, gan ddangos bod Δψm celloedd Eca-109 wedi gostwng. Arsylwyd y newidiadau fflworoleuedd mewn celloedd Eca-109 hefyd gyda microsgop fflworoleuedd gwrthdro (Ffig. 5 B). Gyda'r crynodiadau cynyddol o CTPG-W, gostyngodd y fflworoleuedd coch a chynyddodd y fflworoleuedd gwyrdd, sy'n gyson â'r data o cytometreg llif. Sylwyd hefyd bod lefel y cytochrome c yn y cytosol wedi cynyddu'n sylweddol (Ffig. 5 C), sy'n ganlyniad i ostyngiad o Δψm. Mae hyn yn atgyfnerthu'r casgliad a dynnwyd o'r cyfrif cynyddol o FL-1 a FL-2-/ ynghyd â chelloedd bod Δψm wedi gostwng o ganlyniad i driniaeth CTPG-W. Mae wedi cael ei adrodd y gall JNK reoleiddio gweithrediad y teulu protein BCL-2 gan achosi rhyddhau cytochrome c (33-35). Penderfynwyd hefyd bod lefel y JNK wedi'i huwchreoleiddio'n sylweddol yn dilyn triniaeth CTPG-W (Ffig. 5C). Dangosodd y canlyniadau y gallai CTPG-W gymell apoptosis celloedd Eca-109 trwy lwybr dibynnol ar mitocondriaidd.
Effaith CTPG-W ar gynhyrchu ROS mewngellol. Gallai ROS leihau Δψm i gymell apoptosis (36). Er mwyn ymchwilio i weld a all CTPG-W gynyddu cynhyrchiant ROS, cafodd celloedd Eca-109 eu trin â chrynodiadau gwahanol o CTPG-W. Casglwyd celloedd ar y pwyntiau amser a nodwyd a'u staenio â DCFH-DA. Pennwyd cynhyrchu ROS mewngellol mewn celloedd Eca-109 gan sytometreg llif. Fel y dangosir yn Ffig. 6A, 800 µg/ml cynyddodd CTPG-W gynhyrchiad ROS yn sylweddol o 2-6h a gostyngiad o 12-24 h. Yn ogystal, cynyddodd 400 µg/ml CTPG-W gynhyrchu ROS yn sylweddol o 12-24 h. At hynny, ni wnaeth 200 µg/ml CTPG-W newid cynhyrchu ROS yn sylweddol. Gall newidiadau deinamig cynhyrchu ROS fod yn gysylltiedig ag apoptosis celloedd Eca-109. Penderfynwyd hefyd bod gan CTPG-W weithgaredd chwilota radical rhydd (Ffig. 6B), a allai fod yn gysylltiedig â'r gostyngiad mewn cynhyrchiad ROS mewn celloedd Eca-109 a gafodd eu trin â 800 µg/ml CTPG-W ar ôl 12 h.
Mae CTPG-W yn dadreoleiddio gweithgaredd caspase-3, caspase-7, caspase-9 a PARP. Gallai rhyddhau cytochrome c oherwydd gostyngiad Δψm actifadu'r proteasau caspase i gymell apoptosis (29,30,37). Yn dilyn triniaeth CTPG-W am 24 h, canfuwyd gweithrediad caspase-3, 7, 8, 9, a PARP gan ddadansoddiad blotiau gorllewinol. O'u cymharu â'r rheolaeth, mae lefelau caspase holltedig, caspase holltedig, caspase holltedig-3, a PARP holltedig, ond nid lefelau caspase holltedig{{{} 20}}, eu huwchreoleiddio gan driniaeth CTPG mewn modd dos-ddibynnol (Ffig. 7). Roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod CTPG-W wedi lleihau Δψm ac yn hyrwyddo rhyddhau cytochrome c i actifadu caspasau sy'n achosi apoptosis celloedd Eca-109.
Dyfyniad Cistanche tubulosa
Trafodaeth
Gallai CHM traddodiadol gymell apoptosis o gelloedd canser esophageal trwy wahanol lwybrau, gan gynnwys y derbynnydd marwolaeth anghynhenid, llwybrau straen reticwlwm mitocondriaidd cynhenid ac endoplasmig (29). Dangosodd ein hastudiaeth flaenorol fod CTPG, fel prif gydran C. tubulosa, yn atal twf celloedd melanoma B16-F10 trwy sefydlu apoptosis trwy lwybr dibynnol mitocondriaidd (24). Yn yr astudiaeth bresennol, ymchwiliwyd i effaith gwrth-tiwmor CTPG-W ar gelloedd Eca-109 a phenderfynwyd bod CTPG-W yn atal twf celloedd Eca-109, apoptosis ysgogedig, ac ataliad cylchred celloedd, lleihau Δψm, cynyddu rhyddhau cytochrome c a caspasau actifedig. Gallai CTPG a CTPG-W gymell apoptosis ac arestiad cylchred celloedd mewn celloedd canser. Fodd bynnag, mae'r mecanweithiau cywir yn wahanol oherwydd gwahanol gydrannau CTPG (26.64 y cant echinacoside, 10.19 y cant acteoside, a 1.71 y cant isoacteoside) a CTPG-W (39.16 y cant echinacoside a 2.44 y cant acteoside). Arestiodd CTPG gelloedd B{16-F10 yn y cyfnodau G0/G1, ond arestiodd CTPG-W gelloedd Eca-109 yn y cyfnod S (24). Cynyddwyd cynhyrchiad ROS yn ddibynnol ar ddos gan CTPG, ond nododd newid mewn modd dibynnol ar amser gan ddos uchel o CTPG-W, a gynyddodd yn sylweddol ar ddechrau triniaeth CTPG-W (2-6 h) a gostwng yn sylweddol ar ôl 12 h, o'i gymharu â'r rheolaeth. Rheswm posibl yw mai prif gydran CTPG-W yw echinacoside. Nododd nifer o astudiaethau y gallai echinacoside atal cynhyrchu ROS ac apoptosis a achosir gan ROS i gyflawni ei effeithiau niwro-amddiffynnol a gwrth-heneiddio (38-40). Yn yr un modd, arsylwyd ar y gweithgaredd chwilota radical rhydd yn yr astudiaeth bresennol. Felly, dyfalwyd y gallai rhai cydrannau, gan gynnwys verbascoside, iso-verbascoside, a salidroside mewn dos uchel o CTPG-W gymell cynhyrchu ROS ar unwaith i achosi apoptosis o gelloedd Eca-109 (41,42), ac yna Cafodd ROS ei ysbwriel gan echinacoside. Rheswm posibl arall dros y gwahaniaethau mewn cynhyrchu ROS gan CTPG a CTPG-W yw bod gwahanol linellau cell wedi'u defnyddio yn yr astudiaeth hon ac astudiaeth flaenorol (24). Dywedodd Dong et al (43) y gallai echinacoside gymell apoptosis celloedd canser colorectol SW480 dynol trwy gynhyrchu iawndal DNA ocsideiddiol heb lefelau ROS uwch.
Lleihaodd triniaeth CTPG-W Δψm ac achosi rhyddhau cytochrome c, sy'n hyrwyddo holltiad caspase-9 (28). Yn gyson, roedd lefelau caspase hollt-9 yn cael eu huwchreoleiddio gan driniaeth CTPG-W. Yn dilyn hynny, gall y caspase gweithredol-9 actifadu caspase-3 i gymell apoptosis (44). Cafodd lefelau caspase hollt-3 hefyd eu huwchreoleiddio gan driniaeth CTPG-W. Fodd bynnag, ni chafodd caspase-8 ei actifadu gan CTPG-W, sy'n dangos nad oedd y llwybr derbynnydd marwolaeth anghynhenid yn ymwneud â'r apoptosis a achosir gan CTPG-W. Mae'r arsylwadau hyn yn dangos bod CTPG-W yn ysgogi apoptosis o gelloedd Eca-109 trwy actifadu llwybr dibynnol mitocondriaidd.
Mae PARP yn cyflawni rolau pwysig mewn sefydlogrwydd genomig a gall y caspasau gweithredol ei hollti, yn enwedig caspase-3 a -7 (45). Penderfynwyd bod triniaeth CTPG-W yn actifadu caspase-3 a -7, a allai hollti PARP i atal atgyweirio DNA ac achosi apoptosis.
Mae CTPG-W hefyd, yn dibynnu ar ddos ac amser, yn atal twf celloedd BEL-7404 carcinoma hepatogellog dynol (data heb ei gyhoeddi). Er bod CTPG-W yn atal twf celloedd Eca-109 a BEL{-7404, mae'n hyrwyddo toreth o splenocytes, a all fod oherwydd cynnwys polysacaridau (~50 y cant) yn CTPG-W (46). ). Yn yr un modd, mae nifer o astudiaethau wedi nodi y gall polysacaridau hybu lledaeniad splenocytes (46-49). Ym model y llygoden, penderfynwyd bod CTPG-W wedi cynyddu mynegai'r ddueg yn sylweddol, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, ond nad oedd yn effeithio ar bwysau'r corff a'r mynegeion organau eraill gan gynnwys y galon, yr afu, yr arennau a'r ysgyfaint (data heb ei gyhoeddi), sy'n nodi nad oes gan CTPG-W unrhyw effaith sytotocsig ar gelloedd normal.
Gyda'i gilydd, dangosodd y data bod CTPG-W yn atal twf celloedd Eca-109 trwy anwytho apoptosis trwy lwybr dibynnol ar mitocondriaidd.
buddion cistanche: gwrth-apoptosis
Diolchiadau
Hoffai'r awduron ddiolch i Dr. Jianhua Yang (Coleg Meddygaeth Baylor) am gaboli'r llawysgrif.
Ariannu
Cefnogwyd yr astudiaeth hon gan y 13eg Cynllun Pum Mlynedd ar gyfer Prosiect Ceisiadau Bioleg Disgyblaeth Allweddol (grant rhif. 17SDKD0202), Prifysgol Normal Xinjiang a Labordy Allweddol Cymhwyso a Rheoleiddio Bioamrywiaeth Amgylchedd Arbennig yn Xinjiang (rhif grant XJTSWZ-2017-04) i JL a Grant Sefydliad Cenedlaethol Gwyddoniaeth Naturiol Tsieina (grant rhif 31760260) i XW.
Argaeledd data a deunyddiau
Mae data a deunyddiau a ddefnyddiwyd ac a ddadansoddwyd yn ystod yr astudiaeth bresennol ar gael gan yr awdur cyfatebol ar gais rhesymol.
Cyfraniadau awduron
Perfformiodd CF, AA, YY, a QC yr arbrofion. Dadansoddodd LX, JLv, a XW y data a'r ffigurau a baratowyd. Dyluniodd JinyuL a JinyaoL y prosiect ac ysgrifennodd y llawysgrif.
Cymeradwyaeth foesegol a chaniatâd i gymryd rhan
Cymeradwywyd yr holl arbrofion anifeiliaid gan y Pwyllgor ar Foeseg Arbrofion Anifeiliaid o Labordy Allweddol Adnoddau Biolegol a Pheirianneg Genetig Xinjiang (cymeradwyaeth, rhif BRGE-AE001; Prifysgol Xinjiang).
Caniatâd y claf i gyhoeddi
Ddim yn berthnasol.
Diddordebau cystadleuol
Mae'r awduron yn datgan nad oes ganddynt unrhyw fuddiannau cystadleuol.
Cyfeiriadau
Wu CR, Lin HC, a Su MH: Gwrthdroi gan dyfrllyddetholiadau o Cistanche tubulosao ddiffygion ymddygiadol ym model llygod mawr tebyg i glefyd Alzheimer: Perthnasedd ar gyfer dyddodiad amyloid a swyddogaeth niwrodrosglwyddydd canolog. BMC Ategol Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J a Zhang F:Glycosidau ffenylethanoid o Cistanche tubulosayn atal twf celloedd B16-F10 in vitro ac in vivo trwy ysgogi apoptosis trwy Lwybr sy'n ddibynnol ar mitocondria. J Canser 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME, a Berset C: Defnyddio dull radical rhydd i werthuso gweithgaredd gwrthocsidiol. LWT-Technoleg Gwyddor Bwyd 28: 25-30, 1995.
