Cynulliad Trawsgrifiad De Novo A Darganfod Genynnau O Cistanche Deserticola Bones Cnawdol-Ⅱ

Dosbarthiad Swyddogaethol O'r Holl Drawsgrifiadau a Fynegwyd yn Seiliedig ar Ontoleg Genynnau A Chronfeydd Data KEGG

Cafwyd anodiad Gene Ontology (GO) o ffeil anodiadau a ffeil hunaniaeth UniProt. At ei gilydd, neilltuwyd 20,907 o drawsgrifiadau, gan gyfrif am 32.69% o gyfanswm y dilyniannau a fynegwyd, i 1,745 o dermau swyddogaethol. O gyfanswm y termau GO swyddogaethol, aseiniadau i'r broses fiolegol oedd y mwyafrif (1,116, 63.95%) ac yna cydran cellog (329, 18.85%) a swyddogaeth foleciwlaidd (300, 17.20%). Roedd swyddogaethau neilltuedig trawsgrifiadau wedi'u mynegi yn cwmpasu ystod eang o gategorïau GO, a rhestrwyd y 10 term GO uchaf gyda'r trawsgrifiadau mwyaf anodedig yn Nhabl 3. Rydym yn darparu dosbarthiad trawsgrifiadau wedi'u mynegi i gyd mewn tri chategori Ontoleg Genynnau (Swyddogaeth Foleciwlaidd, Cydran Cellog, a broses fiolegol) yn y ffeil atodol (S3 Dataset). Cynrychiolwyd termau GO yn ymwneud â swyddogaethau rhwymo a gweithgaredd transferase yn bennaf yn y categori ffwythiant moleciwlaidd. O ran y swyddogaethau rhwymo, rhwymo catïon (4,394 o drawsgrifiadau) oedd yn cynrychioli'r mwyaf niferus, ac yna rhwymo niwcleotid/niwcleosid (3,404 o drawsgrifiadau ar gyfartaledd) a rhwymo protein (2,422 o drawsgrifiadau). Tra yn y grŵp gweithgaredd transferase, y mwyaf yw'r rhai â grwpiau trosglwyddo sy'n cynnwys ffosfforws (2,256 o drawsgrifiadau, 65.77%). Ymhlith y categori cydrannau cellog, roedd trawsgrifiadau wedi'u lleoli'n fwy mewngellol (trawsgrifiadau 10,581 ar gyfartaledd), tra ymhlith y categori proses fiolegol, roedd trawsgrifiadau'n ymwneud yn fwy â'r broses metabolig biopolymer (6,683 o drawsgrifiadau ar gyfartaledd), ac yna rheoleiddio'r broses gellog (4,841 trawsgrifiad ), mynegiant genynnau (4,678 trawsgrifiad) a chludiant (3,512 o drawsgrifiadau).

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER ATAL CLEFYD ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

I gloddio genynnau sy'n ymwneud â biosynthesis lignin a PhG, chwiliwyd 21,358 o ddilyniannau protein potensial nad oeddent yn ddiangen yn erbyn dilyniannau genynnau o 13 o organebau planhigion yng nghronfa ddata KEGG, ac fe'u neilltuwyd i 275 o lwybrau KEGG gydag o leiaf 5 trawiad. Rhestrir y 10 llwybr uchaf gyda'r dilyniannau wedi'u halinio fwyaf yn Nhabl 4. Roedd y rhan fwyaf o lwybrau'n ymwneud â phrosesau metabolaidd sylfaenol, megis metaboledd asid amino neu brotein (ko01230, ko04141, a ko04120), metaboledd carbohydrad (ko01200 a ko00500), a niwcleotid neu metaboledd niwcleosid (ko03018, ko00230, a ko00240). Ar ben hynny, mae yna 27 o lwybrau eilaidd sy'n gysylltiedig â metaboledd (Ffig 2), megis biosynthesis asgwrn cefn terpenoid, biosynthesis ffenylpropanoid, biosynthesis carotenoid, biosynthesis alcaloid isoquinoline, a biosynthesis alcaloid tropane, piperidine a pyridine. Mae'r canlyniadau hyn yn rhoi arwydd pellach bod prosesau metabolaidd gweithredol ar y gweill yn yC. deserticolameinwe coesyn. Roedd yr holl drawsgrifiadau mynegedig sy'n gysylltiedig â llwybrau KEGG wedi'u rhestru yn y ffeil atodol (Set Data S4). Er bod rhai llwybrau wedi newid yn sylweddol rhwng C. deserticola a phlanhigion eraill, megis reis (S5 Dataset), ein prif nod yn yr astudiaeth hon yw datgelu proffil trawsgrifiad cyfan coesyn C. deserticola a darlunio llwybrau cysylltiedig biosynthesis PhGs. a allai fod yn ddefnyddiol ar gyfer arwain y tyfu.

Ensymau Amgodio Genynnau Ymgeisydd sy'n Ymwneud â Biosynthesis Lignin

Lignin yw'r ail bolymer daearol naturiol mwyaf niferus yn y deyrnas planhigion, gan gyfansoddi hyd at un rhan o dair o'r deunydd a geir mewn cellfuriau planhigion. Fel elfen bwysig o gellfuriau, mae ligninau yn helpu i gludo dŵr, yn darparu cefnogaeth fecanyddol a chyfanrwydd strwythurol, ac yn amddiffyn rhag pathogenau a llysysyddion. Mae'r rolau hynny o lignin yn werthfawr iawn i gefnogi twf codiadol tanddaearol C. deserticola yn yr anialwch. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom gyflwyno'r darlun cyflawn o lwybrau biosynthesis lignin yn C. deserticola (Ffig 3), lle mae'r monomerau lignin yn cael eu biosyntheseiddio o ffenylalanîn trwy gyfres o adweithiau enzymatig, gan gynnwys hydroxylation, methylation, reducer, a oxidative polymerization process. Canfuwyd ensymau cysylltiedig â biosynthesis lignin ar gyfer tair ffurf wedi'u synthesis yn bennaf mewn meinwe fasgwlaidd (p-hydroxyl-phenyl (H), guaiacyl (G) a syringyl (S) lignin) a 5-hydroxyl-guaiacyl lignin a nodwyd yn unig mewn COMT (asid caffein 3-O-methyltransferase, EC 2.1.1.68) planhigion diffygiol (fel dymchwel).

Amonia-lyase ffenylalanin (PAL, EC 4.3.1.24) yw'r ensym allweddol cyntaf yn y llwybr biosynthesis lignin (Ffig 3) sy'n trawsnewid ffenylalanîn yn asid sinamig trwy ddadamination anocsidiol. Cafodd cyfanswm o 6,297 o ddarlleniadau PAL eu dilyniannu a chafodd 7 trawsgrifiad PAL eu rhoi at ei gilydd yn C. deserticola (Tabl 5). Trwy gymharu tebygrwydd mewn dilyniant, canfuom fod gan 4 ohonynt (comp28550_c1_seq1/2/3/5) fwy na 95% o debygrwydd â'r dilyniant mRNA hysbys o C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), tra bod gan comp28550_c1_seq4 a comp25940_c0_seq1) debygrwydd o 77% ac 82%, yn y drefn honno. Datgelodd rhagfynegiad ORF fod gan 5 trawsgrifiad botensial o amgodio proteinau a'u cario gyda pharth lyase asid amino aromatig (PF00221.14). Yn eu plith, dim ond y trawsgrifiad comp{33}}c1_seq4 allai amgodio dilyniant protein cyflawn o 718 o weddillion asid amino. Dywedwyd bod PAL wedi'i amgodio gan deulu amlgenyn bach yn y rhan fwyaf o rywogaethau planhigion, megis 4 yn Arabidopsis thaliana, 5 yn Populus trichocarpa, 3 yn Scutellaria baicalensis, a 7 Cucumis sativus, ac ati. Awgrymodd ein dadansoddiad ffylogenetig fod yna 4 Genynnau amgodio PAL yn C.

deserticola ac fe wnaethom eu henwi CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 a CdPAL4, yn y drefn honno (S2 Ffig). Mae 4-ligas coumate-CoA (4CL, EC 6.2.1.12) a trans-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) yn ddau ensym sy'n gyfrifol am drawsnewid asid cinnamig i dicoumarol-CoA mewn dau wrth gefn gorchmynion. Maent hefyd yn asgwrn cefn, a'u mynegiant gwerthoedd FPKM yw 39.57 a 51.93, yn y drefn honno.

Cafodd y pedwar math o ligninau eu biosyntheseiddio gan wahanol lwybrau a oedd yn cael eu rheoli gan dri ensym allweddol, cinnamoyl-CoA reductase (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133), a ferulate{{1{1}). {56}}}}hydroxylase (F5H, EC 1.14.-.-). Adroddwyd bod CCR yn bwynt rheoli'r llwybr ligninau [50, 51] a oedd yn cataleiddio X-CoA (X gan gynnwys dicoumarol, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl, a sinapoyl) i Y-aldehyde (Y gan gynnwys p -cougar, caffeoyl, conwyddyl, 5-hydroxyl-conifferyl, a snap), tra bod HCT wedi cataleiddio p-coumaroyl-CoA i asid shikimig p-coumaroyl/asid cwinig p-coumaroyl. Roedd y ddau ensym, yn union fel switsh, yn rheoleiddio biosynthesis ligninau P-hydroxyl-phenyl neu'r tri math arall o ligninau. Roedd F5H yn switsh cangen arall a oedd yn rheoleiddio syringyl lignin a 5-hydroxyl-guaiacyl lignin. Enzymau pwysig eraill gan gynnwys asid caffeic 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104), a sinamyl-alcohol dehydrogenase (CAD, EC 1.1.1.195 ) eu canfod hefyd wedi'u mynegi. Rhestrir gwybodaeth mynegiant manwl yn Nhabl 6. Bydd y genynnau ensymau hyn a nodir yn yr astudiaeth hon yn darparu adnodd gwerthfawr ar gyfer astudiaethau genomig swyddogaethol yn y planhigyn meddyginiaethol pwysig hwn. Dewiswyd 10 genyn sy'n gysylltiedig â'r llwybr biosynthesis lignins yn Nhabl 6 ar gyfer dilysiad RT-qPCR i gadarnhau ein canlyniadau RNAseq (Ffig 4), ac roedd eu cydberthnasau uchel (cyfernod cydberthynas Pearson: 0.90343) yn nodi cywirdeb uchel ac atgynhyrchu ein dadansoddiad trawsgrifiad. Mae Set Ddata S1 yn rhestru'r dilyniannau preimio a ddefnyddir yn y dadansoddiad hwn.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH RHYWIOL PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Ensymau Amgodio Genynnau Ymgeisydd Sy'n Ymwneud â Biosynthesis PhGs

Gwyddys mai glycosidau ffenylethanoid (PhGs) yw'r prif gynhwysion gweithredol yn C. deserticola gyda gweithgareddau o wella nerth rhywiol, chwilota radicalau rhydd, a gwrth-heneiddio. Tair cydran gemegol PhGs yw asid organig, saccharid, ac aglycon ffenylethanol (Ffig 3). Mae'r asidau organig gan gynnwys asid caffeic, asid ferulic, ac asid coumalic yn gynhyrchion y llwybr biosynthesis ffenylpropanoid. Mae cydrannau saccharid gan gynnwys glwcos a rhamnose yn gynhyrchion o lwybrau metaboledd carbohydrad, megis metabolaeth startsh a swcros, siwgr amino a metaboledd siwgr niwcleotid, metaboledd ffrwctos a mannose, ac ati Fodd bynnag, nid yw llwybr biosynthesis rhan ffenylethanol yn glir eto. Yma, gwnaethom gynnig dau lwybr biosynthesis ffenylethanol posibl yn seiliedig ar ein data dilyniant. Un yw'r llwybr asid caffeic neu asid ferulic a adroddir, a elwir hefyd yn llwybr asid sinamig sy'n debyg i lwybr asgwrn cefn biosynthesis lignin. Mae un arall yn seiliedig ar y llwybr metaboledd ffenylalanîn (Ffig 3), lle cyflawnwyd y ffenylalanîn i ffenylethanol gan 'lwybr Enrlich' hysbys a ddarganfuwyd gyntaf mewn burum ganrif yn ôl ac a ddilyswyd mewn blodau petunia, tomato, a rhosyn. Darganfuwyd pedwar genyn ensym sy'n amgodio aspartate/tyrosine aminotransferase, histidine-phosphate aminotransferase, ac ocsidas cynradd-amine sy'n gyfrifol am drosi ffenylalanin i ffenylethanol wedi'u mynegi yng nghesyn C. deserticola. Gall cynnyrch ethanol ffenyl gael ei ocsidio ymhellach gan monooxygenase neu ei methylu gan methyltransferase i'w ddeilliadau (phenyl ethanol aglycon) sy'n cymryd rhan mewn biosynthesis PhG. I grynhoi, cynigiwyd dau lwybr biosynthesis tybiedig o aglycon ffenylethanolC. deserticolaond dal angen mwy o astudio ymhellach.

Trafodaethau

Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae genomeg planhigion wedi datblygu'n gyflym gyda chymhwyso technoleg dilyniannu cenhedlaeth nesaf, tra bod ychydig o ymchwil wedi canolbwyntio ar genomeg planhigion meddyginiaethol anialwch. Mae angen gwneud ymchwil genomig neu drawsgrifio ar fyrder i ddeall ei addasiad i amgylcheddau sychder a halltedd a llwybr biosynthesis y prif gydrannau bioactif. Darganfyddiad trawsgrifiad de novo ar gyfer rhai planhigion meddygol,

megis Panax ginseng, Ginkgo biloba, a Glycyrrhiza uralensis wedi cael eu hecsbloetio gyntaf gan ddefnyddio platfform Roche 454 am ei hyd darllen hir. Oherwydd y gallu cydosod effeithiol gyda darlleniadau byr, yn enwedig y darlleniadau pen pâr breintiedig, mae dilyniannu a chydosod trawsgrifio seiliedig ar Illumina hefyd wedi cael eu defnyddio'n helaeth ar gyfer organebau model a di-fodel. Yn yr astudiaeth bresennol, cynhyrchwyd tua 8G o ddarlleniadau pen parau 101 bp a chynhyrchwyd dilyniannau unigene hirach gyda hyd cyfartalog o 725 bp. Gallai data trawsgrifio coesyn-benodol ar raddfa fawr ddarparu data cyfeirio defnyddiol a chael ei ddefnyddio i gloddio am fetaboledd eilaidd cydrannau bioactif C. deserticola. Mae 81.62% o gyfanswm y darlleniadau amrwd wedi pasio hidlwyr ansawdd llym (gan gynnwys trimio addasydd a thaflu darlleniadau o ansawdd isel) cyn eu cydosod, sy'n awgrymu ansawdd uchel ein data dilyniannu, ac roedd 82.08% o'r darlleniadau o ansawdd uchel yn ddefnyddiol ar gyfer cydosod. Gall darlleniadau eraill na chafodd eu defnyddio ar gyfer cydosod ddod o wallau dilyniannu, paramedrau cydosod et al. Roedd y darlleniadau ansawdd uchel hynny nas defnyddiwyd yn parhau i fod yn ddefnyddiol wrth wella cydosod de novo ynghyd â darlleniadau hirach o lwyfan arall (fel Roche 454) yn y dyfodol.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH RHYWIOL PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Roedd nifer fawr o drawsgrifiadau a gasglwyd (30,098) yn dangos tebygrwydd dilyniant uchel i enynnau hysbys mewn cronfeydd data cyhoeddus, gan awgrymu bod ein data pen parau yn seiliedig ar Illumina yn cwmpasu ffracsiwn sylweddol o drawsgrifiadau o C. deserticola. Gall trawsgrifiadau heb unrhyw drawiadau BLAST fod o ganlyniad i 3' neu 5' o ranbarthau heb eu cyfieithu, RNA heb godio, neu ddilyniannau genynnau newydd o C. deserticola. Cafodd y trawsgrifiadau a fynegwyd eu hanodi i ystod eang o gategorïau GO a llwybrau KEGG (Tablau 3 a 4), lle neilltuwyd llawer o drawsgrifiadau i lwybrau cysylltiedig â metaboledd eilaidd. Fel y gwyddom, gall ffenylpropanoid weithredu fel cyfansoddyn gwrthficrobaidd anwythol sy'n fuddiol iawn ar gyfer ffordd o fyw o dan y ddaear [1], a hefyd yn gweithredu fel moleciwl signal mewn rhyngweithiadau microbau planhigion ar wahân i'w ddefnyddioldeb meddyginiaethol [68, 69]. Defnyddir terpenoid ar gyfer biosynthesis o gydrannau bioactif (fel 6- deoxycatalpol) [70]. Gwelsom fod genynnau a oedd yn rhan o'r llwybr biosynthesis asgwrn cefn ffenylpropanoid a terpenoid yn helaeth iawn yn C. deserticola. Yn bwysicach fyth, roedd darganfod llwybrau biosynthesis lignin a gynrychiolir yn dda (Ffig 3) yn dangos proses metabolig weithredol lignin yn y coesyn C. deserticola. Darganfuwyd pob genyn ensymau hysbys sy'n ymwneud â biosynthesis lignin (Ffig 3) wedi'i fynegi, ac roedd gan bedwar ensym allweddol gan gynnwys PAL, CCR, HCT, a F5H ddigonedd mynegiant is (FPKM 26.47, 3.89, 3.4, a 3.83, yn y drefn honno) o'i gymharu â genynnau ensym eraill (Tabl 6). Mae'n werth astudio p'un a allai newid mynegiant y tri genyn hynny ddylanwadu ar gynhyrchu lignin yn C. deserticola ai peidio. Mae PAL yn ensym allweddol mewn biosynthesis lignin ac mae hefyd yn ymwneud â biosynthesis ffenylpropanoid, resveratrol, flavonoid, a coumarin [71-74]. Canfuom bedwar genyn PAL gwahanol yn y genom C. deserticola (S2 Ffig) a oedd yn cyd-fynd â'r ffaith bod PAL wedi'i amgodio gan deulu amlgen bach [39, 43, 45-49] a phrofwyd ymhellach y gallai chwarae rhan bwysig mewn fflwcs carbon metabolig. .

PhG yw'r prif gynhwysyn gweithredol yn C. deserticola. Mae genynnau sy'n ymwneud â biosynthesis ffenylethanol yn bwysig ar gyfer ansawdd C. deserticola. Rydym wedi diddwytho dau lwybr biosynthesis gwahanol o ethanol ffenyl ac 17 o enynnau ensym sy'n ymwneud â biosynthesis PhG yn y coesyn C. deserticola. Cafodd y prosesau asid fferwlig/caffeig posibl (Ffig 3) eu diddwytho am y tro cyntaf hefyd yn seiliedig ar fformiwla adeileddol o ganolraddau a phriodweddau catalytig ensymau cyfatebol, lle byddai'r asid caffeig/ferulig yn cael ei ocsidio gyntaf i ddeilliad ffenylpyrufad; yna, roedd y grŵp carboxyl yn cael ei amddifadu gan decarboxylase; yn olaf, troswyd grŵp aldehyd yn ôl yn grŵp alcohol gan dehydrogenase. Dyma gymhwysiad cyntaf technoleg dilyniannu pen pâr Illumina i ymchwilio i drawsgrifiad cyfan C. deserticola ac i gydosod darlleniadau RNA-seq heb genom cyfeirio. Bydd yr astudiaeth hon yn darparu adnoddau defnyddiol a dilyniannau genynnau ar gyfer genomeg swyddogaethol ac ymchwil proteomeg ar C. deserticola yn y dyfodol.

Casgliadau

Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom broffilio trawsgrifiad coesyn C. deserticola yn seiliedig ar ddata dilyniannu trwybwn uchel, canfuwyd genynnau sy'n ymwneud â llwybrau biosynthesis lignin, a chasglwyd hefyd lwybr biosynthesis posibl PhGs am y tro cyntaf, a fydd yn sicr yn cyflymu'r ddealltwriaeth o'r prosesau ffisiolegol amwys a'r gwerth meddyginiaethol mawr yn y lefel foleciwlaidd. Hyd yn hyn, dyma'r ymgais gyntaf i de novo i gydosod trawsgrifiad cyfan o goesyn C. deserticola ac i ganfod llwybr biosynthesis cydrannau meddyginiaethol gan ddefnyddio setiau data dilyniannu seiliedig ar Illumina. Gall ein hastudiaeth hyrwyddo datblygiad meddyginiaethau naturiol a dewis cyltifarau â nodweddion meddyginiaethol.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH RHYWIOL PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%