Mae Cistanche Tubulosa yn Amddiffyn Niwronau Dopaminergig Trwy Reoliad Apoptosis A Ffactor Niwrotroffig sy'n Deillio o Gelloedd Glial: yn Vivo Ac yn Vitro-Ⅰ

RHAGARWEINIAD

Mae clefyd Parkinson (PD) yn glefyd niwroddirywiol cyffredin sy'n digwydd mewn pobl oedrannus gyda'r amlygiadau patholegol o golli niwronau dopaminergig yn y substantia nigra (SN) oherwydd dirywiad. Mae difrifoldeb y clefyd yn cydberthyn â cholled celloedd niwronaidd dopamin (DA) yn yr SN, sy'n gyson â'r farn bod y niwroddirywiolmae'r broses yn mynd rhagddi dros nifer o flynyddoedd cyn i unrhyw symptomau ymddangos (Sawle a Myers, 1993). Mae natur gynyddol y clefyd yn awgrymu posibiliadau diddorol ar gyfer ymyrraeth therapiwtig trwy rwystro'r broses niwroddirywiol sylfaenol. Mae'r chwilio am weithredoedd grymus a phenodol a achosir gan therapi o ffactorau niwrotroffig ar oroesiad niwronau DA felly o ddiddordeb mawr.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER AMDDIFFYN NIWRONAU DOPAMINERGIG PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Mae ffactorau niwrotroffig yn broteinau hanfodol, gan gynnwys ffactor twf nerf (NGF), ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF), a ffactor niwrotroffig glial sy'n deillio o gelloedd (GDNF), sy'n hyrwyddo twf nerfau, datblygiad niwrolegol, arweiniad echelinol, a swyddogaeth niwronaidd. Ymhlith yr holl ffactorau niwrotroffig sy'n amddiffyn ac yn hyrwyddo atgyweirio niwronau dopaminergig, mae gan GDNF yr effeithiau cryfaf (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Dangoswyd bod GDNF yn meddu ar effeithiau niwrotroffig cryf ar niwronau DA in vitro (Lin et al., 1993) ac i gael effeithiau niwro-amddiffynnol in vivo. Dangoswyd bod GDNF yn achub niwronau DA nigral rhag marwolaeth celloedd a achosir gan friw ar ôl axotomi a achosir gan lawdriniaeth neu docsin mewn llygod mawr (Beck et al., 1995; Kearns a Gash, 1995; Sauer et al., 1995) ac yn rhannol hefyd ar ôl gweinyddu systemig oN-methyl-4-ffenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)mewn llygod (Tomac et al., 1995). Mae nifer cynyddol yr achosion o apoptosis niwronaidd a llai o effeithiau amddiffynnol ffactorau niwrotroffig, a allai gael eu hysgogi gan ffactorau patholegol amrywiol, yn sail i ddirywiad niwronau dopaminergig (Holden et al., 2006).

Mae C. tubulosa yn feddyginiaeth lysieuol sy'n tarddu o sawl planhigyn o'r genws Cistanche. Mae'n opsiwn therapiwtig mawr ar gyfer syndrom diffyg arennau sydd â chysylltiad agos â hormonau androgen mewn meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol (TCM). Hyd yma, mae llawer o ymchwil glinigol a sylfaenol ar C. tubulosa wedi dangos gweithgareddau clefydau niwroddirywiol. Gallai nodi presgripsiynau tynhau aren TCM mewn triniaeth PD felly ddarparu triniaeth glinigol amgen ar gyfer PD.Echinacoside (ECH)yn gydran bioactif fawr a geir yn y perlysiau meddyginiaethol C. tubulosa. Mae astudiaethau wedi dangos effeithiau therapiwtig glycosidau Cistanche ac ECH,verbscoside(VER), ac icariin (ICA) ar glefyd Alzheimer (AD), PD, a chleifion dementia fasgwlaidd eraill (Urano a Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Roedd Wu et al. (2014) fod darnau C. tubulosa a oedd yn cynnwys digon o ECH ac acteoside yn lleddfu'r camweithrediad gwybyddol a achosir gan A -42 trwy rwystro dyddodiad amyloid a gwrthdroi swyddogaeth niwronaidd dopaminergig cholinergig a hippocampal. Mae Tao et al. (2015) wedi canfod bodglycosidau ffenylethanoido C. tubulosa (Ph Gs-Ct) atal oedema cerebral uchder uchel trwy leihau mynegiant protein a mRNA AQP4 ym meinwe ymennydd modelau llygod mawr.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA BYRBRYDAU DYFYNIAD GWELLA'R COF PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod cyfansoddion llysieuol Tsieineaidd, gan gynnwys y tri chynhwysyn C. tubulosa, epimedium, a rhizoma polygonati, wedi lleddfu difrod i niwronau dopaminergig a lefelau uwch o dopamin trwy reoleiddio mynegiant ffactorau niwrotroffig (Wu et al., 2013). Felly, nid yw'n hysbys eto a yw'r effeithiau niwro-amddiffynnol a achosir gan C. tubulosa yn para'n hir ac i ba raddau y gall achub niwronau nigral DA trwy weinyddu GDNF fforddio cadw ymddygiadau modurol sy'n berthnasol i symptomatoleg anifeiliaid PD yn sylweddol. Defnyddiodd yr astudiaeth hon rysáit TCM tonyddio arennau, C. tubulosa nanopopwder, sydd wedi derbyn patent cenedlaethol (rhif patent: 2011103028541) yn Tsieina ac sydd wedi dangos effaith therapiwtig benodol mewn PD yn flaenorol. Cynlluniwyd yr astudiaeth bresennol, felly, i archwilio effeithiau niwro-amddiffynnol ac adfywiol triniaeth C. tubulosa ac ymchwilio i'r apoptosis ar gelloedd MES23.5 a llygod mawr diffiniol ymddygiadol, a rheoleiddio GDNF, fel y'i mesurwyd gan batri o brofion targed .

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Deunyddiau, Adweithyddion, ac Offer

Prynwyd C. tubulosa o Beijing Tong Ren Tang Group, Co, Ltd, Beijing, Tsieina. Daeth ECH, VER, ac ICA o'r Sefydliadau Cenedlaethol ar gyfer Rheoli Bwyd a Chyffuriau, Tsieina. Roedd llinell gell niwronaidd dopaminergig MES23.5 yn anrheg gan yr Athro Biao Chen, Labordy Niwrobioleg, Prifysgol Capital Medical, Beijing, Tsieina. Prynwyd pum deg C57BL/6 llygod gwrywaidd (yn pwyso 20–25 g yr un) oddi wrth Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (rhif trwydded: SCXK2012-0002), Shanghai, China.

Prynwyd MPP+, MTT, a glutamine gan Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, UDA); Prynwyd serwm buchol canolig a ffetws DMEM/F12 oddi wrth Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, UDA); a MPTP, safon DA a safon asid homovanillic (HVA) eu prynu gan Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, UDA). -actin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF teulu receptor alffa (GFR 1) a gwrthgyrff Ret eu prynu oddi wrth Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, UDA); Prynwyd pecyn adweithydd staenio 3,3'-diaminobenzidine (DAB) gan Fuzhou Maixin Biotech., Ltd (Fujian, Tsieina); a phecyn paratoi sampl gel SDS-PAGE, pecyn canfod cemiluminescence uwch-sensitif (ECL) a assay asid bicinchoninic (BCA) gan Beyotime Institute of Biotechnology (Beijing, Tsieina).

Defnyddiodd yr astudiaeth hon yr offerynnau canlynol: ELX800 darllenydd microplate (Bio Tek Winooski, VT, UDA); deorydd CO2 (Heraeus, Hanau, yr Almaen); System dadansoddi delweddu gel DOC 2000 gel, cell electrofforesis a thanc electrofforesis (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA); Dadansoddwr protein DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, UDA); 5417R allgyrchydd rheweiddiedig cyflym (Eppendorf, Hamburg, yr Almaen); Melin bêl deuol planedol SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co, Ltd, Hunan, Tsieina); Melin gymysgu MM400 (Retsch GmbH, Haan, yr Almaen); Cromatograffaeth hylif perfformiad uchel Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, UDA); PowerPac Electrofforesis sylfaenol, system drosglwyddo trawsbilen sylfaenol PowerPac, delweddwr cemiluminescence Universal Hood II, S1000 Thermal Cycler RNA system trawsgrifio gwrthdro (Bio-Rad); System dadansoddi delweddau meinwe a chelloedd Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co, Ltd, Xiamen, Tsieina).

ParatoiC. tubulosaNanopowdr

Roedd C. tubulosa yn cael ei bwyso, yna ei buro a'i ddadhydradu. Ar ôl malurio confensiynol, cafodd powdr mân C. tubulosa ei basio trwy ridyll rhwyll 200- a'i rewi-sychu. Defnyddiwyd gwactod a reolir gan dymheredd a melin bêl ynni uchel i baratoi'r C. tubulosa nanopopwdwr. Yn gyntaf, gosodwyd nanopowder C. tubulosa amrwd mewn tanc melino pêl gwactod a lwythwyd â pheli malu carbid. Roedd y gymhareb rhwng y peli malu a C. tubulosa nanopopwder yn amrywio o 15:1 i 5:1. I gael powdr mân, gosodwyd cyflymder a hyd y felin bêl ynni uchel i 300 rpm ac 20 munud, yn y drefn honno. Pwyswyd y powdr mân ar gyfer prosesu deunyddiau nanoscale a'i brosesu yn y felin gymysgu gydag amlder o 25/s ac osciliad o 20au am dri ailadrodd. Defnyddiwyd PBS i doddi a pharatoi hydoddiant stoc 25 mg/mL, ac yna 30 munud o ultrasonication, awtoclafio, ac yn olaf storio ar −20◦C.

Rheoli Ansawdd Cydrannau Gweithredol oC. tubulosagan HPLC

Roedd yr ECH a VER yn cynnwys elution graddiant gyda silica bond octadecylsilane fel llenwad, methanol fel cam symudol A, a 0.1% hydoddiant asid fformig fel cam symudol B. Y donfedd canfod oedd 330 nm. Roedd yr ICA yn cynnwys elution graddiant gyda silica wedi'i fondio octadecylsilane fel llenwad a dŵr acetonitrile (30:70) fel y cyfnod symudol. Y donfedd canfod oedd 270 nm. Mesurwyd y sampl, y rheolaeth, a'r rheolaeth negyddol fel 10 µL yr un ar gyfer y prawf.

Diwylliant Cell a Assay MTT i Fesur Hyfywedd MPP+-Celloedd wedi'u Trin

Cafodd celloedd MES23.5 eu brechu â 5% o serwm llo ffetws, 1% glutamine, 2% 50 × hydoddiant Sato, a chyfrwng DMEM/F12 gyda 2% penisilin/streptomycin. Cawsant eu deor ar 37◦C mewn deorydd CO2 5% gyda lleithder dirlawn. Cafodd y celloedd eu hynysu a'u pasio gyda 0.25% trypsin a chynaeafwyd ataliad y gell yn y cyfnod twf logarithmig. Cafodd celloedd ynysig â dwysedd o 1 × 105 eu hadu i blatiau ffynnon 96- wedi'u gorchuddio â polylysin, ac yna ychwanegu crynodiadau terfynol gwahanol (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 a 800 µmol/L ) o gyfryngau MPP+. Defnyddiwyd celloedd MES23.5 a ddeorwyd â chyfrwng diwylliant arferol am 24 h a 48 h fel rheolaethau negyddol yn yr arbrofion in vitro. Deorwyd y celloedd o'r gwahanol grwpiau triniaeth ag adweithydd MTT am 4 h. Yna cafodd yr hydoddiant yn y ffynhonnau ei daflu ac ychwanegwyd 150 µL o DMSO a'i osgiladu am 10 munud. Mesurwyd amsugnedd pob sampl ar donfedd o 570 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate awtomatig. Canran hyfywedd celloedd (%)=amsugnedd cymedrig y grŵp arbrofol/amsugnedd cymedrig y grŵp rheoli negyddol × 100%.

Ychwanegwyd crynodiadau perthnasol o gyfrwng MPP+ ar gyfer y driniaeth 24-awr mewn celloedd MES23.5 gan ddefnyddio'r un dull ag ar gyfer y diwylliant in vitro. Ar ôl y driniaeth, cafodd yr hydoddiant yn y ffynnon ei daflu. Ychwanegwyd cyfryngau sy'n cynnwys crynodiadau gwahanol (10, 50, 100, 200, 250, 500, a 1000 µg/mL) o C. tubulosa nanopoper at gelloedd MES23.5 mewn gwahanol ffynhonnau a'u gadael i ddeor am 24 h a 48 h. Defnyddiwyd y celloedd MES23.5 a ddeorwyd â chyfrwng diwylliant arferol am 24 h a 48 h fel rheolaethau negyddol. Defnyddiwyd y celloedd MES23.5 a ddeorwyd â chyfrwng MPP+ fel y cerbyd. Gwnaed y mesuriadau yn driphlyg ar gyfer pob sampl. Mesurwyd amsugnedd y grwpiau triniaeth a rheoli cyfatebol i gyfrifo hyfywedd celloedd.

DYFYNIAD GWRTHFFLinder PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Mynegiant TH Wedi'i Fesur gan Imiwnocytocemeg

Pan oedd C. tubulosa nanopowder yn 100, 200, a 250 µg/ml, cynyddodd cyfradd goroesi celloedd yn sylweddol (Ffigur 2G). Felly, mewn arbrofion dilynol, gwnaethom brofi'r tri chrynodiad: grwpiau dos isel, dos canol a dos uchel. Profwyd tri atgynhyrchiad ar gyfer pob un o'r grwpiau C. tubulosa. Rhoddwyd slipiau gorchuddio polylysin wedi'u sterileiddio mewn 6-blatiau ffynnon. Nesaf, cafodd celloedd 5 × 104 eu hadu ym mhob ffynnon a'u deor am 24 h. Disodlwyd cyfrwng ffres confensiynol yn y grŵp rheoli arferol a disodlwyd crynodiad terfynol o gyfrwng 100 µmol/L MPP+ yn y grwpiau triniaeth sy'n weddill i ddeor am 24 h. Yna disodlwyd cyfryngau ffres confensiynol yn y grwpiau rheoli a cherbydau arferol, a chafodd crynodiadau terfynol o 100, 200, a 250 µg/mL C. tubulosa nanopopor eu deor â'r celloedd am 24 h yn y dos isel, cymedrol ac uchel C. grwpiau triniaeth tubulosa, yn y drefn honno. Cafodd y celloedd MES23.5 yn y gwahanol grwpiau eu golchi deirgwaith yn PBS i gael gwared ar y supernatant a'u gosod ymhellach mewn paraformaldehyde 4% am 15 munud. Ar ôl golchi gyda PBS, cafodd y celloedd eu deor â rhwystrydd peroxidase ar 37◦C am 30 munud ac yna eu golchi eto gyda PBS. Defnyddiwyd hydoddiant 0.2% Triton X{-100 ar gyfer athreiddedd celloedd am 10 munud, ac yna golchi â PBS. Ychwanegwyd serwm gafr arferol at bob sampl a'i ddeor ar dymheredd ystafell am 30 munud. Yna tynnwyd y serwm gafr arferol ac ychwanegwyd y gwrthgorff sylfaenol wedi'i wanhau 1:400 mewn PBS at bob sampl a'i ddeor ar 4◦C dros nos. Deorwyd y celloedd yn y grŵp rheoli negyddol â PBS ar 4◦C dros nos. Ar ôl golchi gyda PBS, deorwyd y celloedd â gwrthgyrff eilaidd wedi'u labelu â biotin yn y siambr lleithder ar 37◦C am 20 munud. Yna golchwyd pob sampl mewn PBS a'i labelu â chyfuniadau rhuddygl poeth peroxidase-streptavidin (hydoddiant gweithio C) ar 37◦C am 20 munud. Ar ôl golchi gyda PBS, cafodd y celloedd eu staenio ag adweithydd DAB yn y tywyllwch am oddeutu 1-10 munud a chafodd datblygiad lliw brown ei fonitro o dan ficrosgopeg golau. Yna golchwyd pob sampl ddwywaith mewn dŵr distyll am 1–2 funud a gwrth-staeniwyd y niwclysau â hydoddiant hematocsilin am 0.5–1 munud. Ar ôl rinsio pob sampl mewn dŵr yn drylwyr, cafodd y celloedd eu trochi mewn 1% o alcohol asid hydroclorig i'w gwahaniaethu ac 1% amonia dyfrllyd, ac yna golchi'r celloedd mewn dŵr yn drylwyr. Yna cafodd y celloedd o bob sampl eu dadhydradu mewn 70% ethanol am 2 funud, 80% ethanol am 2 funud, 90% ethanol am 2 funud ddwywaith, 95% ethanol am 2 funud ddwywaith, a 100% ethanol am 2 funud ddwywaith. Yna cafodd y celloedd eu trochi mewn hydoddiant xylene am 2 funud ddwywaith a'u gosod ar sleid gwydr gyda resinau niwtral. O dan ficrosgopeg ysgafn, cafodd pob sampl ei dal delwedd a dewis ar hap o 5-10 maes gweledol effeithiol i bennu mynegiant proteinau dethol mewn niwronau dopaminrgig a nodir gan ddwysedd y gronynnau brown ac i hanner-meintoli'r cynnwys protein yn ôl ei werth llwyd cyfartalog. .

Cyfradd Apoptosis o gelloedd MES23.5 wedi'i Mesur gan Sytometreg Llif

Roedd celloedd ymlynol yn cael eu golchi unwaith gyda PBS. Ar gyfer ynysu celloedd, ychwanegwyd swm priodol o hydoddiant trypsin heb EDTA ar dymheredd yr ystafell a chafodd yr hydoddiant ei bibedu'n ysgafn i ganiatáu i gelloedd ymlynol ddatgysylltu. Yna ychwanegwyd cyfrwng meithrin celloedd i atal y trypsineiddiad. Trosglwyddwyd y gymysgedd i diwb centrifuge newydd ac yna ei allgyrchu am 5 munud ar 1500 rpm i gasglu'r celloedd ynysig. Ar ôl taflu'r uwchnatant, cafodd y belen gell ei haildynnu'n ysgafn gan ddefnyddio PBS, a chafodd y celloedd eu cyfrif. Cafodd tua 1 × 105 i 5 × 105 o gelloedd wedi'u hailddarlledu eu hallgyrchu am 5 munud ar 1500 rpm a chafodd y supernatant ei daflu. Ychwanegwyd pum microlitr o hydoddiant rhwymo Annexin V-FITC at y belen gell i atal y celloedd yn ysgafn eto. Ychwanegwyd 5 µL arall o Annexin V-FITC a'i gymysgu'n drylwyr. Defnyddiwyd pum microlitr o hydoddiant ïodid propidium ar gyfer staenio celloedd trwy ddeor ar dymheredd ystafell am 10 munud ychydig cyn y cytometreg llif.

Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol ar gyferin vitro

Rhannwyd y celloedd yn grŵp arferol, grŵp triniaeth MPP+, dos iselC. tubulosagrŵp triniaeth, grŵp triniaeth dos cymedrol C. tubulosa, a grŵp triniaeth dos uchel C. tubulosa. Mesurwyd mynegiant Bcl2 a Bax ym mhob un. Defnyddiwyd cyfanswm o 1 × 105 cell y ffynnon yn 6-plât y ffynnon ar gyfer modelu a thrin ym mhob grŵp cyn cynaeafu celloedd. Ychwanegwyd lysate cymysg, yn cynnwys byffer RIPA, atalydd proteas, ac atalydd ffosffatas, i lyse'r celloedd am 30 munud ar rew. Ar ôl centrifugation, defnyddiwyd y supernatant ar gyfer dadansoddi protein. Mesurwyd cyfanswm y protein gan ddefnyddio assay BCA a'i wahanu gan 10% SDS-PAGE. Trosglwyddwyd y proteinau gwahanedig i bilen a'u deor gyda byffer atal llaeth sgim o 5% ar dymheredd ystafell am 2 awr. Yna deorwyd y bilen mewn gwrthgorff cynradd (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0.11 mg/ml, gwanediad 1:200) ar 4◦C dros nos. Ar ôl cam golchi, deorwyd y bilen mewn gwrthgorff eilaidd (0.5 mg / ml, gwanhau 1:5000) ar 4◦C am 1 awr ac yna mewn datblygwr ECL am 2 funud ar gyfer datblygiad confensiynol. Defnyddiwyd meddalwedd Meintiau Un ar gyfer dadansoddiad lled-feintiol o fynegiant protein.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWRTHGLinder AMDDIFFYN YR Afu PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Modelu Anifeiliaid Arbrofol a Gweinyddu Cyffuriau

Rhannwyd hanner cant o lygod gwrywaidd wythnos oed heb bathogen penodol ar hap yn bum grŵp: grŵp arferol, grŵp triniaeth MPTP (Cerbyd), grŵp triniaeth C. tubulosa dos isel, triniaeth C. tubulosa dos cymedrol grŵp, a grŵp triniaeth dos uchel C. tubulosa. Roedd yr anifeiliaid dan do ar 20–22◦C gyda mynediad am ddim i fwyd a dŵr. Cafodd y llygod yn y grŵp arferol eu chwistrellu'n fewnberitoneol gyda chyfaint cyfartal o halwynog arferol am saith diwrnod yn olynol. Cafodd y llygod yn y grwpiau triniaeth eraill eu chwistrellu'n fewnperitoneol gyda MPTP (30 mg/kg/d) am saith diwrnod yn olynol i sefydlu cerbydau.

Yn ystod modelu PD, rhoddwyd cyfeintiau clinigol cyfatebol o 4 g/kg/d, 8 g/kg/d, a 16 g/d, i'r llygod yn y grwpiau triniaeth dos isel, dos cymedrol, a dos uchel o C. tubulosa. kg/chC. tubulosa nanopopwder, yn y drefn honno, am 14 diwrnod yn olynol. Roedd y llygod yn y grwpiau rheoli a cherbydau'n cael eu gweinyddu'n fewn-gastig symiau cyfatebol o halwynog arferol am 14 diwrnod yn olynol. Cymeradwywyd yr holl weithdrefnau arbrofol gan Bwyllgor Moesegol Prifysgol Fujian TCM ac fe'u perfformiwyd yn unol â'r egwyddorion a dderbynnir yn rhyngwladol ar gyfer defnydd a gofal anifeiliaid labordy. Gwnaed pob ymdrech i leihau dioddefaint anifeiliaid yn yr astudiaeth hon.