Mae Cyclopentanone yn Cyflawni Gweithgareddau Gwrth-Melanogenesis A Gwrth-Wrinkle mewn Melanoma B16F10

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 a Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Crynodeb:Amlygiad i ymbelydredd uwchfioled (UV) yw prif achos heneiddio croen anghynhenid, sy'n arwain at orbigmentu croen a chrychni. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymchwilio i effaith gwynnu (2E,5E)-2,5-bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP)) ar felanoma B16F10 a'i wrth- gweithgaredd wrinkle ar gelloedd ffibroblasts Hs27. Canfuwyd bod BHCP yn atal tyrosinase yn gryf, gyda gwerthoedd crynodiad ataliad 50 y cant (IC50) o 1.10 μM a 8.18 μM fformiwlacophenolate (L-tyrosine) a diphenolase (L-DOPA), a datgelodd yr astudiaeth cineteg ensymau fod BHCP yn atalydd tyrosinase math cystadleuol . Ar ben hynny, rhwystrodd BHCP yn sylweddol weithgaredd melanincontent a thyrosinase cellog a is-reoleiddio lefelau ffactor trawsgrifio cysylltiedig â microphthalmia (MITF), lefelau ffosfforyleiddio o brotein elfen-rhwymo elfen ymateb cAMP (CREB), a thyrosinase mewn hormon sy'n ysgogi melanocyte (-MSH) - a achosir. Celloedd melanoma B16F10. At hynny, rhwystrodd BHCP ffosfforyleiddiad p65 a mynegiant metalloproteinasau matrics (MMP-1, MMP-9, MMP-12, a MMP-13) mewn ffibroblastau Hs27 wedi'i ysgogi gan ymbelydredd UV.

Geiriau allweddol: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP); atalydd tyrosinase; gwrth-melanogenesis; gwrth-wrinkle

Cistanche yngwrth-wrinkling.

1. Rhagymadrodd

Mae heneiddio croen yn broses gymhleth a chynyddol sy'n arwain at newidiadau swyddogaethol ac esthetig yn y croen, gyda ffactorau cynhenid ​​​​ac anghynhenid ​​yn gyfrifol [1]. Mae heneiddio croen anghynhenid ​​yn cael ei achosi gan ymosodwyr amgylcheddol, fel ymbelydredd uwchfioled (UV), straen, neu ysmygu. Fodd bynnag, mae'n cael ei achosi'n bennaf gan amlygiad mynych i UV o'r haul, a elwir yn ffoto-dynnu. Nodweddir ffotoaging croen gan grychau bras a dwfn, trwch, garwedd, dyspigmentiad, a newidiadau histolegol [2-4].

Mae Tyrosinase (EC 1.14.18.1), a elwir hefyd yn polyphenol oxidase, yn un o'r ensymau amlswyddogaethol sy'n cynnwys copr sy'n ymwneud â synthesis melanin ac fe'i darganfyddir yn eang mewn natur [5]. Mae Tyrosinase fel arfer yn bresennol mewn mwyafrif o ficro-organebau, planhigion, ac anifeiliaid. Mewn planhigion, mae tyrosinase yn gweithredu trwy ocsideiddio monoffenolau i ddiffenolau (gweithgaredd mycophenolate) ac mae'n ymwneud ag ocsidiad o-diphenols yn o-quinones (gweithgaredd diphenolase), ac yna ocsidiad cwinones yn pigmentau brown tywyll [6].

Melanogenesis yw trawsnewid L-tyrosine yn 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), lle mae L-DOPA yn cael ei drawsnewid yn DOPA cwinîn [7]. Felly, mae tyrosinase yn chwarae rhan bwysig mewn cynhyrchu melanin mewn melanocytes, ac mae atal tyrosinase yn darged deniadol ar gyfer gwella anhwylderau sy'n gysylltiedig â pigmentiad ac ar gyfer datblygu asiantau gwynnu [8,9]. Mae synthesis melanin yn cael ei ysgogi gan sawl ysgogiad, megis UV a chemegau gan gynnwys isobutylmethylxanthine (IBMX) a hormon ysgogol alffa-melanocyte (-MSH). -MSH yn rhwymo ei dderbynnydd melanocortin 1 derbynnydd (MC1R), gan gynyddu'r lefel AMP cylchol cytoplasmig (cAMP) o ganlyniad. Mae'r lefel cAMP uwch yn actifadu protein kinase A (PKA), sy'n ysgogi mynegiant ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia (MITF) trwy ffosfforyleiddiad y protein sy'n rhwymo elfen ymateb cAMP (CREB). Mae MITF yn cymell mynegiant tyrosinase, protein sy'n gysylltiedig â tyrosinase (TRP)-1, a TRP-2, sydd o'r diwedd yn arwain at fwy o synthesis melanin [10]. Ystyrir MITF yn ffactor trawsgrifio bysell o melanogenesis; felly, mae llawer o astudiaethau wedi'u perfformio i reoli mynegiant MITF i atal melanogenesis [11].

Mae'n hysbys bod ffurfio crychau yn gysylltiedig yn agos â diraddio matrics allgellog y croen, ac mae ymbelydredd UV yn actifadu ffactor niwclear-κB (NF-κB), a thrwy hynny gynyddu cynhyrchiad darnio colagen a metalloproteinasau matrics (MMPs) [2]. Endopeptidasau aresin-ddibynnol MMP sy'n bwysig wrth ailfodelu'r matrics allgellog yn y croen. Felly, mae diraddiad gormodol colagen a'r matrics gan MMPs a achosir gan UV yn nodwedd nodweddiadol o groen wedi'i ddifrodi gan ffoto, a defnyddir MMPs fel prif farciwr ar gyfer lluniadu a achosir gan UV yn ogystal â llid y croen [12].

Mae'r deilliadau sgerbwd diarylheptanoid tebyg i curcumin wedi bod yn cynnwys gwrthocsidyddion, canser adrodd, sgaffaldiau gweithgareddau, gan gynnwys (2E,5E)-2,5-bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone). (BHCP) (Ffigur 1),i arddangos ystod eang o wrth-lid, gwrth-melanogenesis, Yn enwedig, Leow et al. [19] a adroddwyd mewn bioactivities, a gwrth-tyrosinase [13-18]dibenzylidene-cyclopentanone 2014 a allai gyfrannu at yr effeithiau amddiffynnol ar osteosarcoma dynol trwy reoleiddio'r llwybr signalau Wnt / -cateninaling. Fodd bynnag, mae effeithiau gwrth-melanogenesis ac gwrth-wrinkle BHCP heb eu darganfod o hyd, ac nid yw'r mecanweithiau moleciwlaidd sy'n sail i'w weithgaredd wedi'u sefydlu'n glir eto.

Ffigur 1. Strwythur (2E,5E)-bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP).

Yn yr astudiaeth bresennol, fe wnaethom ymchwilio i botensial gwrth-melanogenesis a gwrth-wrinkle BHCP, a cheisio nodi'r mecanwaith dan sylw, yn enwedig o ran cynnwys melanin a gweithgaredd tyrosinase cellog, a archwiliwyd gan ddefnyddio assay atal tyrosinase a dadansoddiad o cineteg ensym. Ar ben hynny, gwnaethom ddangos bod BHCP yn cael effaith ataliol ar melanogenesis a chrychau sy'n gysylltiedig ag is-reoleiddio CREB / MITF / tyrosinase mewn celloedd melanoma llygoden -MSH-inducedB16F10 ac ataliad ffosfforyleiddiad p65 a mynegiant MMP mewn ffibroblastau dynol Hs27 a achosir gan UV.

cistanche perlysiau draig

2. Canlyniadau a Thrafodaeth

2.1. Synthesis o (2E,5E)-2,5-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP)

Hydoddiant o {{0}}hydroxy-4-methoxybenzaldehyde(100 mg, 0.66 mmol, isovanillin) a seiclopentanone (0.03 mL, 0.33 mmol) mewn hydoddiant asid asetig 1 N HCl (0.02 mL) ei droi ar 25 ◦Cfor 2 h. Ar ôl sefyll am 1 diwrnod, cafodd y cymysgedd adwaith ei drin â dŵr oer ym mhresenoldeb swm bach o fethanol, ei hidlo, a'i olchi â dŵr oer i gynhyrchu BHCP (65.9 mg) mewn 56.9 y cant o gynnyrch. Nodwyd BHCP trwy ddulliau sbectrosgopig, gan gynnwys 1H a 13C-NMR, yn ogystal â thrwy gymharu â data sbectrol cyhoeddedig a dadansoddiad Cromatograffaeth Haen denau (TLC) [19]. Dangosir y strwythur yn Ffigur 1.

BHCP: powdr amorffaidd melyn (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.25 (s, 2H, 2 × OH), 7.28(s,2H,2×vinylicH), 7.14 (d, 2H , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7.11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H), 7.01 (d, 2H, J=8.5 Hz, 2 × 5-H), 3.81 (s, 6H, 2 × OM), 3.01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 195.5, 149.9, 147.2, 136.0, 133.1, 129.1, 124.3, 117.5, 112.8, 56.3, 26. ESI-MS: m/z 351 (M − H)−.

2.2. Effaith Ataliol BHCP ar Weithgaredd Tyrosinase Madarch

Fel y dangosir yn Nhabl 1, roedd BHCP yn atal tyrosinase gyda gwerthoedd IC50 ± 0.12 μMand 8.18 ± 0.44 μM, tra bod gan asid kojic (rheolaeth gadarnhaol) werthoedd IC50 o 18.68 ± 3 1.9 ± 4 1. μM ar gyfer monophenolase a diphenolase, yn y drefn honno. Yn ein hastudiaeth flaenorol o atalyddion potensial synthetig tyrosinase, canfuom fecanwaith trwy astudiaethau modelu moleciwlaidd lle'r oedd gan y grwpiau 3-hydroxy a 4-methocsi bensylidene dueddiadau rhwymol mawr tuag at safle actif tyrosinase [20]. O ganlyniad yr astudiaeth hon, dangoswyd bod ei grwpiau swyddogaeth (3-hydroxy a 4-grwpiau methoxy) yn gysylltiedig â chynnydd sylweddol yn y gweithgaredd atal tyrosinasein.

Tabl 1. Gweithgaredd ataliol tyrosinase a dadansoddiad cinetig ensym o BHCP.

At hynny, archwiliwyd y mecanwaith sy'n gyfrifol am ataliad tyrosinase gan BHCP gan ddadansoddiad cinetig ensym yn yr astudiaeth bresennol (Tabl 1 a Ffigur 2). Roedd lleiniau gwehydd llinell-Burk yn defnyddio'r data a gafwyd o'r astudiaethau cinetig, a chafwyd y cysonyn ataliad (Ki) o'r plotiau Dixon. Roedd plotiau dwyochrog Lineweaver-Burk yn dynodi ataliad tebyg i gystadleuaeth. Fel y dangosir yn Ffigur 2a–c, gweithredodd BHCP fel atalydd cystadleuol L-tyrosine a L-DOPA. a ddefnyddir i ganfod y mathau o gysonion ataliad ensym (Ki) ar gyfer cymhlyg ensymau-atalydd [21,22], lle mae gwerth echelin thex yn dynodi gwerth −Ki. Fel y dangosir yn Ffigur 2b–d, gwerthoedd Ki BHCP oedd 1.7 μMand 10.5 μM fel swbstradau ar gyfer L-tyrosine ac L-DOPA, yn y drefn honno. Gan fod y gwerth Ki yn cynrychioli'r crynodiad sydd ei angen i ffurfio cymhlyg atalydd ensym, mae gwerth Ki is yn awgrymu ataliad mwy effeithiol yn erbyn tyrosinase.

Ffigur 2. Lleiniau gwehydd llinell-Burk (a,c) a Dixon (b,d) ar gyfer ataliad ensymau tyrosinase gan BHCP.

2.3. Effeithiau BHCP ar Hyfywedd Celloedd Melanoma B16F10 a Chelloedd Ffibroblast Hs27

Cyn penderfynu a oedd BHCP yn cyflawni unrhyw weithgareddau gwrth-melanogenesis a gwrth-wrinkle, fe wnaethom archwilio sytowenwyndra BHCP i gelloedd B16F10 a chelloedd Hs27 trwy driniaeth gyda chrynodiadau gwahanol o BHCP am gyfnodau amser gwahanol, a mesurwyd hyfywedd celloedd gyda'r assayEZ-Cytox. Fel y dangosir yn Ffigur 3a,b, ni wnaeth hyd at 10 μM o BHCP am 48 h leihau goroesiad naill ai celloedd B16F10 na chelloedd Hs27. Yn dilyn hynny, cynhaliwyd astudiaethau in vitro pellach ar weithgareddau gwrth-melanogenesis a gwrth-wrinkle BHCP gyda 1, 5, a 10 μM.

2.4. Atal BHCP yn erbyn Cynnwys Melanin a Gweithgaredd Cellog Tyrosinase mewn Celloedd Melanoma B16F10

Er mwyn penderfynu a yw BHCP yn gweithredu potensial ataliol ar gynnwys melanin celloedd -MSH-inducedB16F10, cyn-driniwyd celloedd gyda'r crynodiadau gwahanol a nodwyd (1, 5, a 10 μM) o BHCP neu asid kojic (5 mM) am 24 h ac yna eu hysgogi. gyda -MSH am 48 h. Fel y dangosir yn Ffigur 4a, gostyngodd y cynnwys melanin yn y celloedd a gafodd eu trin â BHCP ym mhresenoldeb -MSH mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad, gan ddangos 113 y cant ar 1 μM, 106 y cant ar 5 μM, a 102 y cant ar 10 μM, o'i gymharu â'r grŵp rheoli wedi'i drin â -MSH yn unig (186 y cant ). Yn ddiddorol, roedd BHCP (1 μM) yn atal cynnwys melanin yn gryfach nag asid kojic (5 mM). At hynny, cynhaliwyd asesiad gweithgaredd tyrosinase cellog i fesur effaith ataliol BHCP ar gelloedd B16F10. Fel y dangosir yn Ffigur 4b, gostyngodd BHCP mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad gyda'r gweithgaredd tyrosinase 120 y cant ar 1 μM, 116 y cant ar 5 μM, a 105 y cant ar 10 μM, o'i gymharu â'r grŵp rheoli a gafodd ei drin â -MSH yn unig (181 y cant). Roedd effaith ataliol BHCP yn llawer mwy grymus nag asid kojic; roedd ataliad BHCP ar 1 μM yn well na'r hyn o asid kojic ar 5 mM (131 y cant ). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod gan BHCP effaith gwynnu trwy atal biosynthesis melanin a synthesis tyrosinase mewngellol mewn melanocytes B16F10.

Ffigur 4. Atal cynnwys melanin (a) a gweithgaredd tyrosinase cellog (b) BHCP ar gelloedd melanoma B16F10.

2.5. Effeithiau BHCP ar Fynegiant MITF/Tyrosinase a CREB Ffosfforyleiddiad mewn Celloedd B16F10

Mae MITF, ffactor trawsgrifio penodol, yn chwarae rhan ganolog wrth actifadu'r melanogengenau yn effeithiol, gan gynnwys tyrosinase, gan gataleiddio'r cam cyfyngu cyfradd mewn biosynthesis melanin: TRP-1, a TRP-2. Gallai mynegiant MITF cael ei gynyddu gan ffosfforyleiddiad CREB [23]. Mae CREB yn hyrwyddwr pwysigMITF [24,25], ac mae ffosfforyleiddiad CREB mewn melanocytes yn cynyddu mynegiant MITF trwy rwymo'r CREB (protein sy'n rhwymo elfen ymateb c-AMP) mewn melanocytes [26]. Er mwyn egluro'r llwybrau moleciwlaidd sy'n gyfrifol am effaith gwrth-melanogenig BHCP ar gelloedd B16F10, fe wnaethom archwilio lefelau protein moleciwlau allweddol, gan gynnwys CREB a MITF, sy'n chwarae rolau pwysig mewn melanogenesis gan ddadansoddiad blot y Gorllewin. Cafodd y celloedd eu trin â BHCP neu asid kojic ac yna eu hysgogi gan -MSH am 48 h. Roedd y cyfnod amser ar gyfer y mesuriadau yn dilyn y fethodoleg a ddisgrifiwyd mewn astudiaethau blaenorol [27]. Fel y dangosir yn Ffigur 5, cynyddodd lefelau tyrosinase a MITF gyda -MSH, ond gostyngodd BHCP y lefelau protein hyn. At hynny, cafodd ffosfforyleiddiad CREB ei atal yn sylweddol gan BHCP. Mae'n hysbys bod rheoleiddio ffosfforyleiddiad CREB a achosir gan -MSH yn bwysig wrth reoleiddio pigmentiad [28]. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod effeithiau gwrth-melanogenig BHCP yn deillio o is-reoleiddio MITF a tyrosinase trwy is-reoleiddio CREB ffosfforyleiddiad. Mae'r astudiaeth bresennol yn awgrymu bod egluro mecanwaith atal BHCP ar tyrosinase a melanogenesis yn hollbwysig a bod yn rhaid ymchwilio iddo ymhellach yn y dyfodol. Er bod llinell gell melanoma B16F10 yn gyffredinol yn fwy addas ar gyfer ymchwilio i fecanweithiau signalau in vitro, mae llinell gell B16F10 yn cynnwys melanoma cnofilod. Felly, bydd angen astudiaethau pellach ar felanosytau dynol i gadarnhau'r canfyddiadau.

2.6. Effaith BHCP ar Weithrediad NF-κB p-p65 a achosir gan UV mewn Celloedd Hs27

Y tro nesaf fe wnaethom ymchwilio i effaith BHCP ar fynegiant a achosir gan UV o gyfryngwyr llidiol gan ddefnyddio ffibroblastau Hs27. Adroddwyd yn flaenorol bod ffosfforyleiddiad p65 (Ser536) yn hanfodol ar gyfer ei allu i draws-actifadu genynnau [29]. Felly, archwiliwyd lefelau protein p-p65 (Ser536) andp65 yn y ffracsiwn cnewyllyn gan blotio Gorllewinol. Fel y nodir yn Ffigur 6a,b, mewn celloedd Hs27, cynyddodd UV lefelau protein p-p65 (Ser536) yn y cnewyllyn, tra bod triniaeth BHCP wedi gostwng lefelau protein cnewyllyn p-p65 (Ser536). Yn gyfatebol, gostyngwyd cyfanswm y p65 yn y cytoplasm gan UV a'i adfer gan BHCP (Ffigur 6c,d). Er bod lefelau mynegiant protein p65 wedi gostwng yn y cytoplasm a'u cynyddu yn y cnewyllyn ar ôl anwythiad UV, roedd rhag-driniaeth gyda BHCP yn gwrthdroi'r tueddiadau hyn mewn modd sy'n dibynnu ar ddos. Felly, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai atal p-p65 gan BHCP gyfrannu at yr effeithiau amddiffynnol ar bigiad croen a dinistrio colagen yn erbyn UV.

Ffigur 6. Effeithiau BHCP ar lefelau mynegiant p-p65 (Ser536) mewn celloedd ffibroblast dynol Hs27 a achosir gan UV.

2.7. Effaith BHCP ar Fynegiant MMPs mewn Celloedd Hs27

Mae MMPs yn chwarae rhan hanfodol mewn heneiddio croen. Mae arbelydru UV yn newid meinweoedd cyswllt y croen trwy ddadreoleiddio mynegiant MMPs [30,31]. Ensym sy'n dadelfennu colagen yw MMP-1 sy'n cyflymu dadansoddiad colagen wedi'i syntheseiddio o brocolagen math I. Ensym sy'n dadelfennu gelatin yw MMP-9 sy'n torri i lawr ffibrau colagen a dorrir gan MMP-1, gan gynyddu cynhyrchiant crychau a cholli elastigedd. I archwilio effaith gwrth-wrinkle BHCP yn erbyn anwythiad UV, fe wnaethom bennu lefelau protein MMP-1 a MMP-9 trwy blotio Gorllewinol. Ymhellach, dangosodd celloedd UV-anwythol lefel sylweddol uwch o MMP-13, sy'n cychwyn diraddio colagen math I aIII yn lle MMP-1 [32]. Fe wnaethom ymchwilio i'r cynnydd mewn MMPs (MMP1, MMP9, MMP12, ac MMP13) ar ôl trin celloedd Hs27 a achosir gan UV gyda BHCP ar 1 a 10 μM. Fel y dangosir yn Ffigur 7, cynyddodd lefelau mynegiant MMP-1, MMP-9, MMP-12, a MMP-13 ar ôl anwythiad UV; fodd bynnag, gostyngodd mynegiant triniaeth BHCP mewn dos - dull dibynnol. Mae ein canlyniadau'n awgrymu y gallai BHCP gyfrannu at atal ffurfio crychau trwy leihau cynhyrchiad annormal MMPs a achosir gan amlygiad UV. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod BHCP yn atal mynegiant MMP mewn ffibroblastau Hs27 i atal dadelfeniad colagen, ac felly cynhyrchu crychau. Felly, mae BHCP yn dangos y potensial i'w ddefnyddio fel cyffur atal a thrin clefydau sy'n gysylltiedig â'r croen.

manteision stem cistanche

3. Deunydd a Dulliau

3.1. Cemegau ac Offeryniaeth

Prynwyd tyrosinase madarch (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tyrosine, 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), dimethyl sulfoxide (DMSO), ac asid kojic gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, UDA).Prynwyd cyfrwng Eagle's (DMEM) addasedig Dulbecco, serwm buchol ffetws, streptomycin, ac amffotericin gan Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, UDA). Gwrthgyrff yn erbyn MITF, CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), t65, tyrosinase, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , a -actinwere prynu gan Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, UDA). Cafwyd pilenni difluorid polyvinylidene (PVDF) gan y Millipore Corporation (Bedford, MA, UDA). Prynwyd nwyddau di-haint plastig ar gyfer meithriniadau meinwe gan SPL Labware (Seoul, Korea). Darparwyd y ffynhonnell golau UV gan y gyfres Crosslinker 800 (UVP, CA, UDA) 6 lamp uned (8 wat/lamp). Perfformiwyd cromatograffaeth haen denau a gel silica 60 (rhwyll 230–400) ar silica gelF{{27} }platiau wedi'u gorchuddio ymlaen llaw o Merck Millipore (Darmstadt, yr Almaen). Recordiwyd sbectra NMR gan ddefnyddio offerynnau Varian Unity INOVA 400 (400 MHz ar gyfer 1H, 100 MHz ar gyfer 13C) ac Varian Unity AS 500 (500 MHz ar gyfer 1H). Adroddir gwerthoedd sifft cemegol (δ) gan gyfeirio at y brigau toddyddion gweddilliol neu ddiwtadwy priodol (δH 2.50 a δC 39.51 ar gyfer DMSO). Cafwyd data sbectrometreg màs cydraniad isel gyda sbectromedr màs Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, UDA).

3.2. Assay Atal Tyrosinase Madarch

Penderfynwyd ar weithgaredd ataliol tyrosinase madarch gan ddefnyddio asbstradau L-tyrosine a L-DOPA, yn seiliedig ar y weithdrefn a ddisgrifiwyd gan Jung et al. [23]. Yn gryno, ychwanegwyd 190 μL o ensym tyrosinase (1000 U wedi'i wanhau â byffer tyrosinase madarch, gan gynnwys 1 mM L-tyrosine a hydoddiant L-DOPA), ym mhresenoldeb neu absenoldeb cyfansoddion (crynodiad terfynol yn amrywio o 1 i 20 μM, hydoddi yn 100 y cant DMSO), i bob ffynnon o 96-blat ffynnon, i ddarparu cyfaint terfynol o 200 μL. Deorwyd y plât ar 37 ◦C am 30 munud. Mesurwyd gweithgaredd Tyrosinase trwy fesur yr amsugnedd ar 492 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate (TECAN, Salzburg, Awstria) a chafwyd yr ataliad canrannol (y cant) o'r hafaliad canlynol:

ataliad y cant=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

lle mae Ac yn amsugnedd y rheolydd ac As yw amsugnedd y sampl. Cafodd y gwerthoedd IC50 eu cyfrifo o'r cromliniau log-llinol a'u hafaliadau. Dangosir canlyniadau cyfartalog ar gyfer tri dyfarniad. Defnyddiwyd asid Kojic fel rheolaeth gadarnhaol.

3.3. Dadansoddiad Cinetig o Atal Tyrosinase

Er mwyn pennu'r mecanweithiau cinetig, defnyddiwyd dau ddull cinetig (Lineweaver-Burk a Dixon plots) yn ategol [21,22,33]. Ar gyfer y lleiniau cilyddol dwbl Lineweaver-Burk (llain o 1/cyflymder ensym (1/V) yn erbyn crynodiad 1/swbstrad (1/[S]))), penderfynwyd ar y math o ataliad gan ddefnyddio crynodiadau amrywiol o L-tyrosin (1, 2, a 4 mM) ac L-DOPA (0.5, 1, a 2 mM) fel swbstrad ym mhresenoldeb crynodiadau gwahanol o BHCP. Roedd crynodiadau BHCP fel a ganlyn:0, 0.5, 1.{{20}}, a 2.0 μM ar gyfer L-tyrosine; a 0, 2.5, 5, ac 10 μM ar gyfer L-DOPA. Mae'r plot Dixon yn ddull graffigol (llain o gyflymder 1/ensym (1/V) yn erbyn crynodiad atalydd (I))) ar gyfer pennu'r math o ataliad ensymau ac fe'i defnyddiwyd i bennu'r cysonyn daduniad neu Ki ar gyfer cymhlyg atalydd ensym. Cafwyd lleiniau Dixon (lleiniau cilyddol sengl) o'r ataliad ym mhresenoldeb swbstrad L-tyrosine yn 1, 2, a 4 mM a {{40}}, 0.5, 1.{ {47}}, a 2.0 μM ar gyfer BHCP; a L-DOPAsubstrate ar {{50}}.5, 1.0, a 2.0 mM a 0, 2.5, 5.0, a 10.0 μM ar gyfer BHCP.

planhigyn cistancheyn atalydd tyrosinase.

3.4. Llinellau Cell a Diwylliant Cell

Cafwyd celloedd melanoma Murine B16F10 o Fanc Llinell Cell Corea. Prynwyd llinell gell ffibroblast croen dynol Hs27 o'r Casgliad Diwylliant Math Americanaidd (ATCC, Manassas, VA, UDA). Roedd y celloedd hyn yn cael eu cynnal yn DMEM ynghyd â 10 y cant o serwm buchol ffetws, 100 U/ml penisilin, a 100 mg/ml streptomycin mewn deorydd CO2 llaith 5 y cant ar 37 ◦C. Cafodd ffibroblastau dermol ar ddysgl 100 mm eu trin â BHCP a'u hamlygu i 50 mJ/cm2UV mewn DMEM di-serwm (ffynhonnell golau UV, UVP). Cafodd y celloedd Hs27 eu meithrin i 70-80 y cant o gydlifiad mewn plât diamedr 100 mm ac fe'u defnyddiwyd rhwng darnau 5 a 15.

3.5. Assay Hyfywedd Celloedd

Aseswyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio'r assay kit EZ-Cytox. Yn gryno, cafodd celloedd B16F10 a Hs27fibroblasts eu hadu i mewn i blât ffynnon 96- ar ddwysedd o 1 × 104 cell/ffynnon a'u deor ar 37 ◦Cfor 24 h. Cafodd y celloedd eu bwydo DMEM ffres, di-serwm a oedd yn cynnwys crynodiadau gwahanol (0, 1, 2, 5, a 10 μM) o BHCP, a'u deor am 24 a 48 h. Yn dilyn hynny, llwythwyd 10 μL o hydoddiant EZ-Cytox i bob ffynnon a deorwyd y celloedd am 2-4 h. Ystyriwyd bod mesuriad amsugnedd celloedd yn absenoldeb unrhyw driniaeth yn goroesiad celloedd 100 y cant. Perfformiwyd pob triniaeth yn ddyrys ac ailadroddwyd pob arbrawf dair gwaith.

3.6. Penderfynu Assay Cynnwys Melanin

Roedd effaith BHCP ar melanogenesis a achosir gan -MSH mewn celloedd B16F10 yn seiliedig ar ddull a ddefnyddiwyd yn flaenorol gydag addasiadau bach [34]. Yn gryno, caniatawyd i gelloedd B16F10 (5 × 104 cell/ffynnon) mewn 6-blatiau ffynnon dyfu i gydlifiad 70-80 y cant. Yna cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol o BHCP (1, 5, a 10 μM) neu asid kojic (5 mM) am 24 h, ac yna eu hysgogi â -MSH (5 μM) am 48 h. Ar ôl triniaeth, golchwyd y celloedd ddwywaith gyda PBS oer iâ, wedi'u diddymu mewn 90 μL 1 M NaOHsolution gan gynnwys DMSO (5 y cant) ar 60 ◦C am 1 h, a mesurwyd yr amsugnedd ar 405 nm gyda sbectrophotometer microplate (TECAN, Salzburg , Awstria). I fesur faint o melanin yn yr arbrawf, cyfrifwyd cyfradd yr ataliad yn y grwpiau triniaeth o amsugnedd y crynodiadau hysbys o melanin synthetig, a gafodd eu cywiro i gyfanswm y protein a oedd yn bresennol yn uwchnatant y lysates cell. Mesurwyd amsugnedd celloedd heb eu trin yn driphlyg.

3.7. Assay Gweithgaredd Tyrosinase Cellog

Perfformiwyd assay gweithgaredd tyrosinase cellog trwy fesur cyfradd ocsidiad L-DOPA [35]. Gosodwyd celloedd B16F10 ar ddwysedd o 5 × 104/celloedd mewn 6-llestri ffynnon a'u deor dros nos. Yna cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau amrywiol o BHCP (1, 5, a 10 μM) neu asid kojic (5 mM) am 24 h, ac yna eu hysgogi â -MSH (5 μM) am 48 h. Cafodd y celloedd eu golchi â PBS a'u gorchuddio mewn hydoddiant sy'n cynnwys 100 μL o glustogfa ffosffad 50 mM (pH 6.5), 0.1 mMphenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), ac 1 y cant Triton X-100. Yna, gosodwyd y celloedd mewn peiriant rhewgell dwfn (−80 ◦C) am 30 munud. Ar ôl dadmer y celloedd, cafodd y darnau cellog eu puro trwy allgyrchu ar 12,000 rpm am 30 munud ar 4 ◦C. Ychwanegwyd cyfanswm o 80 μL y supernatant a 20 μL oL-DOPA (2 mg/mL) at 96-blat ffynnon, a mesurwyd yr amsugnedd ar donfedd o 492 nm bob 10 munud yn ystod 1 h ar 37 ◦ C gyda darllenydd plât ELISA (TECAN, Salzburg, Awstria).

3.8. Paratoi Detholiad Cytosolig a Niwclear o Gelloedd Hs27

Cafodd y celloedd Hs27 eu golchi â PBS oer iâ a'u cynaeafu. Defnyddiwyd byffer yn cynnwys 10 mM Tris(pH 8.0), 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 y cant NP-40, ac atalyddion proteas i echdynnu ffracsiynau sytosolig gan centrifugio ar 12, 000 rpm ar 4 ◦C am 15 munud, a chafodd ffracsiynau niwclear eu tynnu o belenni gan ddefnyddio byffer yn cynnwys 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, ac atalyddion proteas, wedi'u deor ar rew am 30 munud, ac yna wedi'i allgyrchu ar 13,000× g am 30 munud ar 4 ◦C i gael ffracsiynau niwclear.

3.9. Blotio Gorllewinol

Cafodd samplau Lysate eu berwi am 10 munud mewn byffer llwytho gel (125 mM Tris-HCl, 4 y cant sodiwmdodecyl sylffad (SDS), 10 y cant 2-mercaptoethanol, a 0.2 y cant bromophenol glas; pH 6.8) ar gymhareb cyfaint o 1:1. Gwahanwyd cyfanswm y protein cyfatebol ar gyfer pob sampl gan gelelectrofforesis SDS-polyacrylamide (PAGE) gan ddefnyddio geliau acrylamid yn seiliedig ar y weithdrefn a ddisgrifiwyd gan Laemmli [36] a'i drosglwyddo i bilenni PVDF ar 80 V am 2 h gan ddefnyddio'r system trosglwyddo gwlyb. Gosodwyd y pilenni ar unwaith mewn byffer blocio (5 y cant o laeth di-fraster) mewn Tris 10 mM, pH 7.5, 100 mMNaCl, a 0.1 y cant Tween-20. Cafodd y blotiau eu rhwystro i atal rhwymo amhenodol ar 25 ◦C am 2 h. Yn dilyn hynny, deorwyd y pilenni â gwrthgorff cynradd penodol ar 4 ◦C dros nos, ac yna deorwyd gyda gwrthgorff eilaidd marchruddygl peroxidase-cyfun ar 25 ◦Cfor 1 h. . Canfuwyd labeli gwrthgyrff gan gemioleuedd uwch yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Perfformiwyd meintioli protein gan ddefnyddio System Ddelweddu Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence CAS-400SM (Core Bio, Seoul, Korea). Defnyddiwyd marcwyr protein wedi'u cadw ar gyfer pennu pwysau moleciwlaidd.

3.10. Dadansoddiad Ystadegol

Cyflwynir yr holl ddata fel cymedr ± SEM Dadansoddwyd y data trwy ddadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) ar gyfer y gwahaniaethau rhwng triniaethau a ddilynwyd gan brawf post-hoc Bonferroni. Ystyriwyd gwerth ofp < 0.05="" yn="" ystadegol="">

4. Casgliadau

I grynhoi, dangosodd canfyddiadau'r astudiaeth bresennol fod gan BHCP effaith gwynnu croen trwy atal tyrosinase, sy'n ensym allweddol ar gyfer biosynthesis melanin mewn -MSH-a achosir gan B16F10melanocytes B16F10melanocytes. At hynny, gostyngodd BHCP fynegiant lefelau protein MMP mewn ffibroblastau a achosir gan UV, y disgwylir iddo gael effaith gwrth-wrinkle. Mae angen ymchwil pellach i gadarnhau effeithiau gwynnu a gwrth-wrinkle BHCP trwy astudiaethau anifeiliaid a chlinigol. Yn olaf, nodwyd bod gan BHCP effeithiau gwynnu a gwrth-wrinkle, gan nodi ei botensial ar gyfer datblygu cyfryngau therapiwtig ar gyfer clefydau sy'n gysylltiedig â gorbigmentu a chrychni.

beth yw cistanche

Am fwy o wybodaeth, cliciwch yma.