Cydlynu Rheoleiddio Metabolaeth Tryptoffan Systemig Ac Arennau Gan y Cludwyr Cyffuriau OAT1 Ac OAT3
Mar 20, 2022
Jeffry C. Granados1, Anne Richelle2, Jahir M. Gutierrez1, Padrig Zhang3, Xinlian Zhang4, Vibha Bhatnagar5, Nathan E. Lewis1,2,6, a Sanjay K. Nigam2,7,*
Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com
profiad cistanche
Mae sut mae organau'n synhwyro metabolion sy'n cylchredeg yn gwestiwn allweddol. Yma, rydym yn dangos bod y cludwyr anion organig aml-benodol cyffuriau, OAT1 (SLC22A6 neu NKT) ac OAT3 (SLC22A8), yn chwarae rhan mewn synnwyr organau. Datgelodd dadansoddiadau metabolomeg o serwm llygod o Oat1 a Oat3 newidiadau mewn deilliadau tryptoffan sy'n ymwneud â metaboledd a signalau. Mae nifer o'r metabolion hyn yn deillio o'r microbiome perfedd ac maent yn gysylltiedig â thocsinau uremig mewncronigarenclefyd. Cefnogwyd rhyngweithio uniongyrchol â'r cludwyr gyda phrofion trafnidiaeth yn seiliedig ar gelloedd. Er mwyn asesu effaith colli swyddogaeth OAT1 neuOAT3 ar yr aren, organ lle mae'r cludwyr derbyniad hyn wedi'u mynegi'n fawr, cafodd data trawsgrifomig canlyniadol eu mapio ar fodel cyfrifiannol yn seiliedig ar "dasg metabolig" sy'n gwerthuso dros 150 o swyddogaethau cellog. Er gwaethaf y newidiadau o fetabolion tryptoffan yn y ddau ergyd, dim ond yn sgil taro Oat1 y cynyddodd nifer o swyddogaethau cellog cysylltiedig â thryptoffan. Felly, wedi'i hamddifadu o'r gallu i gymryd kynurenine, kynurenate, anthranilate, a N-for-mylanthranilate trwy OAT1, mae'r aren yn ymateb trwy actifadu ei llwybrau biosynthetig ei hun sy'n gysylltiedig â thryptoffan. Mae'r canlyniadau'n cefnogi'r Theori Synhwyro a Signalau o Bell, sy'n disgrifio sut mae cludwyr "cyffuriau" yn helpu i wneud y gorau o lefelau metabolion a moleciwlau signalau trwy hwyluso traws-siarad organau. Gan fod OAT1 ac OAT3 yn cael eu rhwystro gan lawer o gyffuriau, mae'r data'n awgrymu'r potensial ar gyfer rhyngweithiadau cyffuriau-metabolyn. Yn wir, trin pobl â probenecid, atalydd OAT a ddefnyddir i drin gowt, metabolion tryptoffan uchel sy'n cylchredeg. At hynny, o ystyried bod asiantaethau rheoleiddio wedi argymell profi cyffuriau ar gyfer rhwymo neu gludo OAT1 ac OAT3, mae'n dilyn y gellir defnyddio'r metabolion hyn fel biomarcwyr mewndarddol i benderfynu a yw ymgeiswyr cyffuriau yn rhyngweithio ag OAT1 a/neu OAT3.
Mae'r cludwyr anion organig OAT1 (SLC22A6, NKT (1) yn wreiddiol) ac OAT3 (SLC22A8, ROCT (2) yn wreiddiol)) i'w cael yn tiwbyn procsimol yarena phlecsws choroid yr ymennydd a rheoli dosbarthiad ffisiolegol a dileu nifer o gyffuriau a tocsinau amgylcheddol yn ogystal â metabolion mewndarddol megis -ketoglutarate, prostaglandinau, ac urate (3, 4). Yn ogystal, mae OATs yn helpu i reoleiddio lefelau o gynhyrchion naturiol sy'n cael eu llyncu a chyfansoddion sy'n deillio o ficrobiome perfedd (ee, epicatechin, 3- sylffad indocsil, sylffad p-cresol) (5, 6).
Mae OAT1 ac OAT3, aelodau o deulu SLC22, ymhlith y cludwyr cyffuriau aml-benodol mwyaf adnabyddus. Mae'r grŵp hwn o gludwyr cyffuriau yn cynnwys aelodau eraill o'r SLC (cludwr hydoddyn) a'r ABC (ATP-rhwymo casét) superfamilies (7, 8). Mae llenyddiaeth helaeth ar rolau fferyllol a gwenwynegol y cludwyr hyn, ond dim ond dechrau cael ei nodweddu yw swyddogaethau mewndarddol y proteinau hyn sydd wedi'u cadw'n esblygiadol, yn ogystal â'r rhwydwaith rheoleiddio y maent yn cymryd rhan ynddo (9). Mae'r cludwyr aml-benodol hyn yn dylanwadu ar lawer o agweddau ar ffisioleg a phathoffisioleg, yn debygol trwy weithredu ar y cyd â chludwyr mono- neu oligo-benodol. Tair enghraifft pathoffisiolegol â nodweddion da yw rolau OAT1, OAT3, URAT1, ac ABCG2 mewn gowt (10), rôl OAT1 ac OAT3 wrth gronni tocsinau uremig sy'n gysylltiedig â chronig.arenclefyd (CKD) (11, 12), a'r teulu SLC22 mewn aciwtarenanaf (13).
Oherwydd yr amrywiaeth eang o gyfansoddion anion organig bach a gludir gan OAT1 ac OAT3, mae'n bosibl y bydd ystod eang o senobiotigau a moleciwlau mewndarddol yn cystadlu am fynediad i a chlirio arennol gan y cludwyr OAT hyn (14, 15). Mae gan hyn oblygiadau pwysig oherwydd bod llawer o'r metabolion, gan gynnwys y rhai sy'n deillio o'r microbiome perfedd ac sy'n cael eu cludo gan OAT1 ac OAT3, yn rheoleiddio ffisioleg mewndarddol ac wedi'u cysylltu â datblygiad anhwylderau clinigol, megis CKD, syndrom metabolig, a diabetes (14, 16, 17). Er enghraifft, mae faint o CMPF (3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2- furan propanoic acid), swbstrad o OAT3, yn y cylchrediad wedi bod yn gysylltiedig â diabetes. Mae CMPF yn fetabolyn asid brasterog furan a geir mewn olewau pysgod, olewau llysiau, menyn, a bwydydd eraill ac yn amharu ar swyddogaeth celloedd pancreatig, gan arwain at anoddefiad glwcos (18, 19). Mae canlyniadau posibl cystadleuaeth ar lefel cludwr rhwng cyffur a'r metabolyn mewndarddol a gludir yn cynnwys (a) crynodiadau mewngellol newidiol o fetabolion oherwydd bod cyffur sy'n cael ei gludo yn rhwystro mynediad metabolyn i'r gell; (b) crynodiadau serwm wedi'u newid o'r cyffur, y metabolyn, neu'r ddau, sy'n arwain at gynnydd mewn hanner oesau a/neu lefelau metabolyn; ac (c) metabolaeth systemig wedi'i newid sy'n deillio o effeithiau rhaeadru distal ar lwybrau metabolaidd lluosog sy'n dibynnu ar OAT1 neu OAT3 neu'r ddau.
Fe wnaethom gymhwyso dull bioleg systemau a ddefnyddiodd ddata metabolomeg a thrawsgrifio o lygod Oat1 a Oat3knockout (KO) i ddadansoddi'r prif swyddogaethau metabolaidd y mae OAT1 ac OAT3 yn dylanwadu arnynt. Roedd y data metabolomig serwm o lygod Oat1 a Oat3 KO yn cynrychioli effaith y cludwyr hyn ar fetaboledd systemig mewndarddol. Fe wnaethom ddefnyddio'r data trawsgrifio o'raren, sef safle mynegiant y genynnau cludwr amgodio, i werthuso gweithgaredd cannoedd o swyddogaethau metabolig gan ddefnyddio dadansoddiad tasg metabolig. Wrth wneud hynny, roeddem yn gallu ategu dealltwriaeth o newidiadau metabolyn allgellog oherwydd colli'r cludwr OAT1 neu OAT3 gyda dadansoddiad o lwybrau metabolaidd mewngellol yr effeithiwyd arnynt.
Gyda’i gilydd, mae’r dull aml-omeg a’r dadansoddiad bioleg systemau a ddefnyddir yma yn darparu portread o’r llwybrau metabolaidd a signalau lleol a systemig wedi’u modiwleiddio ar wahân ac ar y cyd gan OAT1 ac OAT3. Rydym yn dangos bod OAT1 nid yn unig yn rheoleiddio metaboledd tryptoffan yn systematig ond hefyd yn chwarae rhan allweddol yn y llwybrau metabolaidd tryptoffan y tu mewn i'r meinwe lle mae'n cael ei ddarganfod. Felly, mae ein canlyniadau'n nodi y dylai astudiaethau o endidau cyffuriau newydd nid yn unig ystyried yr effeithiau rhyngweithio cyffuriau-metabolyn (DMI) yn y serwm ond hefyd werthuso newidiadau posibl mewn metaboledd cellog oherwydd colli mewnlifiad metabolyn trwy gystadleuaeth ar lefel y cludwr. I gefnogi perthnasedd dynol ein gwaith, rydym yn dangos bod llawer o'r newidiadau yn lefelau serwm metabolion tryptoffan a welir yn y llygod taro hefyd i'w gweld mewn bodau dynol ar ôl rhoi probenecid, cyffur a ddefnyddir i drin gowt sy'n atal OAT1 ac OAT3.
\
manteision gwrywaidd cistanche
Canlyniadau
Crynodeb o'r ymagwedd gyffredinol
Mae teulu genynnau SLC22 (OATs, OCTs, OCTNs) yn amgodio ar gyfer cludwyr sy'n cymryd rhan yn y nifer sy'n cymryd llawer o gyfansoddion unigryw ar draws sawl meinwe, er bod llawer o'r ymchwil wedi canolbwyntio ar lond llaw o aelodau (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8) sy'n trin llawer o gyffuriau cyffredin (20, 21). Fodd bynnag, mae'r genynnau hyn wedi'u cadw'n fawr, gydag orthologau mewn pryfed, mwydod, pysgod, a draenogod y môr (22); mae hyn yn awgrymu bod ganddynt rolau ffisiolegol pwysig y tu hwnt i drin cyffuriau. Er mwyn pennu rolau mewndarddol OAT1 ac OAT3 wrth reoli metaboledd lefel meinwe a lefel organeb yn annibynnol ar eu rolau adnabyddus fel cludwyr cyffuriau a thocsin, dadansoddwyd data trawsgrifomig meinwe-benodol a data metabolomeg serwm (Ffig. 1). Cymharwyd data o lygod oedd yn enetig ddiffygiol naill ai mewn Ceirch1 neu Ceirch3 a'u rheolaethau math gwyllt. Mae'r setiau data hyn wedi'u harchwilio'n flaenorol o safbwynt cemowybodeg (23) ac i ddarparu trosolwg eang o'r llwybrau yr effeithir arnynt (24), ond yma rydym yn rhoi pwyslais ar eu rôl benodol wrth waredu metabolion tryptoffan. Am fod y ddau gludydd hyn i'w cael yn yaren, dadansoddwyd gennymarendata trawsgrifomig gan ddefnyddio Dadansoddiad Tasg Metabolaidd, dull bioleg systemau sy'n grwpio genynnau yn ôl eu rolau cydlynol yn y biosynthesis o set gyfyngedig o ganolraddau metabolyn allweddol o fewnbynnau metabolion amrywiol (gweler yr adran Dulliau am ragor o fanylion). Cefnogwyd yr astudiaethau hyn o fewn profion trafnidiaeth vitro; rydym hefyd yn cefnogi perthnasedd clinigol ein canfyddiadau gyda data metabolomeg dynol.
Nodweddion hysbys llygod Oat1 KO a Oat3 KO Mae bron pob un o nodweddion llygod sy'n ddiffygiol mewn Ceirch1 neu Ceirch3 yn debyg i nodweddion llygod math gwyllt (25-27) (Tabl 1). Mae'r llygod sy'n taro allan yn hyfyw gyda goroesiad tebyg i lygod gwyllt. Ar ben hynny, nid ydynt yn arddangos unrhyw annormaleddau datblygiadol neu dwf ymddangosiadol, a datgelodd archwiliad histolegol a ffisiolegol o'r ergydion amrywiol hyn (~2-8 mis oed) fawr ddim gwahaniaethau, os o gwbl, o'r math gwyllt, heblaw bod gan lygod Oat3 KO bwysedd gwaed ychydig yn is. 28). Mae tueddiad tuag at ddyddodiad lipid hepatig yn y Oat1 KO hefyd wedi'i nodi ond dim ond ar gyfer llygod hen iawn (29).
Mae'r llygod taro cludwr hyn hefyd wedi'u nodweddu o safbwynt ffarmacolegol a gwenwynegol (Tabl 2). Mae OAT1 ac OAT3 yn chwarae rhan bwysig wrth drin cyffuriau a thocsinau amrywiol, yn amgylcheddol ac wedi'u cynhyrchu'n fewndarddol (30-38). Mae'r ddau lygod cnocio wedi newid ymatebion i ddiwretigion dolen a thiazide oherwydd anallu'r cyffuriau hyn i gael mynediad i lwmen y neffron - proses sy'n dibynnu ar dderbyniad cyfryngol OAT neu OAT i'r gell tiwbyn procsimol . Ceirch1 Mae anifeiliaid KO yn cael eu hamddiffyn rhag neffrowenwyndra a achosir gan fercwri oherwydd diffygarencymeriant cyfuniadau mercwri. Roedd y ddau lygod yn cronni tocsinau uremig yn y serwm ac yn arddangos secretion llai o asid wrig. Mae dadansoddiad ex vivo o feinweoedd naill ai o lygod Oat1 KO neu Oat3 KO yn dangos bod llai o nifer yn cael nifer o gyffuriau gwrthfeirysol.
Rydym wedi adrodd y gallai {0}}anifeiliaid diffygiol o geirch fod wedi lleihau mynegiant OAT3 (39). Fodd bynnag, mae nifer o astudiaethau wedi nodi bod effaith swyddogaethol hyn yn gymedrol ar y gorau yn y cyflwr gwaelodol. Er enghraifft, y knockout Oat1arennauwedi lleihau cludiant PAH yn sylweddol, ond dim colled amlwg o gludiant o'r swbstrad OAT3, estrone sylffad (26). Mae dadansoddiad cemowybodus wedi nodi setiau o briodweddau moleciwlaidd sy'n gwahaniaethu metabolion a newidiwyd yn Oat1 o'i gymharu â llygod diffygiol Oat3 (23). Ar ben hynny, embryonigarenroedd diwylliannau organau o'r ddwy linell o lygod yn cludo gwahanol setiau o gyffuriau gwrthfeirysol (36-38). Mae gwahaniaethau hefyd yn y mathau o docsinau uremig a geir yn y Oat1 yn erbyn y Oat3 KO (34).
Mae metaboledd tryptoffan yn cael ei newid yn systemig mewn llygod Oat1 a Oat3 KO
Mae dadansoddiadau metabolomig cyhoeddedig o lygod Oat1 KO a Oat3 KO yn awgrymu newidiadau ffisiolegol bwysig wrth drin metabolion mewndarddol a chynhyrchion microbiome perfedd, gan gynnwys rhai tocsinau uremig (34, 35). Yma, dadansoddwyd 731 o fetabolion o hunaniaeth hysbys yn y serwm a gasglwyd o reolaeth a llygod Oat1 KO. Yn yr un modd, canfuwyd 611 metabolion o hunaniaeth hysbys yn y serwm o reolaeth a llygod Oat3 KO.
Ar gyfer llygod Oat1 KO, canfuom fod 63 o fetabolion yn yr Superpathway Amino Acid Superpathway (Tabl Atodol S1) wedi cynyddu'n sylweddol (p Llai na neu'n hafal i 0.{8}}5, 54 metabolion, ymhlith y rhain 12 metabolion wedi newid plyg yn uwch na 3) neu dueddiad tuag at gynnydd sylweddol (0.05 Llai na neu hafal i p Llai na neu hafal i 0.10, naw metabolyn), sy'n awgrymu eu bod naill ai'n swbstradau OAT1 neu fod eu crynodiadau serwm yn dibynnu ar OAT1. Ar gyfer llygod Oat3 KO, canfuom fod deg metabolyn yn yr Uwchlwybr Asid Amino wedi cynyddu'n sylweddol, tra bod 11 yn tueddu i gynyddu'n sylweddol (Tabl Atodol S2). I ategu'r gwerthoedd-p, gwnaethom hefyd gyfrifo d Cohen, a ddangosodd feintiau effaith mawr (yn amrywio o 1.76 i 4.17) ar gyfer metabolion tryptoffan. Yn gyson â data ffarmacolegol a ffisiolegol arall a gafwyd o lygod taro OAT1 ac OAT3 neu eu meinwe sy'n nodi gwahaniaethau swyddogaethol pwysig (23, 36, 38), cymhariaeth o newidiadau mewn metabolion serwm yn y ffordd Superpath Asid Amino rhwng Oat1 KO (63 metabolion) a Datgelodd llygod Oat3 KO (21 metabolyn) dim ond deg metabolyn gorgyffwrdd yn yr is-setiau hyn (Tabl Atodol S3).
Dosbarthwyd pob metabolyn gan ddefnyddio meddalwedd Metabolon yn un o wyth Superpathways (Amino Acid, Carbohydrad, Cofactors, a Fitaminau, Egni, Lipid, Niwcleotid, Peptid, Xenobiotig) ac un o 90 o Is-lwybrau. O'r 17 metabolyn a gronnodd yn sylweddol yn serwm yr anifeiliaid Oat1 KO a Oat3 KO, roedd pedwar yn perthyn i Is-lwybr Metabolaeth Tryptoffan, sy'n nodi bod gan y ddau gludwr hyn rôl bwysig a rennir wrth reoleiddio metaboledd tryptoffan systemig (Ffig. 2) . Yn annibynnol, roedd Metabolaeth Tryptoffan ymhlith yr Is-lwybrau mwyaf cyfoethog ar gyfer y ddau fodel cnocio (Ffig. 3). Un ar bymtheg Ffigur 3. Metabolaeth tryptoffan yw un o'r llwybrau sydd wedi newid fwyaf yn y ddau lygod taro allan. Mae plot llosgfynydd ar gyfer y Oat1 KO (n=5) yn dangos y metabolion tryptoffan yn erbyn pob metabolyn mesuredig arall. B, metaboledd tryptoffan yw'r ail lwybr mwyaf cyfoethog ar gyfer metabolion uchel iawn. C, plot llosgfynydd ar gyfer y Oat3 KO (n=3) yn dangos y metabolion tryptoffan yn erbyn pob metabolyn mesuredig arall. D, metaboledd tryptoffan yw'r llwybr cyfoethogi mwyaf ar gyfer metabolion uchel iawn yn seiliedig ar ddadansoddiad is-lwybr metabolon. Rôl OAT1 ac OAT3 mewn metaboledd tryptoffan 4 J. Biol. Cemeg. (2021) 296 100575mesurwyd metabolion tryptoffan yn serwm y ddau lygod, a newidiwyd 12 yn sylweddol mewn o leiaf un grŵp. Roedd gan lygod Oat1 KO 11 metabolyn uwch, gan gynnwys un (N-formylant hranilate) na chafodd ei fesur yn serwm y Oat3 KO (Tabl 3). Datgelodd dadansoddiad o'r Oat3 KO fod chwech o'r 16 metabolyn wedi newid yn sylweddol neu'n tueddu tuag at newid sylweddol. Mae'n hysbys bod rhai o'r metabolion hyn, gan gynnwys y rhai sy'n deillio o facteria ym micro-fflora'r perfedd, yn cael effeithiau pellgyrhaeddol ar nifer o organau eraill. Er enghraifft, mae 3-indoxyl sulfate yn gysylltiedig â dilyniantarenclefyd a syndrom uremig (12, 40). Mae'r data'n dangos bod OAT1 ac OAT3 yn gweithio gyda'i gilydd i reoleiddio metaboledd tryptoffan systemig, ac eto mae ganddynt hefyd swyddogaethau penodol o fewn metaboledd tryptoffan trwy drin setiau penodol o fetabolion sy'n effeithio ar wahanol adweithiau biocemegol.
Gwerthusiad o ryngweithio cyffuriau-metabolit mewn bodau dynol sy'n cynnwys cyffur sy'n atal OAT a metabolion tryptoffan
Rhoddwyd Probenecid, cyffur a ddefnyddir i drin gowt, i bobl er mwyn pennu effaith tymor byr cyffur rhwymo OAT affinedd uchel ar lefelau metabolion cylchredeg. Mae gan Probenecid dri tharged sydd wedi'u hen sefydlu: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1, ac OAT3, ac mae pob un ohonynt yn enynnau â chysylltiad agos yn y grŵp cludo anion organig o'r teulu SLC22 o gludwyr hydoddyn. Mae URAT1 yn gludwr asid wrig sydd wedi'i leoli ar bilen apical (ochr sy'n wynebu wrin) y tiwbyn procsimol, felly disgwylir i OAT1 ac OAT3, sy'n aml-benodol ac wedi'u mynegi ar ochr wyneb gwaed y tiwbyn procsimol, roi a effaith fwy dwys ar y metabolome serwm. Mae cymariaethau o fesuriadau metabolaidd ar y gwaed cyn a 5 h ar ôl dos yn dangos newidiadau mawr i Islwybr Metabolaeth Tryptoffan (Tabl 4). Oherwydd gwahanol lwyfannau, roedd 22 o fetabolion yn yr Is-lwybr hwn, a chafodd 16 ohonynt eu newid yn sylweddol. Mesurwyd pedwar ar ddeg o fetabolion ar draws pob un o'r tri llwyfan a datgelwyd nifer o bethau cyffredin rhwng y llygod sy'n taro allan a bodau dynol wedi'u trin â phrobenecid (Ffig. 4). Er enghraifft, gwelwyd cynnydd mewn 3-indocsyl sylffad, kynurenine, N-acetylkynurenine, a indole lactad mewn grwpiau o lygod cnocio a phobl. Fodd bynnag, roedd mwy o orgyffwrdd rhwng llygoden Oat1 KO a bodau dynol a gafodd eu trin â probenecid. Roedd pob un o'r wyth metabolyn a gafodd eu dyrchafu'n sylweddol yn y Oat1 KO hefyd wedi'u dyrchafu'n sylweddol yn y bodau dynol a gafodd eu trin â chyffuriau. Dim ond serotonin, a gafodd ei godi yn y llygoden Oat3 KO, na chafodd ei newid mewn bodau dynol.
Mae llygod sy'n cael eu trin â chyffur sy'n atal OAT yn dangos newidiadau ym metabolaeth tryptoffan
Fel canolradd rhwng ein modelau o lygoden knockout a bodau dynol, buom yn trin llygod tebyg i wyllt gyda probenecid, cyffur atal OAT sydd wedi'i hen sefydlu. Arweiniodd y driniaeth gyffuriau hon at godi chwe metabolyn tryptoffan, gan gynnwys kynurenine, kynurenate, ac indolelactate (Ffig. 5). Codwyd y metabolion hyn mewn un neu'r ddau arbrawf taro allan a'r bodau dynol a gafodd eu trin â phrobenecid.
Felly, mae'r canlyniadau cyffredinol mewn bodau dynol a llygod sy'n cael eu trin â phrobenecid, yn ogystal â'r llygod sy'n taro allan, yn cefnogi rôl OAT1 ac OAT3 wrth reoleiddio lefelau cylchredeg metabolion tryptoffan.
Mae metabolion tryptoffan yn rhyngweithio â phrofion trafnidiaeth in vitro OAT1 ac OAT3 dynol I gadarnhau ein canfyddiadau, gwnaethom gynnal profion trafnidiaeth in vitro gan ddefnyddio celloedd yn gorfynegi OAT1 ac OAT3 dynol. Mae llawer o'r metabolion yn y Subpathway hwn wedi'u profi yn erbyn y cludwyr hyn (Tabl 3), ond mae metabolion eraill yn parhau i fod heb eu harchwilio. Datgelodd profion trafnidiaeth ar gyfer asid indoleacetig (ILA) fod ILA yn rhyngweithio ag OAT1 ac OAT3 (IC50=229.1 ± 74.56 μM, 74.49 ± 23.29 μM yn y drefn honno) (Ffig. 6). Ymhellach, roedd serotonin, a gafodd ei ddyrchafu'n unigryw yn y Oat3 KO, yn rhyngweithio â dim ond OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (data heb ei ddangos). Yna cafodd y gwerthoedd IC50 eu hintegreiddio â gwerthoedd Km hysbys i gyfrifo cysonion ataliol. Y cysonyn ataliol (Ki) ar gyfer ILA gydag OAT1 oedd 119.3 μM.
Mae dadansoddiad tasg metabolomig arennau Knockout yn nodi rôl ganolog i OAT1 mewn synhwyro tiwbyn agosol o fetabolion tryptoffan
Defnyddiwyd data microarray o'rarennauo Oat1 KO, Oat3 KO, a'u rheolyddion math gwyllt i nodi sut mae'r newidiadau cludwr yn dylanwadu ar yarenswyddogaethau metabolaidd. I'r perwyl hwn, gwnaethom ddefnyddio dull bioleg systemau (dadansoddiad tasg metabolig (41) o'r offeryn CellFie) sy'n rhagweld sut mae newidiadau mewn mynegiant genynnau yn effeithio ar restr ragnodedig o 175 o dasgau metabolaidd (Tabl Atodol S4), sy'n cwmpasu systemau metabolaidd cyffredinol a cell (ynni, niwcleotid, carbohydradau, asid amino, lipid, fitamin a cofactor, a metaboledd glycan). Fel y disgrifir yn Methods, mae cyfrifiant "sgôr tasg metabolig" yn cymryd data trawsgrifomig ac yn priodoli sgôr gweithgaredd genynnau ar gyfer pob genyn. Defnyddir model metabolaeth ar raddfa genom i lunio rhestr o adweithiau sydd eu hangen i gyflawni pob un o'r 175 o dasgau metabolaidd. Felly, gellir defnyddio dadansoddiad trawsgrifiad yn uniongyrchol i gymharu gweithgaredd cymharol pob swyddogaeth metabolig yn feintiol o dan yr amodau amrywiol (ee, math gwyllt yn erbyn Oat1 KO, math gwyllt yn erbyn Oat3 KO).
Canfuom fod tasgau metabolaidd cysylltiedig â thryptoffan yn gyffredin ymhlith y rhai â gwahaniaeth mawr rhwng Oat KO a llygod math gwyllt. Yr hyn oedd yn annisgwyl, fodd bynnag, oedd bod yarenroedd tasgau metabolaidd yn ymwneud â thryptoffan yn dibynnu ar OAT1 ond nid OAT3. Yn y llygod Oat1 KO, roedd synthesis kynurenine, kynurenate, anthranilate, ac N-for-mylanthranilate o tryptoffan wedi cynyddu sgoriau tasgau metabolaidd, tra bod gan bob un o'r tasgau hynny sgôr tasg metabolig is yn y Oat3 KO. Mae hyn yn gyson â'r dadansoddiadau metabolomeg serwm, sy'n dangos drychiadau sylweddol yn y lefelau kynurenine, kynurenate, anthranilate, ac N-for-mylanthranilate yn y Oat1 KO.
Trafodaeth
Mae OAT1 ac OAT3 yn cael eu cydnabod am eu rôl wrth ddileu cannoedd o gyffuriau (42). Fodd bynnag, mae astudiaethau in vivo ac in vitro o OAT1 ac OAT3 wedi dangos bod y proteinau hyn yn ymwneud â chludo nifer o fetabolion mewndarddol ac yn deillio o ficrobau perfedd, tocsinau uremig, moleciwlau signalau, maetholion a amlyncwyd, tocsinau diwydiannol, a chynhyrchion naturiol (9, 24, 26, 34, 35, 43). Mae'n ymddangos bod hyn hefyd yn wir am gludwyr cyffuriau aml-benodol eraill, sy'n awgrymu bod eu cyfraniad at fetaboledd mewndarddol yn cael ei dan werthfawrogi'n fawr (44).
Mae'r cludwyr cyffuriau aml-benodol hyn wedi'u mynegi'n fawr ym mron pob meinwe ac maent yn chwarae rhan arbennig o allweddol yn Ffigur 4. Roedd metabolion tryptoffan yn uwch mewn llygod sy'n cael eu taro allan o geirch a phobl sy'n cael eu trin â phrobenecid. Diagram Venn o fetabolion tryptoffan sydd wedi'u newid yn sylweddol mewn llygod sy'n taro allan a phobl sy'n cael eu trin â probenecid. O'r 14 metabolyn sy'n gyffredin i bob un o'r tri llwyfan, roedd 12 wedi'u dyrchafu'n sylweddol mewn o leiaf un o'r arbrofion. Codwyd pedwar metabolyn yn sylweddol ym mhob arbrawf. B, adeileddau cemegol metabolion wedi'u dyrchafu ym mhob arbrawf: 3- sylffad indocsil, indolelactate, kynurenine, a N-acetylkynurenine. C, blychau blychau ar gyfer pob metabolyn yn y bodau dynol sy'n cael eu trin â phrobenecid(n=20), llygod Oat1 KO (n=5), a llygod Oat3 KO (n -). Mae llinellau mewn plotiau bocs yn nodi'r canolrif. Rôl OAT1 ac OAT3 mewn metaboledd tryptoffan. Biol. Cemeg. (2021) 296 100575 7rhwystrau epithelial ac endothelaidd rhwng gwaed a hylifau/adrannau corff eraill (ee, rhwystr gwaed-ymennydd, rhwystr gwaed-retina, rhwystr gwaed-CSF, rhwystr trwyn-ymennydd, rhwystr gwaed-troeth). Fel rheoleiddwyr metaboledd systemig, yn ogystal â metaboledd lleol o fewn eu meinwe mynegiant, gall y math o astudiaethau a dadansoddiadau yr ydym wedi'u disgrifio yma os cânt eu perfformio ar gyfer pob cludwr "cyffuriau", newid ein barn ffisiolegol am y proteinau hyn sydd wedi'u cadw'n esblygiadol yn sylweddol.
Mae pwysigrwydd fferyllol clinigol y cludwyr hyn yn aruthrol, ac mae asiantaethau rheoleiddio wedi argymell sgrinio endidau cyffuriau newydd yn erbyn o leiaf saith cludwr cyffuriau aml-benodol (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP) i gyfyngu ar y posibilrwydd o gyffuriau. rhyngweithiadau cyffuriau (DDI) - achosion lle mae dau gyffur neu fwy yn cystadlu am fynediad i'r un cludwr. Gall DDIs a gyfryngir gan gludwr newid crynodiad y cyffuriau yn y gwaed, gan arwain o bosibl at effeithiau clinigol andwyol (45). O ystyried nifer y swbstradau ar gyfer OAT1 ac OAT3, gall ffenomen debyg ddigwydd rhwng cyffuriau a metabolion mewn cylchrediad. Mae gan y DMIs hyn hefyd y potensial i effeithio ar swyddogaeth meinwe, oherwydd efallai na fydd metabolion a moleciwlau signalau yn gallu mynd i mewn i'r gell a chael eu heffeithiau ar ffisioleg cellog arferol. Mae'r astudiaeth bresennol yn cefnogi'r posibilrwydd hwn.
Yn ein dadansoddiadau metabolomeg o serwm llygod taro Ceirch1 a Oat3, bu newidiadau amlwg mewn metabolion sy'n gysylltiedig â thryptoffan. Mae'r cynnydd yn lefelau systemig metabolion, oherwydd absenoldeb y cludwyr hyn yn y rhyngwyneb gwaed â'raren, wedi codi'r posibilrwydd o grynodiad mewngellol gostyngol ynarencelloedd tiwbyn procsimol. Sut gallai'r celloedd hyn yn eu tro ymateb? Defnyddiwyd dadansoddiad tasg metabolig yn seiliedig ar drawsgrifomeg i fynd i'r afael â'r cwestiwn hwn. Fe wnaethom nodi tasgau metabolaidd lluosog lleol (arennau) yn ymwneud â thryptoffan yr effeithiwyd arnynt gan absenoldeb y cludwyr. Achosir y newidiadau hyn mewn sgoriau tasgau metabolaidd gan gynnydd cydadferol yn y mynegiant o'r genynnau metabolaidd sy'n gysylltiedig â thasg yng nghyd-destun diffyg OAT1. Er bod llawer o lwybrau metabolaidd wedi'u harolygu gan ddadansoddiad tasg metabolig ar sail metabolomeg a thrawsgrifomeg, rhoddodd y defnydd o'r ddau ddull fewnwelediad unigryw i ni ar sut mae rhai cludwyr cyffuriau yn cymryd rhan yn y cyfathrebu rhwng y meinwe a'r amgylchedd allgellog. Felly, tra bod metabolion tryptoffan yn cael eu rheoleiddio gan y ddau gludwr ar y lefel systemig, roedd tasgau metabolaidd cysylltiedig â thryptoffan yn yr aren yn dibynnu'n bennaf ar OAT1.
Mae'r canlyniadau'n dangos bod tiwbyn procsimol yaren, lle canfyddir OATs, nid yw'n sianel ar gyfer dileu metabolion tryptoffan yn unig; mae'n synhwyro metabolion tryptoffan ac yn ymateb i newidiadau yn eu helaethrwydd mewngellol. Gyda’i gilydd, roedd y data’n cefnogi’r farn bod OAT1 yn chwarae rhan allweddol nid yn unig wrth glirio metabolion sy’n gysylltiedig â thryptoffan o’r cylchrediad trwy hybu eu derbyniad gan yarenond hefyd bod y cludwr hwn yn rheoleiddio metaboledd mewngellol, yn enwedig metaboledd tryptoffan.
Mae hyn yn cefnogi'r farn bod cludiant cyfryngol OAT o kywrenine, kynurenate, anthranilate, ac N-for-mylanthranilate yn bwysig iarenswyddogaeth (Ffig. 8). Mae'r pedwar metabolyn hyn yn perthyn i'r is-lwybr kynurenine o ddiraddiad tryptoffan, ac ar wahân i kynurenate, maent yn ymwneud â chynhyrchu egni cellog trwy synthesis NAD plus (46). Felly, mae'n bosibl bod diffyg OAT1 yn arwain at nam ar y metaboledd cellog y gellir ei adennill, yn rhannol o leiaf, trwy gynhyrchu'r metabolion hyn.
Mae bron pob tryptoffan sy'n cael ei lyncu yn cael ei fetaboli yn dri phrif islwybr: kynurenine, serotonin, ac indole (47, 48). Yn ogystal â'i rôl wrth gynhyrchu NAD plus , mae'r is-lwybr kynurenine yn cynhyrchu metabolion sydd ag amrywiaeth o swyddogaethau mewn cyflyrau iach ac afiach (46, 49). Mae'r llwybr serotonin yn cynhyrchu'r niwrodrosglwyddydd, serotonin, sydd â rôl mewn nifer o brosesau ffisiolegol, yn fwyaf nodedig fel rheolydd swyddogaeth CNS (50). Mae'r is-lwybr indole, sy'n cael ei gyfryngu gan ficrobiome y perfedd, yn cynhyrchu moleciwlau signalau sy'n cymryd rhan mewn cyfathrebu cynhaliol-microbaidd (51). Yn systemig, mae OAT1 ac OAT3 yn modiwleiddio bio-argaeledd metabolion tryptoffan o bob un o'r tri is-lwybr, er bod y rhan fwyaf o'r metabolion yn dod o'r islwybrau kynurenine ac indole.
O ystyried y myrdd o rolau signalau sydd gan y metabolion uchel, mae potensial i OAT1 ac OAT3 ddylanwadu ar sawl agwedd ar ffisioleg. Er enghraifft, mae kynurenate yn actifadu GPR35, targed cyffuriau, a GPCR sy'n ymwneud ag ymatebion llidiol a chlefyd cardiofasgwlaidd (52). Mae llawer o'r metabolion tryptoffan sydd wedi'u newid yn sylweddol hefyd yn ligandau sefydledig neu ragdybiedig o'r derbynnydd hydrocarbon aryl (AhR) (Tabl 3), rheolydd trawsgrifiadol a fynegir ym mron pob meinwe sy'n ymateb i senobiotig (53).
Dangosodd astudiaethau metabolomeg y ddau lygod taro allan mai swyddogaeth mewndarddol allweddol OAT1 ac OAT3 yw rheoleiddio lefelau systemig o fetabolion tryptoffan. Felly, byddai disgwyl i gyffur sy'n targedu OAT1 ac OAT3 gael effaith debyg ar y metabolom. Fel y rhagwelwyd, cefnogwyd potensial trosiadol ein llygod sy’n cael eu taro allan fel modelau o DMIs yn gryf gan ganlyniadau bodau dynol a gafodd eu trin â probenecid, cyffur sy’n atal OAT a ddefnyddir ledled y byd i drin gowt. Roedd nifer o'r metabolion tryptoffan wedi'u dyrchafu yn serwm bodau dynol a'r llygod sy'n taro allan.
Felly, mae potensial i'r cyfansoddion uchel mewn astudiaethau dynol a chnofilod gael eu defnyddio fel biofarcwyr ar gyfer endidau cyffuriau newydd a allai atal OAT1 ac OAT3. Er bod y modelau llygoden cnocio (sydd â disgwyliad oes arferol) a'r bodau dynol a gafodd eu trin â phrobenecid yn iach, mae rhai o'r metabolion uchel yn wenwynau uremig hysbys sy'n cael eu cynyddu yn serwm bodau dynol sy'n dioddef o fethiant arennol cronig ac sy'n gysylltiedig â chanlyniadau negyddol (54). , 55). Mae'r gorgyffwrdd o fetabolion sy'n gysylltiedig ag agweddau ar CKD a'n hastudiaethau'n awgrymu y gallai'r OATs chwarae rhan allweddol mewn amlygiadau o CKD neu ei ddilyniant, er ei bod hefyd yn bosibl y gallai crynodiadau metabolion gynyddu oherwydd colli secretiad o ganlyniad i feinwe. difrod (56, 57). Gall CKD hefyd arwain at fethiant aml-organ, yn rhannol oherwydd bod tocsinau uremig yn cronni, a gall hyn fod yn rhannol oherwydd y nifer sy'n cael eu cymryd i feinweoedd eraill trwy gludwyr cyffuriau SLC ac ABC (12, 58).
Mae llwybr metaboledd tryptoffan yn gofyn am swyddogaeth gydgysylltiedig sawl organ. Mae tryptoffan yn cael ei amsugno gan y perfedd, wedi'i addasu gan yr afu neu organau eraill, ac mae'r metabolion yn cael eu cludo yn y pen draw gan yaren, yn rhannol trwy swyddogaeth OAT1 ac OAT3. Yn gonfensiynol, ystyrir hyn yn syml fel llwybr dileu. Mae ein canlyniadau, sy'n dangos bod celloedd yarenymateb i absenoldeb y metabolion a'r moleciwlau signalau hyn trwy baratoi i'w cynhyrchu, awgrymu fel arall. Er bod eu rôl benodol yn yarenmae tiwbyn procsimol wedi'i ddiffinio'n wael, mae'n amlwg bod llawer o'r canolraddau a gynhyrchir yn niwrodrosglwyddyddion a bod ganddynt rôl bwysig yn swyddogaeth CNS (46, 49, 59, 60). Yn ogystal â chyfathrebu rhyng-organ, mae metaboledd tryptoffan hefyd yn adlewyrchu cyfathrebu rhyng-organebol rhwng y gwesteiwr a microbiome'r perfedd. Yn wir, mae serwm llygod di-germ wedi gostwng lefelau o 3- sylffad indocsil, indolepropionate, a serotonin (61). Ymhellach, mae astudiaethau blaenorol wedi dangos, o fewn celloedd positif OAT arennol, bod indocsyl sylffad yn gweithredu mewn signalau celloedd trwy actifadu AhR a rheoleiddio eu secretiad eu hunain trwy OAT1 (62). Mae ein canfyddiadau bod metabolion sy'n deillio o'r perfedd wedi cynyddu yn serwm y llygod Oat1 KO ac Oat3 KO - ynghyd â'n harddangosiad bod rhai yn ligandau in vitro, yn darparu cefnogaeth ychwanegol i bwysigrwydd y cludwyr hyn wrth reoleiddio cyfathrebu rhwng y gwesteiwr a'r commensal organebau. Ar y cyfan, mae ein canlyniadau'n cyd-fynd â'r Theori Synhwyro a Signalau o Bell, sy'n cynnig bod cludwyr cyffuriau ac ensymau metaboleiddio cyffuriau yn cymryd rhan mewn cyfathrebu rhyng-organaidd a rhyng-organebol trwy gludo ac addasu moleciwlau bach i gynnal homeostasis (63, 64). Felly, mae'n hanfodol deall gamut swyddogaethau ffisiolegol mewndarddol cludwyr cyffuriau yn systematig ac yn lleol.
Gyda gwell data metabolomeg, fe wnaethom nodi metabolion yr effeithiwyd arnynt gan absenoldeb OAT1 ac OAT3 mewn modelau cnofilod a metabolion yr effeithiwyd arnynt gan ataliad OAT1 ac OAT3 mewn pobl sy'n cael eu trin â chyffuriau sy'n atal OAT. Mae ein grŵp wedi defnyddio rhwydweithiau ail-greu metabolaidd yn flaenorol i ragfynegi swyddogaeth metabolig ac wedi adrodd ar nifer o lwybrau a rennir ac unigryw a reoleiddir gan OAT1 ac OAT3 (43, 65). Fodd bynnag, cyfyngwyd yr astudiaethau hyn gan fersiynau cynnar o offer ail-greu ac ychydig iawn o ddata metabolomeg. Yma, gan ddefnyddio dull gwahanol, rhoddodd Dadansoddiad Tasg Metabolaidd lawer mwy o bwyslais ar rôl OAT1 ym metabolaeth tryptoffan mewngellol yaren. Gellir defnyddio ein dull i ymchwilio i swyddogaethau mewndarddol aelodau eraill o'r teulu SLC ac ABC ac adeiladu rhwydweithiau ar wahân ond gorgyffwrdd ar gyfer yr holl gludwyr cyffuriau hyn, sydd i'w cael nid yn unig mewn llygod ond hefyd yn llawn a mwydod (20, 66). Bydd sylwadau o'r fath hefyd yn hwyluso dealltwriaeth o raddau llawn DMIs ar gyfer cyffuriau sy'n rhyngweithio ag OAT1, OAT3, neu'r ddau, sy'n debygol o fynd y tu hwnt i gystadleuaeth syml ar lefel y cludwr.
Gweithdrefnau arbrofol
Anifeiliaid
Cymeradwywyd yr holl brotocolau arbrofol yn ymwneud â defnyddio anifeiliaid gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol UCSD (IACUC). Cafodd pob anifail ei drin yn unol â Chanllawiau'r Sefydliad ar Ddefnyddio Anifeiliaid Byw ar gyfer Ymchwil. Roedd oedolion WT, Oat1 KO, a Oat3 KO yn cael eu cartrefu ar wahân o dan gylchred golau-tywyll 12-h a darparwyd mynediad ad libitum at fwyd a dŵr iddynt. Disgrifiwyd yr anifeiliaid hyn mewn cyhoeddiadau blaenorol (26, 27). Rhoddwyd chwistrelliad mewnperitoneol dyddiol o 200 mg/kg probenecid neu PBS i lygod wedi'u trin â phrobenecid am 3 diwrnod cyn aberth. Rhoddwyd y pigiad olaf 2 h cyn aberth. Mae'r setiau data a ddefnyddiwyd ar gyfer y dadansoddiad hwn hefyd wedi'u disgrifio'n rhannol (23, 24). Mae set ddata Oat1 KO wedi'i hastudio'n rhannol o safbwynt cemowybodeg, ond ni pherfformiwyd dadansoddiad llwybr manwl (23). Ail-ddadansoddwyd set ddata Oat3 KO a dim ond dau grŵp a gymharwyd (24).
Astudiaethau dynol gyda probenecid
Cafodd yr holl brotocolau arbrofol eu hadolygu a'u cymeradwyo gan y Bwrdd Adolygu Sefydliadol ac maent yn cadw at Ddatganiad Egwyddorion Moesegol Helsinki. Casglwyd samplau gwaed cyfan oddi wrth 20 o unigolion (14 benyw, chwe dyn). Yr oedran cyfartalog oedd 30.85 ± 10.98, a'r BMI cyfartalog oedd 24.18 ± 3.52. Cyfranogwyr nad oeddent yn cymryd unrhyw feddyginiaeth ac a oedd ar ddiet llysieuol trwy gydol yr astudiaeth. Gweinyddwyd dos llafar o 1 gram o probenecid, ac ar ôl 5 h, casglwyd gwaed cyfan eto. Cadwyd pob sampl wedi'i rewi ar -80 gradd tan ddadansoddiad metabolomig.
Metabolomeg samplau serwm Dynol eu storio ar unwaith ar -80 gradd a'i gludo ar iâ sych i Metabolon Inc samplau serwm Llygoden eu casglu a'u dadansoddi, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (23, 24). I ailadrodd yn fyr, ar gyfer pob sampl, perfformiwyd proffilio metabolomig wedi'i dargedu gan Metabolon Inc. Defnyddiwyd system MicroLab STAR o Hamilton Company i baratoi pob sampl, ac ychwanegwyd nifer o safonau adfer ar gyfer rheoli ansawdd. Cafodd y serwm ei waddodi â methanol a'i droi gyda Glen Mills GenoGrinder 2000 i dynnu proteinau o'r serwm a rhyddhau moleciwlau sy'n rhwym i'r proteinau hynny. Gwahanwyd yr ateb canlyniadol yn bedwar sampl llai. Dadansoddwyd dau gan sbectrometreg màs (MS) cromatograffaeth hylif ultraperformance cam cefn (RP) gydag ioneiddiad electrochwistrellu ïon positif (ESI). Dadansoddwyd un sampl gan RP/UPLC-MS/MS gyda modd ïon negatif ESI. Dadansoddwyd un sampl gan HILIC/UPLC-MS/MS. Tynnwyd y toddydd organig trwy osod pob sampl ar TurboVap (Zymark).
Ystadegau
Ar gyfer samplau dynol a llygoden, normaleiddiwyd gwerthoedd crai i gyfaint, trawsffurfiwyd log, a disodlwyd gwerthoedd coll gyda'r gwerth a arsylwyd isaf ar gyfer pob cyfansoddyn. Yn y samplau serwm dynol, pennwyd arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio cyferbyniadau ANCOVA sy'n ymgorffori BMI ac oedran. Ar gyfer samplau serwm llygoden, pennwyd arwyddocâd gan ddefnyddio prawf-t dau sampl Welch gyda metabolion a gafodd arwyddocâd ystadegol (p Llai na neu'n hafal i 0.{5}}5), yn ogystal â'r rhai a oedd yn agosáu at arwyddocâd ( 0.05 Llai na neu'n hafal i p Llai na neu'n hafal i 0.10) wedi'i gynnwys mewn dadansoddiadau dilynol. Penderfynwyd ar gyfoethogi gan ddefnyddio Hafaliad 1, lle k yw nifer y metabolion a newidiwyd yn sylweddol mewn Subpathway, m yw nifer y metabolion mewn Subpathway, n yw nifer y metabolion a newidiwyd yn sylweddol yng nghyfanswm y set ddata, ac N yw nifer y metabolion wedi'u mesur yn y set ddata gyfan.
Dadansoddiad tasg metabolig
Defnyddiwyd y dadansoddiad tasg metabolig, fel y'i gweithredwyd yn y modiwl CellFie yn GenePattern, i feintioli'rarennauswyddogaethau metabolaidd a dylanwad newidiadau cludwr OAT o ddata mynegiant genynnau (41) (hy, data micro-arae o arennau Oat1 KO, Oat3 KO, a'u rheolyddion math gwyllt). Mae'r dadansoddiad hwn yn rhagweld gweithgaredd casgliad wedi'i guradu o gannoedd o dasgau sy'n cwmpasu saith gweithgaredd metabolaidd mawr cell (cynhyrchu ynni, niwcleotid, carbohydrad, asid amino, lipid, fitamin a cofactor, a metaboledd glycan) yn uniongyrchol o ddata trawsgrifio trwy ddefnyddio genom- modelau graddfa o fetaboledd dynol. Yn fwy penodol, mae cyfrifiant gweithgaredd cymharol tasg metabolig (hy, sgôr tasg metabolig) yn dibynnu'n gyntaf ar ragbrosesu'r data trawsgrifomig sydd ar gael a phriodoli sgôr gweithgaredd genynnau ar gyfer pob genyn (67). Defnyddir y model graddfa genom o fetaboledd dynol ymhellach i nodi'r rhestr o adweithiau sydd eu hangen i gyflawni pob tasg metabolig ac, wrth wneud hynny, i nodi'r rhestr o enynnau a all gyfrannu at gaffael swyddogaeth metabolig yn seiliedig ar reolau GPR (h.y. , rheolau Adwaith Protein Genynnau). Felly, mae'r sgôr tasg metabolig yn cael ei chyfrifo fel sgôr gweithgaredd cyfartalog yr holl enynnau sy'n cyfrannu at swyddogaeth metabolig. Wrth wneud hynny, gellir defnyddio data trawsgrifiad yn uniongyrchol i feintioli gweithgaredd cymharol pob swyddogaeth metabolig mewn cyflwr penodol.
Profion trafnidiaeth in vitro
Embryonig dynolaren(HEK){0}} celloedd sy'n gorfynegi'n sefydlog dynol OAT1 ac OAT3 (Solvo Biotechnology) i gydlifiad yn Modified Eagle'sMedium (Invitrogen) Dulbecco, wedi'i ategu â 10 y cant o serwm buchol ffetws ac 1 y cant o benisilin/streptomycin a'i gynnal mewn 5. y cant CO2 ar 37 C. Dewiswyd y celloedd mynegi OAT ym mhresenoldeb blasticidin, a dewiswyd y celloedd mynegi OAT ym mhresenoldeb puromycin. Profodd y ddwy linell gell yn negyddol am halogiad Mycoplasma. Cyn cynnal profion swyddogaethol, roedd celloedd yn cael eu platio ar 96-blatiau ffynnon, eu deor am 24 awr, a'u hategu gan gyfryngau. Cynhaliwyd arbrofion derbyniad cystadleuol trwy ddeor celloedd mewn hydoddiant byffer gyda chrynodiad sefydlog o 10 μM6-carboxyfluorescein a chrynodiad wedi'i wanhau'n gyfresol o'r swbstrad arfaethedig gan ddechrau ar 2 mM. Tynnwyd byffer ar ôl 10-munud o ddeori ar dymheredd ystafell, a chafodd celloedd eu rinsio â DPBS deirgwaith. Yna aseswyd y fflworoleuedd FL gan ddefnyddio darllenydd plât fflwroleuol FL. Penderfynwyd ar werthoedd IC50 gan ddefnyddio GraphPad Prism 8.
Cafodd gwerthoedd arddwysedd fflwroleuol eu normaleiddio fel bod y gwerth isaf wedi'i osod i 0 y cant a'r gwerth uchaf wedi'i osod i 100 y cant . Yn dilyn normaleiddio, roedd y data yn addas i fodel aflinol, a phenderfynwyd ar yr IC50 gan ddefnyddio Hafaliad 2.
Yna cyfrifwyd Ki ar gyfer pob metabolyn gan ddefnyddio hafaliad Cheng-Prusoff (Hyaliad 3), gyda'r Km ar gyfer celloedd hOAT1 HEK293 yn deillio o arbrofion blaenorol (68).
Argaeledd data
Mae'r holl ddata metabolomeg perthnasol wedi'u cynnwys yn yr erthygl a'r deunydd atodol. Mae data trawsgrifiadol ar gael ar gais gan snigam@health.ucsd.edu. ddamcaniaethu, goruchwylio’r prosiect, dylunio’r arbrofion, ac ysgrifennu a golygu’r erthygl.
Cyllid a gwybodaeth ychwanegol—Cafodd y gwaith hwn ei gefnogi gan grant gan y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol (NIH) i SKN gan Sefydliad Cenedlaethol y Gwyddorau Meddygol Cyffredinol (NIGMS)(R01GM132938). Daw cymorth i JCG o’r grant hyfforddi a ddyfarnwyd gan y Sefydliad Cenedlaethol Delweddu Biofeddygol a biobeirianneg (NIBIB) (T32EB009380) ac atodiad iR01GM132938. Ariannwyd y gwaith hwn yn rhannol gan gyllid hael gan NIGMS i NEL (R35GM119850), Sefydliad Cenedlaethol Alergedd a Chlefydau Heintus (NIAID) i NEL (UH2AI153029), cymrodoriaeth LIFA i AR, a chymrodoriaeth i JMG gan lywodraeth Mecsico ( CONACYT) a Sefydliad Prifysgol California ar gyfer Mecsico a'r Unol Daleithiau (UC-MEXUS). Cyfrifoldeb yr awduron yn unig yw’r cynnwys ac nid yw o reidrwydd yn cynrychioli barn swyddogol yr NIH. Cynhyrchwyd rhai ffigurau gan ddefnyddio Biorender. Mae'r erthygl hon wedi'i chysegru er cof am Vibha Bhatnagar, MD, MPH.
Gwrthdaro buddiannau—Mae'r awduron yn datgan nad oes ganddynt unrhyw wrthdaro buddiannau â chynnwys yr erthygl hon.
Byrfoddau—Y byrfoddau a ddefnyddir yw: AhR, derbynnydd hydrocarbon aryl; CKD, cronigarenclefyd; DMI, rhyngweithio cyffuriau-metabolyn; ESI, ionization electrospray; HEK, embryonig dynolaren; ILA, asid asetig indole; KO, cnocio; RP/UPLC/MS, cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad cyfnod cefn – sbectrometreg màs.
Mae Cistanche tubulosa yn atal clefyd yr arennau, cliciwch yma i gael y sampl
O'r 1Adran Biobeirianneg, 2Adran Pediatrig, 3Adran Bioleg, 4Adran Bioystadegau a biowybodeg, Adran Meddygaeth Teulu ac Iechyd y Cyhoedd, 5 Adran Meddygaeth Deuluol ac Ataliol, 6Canolfan Biogynaladwyedd Sylfaen NovoNordisk yn UC San Diego, a 7Adran Meddygaeth Prifysgol California SanDiego, La Jolla, California, USAEdited
gan Mike Shipston
Cyfeiriadau
1. LopezNieto, CE, Chi, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR, a Nigam, SK (1997) Clonio moleciwlaidd a nodweddu NKT, cynnyrch genyn sy'n gysylltiedig â'r teulu cludo cation organig sydd bron yn gyfan gwbl fynegi yn yaren. J. Biol. Cemeg. 272, 6471–6478
2. Brady, KP, Dushkin, H., Fornzler, D., Koike, T., Magner, F., Her, H., Gullans, S., Segre, GV, Green, RM, a Beier, DR (1999 ) Mae cludwr tybiedig newydd yn mapio i'r treiglad osteosclerosis (oc) ac nid yw'n cael ei fynegi yn y llygoden mutant OC. Genomeg 56 , 254–261
3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E., a Schwab, M. (2012) Cludwyr anion organig a'u goblygiadau mewn pharmacotherapy.Pharmacol. Parch 64, 421–449
4. Ahn, SY, a Bhatnagar, V. (2008) Diweddariad ar ffisioleg moleciwlaidd cludwyr anion organig. Curr. Barn. Nephrol. Hypertens. 17, 499–505
5. Nigam, SK (2018) Teulu cludwyr SLC22: Paradeim ar gyfer effaith cludwyr cyffuriau ar lwybrau metabolaidd, signalau, ac afiechyd. Annu. Ffarmacol y Parch. 58, 663–687
6. Lowenstein, J., a Grantham, JJ (2016) Aileni diddordeb mewn swyddogaeth tiwbaidd arennol. Yn. J. Physiol. Arennol 310, F1351–F1355
7. Govindarajan, R., a Sparreboom, A. (2016) Cludwyr cyffuriau: Datblygiadau a chyfleoedd. Clin. Ffarmacol. Ther. 100, 398–403
8. Chi, GF, a Morris, ME (2014) Rhagair. Yn Nodweddiad Moleciwlaidd Cludwyr Cyffuriau a Rôl mewn Gwaredu Cyffuriau, 2il Argraffiad. Disg Cyffuriau Wiley Ser, Hoboken, NJ. Xix
9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, AS, Blantz, RC, a Bhatnagar, V. (2015) Trin cyffuriau, metabolion, a thocsinau uremig ganarencludwyr cyffuriau tiwbyn procsimol. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2039–2049
10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX, a Nigam, SK (2016) Dadansoddiad o ABCG2 a chludwyr urate eraill mewn asid wrig homeostasis mewn cronigarenclefyd: Rôl bosibl synhwyro o bell a signalau. Clin.ArennauJ. 9, 444-453 Rôl OAT1 ac OAT3 ym metabolaeth tryptoffan
12 J. Biol. Cemeg. (2021) 296 100575
11. Nigam, SK, a Bhatnagar, V. (2018) Bioleg systemau cludwyr asid wrig: Rôl synhwyro o bell a signalau. Curr. Barn. Nephrol. Hypertens. 27, 305–313
12. Nigam, SK, a Bush, KT (2019) Syndrom wraemig o gronigarenclefyd: Newid synhwyro o bell a signalau. Nat. Nephrol y Parch. 15, 301–316
13. Saito, H. (2010) Rheoleiddio pathoffisiolegol cludwyr sefydliad arennol SLC22A mewn aciwtarenanaf: Goblygiadau ffarmacolegol a gwenwynegol. Ffarmacol. Therapiwt. 125, 79–91
14. Lepist, EI, a Ray, AS (2017) Y tu hwnt i ryngweithio cyffuriau-cyffuriau: Effeithiau ataliad cludwr ar wrthfiotigau, maetholion a thocsinau. Barn Arbenigwr. Metab Cyffuriau. Gwenwynig. 13, 1075–1087
15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Cymraeg, WJ, a Chi, GF (2012) Atalyddion cryf o gludwyr anion organig dynol 1 a 3 o lyfrgelloedd cyffuriau clinigol: Darganfod a nodweddu moleciwlaidd . Mol. Fferyllfa. 9, 3340–3346
16. Evers, R., Piquette-Miller, M., Polli, JW, Russel, FGM, Sprowl, JA, Tohyama, K., Ware, JA, de Wildt, SN, Xie, W., Brouwer, KLR, a Consortium, IT (2018) Gall newidiadau sy’n gysylltiedig â chlefydau mewn cludwyr cyffuriau effeithio ar ffarmacocineteg a/neu wenwyndra cyffuriau: Papur gwyn gan y International Transporter Consortium. Clin. Ffarmacol. Ther.104, 900–915
17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH, a Lowenstein, J. (2014) Thearena thynnu tocsin uremig: Glomerulus neu diwbyn? Semin. Nephrol. 34, 191–208
18. Liu, Y., Prentice, KJ, Eversley, JA, Hu, C., Batchuluun, B., Leavey, K., Hansen, JB, Wei, DW, Cox, B., Dai, FHF, Jia, WP , a Wheeler, MB (2016) Gall codiad cyflym yn CMPF fod yn bwynt tyngedfennol yn natblygiad diabetes. Cell Sylw 14, 2889–2900
19. Prentice, KJ, Luu, L., Allister, EM, Liu, Y., Jun, LS, Sloop, KW, Hardy, AB, Wei, L., Jia, WP, Fantus, IG, Sweet, DH, Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF, a Wheeler, MB (2014) Mae metabolit asid brasterog furan CMPF yn uwch mewn diabetes ac yn achosi camweithrediad celloedd beta. Cell Metab. 19, 653–666
20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R., a Nigam, SK (2020) Mae dadansoddiad bioleg systemau yn datgelu wyth is-grŵp cludo SLC22, gan gynnwys OATs, OCTs, ac OCTNs.Int. J. Mol. Sci. 21, 1791