Priodweddau Ffoto-amddiffynnol A Gwrth-Melanogenig O Wahanol Detholiad Kadsura Coccinea

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ymbelydredd uwchfioled solar (UV), a nodweddir gan UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm), ac UVC (100-280 nm), yw'r ffactor amgylcheddol mwyaf hanfodol sy'n achosi canser y croen a thynnu lluniau o ganlyniad i sytowenwyndra, genowenwyndra. , a ffotowenwyndra. Yn benodol, mae ymbelydredd UVA ac UVB yn cynnwys dros 95 y cant a 3 y cant o arbelydru UV dyddiol, yn y drefn honno [8]. Gall arbelydru UVA ac UVB achosi rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn anuniongyrchol neu'n uniongyrchol trwy dreiddio i haenau epidermaidd a / neu ddermol y croen, gan arwain at ddifrod ocsideiddiol a marwolaeth celloedd. Yn ystod y degawdau diwethaf, mae ymbelydredd UV wedi dod yn bryder iechyd croen difrifol ac mae'n dal i ledaenu'n beryglus ledled y byd [9-11]. Mae arbelydru UV yn symbylydd uniongyrchol a chyson o keratinocytes, sy'n cyfrif am tua 95 y cant o fàs celloedd epidermaidd y croen. Mae Keratinocytes yn gweithredu fel y rhwystr cyntaf yn erbyn peryglon microbaidd, cemegol a chorfforol, ac yn helpu i amddiffyn rhag ymbelydredd UVA ac UVB. Pan fydd keratinocytes yn agored i UVA a UVB, cynhyrchir ROS mewngellol, gan sbarduno apoptosis [12-14].

Mae melanocytes yn gyfrifol am gynhyrchu a maint pigmentau melanin, sy'n chwaraewyr pwysig yn amddiffyniad biolegol epidermis y croen; gall eu dadreoleiddio achosi hyperpigmentation neu anhwylderau hypopigmentation [15,16]. Mae melanocytes yn cael eu dosbarthu yn basal stratum yr epidermis croen, sydd hefyd yn cael ei effeithio gan amlygiad golau'r haul, rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), a hormonau ysgogol -melanocyte (-MSH) [17,18]. Mae Tyrosinase, sy'n aelod o'r teulu math o brotein copr, yn feteloprotein sydd wedi'i warchod yn esblygiadol sy'n chwarae rhan hanfodol mewn melanogenesis ac mewn gweithgareddau monophenol monooxygenase, catecholase, a deuffenolau. Mae is-reoleiddio tyrosinase, protein sy'n gysylltiedig â thyrosinase-1 (TRP-1), a phrotein sy'n gysylltiedig â thyrosinase-2 (TRP-2) yn cael effeithiau catalytig penodol. Mae TRP{14}} yn 5,6-dihydroxyindole-2-asid carbocsilig ocsidas, ac mae TRP-2 yn tautomerase DOPAchrome [19,20]. Yn ogystal, mae'r ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â myoffthalmosis (MITF) a phrotein elfen-rhwymo elfen ymatebol cAMP (CREB) yn ffactorau trawsgrifio sy'n rheoleiddio melanogenesis yn bennaf ac yn amgodio gwybodaeth am fodd a dwyster yr ysgogiad [17,21]. Mae astudiaethau lluosog wedi nodi bod llwybrau MITF a CREB yn rheoleiddio melanogenesis. Mae MITF yn ffactor allweddol wrth drawsgrifio ensymau sy'n gysylltiedig â melanogenesis a rheolydd canolog melanogenesis. -MSH yn arwain at fynegiant MITF trwy fecanwaith signalau sy'n cynnwys protein rhwymo sy'n gysylltiedig â cAMP (CREB). Yna, mae MITF yn mynd i mewn i'r cnewyllyn gyda'r dilyniant M-box (AGTCATGTGCT) i hyrwyddo trawsgrifio genynnau ac ensymau melanogenig penodol. Mae'n hysbys hefyd bod CREB ffosfforylaidd yn cael ei ysgogi gan -MSH, sy'n clymu i'r elfen consensws CRE yn hyrwyddwr Mitf i ddadreoleiddio trawsgrifiad Mitf [21-24].

Yn yr astudiaeth hon, cymharwyd darnau o wreiddyn KC (KCR), coesyn (KCS), dail (KCL), a ffrwythau (KCF) yn gynhwysfawr a chynhaliwyd gwerthusiadau lluosog o'u priodweddau ffotoprotective a gwrth-melanogenig.

2. Defnyddiau a Dulliau

2.1. Paratoi Detholiad KC

Tyfwyd planhigyn KC 15 tair oed mewn pot plastig 9 L ar gampws Miryang ym Mhrifysgol Genedlaethol Pusan. Nodwyd KC gan yr Athro Young Whan Choi, awdur yr astudiaeth hon. Cafodd y samplau hyn eu hadneuo fel sbesimenau taleb (rhif derbyn KC-PDRL-1) yn llysieufa Adran Biowyddoniaeth Garddwriaethol, Coleg Adnoddau Naturiol a Gwyddor Bywyd, Prifysgol Genedlaethol Pusan. Cafodd planhigion eu dyfrio'n ddigonol gan ddefnyddio hydoddiant maethol cyflawn gyda lefel dargludedd o 1.0 mS·cm−1 ac yn cynnwys yr elfennau canlynol (yn me·L−1): NA3-N, 16; NH4-N, 1.34; P, 4 ; K, 8; Ca, 8; a S, 4. Cynaeafwyd gŵn KC yn y porthladd ym mis Rhagfyr 2020 trwy ddosbarthu gwreiddiau, coesynnau, dail a ffrwythau (Ffigur 1A). Roedd samplau wedi'u cynaeafu yn cael eu lyoffileiddio ar unwaith mewn peiriant sychu rhewi a'u storio mewn bagiau finyl ar 20 ◦C tan ddadansoddiad. Cafodd gwreiddiau sych, coesynnau, dail a ffrwythau KC (20 g) eu malu'n bowdr mân a'u tynnu ar dymheredd ystafell gydag alcohol ethyl. Yn fyr, perfformiwyd hidlo ac anweddu echdynion EtOH o KC o dan bwysau llai ar 45 ◦C ac yna lyophilization. Yn olaf, diddymwyd y darn solet (50 mg / mL) mewn dimethyl sulfoxide (DMSO) ar gyfer arbrofion pellach.

cistancheherba epimedium sagittatumdyfyniad

2.2. Cyfanswm Cynnwys Polyphenolic a Flavonoid Detholiad KC

Fel y disgrifiwyd yn flaenorol [25], mesurwyd cyfanswm cynnwys polyphenolic a flavonoid gwreiddyn KC, coesyn, dail, a ffrwythau gan ddefnyddio dulliau lliwimetrig Folin-Ciocalteu (cyfanswm polyphenol) ac alwminiwm clorid (flavonoid). Mesurwyd amsugnedd ar 700 nm (cyfanswm polyphenol) gan ddefnyddio Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buck- ingham, UK) ac ar 510 nm (flavonoid) gan ddefnyddio Darllenydd Plât Multilabel VICTOR (Perkin-Elmer, Waltham, MA, UDA) .

Adeiladwyd cromliniau safonol gan ddefnyddio asid galig (cyfanswm polyphenol) a quercetin (flavonoid) fel y safonau, a mynegwyd y canlyniadau fel cyfwerth ag asid galig fesul gram (GAE/g) o wreiddyn KC, coesyn, dail, a darnau ffrwythau a chyfwerth â quercetin. fesul gram (QE/g) o echdynion gwraidd KC, coesyn, dail, a ffrwythau, yn y drefn honno.

2.3. Assay DPPH ac ABTS

Mesurwyd gweithgareddau sborion radical DPPH ac ABTS o ddarnau gwraidd, coesyn, dail a ffrwythau KC ({{0}.5 mg/mL) yn ôl dull a ddisgrifiwyd yn flaenorol [25] gydag addasiadau bach. Cymysgwyd gwreiddyn KC, coesyn, dail, a ffrwythau (0.5 mg/mL) â hydoddiant DPPH (60 µM) mewn microblatiau. Ar ôl i'r samplau gael eu hysgwyd yn egnïol, cawsant eu cadw yn y tywyllwch ar 25 ◦C am 0.5 h. Paratowyd hydoddiannau stoc o 7 mM ABTS a 2.6 persulfate potasiwm mewn dŵr distyll ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch am 18 awr. Cymysgwyd gwreiddyn KC, coesyn, dail, a ffrwythau (0.5 mg / mL) gyda'r hydoddiant gweithio ac yna'n cael sefyll am 0.5 h ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch. Cafodd amsugnedd y cymysgeddau sampl ei fonitro ar 510 nm (DPPH) neu 734 nm(ABTS).

2.4. Diwylliant Cell

Cafodd y Keratinocytes glynu (HaCaT) a'r melanocytes glynu (B16F10) eu brechu mewn datrysiad diwylliant DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, UDA) sy'n cynnwys 10 y cant o FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, UDA) ac 1 y cant penisilin / streptomycin (Invitrogen Gorfforaeth, Carlsbad, CA, UDA) a diwylliedig ar 37 ◦C gyda 5 y cant CO2. Arsylwyd twf celloedd HaCaT a B16F10 glynu'n rheolaidd, a newidiwyd y cyfrwng bob dau i dri diwrnod. Defnyddiwyd celloedd o'r cyfnod twf logarithmig ar gyfer arbrofion dilynol.

2.5. Arbelydru UVA ac UVB

Roedd Keratinocytes yn agored i arbelydru UVA neu UVB (Bio-Link BLX-365, Villber- Lourmat, Eberhardzell, yr Almaen) gyda 5 8 tiwbiau W sy'n allyrru'r rhan fwyaf o'u hynni ar frig allyriadau naill ai 365 nm ( UVA) neu 312 nm (UVB). Roedd dosau arbelydru UVA yn 20 J/cm2 a dosau arbelydru UVB yn 50 mJ/cm2.

2.6. Mesur Hyfywedd Celloedd a Sytowenwyndra trwy Ddadansoddi CCK-8 a LDH

Ar gyfer dadansoddiad hyfywedd celloedd, ychwanegwyd datrysiad Cell Counting Kit-8 (CCK-8) o'r CCK-8 Assay Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) at keratinocytes HaCaT ac ataliadau celloedd melanoma B16F10 yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr a'u deor ar 37 ◦C am 4 h. Yn gryno, cafodd 2 104 celloedd eu hadu i bob ffynnon o 24-blat ffynnon a'u deor â 5 y cant o CO ar 37 ◦C am 24 h. Yn gryno, cafodd 2 104 celloedd eu hadu i bob ffynnon o 24-blat ffynnon a'u deor â 5 y cant o CO ar 37 ◦C am 24 awr. Ar ôl 24 awr o ddeor, ychwanegwyd adweithydd CCK-8 at bob ffynnon, a deorwyd y celloedd ymhellach am 4 awr. Defnyddiwyd pecyn canfod sytowenwyndra (Roche Applied Science, y Swistir) i bennu rhyddhau lactad dehydrogenase allgellog (LDH) mewn cyfrwng diwylliant ceratinocyte HaCaT. Dadansoddwyd amsugno ar 450 nm (CCK-8) a 490 nm (LDH) gan ddefnyddio Darllenydd Plât Amllabel VICTOR.

2.7. Gwerthusiad o Gynhyrchu ROS Mewngellol mewn Keratinocytes

Dadansoddwyd lefelau ROS mewngellol gan ddefnyddio {{0}}(a-6)-chloromethyl-2′,7′-dichloride- hydrofluorescein diacetate acetyl ester (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA). Perfformiwyd yr holl weithdrefnau yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, ar ôl triniaeth echdynion rhannol eraill KC (0.5 mg/mL), golchwyd Keratinocytes (HaCaT) â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) a'i ddeor â CM-H2DCFDA (5 µM) am 0.5 h yn y tywyllwch. Wedi hynny, delweddwyd cynhyrchu ROS mewngellol gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd Carl Zeiss; mesurwyd dwyster fflworoleuedd yn seiliedig ar liw fflwroleuol (CM-H2DCFDA) gan ddefnyddio cytomedr llif (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, UDA).

2.8. Dadansoddiad o Apoptosis

Ar ôl datguddiad a thriniaeth, cafodd keratinocytes HaCaT eu trypsineiddio a'u centrifugio. Yn dilyn hynny, gwerthuswyd apoptosis o'r celloedd a gafwyd gan ddefnyddio'r Pecyn CellApoptosis V / Marw Annexin fluorescein isothiocyanate (FITC) (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn fyr, rinsiwyd keratinocytes ddwywaith gyda PBS, a chafwyd keratinocytes yn y byffer rhwymo anexin a'u cymysgu â datrysiad gweithio FITC / Atodiad V (cydran A) a propidium ïodid (PI). Ar ôl deori ar dymheredd ystafell am 15 munud yn y tywyllwch, mesurwyd apoptosis keratinocyte a chyfrifwyd canran y celloedd apoptotig gan ddefnyddio cytomedr llif (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, UDA). Canfuwyd arwyddion ar gyfer sianeli FL1 (FITC/Nexin V) a FL3 (PI), a sefydlwyd staen marciwr cwadrant a phlotiau dotiau o'r celloedd lliw.

2.9. Dadansoddiad o Gynnwys Melanin Mewngellol a Gweithgaredd Tyrosinase

Mesurwyd cynnwys melanin mewngellol a phrofion gweithgaredd tyrosinase trwy egluro lle'r oedd y weithdrefn wedi'i haddasu ychydig yn wahanol [24]. Cafodd melanocytes eu trin â chrynodiad terfynol o 0.5 µM -MSH a 0.5 mg/mL KC echdynion rhannol eraill am 48 h. Cafodd pelenni melanocyte eu gosod gydag 1 N NaOH mewn 10 y cant DMSO ar 80 ◦C am 1 h. Pennwyd cynnwys melanin cymharol trwy fesur amsugnedd ar 475 nm gan ddefnyddio Darllenydd Plât VICTORMultilabel. Pennwyd gweithgaredd tyrosinase mewngellol trwy fesur cyfradd cynhyrchu dopacrom gan ddefnyddio L-DOPA. Cafodd melanocytes eu golchi â PBS oer iâ a'u gosod mewn PBS yn cynnwys 1 y cant (w/v) Triton X-100. Paratowyd y swbstrad tyrosinase L-DOPA (2 mg / mL) yn yr un byffer lysis ffosffad. Rhoddwyd pob echdyniad mewn 96-plât ffynnon, a chychwynnwyd dadansoddiad ensymau trwy ychwanegu hydoddiant L-DOPA. Ar ôl deori am 1 h, mesurwyd yr amsugnedd ar 475 nm gan ddefnyddio Darllenydd Plât Amllabel VICTOR i ddadansoddi cynhyrchiad dopachrome. Mynegwyd gwerth pob mesuriad fel canran o'r rheolaeth. Defnyddiwyd Arbutin (A, 0.5 mg / mL) fel rheolaeth gadarnhaol.

Cistancheechinacosideyn atalydd tyrosinase.

2.10. PCR Amser Real Meintiol

Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu o bob grŵp o felanocytes gan ddefnyddio'r Pecyn Bach RNeasy (QIAGEN, Hilden, yr Almaen). Perfformiwyd trawsgrifio o chwith gan ddefnyddio pecyn trawsgrifio cefn cDNA gallu uchel (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, UDA), yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, i gael y llinyn cyntaf o cDNA. Yna defnyddiwyd y llinynnau fel templedi ar gyfer PCR meintiol amser real (qRT-PCR) gan ddefnyddio offeryn Bio-Rad Chromo4TM a phrif gymysgedd SYBR Green qPCR (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, UDA). Perfformiwyd PCR o dan cyn-ddadnatureiddio ar 95 ◦C am 5 munud, dadnatureiddio ar 95 ◦C am 15 s, ac anelio ar 55-58 ◦C am 30 s. Defnyddiwyd mRNA GAPDH fel cyfeiriad mewnol ar gyfer tyrosinase, TRP-1, a TRP-2 mRNA. Gwerth cymharol mynegiant genynnau targed=2−∆∆CT. Roedd y dilyniannau cysefin fel a ganlyn: Tyrosinase-sense (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), Tyrosinase-anti-sense (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-synnwyr (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-gwrth-synnwyr (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-synnwyr (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-gwrth-synnwyr (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sense (5′-aggtggtcctctgacttc-3′), a GAPDH-antisense (5′-gacta-gacta-gtatg -3′).

2.11. Blotio Gorllewinol

Cafodd melanocytes eu cynaeafu a'u gorchuddio gan ddefnyddio adweithydd echdynnu protein mamalaidd (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA). Perfformiwyd yr holl weithdrefnau yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Penderfynwyd ar yr holl grynodiad protein gan ddefnyddio pecyn assay protein Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA). Yna, ychwanegwyd byffer llwytho at y supernatant protein a chymysg. Cafodd y cymysgedd ei ferwi am 10 munud, a gwahanwyd y proteinau gan ddefnyddio Geli Precast Mini-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA) a'u trosglwyddo i bilen difluorid polyvinylidene Hybond (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, UDA). Perfformiwyd imiwnonodi gan ddefnyddio tyrosinase (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), CREB â ffosfforyleiddiad (p-CREB 1: 1000), CREB(1:1000), a -tubulin (1:1000) (Technoleg Signalau Cell, Beverly, MA, UDA) gan ddefnyddio Pecyn Gwella Imiwnedd SignalBoost (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA). Cafodd y bilen ei deor dros nos gyda'r gwrthgyrff cynradd ar 4 ◦C. Ychwanegwyd gwrthgorff eilaidd gwrth-gwningen gafr (IgG) (1:5000, Technoleg Signalau Cell) at y bilen a'i ddeor ar dymheredd ystafell am 1 h. Arsylwyd bandiau protein gan ddefnyddio swbstrad blotio gorllewinol Pierce ECL gwell (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) a'i feintioli fel cymhareb dwyster y band protein targed i ddwysedd y band -tubulin.

2.12. Dadansoddiad Ystadegol

Ailadroddwyd yr holl brofion yn annibynnol o leiaf deirgwaith. Cyflwynir yr holl baramedrau ystadegol fel cyfeiliornad safonol cymedrig y cymedr (SEM). Perfformiwyd dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA), ac yna prawf post-hoc Dunn. Ystyriwyd gwerth p < 0.01="" neu="" p="">< 0.05="" yn="">

prawf ar gyfer flavonoids

3. Canlyniadau

3.1. Cymharu Priodweddau Gwrthocsidiol Sawl Detholiad Rhannol o KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25.7 ± 2.1 y cant ) > KCF (8.7 ± 1.1 y cant ) (Ffigur 1E).

3.2. Cymhariaeth o Keratinocytes Hyfyw a Difrod sy'n cael eu Trin â Sawl Detholiad Rhannol o KC ym Mhresenoldeb UVA, UVB, neu Heb Arbelydru

Fe wnaethom gynnal yr arbrofion canlynol i archwilio effeithiau onkeratinocytes KCR, KCS, KCL, a KCF. Yn gyntaf, cymhwyswyd yr holl echdynion i keratinocytes HaCaT ym mhresenoldeb UVA, UVB, neu an-arbelydru. Dangosodd dadansoddiad CCK-8 nad oedd y detholiadau wedi newid hyfywedd ceratinocyte yn sylweddol ar grynodiadau o 0.5 mg/mL. Yn ddiweddarach, cafodd keratinocytes eu trin â KCR, KCS, KCL, a KCF ym mhresenoldeb arbelydru UVA neu UVB. Roedd arbelydru UVA ac UVB yn atal hyfywedd ceratinocyte yn sylweddol, fel y dangosir gan ddadansoddiad CCK-8 yn Ffigur 2A. Fodd bynnag, canfuom fod hyfywedd keratinocytes arbelydru UVA- ac UVB wedi cynyddu yn y drefn ganlynol: KCL, KCR, KCS, a KCF (Ffigur 2A). Gwnaethom hefyd fonitro'r keratinocytes a ddifrodwyd trwy fesur y rhyddhad LDH allgellog. Dangosodd y canlyniadau fod arbelydru UVA neu UVB yn hwyluso rhyddhau LDH yn sylweddol; fodd bynnag, gwanhaodd KCL, KCR, KCS, a KCF ryddhad LDH yn sylweddol gydag amlygiad UVA neu UVB yn y drefn honno (Ffigur 2B). Dangosodd y canlyniadau arbrofol uchod fod effeithiau gwrth-amlhau a sytotocsig arbelydru UVA neu UVB ar keratinocytes wedi'u lleddfu yn nhrefn KCL, KCR, KCS, a KCF. Yn nodedig, gall KCL adfer hyfywedd celloedd i reoli lefelau.

Ffigur 2. Mae hyfywedd keratinocytes ac effeithiau cytotoxicity o KCR, KCS, KCL, a KCF dyfyniad ym mhresenoldeb UVA, UVB, neu nad ydynt yn arbelydru.

3.3. Cymhariaeth o Gynhyrchu ROS Mewngellol mewn Keratinocytes wedi'i Drin â Sawl Darn Rhannol o KC ym Mhresenoldeb neu Absenoldeb Arbelydru UVA ac UVB

Gan fod cynhyrchu ROS mewngellol yn achosi difrod ceratinocyte difrifol, fe'u hystyrir yn gyfryngwyr posibl difrod a achosir gan ymbelydredd UVA neu UVB. Mae sawl astudiaeth wedi awgrymu bod arbelydru UVA neu UVB yn cymell cynhyrchu ROS mewndarddol [12,14]. Ein nod oedd pennu a oedd cynnydd mewn lefelau ROS mewndarddol mewn keratinocytes arbelydredig UVA neu UVB. Yn unol â hynny, dadansoddwyd dwyster fflworoleuedd mewngellol y stiliwr CM-H2DCFDA gan ddefnyddio microsgopeg fflworoleuedd a sytometreg llif. O ganlyniad i ficrosgopeg fflworoleuedd, dangosodd delweddau staenio CM-H2DCFDA ychydig o staenio mewn rheolaeth, KCR, KCS, KCL, a keratinocytes wedi'u trin â KCF a staenio sylweddol mewn keratinocytes arbelydredig UVA neu UVB (Ffigur 3A). Yn ôl canlyniadau meintioledig cytometreg llif, cynyddodd arbelydru UVA ac UVB lefelau ROS mewngellol mewn keratinocytes 27.2 ± 4.5 y cant a 34.1 ± 4.2 y cant, yn y drefn honno, o'i gymharu â hynny yn y rheolaeth (5.7 ±0.2 y cant ). Yn ogystal, yn debyg i ganlyniadau microsgopeg fflworoleuedd, cadarnhawyd bod y lefel ROS mewngellol yn cael ei atal gan ddarnau KC yn nhrefn KCL> KCR> KCS> KCF ym mhresenoldeb arbelydru UVA neu UVB (Ffigur 3B). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod nifer o ddarnau rhannol o KC wedi atal difrod keratinocyte yn sylweddol trwy leihau lefelau ROS mewndarddol.

Ffigur 3. Effaith dyfyniad KCR, KCS, KCL, a KCF ar y cynhyrchiad ROS mewngellol mewn UVA, UVB, neu keratinocytes nad ydynt yn arbelydru

3.4. Cymhariaeth o Apoptosis o Keratinocytes wedi'u Trin â Sawl Detholiad Rhannol o KC ym Mhresenoldeb neu Absenoldeb Arbelydru UVA ac UVB

Er mwyn canfod apoptosis, sy'n ddangosydd dibynadwy o ddifrod keratinocyte, cafodd keratinocytes eu staenio ag Atodiadin V mewn cyfuniad â propidium ïodid. Defnyddiwyd y pecyn fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V/Apoptosis Cell Marw i brofi cyfradd yr apoptosis mewn keratinocytes. Hwylusodd arbelydru UVA ac UVB weithgaredd staenio Atodiadin V, tra gostyngodd KCR, KCS, KCL, a KCF gyfradd gweithgaredd staenio Atodiadin V ym mhresenoldeb arbelydru UVA ac UVB. Ni wnaeth KCR, KCS, KCL, a KCF yn unig (0.5 mg/mL) ysgogi gweithgarwch staenio Atodiadin V. Dangosodd data meintiol o sytometreg llif fod arbelydru UVA ac UVB wedi cynyddu lefelau apoptosis o keratinocytes 46.3± 1.5 y cant a 48.7 ± 1.0 y cant , yn y drefn honno, o gymharu â rheolaeth (5.0 y cant ± 0.7 y cant ). Yn bwysig, cadarnhawyd bod lefel yr apoptosis yn cael ei atal gan ddarnau KC yn nhrefn KCL> KCR> KCS> KCF ym mhresenoldeb arbelydru UVA neu UVB (Ffigur 4A, B). Yn gyffredinol, achosodd arbelydru UVA ac UVB ddifrod keratinocyte a nifer o ddarnau rhannol o ddifrod keratinocyte gwanedig KC a achosir gan arbelydru UV.

Ffigur 4. Effaith echdynion KCR, KCS, KCL, a KCF ar yr apoptosis mewn UVA, UVB, neu keratinocytes nad ydynt yn arbelydru.

3.5. Cymhariaeth o Gynnwys Melanin Mewngellol a Gweithgaredd Tyrosinase Melanocytes wedi'i Drin â Nifer Rhannol o KC ym Mhresenoldeb neu Absenoldeb Triniaeth -MSH

Cyn ymchwilio i botensial biolegol KCR, KCS, KCL, a KCF ar melanogenesis a ysgogwyd gan MSH, aseswyd hyfywedd celloedd ar ôl triniaeth KCR, KCS, KCL, a KCF (0.5 mg/mL) gan ddefnyddio yr assay CCK-8 mewn melanocytes B16F10 gyda neu heb -MSH. Ni wnaeth KCR, KCS, KCL, a KCF (0.5 mg/mL) newid hyfywedd celloedd ym mhresenoldeb neu absenoldeb -MSH (Ffigur 5A). -MSH yn asiant melanogenig pwysig a all gynyddu cynnwys melanin mewngellol trwy rwymo i'r derbynnydd melanocortin 1 ac actifadu cyclase adenylate. Er mwyn ymchwilio i effaith KCR, KCS, KCL, a KCF ar melanogenesis mewn melanocytes, pennwyd y cynnwys melanin mewngellol gan arsylwi gweledol a mesuriadau biocemegol. Fel y dangosir yn Ffigur 5B, cynyddwyd y cynnwys melanin mewngellol yn sylweddol gan -MSH. Fodd bynnag, dangosodd cyd-driniaeth â KCR, KCS, KCL, a KCF ostyngiad rhyfeddol yn y cynnwys melanin mewngellol o'i gymharu â'r driniaeth -MSH. Roedd y dilyniant o fesuriadau biocemegol sy'n nodi ataliad cynnwys melanin mewngellol fel a ganlyn: KCL > KCR > KCS > KCF (Ffigur 5B). Perfformiwyd assay gweithgaredd tyrosinase mewngellol yn unol â'r assay cynnwys melanin mewngellol. Cynyddodd gweithgaredd tyrosinase mewngellol melanocytes a ysgogwyd gan -MSH, tra gostyngodd gweithgaredd melanocytes a ysgogwyd gan -MSH a driniwyd â KCR, KCS, KCL, a KCF. Roedd y dilyniant o fesuriadau biocemegol yn nodi ataliad tyrosinaseactifedd mewngellol fel a ganlyn: KCL > KCR > KCS > KCF (Ffigur 5C). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod nifer o ddarnau rhannol o KC wedi lleihau'n sylweddol y cynnwys melanin mewngellol ac wedi atal gweithgaredd tyrosinase heb newid hyfywedd celloedd.

3.6. Cymharu Lefelau Trawsgrifio a Chyfieithu Tyrosinase, TRP-1, a TRP-2 mewn Melanocytes Wedi'u Trin â Sawl Darn Rhannol o KC ym Mhresenoldeb neu Absenoldeb-MSH Triniaeth

Er mwyn archwilio effaith KCR, KCS, KCL, a KCF ar is-reoleiddio lefelau mynegiant protein ac mRNA marcwyr melanogenesis (tyrosinase, TRP-1, a TRP-2), cafodd y melanocytes eu trin â KCR , KCS, KCL, a KCF ym mhresenoldeb neu absenoldeb -MSH. Fel y dangosir yn Ffigur 6A-C, cynyddwyd lefelau mRNA tyrosinase, TRP-1, a TRP-2 yn sylweddol gan driniaeth -MSH. Mewn cyferbyniad, o gymharu â'r driniaeth -MSH, roedd KCR, KCS, KCL, a KCF yn is-reoleiddio mynegiant mRNA tyrosinase, TRP-1, a TRP-2. Yn ogystal, ni chafodd KCR, KCS, KCL, a KCF yn unig unrhyw effaith sylweddol ar lefelau mRNA tyrosinase, TRP-1, a TRP-2. Perfformiwyd dadansoddiad blotiau gorllewinol mewn cydweithrediad â PCR amser real. Dangosodd y canlyniadau fod triniaeth -MSH wedi cynyddu lefelau mynegiant protein tyrosinase, TRP-1, a TRP-2 a gostyngwyd y lefelau hyn trwy gyd-driniaeth â KCR, KCS, KCL, a KCF (Ffigur 6D ). Roedd y dilyniant o PCR amser real meintiol ac ataliad blotindicating gorllewinol o tyrosinase, TRP-1, a TRP-2 mRNA a mynegiant protein fel a ganlyn: KCL > KCR=KCS > KCF (Ffigur 6). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod gan sawl detholiad rhannol o KC y potensial i hyrwyddo gwrth-melanogenesis, a ddangoswyd gan is-reoleiddio marcwyr melanogenesis.

3.7. Cymharu Mynegiant MITF a Ffosfforyleiddiad CREB Melanocytes wedi'u Trin â Darnau Rhannol o KC ym Mhresenoldeb neu Absenoldeb Triniaeth -MSH

Mae Tyrosinase, TRP-1, a TRP-2 yn hanfodol mewn melanogenesis. Mae eu mynegiant yn cael ei reoleiddio gan MITFexpression a CREB phosphorylation [17,21]. Nododd dadansoddiad blot y gorllewin fod KCR, KCS, KCL, a KCF yn effeithiol yn atal y cynnydd yn lefel protein MITF a achosir gan driniaeth -MSH. Yn ogystal, prin y canfuwyd mynegiant protein MITF gan KCR, KCS, KCL, a KCF yn unig. Roedd y dilyniant o ganlyniadau blot gorllewinol wedi'i feintioli sy'n nodi ataliad ar lefelau mynegiant protein MITF fel a ganlyn: KCL > KCR > KCS > KCF (Ffigur 7A). Ar ben hynny, gwrthdroiodd KCR, KCS, KCL, a KCF effeithiau triniaeth -MSH ar ffosfforyleiddiad CREB. Ychydig iawn o effaith a gafodd KCR, KCS, KCL, a KCF yn unig ar ffosfforyleiddiad CREB. Roedd y dilyniant o ganlyniadau blot gorllewinol wedi'u meintioli sy'n nodi ataliad ar lefelau ffosfforyleiddiad CREB fel a ganlyn: KCL > KCR > KCS > KCF (Ffigur 7B). Dangosodd y canlyniadau hyn fod nifer o ddarnau rhannol o KC yn atal melanogenesis inmelanocytes, yn rhannol o leiaf, trwy fynegiant MITF a ffosfforyleiddiad CREB.

4. Trafodaeth

Mae poblogrwydd gwynnu croen yn cynyddu ledled y byd oherwydd y cynnydd mewn arbelydru UV, ac mae'n debygol o gyrraedd cyfrannau uchel yn y degawdau nesaf at ddibenion esthetig [8]. Mae'r mathau niferus o gannydd, fel asid kojic ac arbutin, wedi'u defnyddio yn y marchnadoedd cosmetig a fferyllol. Ar ben hynny, mae darnau naturiol yn cael sylw cynyddol oherwydd eu gweithgareddau gwrthocsidiol, gwrthlidiol, gwrth-tiwmor, gwrthfacterol, a gweithgareddau eraill posibl [26,27]. Yn seiliedig ar nodweddion gwrthocsidyddion a ffotoprotective a gwrth-melanogenesis, mae nifer o ymgeiswyr cosmetig a fferyllol wedi'u datblygu. Mae'n hysbys bod priodweddau ymgeiswyr gwynnu yn gyfranwyr anhepgor i ymchwil a datblygiad cosmetig a fferyllol [28]. Mae gan TDM eiddo aml-gydran ac aml-darged ac mae'n gwella effeithiolrwydd biolegol dynol ac ansawdd bywyd yn fawr [29]. Mae ymchwil ffytocemegol modern yn dangos bod KC yn cynnwys amrywiaeth o gynhwysion, a lignans aterpenoidau yw'r prif gynhwysion [30]. Mae mwy na 202 o gyfansoddion wedi'u nodi, gan gynnwys dibenzocy- clooctadiene lignans, Spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene lignans, Arylnaphthalene lignans, Kadlongilactone triterpenoids, a sesquiterpenoids [31,32]. Mae gan wreiddiau sych, coesynnau a dail KC draddodiad eang o ddefnydd mewn TDM i drin arthritis gwynegol, wlserau dwodenol, anhwylderau gastroberfeddol, a phroblemau gynaecolegol. Gwreiddiau sych KC, gyda gweithredoedd o glirio gwres a dileu tocsinau, gan achosi diuresis i gael gwared ar oedema. Mae ffrwythau KC yn cael eu bwyta'n bennaf ar ffurf ffrwythau ffres, sudd a gwin ffrwythau, sy'n nodi eu bod yn fuddiol i iechyd pobl [7,33,34]. Mae astudiaethau blaenorol hefyd wedi dangos ei fod yn gyfoethog mewn cynhwysion bioactif fel lignans, triterpenoidau, flavonoidau, asidau ffenolig, steroidau, ac asidau amino, sydd â gwerth maethol a meddyginiaethol uchel [3,35]. Yn yr astudiaeth hon, echdynnwyd gwahanol rannau o KC. Yn nodedig, roedd cyfanswm cynnwys polyffenol a flavonoid dail a gwreiddiau KC yn llawer uwch na chynnwys coesynnau a ffrwythau. Mae dail a gwreiddiau'n cynnwys mwy na dwywaith cymaint o polyffenolau a flavonoidau â choesynnau a ffrwythau. O ganlyniad, rydym o'r farn bod cyfanswm polyffenolau a flavonoidau yn cyfrannu'n sylweddol at effeithiau ffoto-amddiffynnol a gwrth-melanogenig KC.

Mae ffotowenwyndra croenol a achosir gan ymbelydredd UV yn bennaf oherwydd sytowenwyndra celloedd, cronni ROS mewngellol, ac apoptosis mewn keratinocytes. Felly, mae'n fwy rhesymol canolbwyntio ar atal sytowenwyndra celloedd, cronni ROS mewngellol, ac apoptosis mewn keratinocytes arbelydru UVA-a UVB [36,37]. Fel y disgrifiwyd yn yr astudiaeth hon [10,38], dangosodd yr ymyriad â darnau KC ar ffoto-cytowenwyndra (UVA: 20 J / cm2, UVB: 50 mJ / cm2) fod echdynion KC wedi lleihau'n sylweddol y sytowenwyndra celloedd, cronni ROS mewngellol a apoptosis. Yn gyson â chanlyniadau blaenorol, roedd effeithiau llun-amddiffynnol dail a gwreiddiau KC yn llawer uwch na rhai'r coesyn a'r ffrwythau. At hynny, nododd ein canlyniadau fod darnau KC yn dangos yr effeithiau uchod trwy hyrwyddo gweithgaredd gwrthocsidiol. Mae melanogenesis yn aml yn cael ei arsylwi ar ôl arbelydru UV ac mae'n gysylltiedig yn bennaf â phigmentiad neu hyperpigmentation [39]. Yn ôl astudiaethau blaenorol, mae thema ysgogi melanogenesis gan ddefnyddio -MSH wedi'i gydnabod a'i gymhwyso'n eang. Felly, roedd yr astudiaeth hon yn seiliedig ar adeiladu model melanocyte wedi'i ysgogi â -MSH [24,39]. Canfuom fod detholiadau KC yn atal gweithgaredd melanintol mewngellol a thyrosinase wedi'i ysgogi gan MSH. Yn ogystal, mae detholiadau KC wedi is-reoleiddio trawsgrifio a chyfieithu marcwyr melanogenesis megis tyrosinase, TRP-1, a TRP-2 mewn melanocytau a symbylwyd gan -MSH. Ar ben hynny, buom yn ymchwilio i fynegiant protein MITF a ffosfforyleiddiad CREB mewn melanocytau wedi'u hysgogi gan -MSH. Yn yr un modd, yn yr astudiaeth hon, canfuom fod darnau KC yn atal mynegiant protein MITF wedi'i gyfryngu gan MSH a ffosfforyleiddiad CREB mewn melanocytes. Yn gyson â chanlyniadau ffotoprotective, roedd effeithiau gwrth-melanogenig dail a gwreiddiau KC yn llawer uwch na rhai'r coesynnau a'r ffrwythau.

sleisen cistanche

Am fwy o wybodaeth, cliciwch yma.

5. Casgliadau

Yn gyffredinol, canfuwyd effeithiau ffotoprotective a gwrth-melanogenig posibl y dyfyniad KC yn yr astudiaeth hon. Gall detholiad KC gyda chynnwys polyphenol a flavonoid uchel gael effeithiau ffoto-amddiffynnol a gwrth-melanogenig ar keratinocytes a melanocytes.